DE3280478T2

DE3280478T2 - Basenmodifizierte Oligo- und Polynucleotide und Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung

Info

Publication number: DE3280478T2
Application number: DE3280478T
Authority: DE
Inventors: Pennina R. Monsey Ny 10952 Langer; Alexander A. Iii Charlottesville Va 22901 Waldrop; David C. Guilford Ct 06437 Ward
Original assignee: Yale University
Current assignee: Yale University
Priority date: 1981-04-17
Filing date: 1982-04-06
Publication date: 1999-02-18
Anticipated expiration: 2002-04-07
Also published as: JPH0694474B2; JPH03261798A; DE3280478D1; IL65447A0; JPH1033199A; JPS57209297A; EP0063879A3; JP3279502B2; DK164407B; JPH1052271A; ATE167189T1; EP0063879B1; JPH0880B2; JPH0375559B2; DK171382A; IL65447A; AU560651B2; DK46797A; DK160591A; JP3279503B2

Description

In der biomedizinischen Forschung und in der DNA-Rekombinationstechnik ist man bei vielen Verfahren auf die Verwendung von Nucleotid- oder Polynucleotidderivaten angewiesen, die mit Isotopen von Wasserstoff (³H), Phosphor (³²P), Kohlenstoff (¹&sup4;C) oder Iod (¹²&sup5;I) radioaktiv markiert sind. Mit Hilfe solcher radioaktiven Verbindungen, die als Indikatorsonden dienen, können Nucleinsäuren und andere Moleküle von wissenschaftlichem oder klinischem Interesse bestimmt, überwacht, lokalisiert oder isoliert werden, auch wenn sie nur in extrem kleinen Mengen vorliegen. Bisher waren radioaktive Stoffe die empfindlichsten und in den meisten Fällen die einzigen Mittel, mit denen viele wichtige experimentelle oder analytische Tests durchgeführt werden konnten. Im Zusammenhang mit der Verwendung von radioaktiven Verbindungen gibt es jedoch wichtige Beschränkungen und Nachteile. Erstens, da das Personal, das mit dem radioaktiven Material arbeitet, mit einer möglicherweise gefährlichen Strahlung in Kontakt kommen kann, müssen während der Herstellung, Verwendung und Entsorgung der Radioisotopen entsprechende Sicherheitsvorkehrungen getroffen werden. Zweitens sind radioaktive Nucleotide im Einkauf und in der Verwendung extrem teuer, was größtenteils auf die Kosten für Ausstattung und Personal, die zur Gewährleistung ausreichender Sicherheitsmaßnahmen erforderlich sind, für Dienste zur Gesundheitsüberwachung beim Hersteller und Anwender und für Programme zur Entsorgung zurückzuführen ist. Drittens sind die radioaktiven Stoffe häufig sehr instabil und haben eine begrenzte Lagerbeständigkeit, was die Kosten für die Verwendung solcher Stoffe weiter in die Höhe treibt. Diese Instabilität ergibt sich aus der radiolytische Zersetzung, die auf den mit dem Zerfall des Radioisotops selbst zusammenhängenden zerstörenden Effekten beruht, und aus der Tatsache, daß viele Isotope (z. B. ³²P und ¹²&sup5;I) Halbwertszeiten von nur wenigen Tagen haben.
Es ist bekannt, daß Haptene sich mit Antikörpern verbinden können, daß sie jedoch nur dann eine Immunantwort auslösen können, wenn sie an einen Träger gebunden sind. Diese Eigenschaft kann für Nachweis- und Identifizierungs-Tests genutzt werden.
Außerdem ist bekannt, daß Biotin und Iminobiotin stark mit Avidin interagieren, einem Glykoprotein von 68 000 Dalton aus Eiklar. Diese Wechselwirkung weist eine der höchsten nicht-kovalenten Bindungskonstanten auf (Kdis = 10&supmin;¹&sup5;), die in der Natur vorkommen. Wenn Avidin an nachweisbare Indikatormoleküle gekoppelt wird, einschließlich fluoreszierende Farbstoffe, z. B. Fluorescein oder Rhodamin, elektronendichte Reagenzien, z. B. Ferritin, Hämocyanin oder kolloidales Gold, oder Enzyme, die befähigt sind, unlösliche Reaktionsprodukte zu erzeugen, z. B. Peroxidase oder alkalische Phosphatase, kann das Vorliegen, die Lage oder die Menge einer Biotin-Sonde festgestellt werden. Obwohl Iminobiotin an Avidin weniger fest bindet als Biotin, können für seinen Nachweis ähnliche Reaktionen verwendet werden. Darüberhinaus bietet die Umkehrbarkeit der Iminobiotin-Avidin-Wechselwirkung, durch Senkung des pH-Wertes der Lösung, in bestimmten Anwendungsbereichen signifikante Vorteile.
Die Spezifität und die Festigkeit des Biotin-Avidin-Komplexes wurden in den letzten Jahren bei der Entwicklung von Verfahren genutzt, mit denen spezifische Proteine, Lipide oder Kohlenhydrate auf oder innerhalb von Zellen visuell lokalisiert werden können (Übersicht von E. A. Bayer und M. Wilchek in Methods of Biochemical Analysis 26 (1980), 1). Die chromosomale Lokalisierung von RNA erfolgte mittels Elektronenmikroskopie, wobei ein biotinyliertes Protein, Cytochrom c, chemisch vernetzt mit RNA, als Hybridisierungssonde verwendet wurde. Die Stelle der Hybridisierung wurde mittels Bindung von Avidin-Ferritin oder Avidin-Methacrylatkügelchen sichtbar ge macht, die durch die Avidin-Biotin-Wechselwirkung vermittelt wurde, (J. E. Manning, N. D. Hershey, T. R. Broker, M. Pellegrini, H. K. Mitchell und N. Davidson, Chromosoma 53 (1975), 107; J. E. Manning, M. Pellegrini und N. Davidson, Biochemistry 61 (1977), 1364; T. R. Broker, L. M. Angerer, P. H. Yen, N. D. Hershey und N. Davidson, Nucleic Acid Res. 5 (1978), 363; A. Sodja und N. Davidson, Nucleic Acid Res. 5 (1978), 383). Diese Vorgehensweise zum Nachweis von Polynucleotidsequenzen, die zwar in den untersuchten spezialisierten Fällen erfolgreich ist, wobei es sich um Sequenzen mit vielen Wiederholungen handelt, ist für die Analyse von Polynucleotiden, die in einer einzigen oder in einer geringen Kopienzahl vorliegen, jedoch nicht allgemein anwendbar.
