DE3689019T2 - Markierte Nukleinsäuren. - Google Patents
Markierte Nukleinsäuren.Info
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Description
- Diese Erfindung betrifft das isotopenfreie Markieren von Nukleinsäuren.
- Das Markieren von Nukleinsäuren ist für viele analytische Zwecke wichtig, sowohl in der Medizin als auch in der Forschung. Beispielsweise können solche markierten Moleküle benutzt werden, um die Anwesenheit einer einzelnen Kopie eines Gens von einem bestimmten Organismus innerhalb einer komplexen Gruppe von Organismen nachzuweisen und so eine rasche Diagnose von Infektionen zu erlauben. Traditionell umfaßte solches Markieren den enzymatischen Einbau von radioaktiv markierten Nukleotiden in Nukleinsäuren unter Verwendung von DNA-Polymerase.
- Verfahren zur isotopenfreien Markierung von Nukleinsäuren existieren ebenfalls. Eines solcher Verfahren erfordert den Einbau von Biotin-markierten Nukleotiden in Nukleinsäure (Langer et al. 1981, Proceedings of National Academy of Sciences, 78, 6633). Nach Hybridisierung dieser markierten Nukleinsäure mit Ziel-DNA, welche an einen Filter gebunden ist, kann sie durch einen kolorimetrischen Test nachgewiesen werden (EP-A-0138357 unter dem Namen von Integrated Genetics).
- Dieser Test umfaßt die Bildung eines Komplexes von dem Biotin mit Avidin, die Zugabe eines mit Biotin markierten Enzyms, derart daß das Enzym mit dem Avidin einen Komplex bildet und den Nachweis des Enzyms durch die Zugabe eines kolorimetrischen Substrates.
- EP-A-0117777 offenbart das Markieren von Nukleinsäuren mit einem interkalierenden Agens wie z. B. Acridin.
- EP-A-0097373 offenbart Markieren von DNA mit einer fluoreszierenden Verbindung wie z. B. Fluorescein.
- WO-A-84/03285 offenbart Markieren von Polynukleotiden mit ablösbaren Reportergruppen (reporter groups), welche an die C&sub5;-Position (für Pyrimidinbasen) und an die C&sub8;-Position (für Purinbasen) gebunden sind.
- Diese Erfindung stellt Polynukleotide, die mit Acridinestern markiert sind zur Verfügung. Diese markierten Polynukleotide stellen ein Mittel für den direkten Nachweis von homologen Nukleotidsequenzen zur Verfügung.
- Die Erfindung betrifft somit ein Verfahren zum isotopen freien Synthetisieren eines markierten Nukleotids oder Polynukleotids, wobei das Verfahren das Bereitstellen des Nukleotids oder Polynukleotids mit einer Base, die eine funktionelle Gruppe an der C&sub4;-Position für ein Pyrimidin oder der C&sub6;-Position für ein Purin umfaßt, welche in der Lage ist, mit einem Acridinester zu reagieren und den Acridinester an die funktionelle Gruppe zu binden.
- Vorzugsweise umfaßt das Verfahren die chemische Modifizierung des genannten Nukleotids oder des genannten Polynukleotids und das Verbinden des genannten Acridinesters mit dem genannten modifizierten Nukleotid oder dem genannten modifizierten Polynukleotid.
- Solches Modifizieren kann eine Alkylierung von einer Base des genannten Nukleotids oder Polynukleotids umfassen.
- Die funktionelle Gruppe ist vorzugsweise eine Amingruppe oder eine Aminopropylgruppe.
- Die Erfindung betrifft somit ebenfalls ein Nukleotid oder Polynukleotid, welches mit einem Acridinester markiert ist, wobei der Acridinester durch eine funktionelle Gruppe an der C&sub4;-Position einer Pyrimidinbase oder an der C&sub6;-Position einer Purinbase an eine Base gebunden ist, wobei die Gruppe in der Lage ist, mit einem Acridinester zu reagieren.
- Der Acridinester wird in geeigneter Weise chemisch an eine Amingruppe des genannten Nukleotids oder des genannten Polynukleotids gebunden. Vorzugsweise wird die Amingruppe in das genannte Nukleotid oder das genannte Polynukleotid durch chemisches oder enzymatisches Verbinden mit dem genannten Nukleotid oder dem genannten Polynukleotid, welches die genannte Amingruppe enthält, eingeführt.
- Das Verfahren zur isotopenfreien Synthese von markierten Polynukleotiden durch Einbau von Acridinestern (Campbell et al., EP-PS0082636) in das Polynukleotid umfaßt im allgemeinen den Einbau von funktionalisierenden Reagenzien in das Polynukleotid und die nachfolgende Verbindung eines Acridinesters mit diesen Reagenzien. Diese funktionalisierenden Reagenzien können entweder chemisch oder enzymatisch eingebaut werden. In einer Ausführungsform werden Cytosin-Analoge während der Synthese eines Polynukleotids chemisch angefügt, und in einer anderen wird DNA-Polymerase benutzt, um z. B. Analoge von triphosphorylierten Basen in ein Polynukleotid einzuführen, welches von einer einzel- oder doppelsträngigen Matrize synthetisiert wird. Beispiele von solchen triphosphorylierten Basen werden unten gezeigt:
- wobei x gleich H oder OH ist und 2≤n≤10 ist. Ein anderes Verfahren umfaßt das kovalente Anbinden von einem vorher markierten Nukleotid oder Polynukleotid an ein bestehendes Polynukleotid, z. B. durch Carbodiimid-Kupplung.
- Die markierten Polynukleotide können in Standardverfahren auf geeigneten Medien, wie z. B. Nitrocellulose, für den direkten Nachweis von homologen RNA- oder DNA-Sequenzen benutzt werden, ohne die Notwendigkeit der Zugabe von Enzymen oder Enzymsubstraten.
- Andere Merkmale und Vorzüge der Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung ihrer bevorzugten Ausführungsformen und aus den Ansprüchen klar werden.
- Der Begriff "Polynukleotide" bezieht sich auf Nukleotidsequenzen, welche zwei oder mehr Nukleotid-Basenpaare enthalten. Diese können chemisch ohne eine Matrize synthetisiert werden, oder enzymatisch unter Verwendung einer einzel- oder doppelsträngigen Polynukleotidmatrize, oder können von nativen Sequenzen abgeleitet werden, die als Gene, oder Teilen von Genen, in einem Genom, Plasmid, Virus oder einem anderen Vektor vorkommen. Gemäß der Erfindung werden Polynukleotide mit einer oder mehreren Acridinestergruppen markiert.
- Acridinester und ihre Synthese sind in Campbell et al., id., McCapra et al., GB-PS-1 461 877 und Sheehan, US-PS-3 539 574 beschrieben worden.
- Acridinester, die in der Erfindung verwendbar sind, haben die allgemeine Formel:
- wobei T eine gesättigte oder ungesättigte aliphatische C&sub1;&submin;&sub1;&sub0;-Kette darstellt oder eine aliphatische C&sub1;&submin;&sub1;&sub0;-Kette, die eine Sulfitgruppe, eine Amidgruppe, oder eine oder mehrere Hydroxylgruppen enthält. Die Länge von T muß derart sein, daß sie die Hybridisierung von homologen Polynukleotiden nicht wesentlich behindert. Vorzugsweise liegt die Zahl der Kohlenstoffatome in der aliphatischen Kette von T zwischen 2 und 5 (inklusive). A ist eine Abgangsgruppe. Vorzugsweise ist A:
- Das Polynukleotid, welches markiert werden soll, muß zuerst durch die Einführung von einer oder mehreren reaktiven Gruppen, wie z. B. Aminopropyl- oder primären Amingruppen, welche in der Lage sind, mit Acridinestern zu reagieren, funktionalisiert werden. Solche funktionellen Gruppen können an die Nukleotide gebunden werden, welche dann in der chemischen oder enzymatischen Synthese von Polynukleotiden benutzt werden. Alternativ können die funktionellen Gruppen chemisch an bestehende Polynukleotide gebunden werden.