Außerdem sind Verfahren bekannt, mit denen chemische Reste an Pyrimidin- und Purinringe angehängt werden können. Vor mehreren Jahren wurde eine einfache und schnelle Acetoxy-Mercurierungsreaktion entwickelt, mit der kovalent gebundene Quecksilberatome in die Position 5 des Pyrimidinrings, die Position C-8 des Purinrings oder die Position C-7 eines 7-Desazapurinrings, sowohl in Nucleotiden als auch in Polynucleotiden, eingeführt werden können (R. M. K. Dale, D. C. Livingston und D. C. Ward, Proc. Natl. Acad. Sci USA 70 (1973), 2238 R. M. K. Dale, E. Martin, D. C. Livingston und D. C. Ward, Biochemistry 14 (1975), 2447). Außerdem wurde vor mehreren Jahren gezeigt, daß Quecksilber-organische Verbindungen in Gegenwart von Palladium-Katalysatoren mit olefinischen Verbindungen reagieren, so daß Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen erzeugt werden (R. F. Heck, J. Am. Chem. Soc. 90 (1968), 5518; R. F. Heck, ibid. 90 (1968), 5526; R. F. Heck, ibid. 90 (1968), 5531; R. F. Heck, ibid. 90 (1968), 5535; und R. F. Heck, J. Am. Chem. Soc. 91 (1969), 6707). Bergstrom und Mitarbeiter (J. L. Ruth und D. E. Bergstrom, J. Org. Chem. 43 (1978), 2870; und D. E. Bergstrom und M. K. Ogawa, J. Am. Chem. Soc. 100 (1978), 8106) und Bigge et al. (C. F. Bigge, P. Kalaritis, J. R. Deck und M. P. Mertes, J. Am. Chem. Soc. 102 (1980), 2033) haben kürzlich dieses Reaktionsschema in der Synthese von C-5- substituierten Pyrimidin-Nucleotidverbindungen angewendet.
Schließlich ist bekannt, daß Antikörper, die für modifizierte Nucleotide spezifisch sind, hergestellt und verwendet werden können, um spezifische Bestandteile der modifizierten Nucleotide zu isolieren und zu charakterisieren (T. W. Munns und M. K. Liszewski, Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology 24 (1980), 109). Jedoch konnte für keinen der bisher gegen natürlich vorkommende Nucleotide hergestellten Antikörper gezeigt werden, daß er mit seiner Nucleotid-Determinante reagiert, wenn sie in einer doppelsträngigen RNA oder DNA-Duplex oder in DNA-RNA-Hybridmolekülen vorliegt.
Um die Beschränkungen der radioaktiv markierten Sonden und der bisher verwendeten chemischen oder biologischen Sonden zu umgehen, wurden verschiedene neue Nucleotidderivate synthetisiert, die Biotin, Iminobiotin, Liponsäure und andere Determinanten enthalten, die kovalent am Pyrimidin- oder Purinring gebunden sind. Diese Nucleotidderivate, und auch sie enthaltende Polynucleotide und Coenzyme interagieren spezifisch und eindeutig mit Proteinen, wie z. B. Avidin oder Antikörpern. Die Wechselwirkung zwischen modifizierten Nucleotiden und spezifischen Proteinen kann in vielen Verfahren, die zur Zeit in der biomedizinischen oder der DNA-Rekombinationstechnik verwendet werden, zum Nachweis und zur Lokalisierung von Nucleinsäurekomponenten als Alternative zu Radioisotopen eingesetzt werden. Verfahren, bei denen diese Wechselwirkungen zwischen modifizierten Nucleotiden und Proteinen eingesetzt werden, zeigen Nachweiskapazitäten, die gleich sind oder die größer sind als die von Verfahren, bei denen Radioisotope eingesetzt werden, und sie können häufig rascher und mit einer größeren Auflösung durchgeführt werden.
Diese neuen Nucleotidderivate können durch chemische Verfahren relativ billig hergestellt werden, wobei diese Verfahren entwickelt und standardisiert wurden, wie nachstehend ausführlicher beschrieben. Insbesondere können die Verbindungen, da weder die erfindungsgemäßen Nucleotidsonden noch die mit ihnen zusammen eingesetzten Proteinreagenzien radioaktiv sind, hergestellt, verwendet und entsorgt werden, ohne daß die für Radioisotope erforderlichen Sicherheitsvorkehrungen getroffen werden müssen. Darüberhinaus sind diese Nucleotidderi vate chemisch stabil und weisen voraussichtlich funktionelle Lagerbeständigkeiten von mehreren Jahren oder länger auf. Schließlich erlauben diese Verbindungen die Entwicklung von Verfahren für Forschung und Diagnose, die sicherer, wirtschaftlicher, schneller und besser reproduzierbar sind.
Diese Erfindung betrifft Ribose- und 2-Desoxyriboseverbindungen der allgemeinen Formel
wobei B einen 7-Desazapurin- oder einen Pyrimidinrest darstellt, der an der Position C1' des Zuckerrestes kovalent gebunden ist, mit der Maßgabe, daß, wenn B ein 7-Desazapurin ist, der Zuckerrest an der Position N&sup9; des Desazapurins angelagert ist, und wenn B ein Pyrimidin ist, der Zuckerrest an der Position N¹ des Pyrimidins angelagert ist;
wobei A einen Liganden bedeutet, der mindestens drei Kohlenstoffatome enthält;
wobei die gepunktete Linie eine Bindungsgruppe darstellt, die B und A verbindet, wobei die Bindungsgruppe Kohlenstoff- Kohlenstoff-Einfachbindungen, Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindungen, Kohlenstoff-Stickstoff-Einfachbindungen oder Kohlenstoff-Sauerstoff-Einfachbindungen umfaßt, mit der Maßgabe, daß, wenn B ein 7-Desazapurin ist, die Bindungsgruppe an der Position 7 des Desazapurins angelagert ist, und wenn B ein Pyrimidin ist, die Bindungsgruppe an der Position 5 des Pyrimidins angelagert ist;
wobei x einen Rest darstellt, der aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist
wobei z eine Hydroxylgruppe oder ein Wasserstoffatom bedeutet.
Die Ansprüche 2 bis 44 betreffen weitere Ausführungsformen der Erfindung.
Diese Verbindungen können durch ein Verfahren hergestellt werden, das die folgenden Schritte umfaßt:
(a) Umsetzung einer Verbindung der Struktur
mit einem Quecksilbersalz in einem geeigneten Lösungsmittel unter geeigneten Bedingungen, so daß eine mercurierte Verbindung der Struktur
erzeugt wird;
(b) Umsetzung der mercurierten Verbindung mit einem chemischen Rest, der mit der -Hg&spplus;-Einheit der mercurierten Verbindung reagiert und durch die Formel ···N dargestellt ist, wobei die Umsetzung in einem wäßrigen Lösungsmittel und in Gegenwart von K&sub2;PdCl&sub4; unter geeigneten Bedingungen durchgeführt wird, so daß eine Verbindung der Struktur
erzeugt wird, wobei N einen reaktiven terminalen funktionellen Rest darstellt oder A ist; und
(c) Gewinnung der Verbindung als das modifizierte Nucleotid, wenn N A ist, oder, wenn N einen reaktiven terminalen Rest bedeutet, Umsetzung der Verbindung mit einer Verbindung der Struktur M-A, wobei M einen funktionellen Rest darstellt, der in einem wäßrigen Lösungsmittel unter geeigneten Bedingungen mit N reagiert, so daß das modifizierte Nucleotid erzeugt wird, das anschließend gewonnen wird.
Diese Erfindung stellt außerdem Verbindungen der folgenden Struktur bereit,
wobei B, B' und B" jeweils einen Purin-, 7-Desazapurin- oder Pyrimidinrest darstellen, der an der Position C1' des Zuckerrestes kovalent gebunden ist, mit der Maßgabe, daß, wenn B, B' oder B" ein Purin oder 7-Desazapurin darstellt, er an der Position N&sup9; des Purins oder des 7-Desazapurins angelagert ist, und wenn B, B' oder B" ein Pyrimidin darstellt, er an der Position N¹ angelagert ist;
wobei A einen Rest darstellt, der aus mindestens drei Kohlenstoffatomen besteht und der befähigt ist, zusammen mit einem Polypeptid einen nachweisbaren Komplex zu erzeugen, wenn die Verbindung in eine doppelsträngige Duplex eingebaut ist, die mit einem komplementären Ribonucleinsäure- oder Desoxyribonucleinsäuremolekül erzeugt wird;
wobei die gepunktete Linie eine chemische Bindung darstellt, die B und A verbindet, mit der Maßgabe, daß, wenn B ein Purin ist, die Bindung an der Position 8 des Purins angelagert ist, wenn B ein 7-Desazapurin ist, die Bindung an der Position 7 des Desazapurins angelagert ist, und wenn B ein Pyrimidin ist, die Bindung an der Position 5 des Pyrimidins angelagert ist;
wobei z ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxylgruppe bedeutet; und
wobei m und n Zahlen von 0 bis etwa 100 000 darstellen. Diese Verbindungen können durch enzymatische Polymerisation eines Nucleotidgemisches hergestellt werden, das die modifizierten Nucleotide der vorliegenden Erfindung umfaßt. In einer anderen Ausführungsform können die in Oligo- oder Polynucleotiden vorliegenden Nucleotide unter Verwendung chemischer Verfahren modifiziert werden.
Nucleotide, die gemäß der Durchführung der vorliegenden Erfindung modifiziert wurden, und Oligo- und Polynucleotide, in die die modifizierten Nucleotide eingebaut wurden, können in der biomedizinischen Forschung, der klinischen Diagnose und der DNA-Rekombinationstechnik als Sonden verwendet werden. Alle diese verschiedenen Anwendungen beruhen auf der Fähigkeit der Moleküle, mit Polypeptiden stabile Komplexe zu erzeugen, die ihrerseits nachgewiesen werden können, entweder anhand von Eigenschaften, die für das Polypeptid charakteristisch sind, oder anhand von nachweisbaren Resten, die mit dem Polypeptid verknüpft sind oder mit ihm interagieren.
Einige Anwendungen umfassen den Nachweis und die Identifizierung von Nucleinsäure-enthaltenden Krankheitserregern, z. B. Bakterien und Viren; das Absuchen von Bakterien auf Antibiotikaresistenz; die Diagnose von genetischen Störungen, z. B. Thalassämie und Sichelzellenanämie; die Chromosomen-Karyotypisierung; und die Identifizierung von Tumorzellen.
Mehrere essentielle Kriterien müssen erfüllt werden, daß ein modifiziertes Nucleotid als Ersatz für eine radioaktiv markierte Form eines natürlich vorkommenden Nucleotids allgemein geeignet ist. Erstens muß die modifizierte Verbindung einen Substituenten oder eine Sonde enthalten, der/die einmalig ist, d. h. er/sie kommt in Verbindung mit Nucleotiden oder Polynucleotiden normalerweise nicht vor. Zweitens muß die Sonde spezifisch mit chemischen oder biologischen Reagenzien reagieren, so daß ein empfindliches Nachweissystem erhalten wird. Drittens müssen die Analoga relativ effektive Substrate für üblicherweise verwendete Nucleinsäureenzyme sein, da es für zahlreiche praktische Anwendungen erforderlich ist, daß das Analogon enzymatisch metabolisiert wird, z. B. müssen die Analoga als Substrate für Nucleinsäurepolymerasen dienen können. Für diesen Zweck sollten die Sondeneinheiten nicht an Ringpositionen plaziert werden, die das normale Watson-Crick-Wasserstoff-Bindungspotential der Basen auf sterische Weise oder auf andere Art und Weise beeinflussen. Ansonsten würden die Substituenten Verbindungen ergeben, die nicht mehr als Polymerase-Substrate aktiv sind. Auch die Substitution an den Ringpositionen muß vermieden werden, die eine Veränderung der normalen "Anti"-Nucleosidkonformation bewirkt, da solche Konformationsänderungen normalerweise dazu führen, daß die Nucleotidderivate nicht mehr als Polymerase-Substrate dienen können. Durch solche Überlegungen kommt man normalerweise zu dem Ergebnis, daß eine Substitution nur an der Position 5 eines Pyrimidins und an der Position 7 eines Purins oder eines 7-Desazapurins erfolgen kann.