- Basenanaloge, wie z. B. jene, die bei Mock beschrieben werden (USSN734,323, angemeldet am 15.5.85 und PCT/US86/01052, angemeldet am 14.5.86, welche alle Länder der Europäischen Gemeinschaft (EPC countries) benennt - Integrated Genetics), können während der Synthese eines Polynukleotids anstelle der normalen Base eingebaut werden. Sie werden an den Enden der Moleküle eingebaut, an welche nachfolgende Basen wenn nötig angefügt werden können und dienen dazu, eine Aminopropylgruppe einzuführen, an welche ein Acridinester gebunden werden kann.
- Die allgemeine Struktur von solchen Analogen ist unten gezeigt:
- wobei D irgendeine blockierende Gruppe ist, vorzugsweise eine 4,4'-Dimethoxytritylgruppe,
- G eine Gruppe ist, welche eine chemische Bindung an andere Nukleotide ermöglicht, z. B.
- und J eine Gruppe ist, welche mit einem Acridinester reagieren kann. Beispiele für J umfassen:
- Um eine Polynukleotid zu funktionalisieren, müssen die letzten zwei Beispiele (b und c) nach dem Einbau in ein synthetisches Polynukleotid durch eine Base hydrolysiert werden. Solche Reaktionen führen zu der Bildung eines Polynukleotids der Struktur:
- wobei 1 und m gleich 0 sind oder eine positive ganze Zahl und wobei K
- oder
- ist.
- Ein Beispiel für ein solches chemisch synthetisiertes funktionalisiertes Polynukleotid ist eines in welchem ein modifiziertes C-4-Aminopropylcytidin an beiden Enden von einem synthetischen Polynukleotid mit 33 Basenpaaren durch automatisierte Phosphitsynthese eingeführt wurde. Ein solches Polynukleotid hat die Struktur:
- Modifizierte Nukleotidanaloge, die eine reaktive oder eine Aminofunktion haben wie z. B. jene, die unten gezeigt sind, können anstelle von einer normalen triphosphorylierten Nukleotidbase während des Markierens von Polynukleotiden unter Verwendung einer einzel- oder doppelsträngigen Matrize eingeführt werden. Beispiele solcher triphosphorylierten Nukleotide sind:
- wobei X gleich H (für DNA) oder OH ist (für RNA) und 2≤n ≤10 ist.
- Beispiele für solche Enzymverfahren umfassen Nick-Translation von doppelsträngiger DNA unter Verwendung von DNA- Polymerase, mit oder ohne DNAse I, Primer-Verlängerung (primer extension) von einzelsträngiger DNA von einer doppelsträngigen Region ausgehend unter Verwendung von DNA- Polymerase I (Klenow-Fragment), terminales Tailing von DNA mit Deoxytransferase, oder Verwendung von RNA-Polymerase mit Analogen, die 2'- und 3'-Hydroxylgruppen an dem Zuckeranteil haben, und einer einzelsträngigen DNA-Matrize mit einer doppelsträngigen Region (Maniatis et al. (1982.) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Box 100, Cold Spring Harbor, NY).
- Polynukleotide können chemisch durch Alkylierung, hauptsächlich an Adenin- und Cytosinresten, beispielsweise mit BSPSE (Landes, id.) modifiziert werden. Alternativ kann ein vorher markiertes Polynukleotid oder Polylysin kovalent an ein zweites Polynukleotid gebunden werden, beispielsweise unter Verwendung der Carbodiimid-Kupplung (Halloran et al., 1966, Journal of Immunology, 96:373). Das Polylysin kann ebenfalls vor dem Markieren an das 5'-Ende eines Polynukleotids gebunden werden, wie von Ward, EP-PS0063879, beschrieben.