Viertens sollte das Nachweissystem in der Lage sein, mit Sondensubstituenten zu interagieren, die sowohl in einzelsträngige als auch doppelsträngige Polynucleotide eingebaut sein können, damit das Nachweissystem mit Verfahren der Nucleinsäurehybridisierung kompatibel ist. Um dieses Kriterium zu erfüllen, wird die Sondeneinheit mit dem Purin oder Pyrimidin vorzugsweise über eine chemische Bindung oder einen "Linkerarm" verknüpft, so daß sie leicht mit Antikörpern, anderen Nachweisproteinen oder chemischen Reagenzien reagieren kann.
Fünftens sollten die physikalischen und biochemischen Eigenschaften der Polynucleotide, die kleine Mengen der Sondensubstituenten enthalten, nicht signifikant verändert werden, so daß die herkömmlichen Verfahren, bei denen radioaktive Hybridisierungssonden eingesetzt werden, nicht entscheidend modifiziert werden müssen. Dieses Kriterium muß erfüllt werden, gleichgültig ob die Sonde auf enzymatischem oder auf direktem chemischem Weg eingeführt wird.
Schließlich sollte die Bindung, mit der die Sondeneinheit angelagert wird, alle experimentellen Bedingungen überstehen, denen normale Nucleotide und Polynucleotide in der Praxis ausgesetzt werden, z. B. verlängerte Hybridisierungszeiten bei erhöhten Temperaturen, Extraktion mit Phenol und organischen Lösungsmitteln, Elektrophorese usw..
Alle diese Kriterien werden durch die hier beschriebenen modifizierten Nucleotide erfüllt.
Diese modifizierten Nucleotide haben die folgenden Struktur
wobei B einen Purin-, 7-Desazapurin- oder Pyrimidinrest darstellt, der an der Position C1' des Zuckerrestes kovalent gebunden ist, mit der Maßgabe, daß, wenn B ein Purin oder 7- Desazapurin ist, er an der Position N&sup9; des Purins oder 7-Desazapurins angelagert ist, und wenn B ein Pyrimidin ist, er an der Position N¹ angelagert ist;
wobei A einen Rest bedeutet, der mindestens aus drei Kohlenstoffatomen besteht und der befähigt ist, mit einem Polypeptid einen nachweisbaren Komplex zu erzeugen, wenn die Verbindung in eine doppelsträngige Ribonucleinsäure, Desoxyribonucleinsäure-Duplex oder ein DNA-RNA-Hybrid eingebaut ist;
wobei die gepunktete Linie eine Bindungsgruppe darstellt, die B und A verbindet, mit der Maßgabe, daß, wenn B ein Purin ist, die Bindung an der Position 8 des Purins angelagert ist, wenn B ein 7-Desazapurin ist, die Bindung an der Position 7 des Desazapurins angelagert ist, und wenn B ein Pyrimidin ist, die Bindung an der Position 5 des Pyrimidins angelagert ist; und
wobei x, y und z jeweils eine der folgenden Gruppen bedeuten
Diese Verbindungen sind als Sonden in der biomedizinischen Forschung und in der DNA-Rekombinationstechnik vielseitig anwendbar.
Obwohl im Prinzip alle Verbindungen, die mit dieser Strukturformel abgedeckt werden, gemäß der Durchführung der vorliegenden Erfindung hergestellt und verwendet werden können, können bestimmte Verbindungen einfacher hergestellt oder/und verwendet werden und sind deshalb hier bevorzugt.
Obwohl prizipiell Purine, Pyrimidine und 7-Desazapurine nützlich sind, sind Pyrimidine und 7-Desazapurine bevorzugt, da eine Purinsubstitution an der Position 8 möglicherweise dazu führt, daß die Nucleotide nicht mehr als Polymerase-Substrate dienen können. Deshalb sind modifizierte Purine zwar in bestimmter Hinsicht nützlich, im allgemeinen sind sie jedoch nicht so nützlich wie Pyrimidine und 7-Desazapurine. Außerdem dürfen die Pyrimidine und 7-Desazapurine, die in dieser Erfindung verwendet werden können, von Natur aus nicht an den Positionen 5 bzw. 7 substituiert sein. Folglich können bestimmte Basen, wie z. B. Thymin, 5-Methylcytosin und 5-Hydroxymethylcytosin, nicht verwendet werden. Zur Zeit bevorzugte Basen sind Cytosin, Uracil, Desazaadenin und Desazaguanin.
A kann ein beliebiger Rest sein, der mindestens drei Kohlenstoffatome aufweist und befähigt ist, zusammen mit einem Polypeptid einen nachweisbaren Komplex zu erzeugen, wenn das modifizierte Nucleotid in eine doppelsträngige Duplex eingebaut ist, die entweder Desoxyribonucleinsäure oder Ribonucleinsäure umfaßt.
A kann somit einen Liganden darstellen, der diese Eigenschaften besitzt, umfassend Haptene, die nur immunogen sind, wenn sie an einen geeigneten Träger gekoppelt sind, die jedoch befähigt sind, mit geeigneten Antikörpern zu interagieren, so daß Komplexe erzeugt werden.
Beispiele von Resten, die verwendet werden können, umfassen
Von diesen Resten sind für A Biotin und Iminobiotin bevorzugt.
Da aromatische Reste dazu neigen, sich in eine helikale Struktur aus gepaarten Basen einzulagern, ist ferner der Rest A vorzugsweise nicht aromatisch. Da außerdem kleinere Reste möglicherweise keine ausreichende molekulare Wechselwirkung mit den Polypeptiden zeigen, ist ein Rest A bevorzugt, der mindestens C&sub5; aufweist, so daß eine ausreichende Wechselwir kung stattfinden kann und stabile Komplexe erzeugt werden können. Biotin und Iminobiotin erfüllen diese beiden Kriterien.
Die Bindung oder die Gruppe, die den Rest A mit der Base B verbindet, kann eine der bekannten Bindungen umfassen, einschließlich Kohlenstoff-Kohlenstoff-Einfachbindungen, Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindungen, Kohlenstoff-Stickstoff-Einfachbindungen oder Kohlenstoff-Sauerstoff-Einfachbindungen. Jedoch ist es im allgemeinen bevorzugt, daß die chemische Bindung eine olefinische Bindung an der α-Position, bezogen auf B, umfaßt. Das Vorliegen einer solchen α-olefinischen Bindung dient dazu, den Rest A von der Base fernzuhalten, wenn die Base mit einer anderen Base in der wohlbekannten Doppelhelix- Konfiguration gepaart ist. Hierdurch wird bewirkt, daß die Wechselwirkung mit einem Polypeptid einfacher stattfinden kann, wodurch die Komplexbildung erleichtert wird. Darüberhinaus kann es bei Einfachbindungen mit größerer Rotationsfreiheit vorkommen, daß der Rest nicht immer so weit von der Helix weggehalten wird, daß die Erkennung durch das Polypeptid und die Komplexbildung mit dem Polypeptid erfolgen kann.
Es ist noch stärker bevorzugt, daß die chemische Bindungsgruppe von einem primären Amin stammt und die Struktur -CH&sub2;-NH- aufweist, da solche Bindungen einfach unter Einsatz einer bekannten Amin-Modifikationsreaktion geknüpft werden können. Beispiele bevorzugter Bindungen, die aus Allylamin- und Allyl-(3-amino-2-hydroxy-1-propyl)ether-Gruppen hergeleitet sind, haben die Formel
-CH=CH-CH&sub2;-NH- bzw.
Obwohl diese Bindungen bevorzugt sind, können auch andere eingesetzt werden, umfassend insbesondere Olefin-Linkerarme mit anderen modifizierbaren Funktionalitäten, wie z. B. Thiol-, Carbonsäure- und Epoxid-Funktionalitäten.
Die Bindungsgruppen werden an spezifischen Positionen angelagert, nämlich an der Position 5 eines Pyrimidins, der Position 8 eines Purins oder der Position 7 eines Desazapurins. Wie vorher angegeben, ergibt eine Substitution an der Position 8 eines Purins kein modifiziertes Nucleotid, das in allen hier beschriebenen Verfahren verwendet werden kann. Möglicherweise ist die Position 7 eines Purins, die durch ein Stickstoffatom besetzt ist, die geeignete Stelle für eine Knüpfung der Bindung. Jedoch sind die Verfahren zur chemischen Substitution, die bis jetzt verwendet werden und die hier diskutiert werden, für diesen Zweck nicht geeignet.
Die Buchstaben x, y und z stellen Gruppen dar, die an den Positionen 5', 3' und 2' des Zuckerrestes angelagert sind. Sie können eine der folgenden Gruppen sein
Obwohl es denkbar ist, ist es unwahrscheinlich, daß x, y und z alle gleichzeitig den gleichen Rest darstellen. Mit größerer Wahrscheinlichkeit ist mindestens einer der Reste x, y und z ein Phosphat-enthaltender Rest, entweder ein Mono-, Di- oder Triphosphat, und mindestens einer der Reste ist eine Hydroxylgruppe oder ein Wasserstoffatom. Wie leicht zu verstehen ist, wird z mit größter Wahrscheinlichkeit eine Hydroxylgruppe oder ein Wasserstoffatom darstellen, was auf ein Ribonucleotid bzw. Desoxyribonucleotid hinweist. Die Beispiele solcher Nucleotide umfassen 5'-Ribonucleosidmonophosphate, 5'-Ribonucleosiddiphosphate, 5'-Ribonucleosidtriphosphate, 5'-Desoxyribonucleosidmonophosphate, 5'-Desoxyribonucleosiddiphosphate, 5'- Desoxyribonucleosidtriphosphate, 5'p-Ribonucleosid-3'p und 5'p-Desoxyribonucleosid-3'p. Spezifischere Beispiele umfassen modifizierte Nucleotide dieses Typs, wobei A Biotin oder Iminobiotin darstellt, die chemische Bindung über die Gruppe -CH=CH-CH&sub2;-NH- oder
und B Uracil oder Cytosin bedeutet.
Die allgemeine synthetische Vorgehensweise, die zur Einführung des Linkerarms und der Sondeneinheit an die Base verwendet wird, wird vorstehend diskutiert (vgl. insbesondere J. L. Ruth und D. E. Bergstrom, J. Org. Chem. 43 (1978), 2870; D. E. Bergstrom, M. K. Ogawa, J. Amer. Chem. Soc. 100 (1978), 8106; und C. F. Bigge, P. Kalaritis, J. R. Deck und M. P. Mer tes, J. Amer. Chem. Soc. 102 (1980), 2033). Jedoch wurden die hier eingesetzten Olefin-Substituenten bisher noch nicht verwendet. Um die Anlagerung von Sondeneinheit A zu erleichtern, erwies es sich als besonders wünschenswert, Olefine mit funktionellen primären Aminresten einzusetzen, wie z. B. Allylamin [AA] oder Allyl-(3-amino-2-hydroxy-1-propyl)ether [NAGE], wodurch die Sondenanlagerung mittels herkömmlicher Amin-Modifikationsreaktionen erfolgen kann, wie z. B.
Aufgrund der einfachen Herstellung erwies es sich als vorteilhaft, für die Sonden-Addition NHS-Ester zu verwenden. Jedoch können auch Olefin-Linkerarme mit anderen modifizierba ren funktionellen Gruppen, wie z. B. Thiole, Carbonsäuren, Epoxide und dergleichen, eingesetzt werden. Außerdem können sowohl Linkerarm als auch Sonde in einem einzigen Schritt zugegeben werden, sofern dies wünschenswert ist.