- Ein Polynukleotid, welches mit einer oder mehreren reaktiven primären Amingruppen funktionalisiert wurde, wird leicht mit einem Acridinester markiert, wie in dem folgenden Beispiel gezeigt wird:
- Vor dem Markieren des Polynukleotids wird der Acridinester (23) wie unten gezeigt synthetisiert:
- Acridin-9-carboxylsäure (870 mg) wird zu Thionylchlorid (10 ml) hinzugegeben und die Mischung wird in einem Ölbad unter Rückfluß 3 Stunden lang erhitzt. Die Reaktionsmischung wird in einem Rotationsverdampfer im Vakuum verdampft und der trockene Rückstand wird unter Erwärmung unterhalb von 60ºC in wasserfreiem Pyridin (50 ml) wieder gelöst. Diese Lösung wird in einem Wasserbad auf ungefähr 20ºC abgekühlt p-Hydroxyphenylpropionsäure-n-hydroxysuccinimidester (1 g) wird in wasserfreiem Pyridin (10 ml) gelöst und unter Rühren zu der obigen Acridin-9-carboxylchlorid-Pyridin-Lösung zugegeben. Die Reaktionsmischung wird ungefähr 30 Minuten lang bei 15-30ºC gerührt und dann unter Rühren in Eiswasser (250 ml) gegossen. Diese Mischung wird in einen Scheidetrichter überführt und mit Ethylacetat (250 ml) extrahiert. Die organische Phase wird abgetrennt, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum verdampft. Der Rückstand wird dreimal aus wasserfreiem Toluol (50 ml) verdampft und wieder in wasserfreiem Dimethoxyethan (50 ml) gelöst. Die resultierende Lösung wird ungefähr 15 Stunden lang bei 15-30ºC in einen lichtgeschützten Behälter gestellt. Jeglicher Niederschlag, der sich während dieser Inkubation gebildet hat, wird abfiltriert und die Lösung wird auf eine Kieselgelsäule (300 Gramm) aufgetragen und durch Schnell-Chromatographie (flash chromatography) gereinigt (W.C. Still et al., Journal (General) of Organic Chemistry (1978), Vol. 43, 2923) mit einer Lösung von Ethylacetat und Hexan (2 : 1) als einem Elutionslösungsmittel. Saubere Fraktionen werden vereinigt und durch einen 47 mm 0,45 pm Teflonfilter filtriert und im Vakuum verdampft. Die Ausbeute beträgt ungefähr 36%. Dieses wird in wasserfreiem Chloroform (25 ml) wieder gelöst und Methylfluorosulfonat (1,1 ml) wird zu der Mischung zugegeben, welche bei 15-30ºC ungefähr 20 Stunden lang gerührt wird. Der gebildete Niederschlag wird abfiltriert und dreimal mit wasserfreiem Toluol und zweimal mit Dimethoxyethan gewaschen. Die getrockneten Kristalle werden wasserfrei und lichtgeschützt bei -20ºC gelagert. Die Endausbeute beträgt ungefähr 556 mg an reinem Acridinester (23).
- 100 ug funktionalisierte DNA (ein Polynukleotid mit 33 Basenpaaren, funktionalisiert mit primären Amingruppen an beiden Enden, wie in Struktur (22) gezeigt) wird mit Wasser (190 ul), NaCl (10 ul einer 5M Lösung) und NaHCO&sub3; (25 ul einer 5%igen Lösung) gemischt. Acridinester (23) (8,3 ul einer 60 uM Stammlösung in Dimethylformamid) wird nach 0, 10 und 20 Minuten zugegeben.
- Nach weiteren 10 Minuten wird Citrat (500 Ml einer 100 mM Lösung, pH 5,5), welches NaCl (200 mM) enthält zugegeben. Das resultierende markierte Polynukleotid wird über eine Sephadex-G25-Säule gereinigt, die mit Citrat (100 mM, pH 6), welches NaCl (200 mM) enthält, equilibriert ist.