Insbesondere modifizierte Nucleotide der folgenden Struktur
wobei B einen Purin-, 7-Desazapurin- oder Pyrimidinrest darstellt, der an der Position C1' des Zuckerrestes kovalent gebunden ist, mit der Maßgabe, daß, wenn B ein Purin oder ein 7-Desazapurin ist, er an der Position N&sup9; des Purins oder des 7-Desazapurins angelagert ist, und wenn B ein Pyrimidin ist, er an der Position N¹ angelagert ist;
wobei A einen Rest bedeutet, der mindestens aus drei Kohlenstoffatomen besteht und der befähigt ist, mit einem Polypeptid einen nachweisbaren Komplex zu erzeugen, wenn die Verbindung in eine doppelsträngige Ribonucleinsäure, Desoxyribonucleinsäure-Duplex oder ein DNA-RNA-Hybrid eingebaut ist;
wobei die gepunktete Linie eine chemische Bindung darstellt, die B und A verbindet, mit der Maßgabe, daß, wenn B ein Purin ist, die Bindung an der Position 8 des Purins angelagert ist, wenn B ein 7-Desazapurin ist, die Bindung an der Position 7 des Desazapurins angelagert ist, und wenn B ein Pyrimidin ist, die Bindung an der Position 5 des Pyrimidins angelagert ist; und
wobei x, y und z jeweils eine der folgenden Gruppen bedeuten
können hergestellt werden durch
(a) Umsetzung einer Verbindung der Struktur
mit einem Quecksilbersalz in einem geeigneten Lösungsmittel unter geeigneten Bedingungen, so daß eine mercurierte Verbindung der folgenden Struktur erzeugt wird
(b) Umsetzung der mercurierten Verbindung mit einem chemischen Rest, der mit der -Hg&spplus;-Einheit der mercurierten Verbindung reagiert und durch die Formel ···N dargestellt wird, wobei die Umsetzung in einem wäßrigen Lösungsmittel und in Gegenwart von K&sub2;PdCl&sub4; unter geeigneten Bedingungen durchgeführt wird, so daß eine Verbindung der Struktur
erzeugt wird, wobei N einen reaktiven terminalen funktionellen Rest oder A bedeutet; und
(c) Gewinnung der Verbindung als das modifizierte Nucleotid, wenn N A ist oder wenn N ein reaktiver terminaler Rest ist, Umsetzung der Verbindung mit einer Verbindung,
und die die Struktur M-A aufweist, wobei M einen funktionellen Rest darstellt, der mit N in einem wäßrigen Lösungsmittel unter geeigneten Bedingungen reagiert, so daß das modifizierte Nucleotid erzeugt wird, das sodann gewonnen wird.
Das folgende Schema dient der Erläuterung
Obwohl die Reaktionen bei Wasserstoffionen-Konzentrationen mit einem so nierigen pH-Wert wie 1 oder einem so hohen pH-Wert wie 14 durchgeführt werden können, ist es bevorzugt, im Bereich von etwa 4 bis 8 zu arbeiten. Dies trifft insbesondere zu, wenn es sich um instabile Verbindungen handelt, wie z. B. Nucleosidpolyphosphate, Polynucleotide und Nucleotid-Coenzyme, die bei pH-Werten außerhalb dieses Bereichs hydrolysiert werden. Genauso ist es bevorzugt, bei einer Temperatur im Bereich von etwa 20 bis 30ºC zu arbeiten, um eine mögliche Zersetzung labiler organischer Substrate zu vermeiden. Jedoch können diese Reaktionen bei Temperaturen von etwa 5 bis 100ºC durchgeführt werden. Wie es bei chemischen Reaktionen üblich ist, beschleunigen höhere Temperaturen die Reaktionsgeschwindigkeit, während niedrigere Temperaturen sie verlangsamen. Somit kann im Temperaturbereich von 5 bis 100ºC das Optimum der Reaktionszeit zwischen etwa 10 Minuten und 98 Stunden liegen. Im bevorzugten Temperaturbereich betragen die Reaktionszeiten normalerweise etwa 3 bis 24 Stunden.
Die bevorzugte Vorgehensweise, um den pH-Wert im gewünschten Bereich zu halten, besteht in der Verwendung von Puffern. Verschiedene Puffer können eingesetzt werden. Diese umfassen z. B. Natrium- oder Kaliumacetat-, Natrium- oder Kaliumcitrat-, Kaliumcitrat-Phosphat-, Tris-Acetat- und Borat-Natriumhydroxid-Puffer. Sofern ein Puffer verwendet wird, kann seine Konzentration in einem großen Bereich bis zu etwa 2,0 Mol liegen.
Während ein besonderer Vorteil der Mercurierungsreaktionen und der Palladium-katalysierten Additionsreaktionen darin besteht, daß sie in Wasser durchgeführt werden können, kann es auch günstig sein, kleine Mengen eines organischen Lösungsmittels als Lösungshilfsmittel zuzugeben. Üblicherweise werden organische Lösungsmittel gewählt, die mit Wasser mischbar sind. Diese können ausgewählt werden aus Ethern, Alkoholen, Ester, Ketonen, Amiden und dergleichen, wie z. B. Methanol, Ethanol, Propanol, Glycerin, Dioxan, Aceton, Pyridin und Dimethylformamid. Da jedoch beobachtet wurde, daß das Vorliegen von Alkoholen, wie z. B. Methanol, häufig zu einer Alkoxy-Addition über die Olefin-Doppelbindung führt, sollte das als Lösungshilfsmittel verwendete organische Lösungsmittel sorgfältig ausgewählt werden. Die Einführung von Alkoxy-Substituenten an den α- und β-exocyclischen Kohlenstoffatomen führt häufig zur Herstellung von Verbindungen, die nicht so gut als Enzymsubstrate geeignet sind.
Obwohl verschiedene Quecksilbersalze eingesetzt werden können, ist das zur Zeit bevorzugte Salz Quecksilber(II)-acetat. Außerdem können die Verbindungen, wie vorstehend angegeben, hergestellt werden, indem zuerst ein Linkerarm und sodann der Rest A zugegeben wird, oder indem ein Linkerarm zugegeben wird, an den A bereits angelagert ist. Somit kann der durch die Formel ···N dargestellte chemische Rest ein beliebiger Rest von zahlreichen Resten sein, die bewirken, daß am Ende die gewünschten Verbindungen hergestellt werden.