- Dieses Verfahren führt zu einem Polynukleotid der Struktur:
- Polynukleotid-Kette
- Polynukleotide in Proben, die getestet werden sollen, werden normalerweise durch Standardtechniken an Nitrocellulosefilter gebunden und dann wie folgt hybridisiert:
- Die Filter werden 2 Stunden lang bei 48ºC unter Verwendung von 100 ul Vorhybridisierungspuffer pro Kubikzentimeter des Filters vorhybridisiert und dann in einem Puffer, der eine mit Acridinester markierte Oligomerprobe (50 ng pro ml) enthält 2 Stunden lang bei 48ºC entweder mit oder ohne Methoxyphenazinmethylsulfat als Blocker hybridisiert. Die Vorhybridisierungs- und Hybridisierungspuffer bestehen aus Tetramethylammoniumchlorid (0,9 M), Natriumcitrat (50 mM.) Denharts-Lösung (5X), SDS (0,1%), Natriumpyrophosphat (0,1%) und E. coli tRNA (2 ul pro ml einer 50 mg/ml Stammlösung). Die Filter werden dann bei 15-30ºC in Tetramethylammoniumchlorid (0,9 M), welches Natriumcitrat (100 mM, pH 6,5) enthält, viermal für fünf Minuten gewaschen. Die Stellen an denen die Polynukleotide gebunden wurden, werden dann ausgeschnitten und mit Natriumacetat (50 ml von 10 mM, pH 4,75) behandelt, welches sich in 12·47 mm Polystyrolröhrchen befindet. Proben werden auf ein Chemolumineszenzsignal (Peakflächenintegrationsmodus) hin in einem Berthold 9500T Photonenzähler gemessen, unter Verwendung von NaOH (100 ml von 0,1 M), welches Wasserstoffperoxid (0,1%) enthält, als Injektionsmittel. Die erhaltenen Werte werden mit jenen verglichen, die von Filtern erhalten wurden, die keine Polynukleotide enthielten. Das Blockerreagens verhindert unspezifische Bindung.
- Weitere Ausführungsformen sind in der folgenden Ansprüchen enthalten.
Claims (9)
1. Verfahren zur Herstellung eines nicht mit Isotopen
markierten Nucleotids oder Polynucleotids, umfassend das
Zusammenbringen des Nucleotids oder Polynucleotids mit
einer Base, die in C&sub4;-Stellung bei Pyrimidin oder C&sub6;-
Stellung bei Purin eine funktionelle Gruppe aufweist,
die mit einem Acridinester reagieren kann, und das
Binden des Acridinesters an die funktionelle Gruppe.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Acridinester die
Struktur
aufweist, wobei T eine gesättigte oder ungesättigte
aliphatische C&sub1;&submin;&sub1;&sub0;-Kette, eine aliphatische C&sub1;&submin;&sub1;&sub0;-Kette mit
einer Sulfitgruppe, eine aliphatische C&sub1;&submin;&sub1;&sub0;-Kette mit
einer Amidgruppe, eine aliphatische C&sub1;&submin;&sub1;&sub0;-Kette mit
einer oder mehreren Hydroxygruppen bedeutet und A eine
Abgangsgruppe ist.
3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Einheit A die
Struktur
aufweist.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, umfassend
die chemische Modifizierung des Nucleotids oder
Polynucleotids und Bindung des Acridinesters an das
modifizierte Nucleotid oder modifizierte Polynucleotid.
5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Modifizierung die
Alkylierung einer Base des Nucleotids oder
Polynucleotids umfaßt.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die
funktionelle Gruppe eine Amingruppe oder eine
Aminopropylgruppe ist.
7. Nucleotid oder Polynucleotid, markiert mit einem
Acridinester, wobei der Acridinester an eine Base über eine
funktionelle Gruppe an C&sub4;-Stellung einer Pyrimidinbase
oder an C&sub6;-Stellung einer Purinbase gebunden ist und die
Gruppe mit einem Acridinester reagieren kann.
8. Nucleotid oder Polynucleotid nach Anspruch 7, wobei der
Acridinester chemisch an eine Amingruppe des Nucleotids
oder Polynucleotids gebunden ist.
9. Nucleotid oder Polynucleotid nach Anspruch 8, wobei die
Aminogruppe in das Nucleotid oder Polynucleotid durch
chemische oder enzymatische Anbindung eines weiteren
Nucleotids oder eines weiteren Polynucleotids, welche
die Aminogruppe enthalten, eingeführt wird.
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