Beispiele umfassen -CH=CH-CH&sub2;-NH&sub2;,
-CH=CH-CH&sub2;-NH-Biotin und
Die Mengen der Reaktionspartner in diesen Reaktionen können innerhalb großer Bereiche liegen. Jedoch sind im allgemeinen die Mengen einer nicht-mercurierten Verbindung, mercurierten Verbindung und Palladium-enthaltenden Verbindung im wesentlichen stöchiometrisch, wohingegen das Quecksilbersalz und die Verbindung ···N im molaren Überschuß vorliegen sollte, z. B. 5 bis 20 Mol von ···N oder des Quecksilbersalzes pro Mol mercurierte Verbindung bzw. nicht-mercurierte Verbindung. In der Praxis können die Mengen verschieden sein, wobei sie von den unterschiedlichen Reaktionsbedingungen und den jeweiligen Reaktionspartnern abhängen.
Durch die direkte Anlagerung der Biotin-Sonde an die Nucleotidderivate, die als Enzymsubstrate dienen können, wird eine enorme Vielseitigkeit geboten, sowohl bei den experimentellen Verfahren, die durchgeführt werden können, als auch bei den Nachweisverfahren (mikroskopisch und nicht-mikroskopisch), die für die Analyse geeignet sind. Z. B. können Biotin-Nucleotide in Polynucleotide eingeführt werden, die gerade durch Zellen oder rohe Zellextrakte synthetisiert werden, wodurch die Möglichkeit eröffnet wird, naszierende (wachsende) Polynucleotidketten nachzuweisen und/oder zu isolieren. Eine solche Vorgehensweise kann unmöglich durch ein direktes chemisches Modifikationsverfahren erfolgen. Außerdem können Enzyme als Reagenzien verwendet werden, um Sonden, wie z. B. Biotin, an hoch-selektiven oder spezifischen Stellen in Polynucleotide einzuführen; die chemische Synthese ähnlicher Sondenmodifizierter Produkte wäre bestenfalls extrem schwierig zu erreichen.
Die Synthese von Nucleotiden, die Biotin oder Iminobiotin enthalten, wurden erreicht, wie in den nachstehend angeführten Beispielen beschrieben. Pyrimidin-Nucleosidtriphosphate, die eine dieser Sonden enthielten, die am Kohlenstoffatom C-5 angelagert war, waren gute bis sehr gute Substrate für die verschiedensten gereinigten Nucleinsäurepolymerasen- sowohl prokaryotischen als auch eukaryotischen Ursprungs. Diese umfassen die DNA-Polymerase I von E. coli, DNA-Polymerase des Bakteriophagen T4, die DNA-Polymerasen-α und -β aus murinen (A-9) und menschlichen (HeLa) Zellen und die DNA-Polymerase des Herpessimplex-Virus. Bestätigende Daten wurden mit der DNA-Polymerase I von E. coli erhalten, wobei entweder die Bedingungen der Nick-Translation von Rigby et al. eingesetzt wurden (P. W. J. Rigby, M. Dieckmann, C. Rhodes und P. Berg, J. Mol. Biol. 113 (1977), 237) oder die von Bourguignon et al. beschriebene gap- Auffüllreaktion durchgeführt wurde (G. J. Bourguignon, P. J. Tattersall und D. C. Ward, J. Virol. 20 (1976), 290). Außerdem wurde gefunden, daß Bio-dUTP als Polymerase-Substrat dient, sowohl in CHO-Zellen, die durch eine Behandlung mit Lysolecithin permeabel gemacht wurden, gemäß dem Verfahren von Miller et al. (M. R. Miller, J. C. Castellot, Jr., und A. B. Pardee, Exp. Cell Res. 120 (1979), 421), als auch in einem nuklearen Replikationssystem, das aus mit Herpes simplex infizierten BHK-Zellen hergestellt wurde. Obwohl gefunden wurde, daß Biotinyl-Ribonucleosidtriphosphate als Substrate für die RNA-Polymerasen von E. coli und des Bakteriophagen T7 dienen, werden sie nicht so effektiv genutzt wie ihre entspechenden Desoxyribonucleotidtriphosphate. Tatsächlich werden sie von den untersuchten eukaryotischen RNA-Polymerasen (HeLa-Zellen-RNA-Polymerase III, Kalbsthymus-RNA-Polymerase II und Mauszellen-RNA- Polymerase II) nur schwach eingebaut, wenn überhaupt. Während diese begrenzte Substratfunktion die Anwendungsmöglichkeit in einigen in vivo- oder in vitro-Transkriptionsstudien ein schränkt, können jedoch Biotin-markierte RNA-Sonden enzymatisch aus DNA-Matrizen unter Verwendung von E. coli- oder T7- RNA-Polymerasen oder durch Verfahren zur 3'-Endmarkierung unter Verwendung von RNA-Ligasen mit Verbindungen, wie z. B. Biotinyl-pCp, hergestellt werden. Die AA- und NAGE-Derivate von UTP dienen jedoch als Substrate für die vorstehend erwähnten eukaryotischen RNA-Polymerasen. Wenn Antikörper gegen diese Analoga verfügbar sind, sollte es machbar sein, naszierende Transkripte durch immunologische Verfahren oder durch Affinitätsverfahren zu isolieren.
Die enzymatische Polymerisation von Nucleotiden, die Biotin- oder Iminobiotin-Substituenten enthalten, wurde nicht direkt überwacht, da keine dieser Sonden radiomarkiert war. Jedoch konnte anhand von zwei experimentellen Beweisführungen eindeutig gezeigt werden, daß die Biotinyl-Nucleotide eingebaut waren. Die erste besteht darin, daß Polynucleotide, die in Gegenwart von Biotin-Nucleotiden synthetisiert werden, selektiv zurückgehalten werden, wenn sie über Avidin- oder Streptavidin-Affinitätssäulen chromatographiert werden (Tabellen I und II). Z. B. wird normale, mit ³²P-dAMP Nick-translatierte DNA bei Zusatz von 0,5 M NaCl quantitativ eluiert, dagegen bleibt der größte Teil der Biotinyl-DNA oder Iminobiotinyl-DNA am Harz gebunden, auch nach gründlichem Waschen mit hohen Konzentrationen von Salz, Harnstoff, Guanidin-HCl, Formamid oder 50 mM NaOH. Die kleine Fraktion der Radiomarkierung, die bei diesen Waschbedingungen eluiert wurde, wird nicht zurückgehalten, wenn sie ein zweites Mal auf das Harz aufgetragen wird, dies legt nahe, daß die Radioaktivität mit DNA-Fragmenten assoziiert ist, die keine Biotin-Substitution aufweisen. Die zweite Beweisführung besteht darin, daß durch Behandlung mit gereinigtem Anti-Biotin-IgG und anschließend mit Formalin-fixiertem Staphylococcus aureus nur Biotin-markierte Polynucleotide immungefällt werden (Tabelle III). Aus den Daten in diesen Tabellen ist ersichtlich, daß durch dieses Verfahren extrem kleine Mengen Biotin nachgewiesen werden können. Diese Ergebnisse zeigen außerdem, daß das Biotinmolekül durch Avidin, Streptavidin oder spezifische Antikörper erkannt werden kann, wenn die DNA noch in der nativen doppelsträngigen Form vorliegt, eine Bedingung, die absolut essentiell ist, wenn die Antikörper-Bindung oder die Avidin-Affinität zum Nachweis von Sonden eingesetzt werden soll, wobei Hybridisierungstechniken verwendet werden. Tabelle I Selektive Retention der biotinylierten DNA auf Avidin-Sepharose Tabelle II Affinitätschromatographie von Iminobiotin-dUTP und Iminobiotinylierter DNA auf Streptavidin-Sepharose Tabelle III Selektive Immunfällung von Bio-DNA mit Anti-Biotin-IqG und Staph. aureus
*N.T. pBR322-DNA, ³²P-markiert; 1% Biotin-Substitution; spezifische Aktivität 2 · 10&sup7; cpm/ug; Biotin-Nachweis 0,001 bis 0,01 pMol.
Somit ist es möglich, neue Verbindungen der folgenden Struktur herzustellen
wobei B, B' und B" jeweils einen Purin-, 7-Desazapurin- oder Pyrimidinrest darstellen, der an der Position C1' des Zuckerrestes kovalent gebunden ist, mit der Maßgabe, daß, wenn B, B' oder B" ein Purin oder ein 7-Desazapurin darstellt, er an der Position N&sup9; des Purins oder des 7-Desazapurins angelagert ist, und wenn B, B' oder B" ein Pyrimidin darstellt, er an der Position N¹ angelagert ist;
wobei A einen Rest darstellt, der aus mindestens drei Kohlenstoffatomen besteht und der befähigt ist, zusammen mit einem Polypeptid einen nachweisbaren Komplex zu erzeugen, wenn die Verbindung in eine doppelsträngige Duplex eingebaut ist, die mit einem komplementären Ribonucleinsäure- oder Desoxyribonucleinsäuremolekül gebildet wurde;
wobei die gepunktete Linie eine Bindungsgruppe darstellt, die B und A verbindet, mit der Maßgabe, daß, wenn B ein Purin ist, die Bindung an der Position 8 des Purins angelagert ist, wenn B ein 7-Desazapurin ist, die Bindung an der Position 7 des Desazapurins angelagert ist, und wenn B ein Pyrimidin ist, die Bindung an der Position 5 des Pyrimidins angelagert ist;
wobei z ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxylgruppe bedeutet; und
wobei m und n Zahlen von 0 bis etwa 100 000 darstellen.
Natürlich ist es so zu verstehen, daß im allgemeinen m und n nicht gleichzeitig 0 sind, da die Verbindung in diesem Fall lediglich zu einem modifizierten Nucleotid wird, wie vorher beschrieben. Im allgemeinen sind B' und B" innerhalb desselben Oligo- oder Polynucleotids verschieden, wobei sie abwechselnd Uracil, Cytosin, Thymin, Guanin, Adenin oder dergleichen darstellen. Außerdem sollte die Veränderung im allgemeinen so erfolgen, daß sie der geordneten Nucleotidsequenz entspricht, durch die die Peptidsynthese nach dem bekannten genetischen Code codiert wird. Vielmehr sollte die dargestellte Struktur auch Polynucleotide umfassen, wie z. B. Poly-C, Poly-U, Poly-r(A-U) und Poly-d(A-U), außerdem Kalbsthymus-DNA, ribosomale RNA von E. coli oder Hefe, Bakteriophagen-RNA und -DNA (R17, fd), tierische Viren (SV40-DNA), chromosomale DNA und dergleichen, lediglich mit der Maßgabe, daß die Polynucleotide gemäß der vorliegenden Erfindung modifiziert sind.
Außerdem ist es so zu verstehen, daß die Struktur mehr als ein modifiziertes Nucleotid umfaßt, wobei im Oligomer oder Polymer z. B. zwei bis 30 modifizierte Nucleotide vorliegen. Der kritische Faktor in dieser Hinsicht besteht darin, daß die Zahl der Modifikationen nicht so groß ist, daß das Polynucleotid für den geplanten Zweck ungeeignet wird.
Schließlich ist es so zu verstehen, daß modifizierte Oligo- und Polynucleotide verknüpft werden können, so daß größere Einheiten mit der gleichen Struktur entstehen, so lange die terminalen Gruppen kompatibel oder reaktiv gemacht werden.
Diese Verbindungen können durch enzymatische Polymerisation der richtigen Nucleotide, insbesondere Nucleotidtriphosphate, hergestellt werden, wobei eine Nucleinsäure-Matrize vorliegen muß, die unter geeigneten Bedingungen die Synthese leitet. Solche Bedingungen können sehr verschieden sein und hängen vom eingesetzten Enzym, von den Mengen der vorliegenden Nucleotide und anderen Variablen ab. Enzyme umfassen z. B. DNA- Polymerase I von E. coli, DNA-Polymerase des Bakteriophagen T4, DNA-Polymerasen-α oder -β aus murinen und menschlichen (HeLa) Zellen, DNA-Polymerase aus Herpes-simplex-Virus, RNA- Polymerase von E. coli, RNA-Polymerase des Bakteriophagen T7, eukaryotische RNA-Polymerase, umfassend RNA-Polymerase III aus HeLa-Zellen, RNA-Polymerase II aus Kalbsthymus und RNA-Polymerase II aus Mauszellen.
Außerdem können die Verbindungen durch terminale Addition an Oligo- oder Polynucleotide hergestellt werden, wobei Verbindungen erzeugt werden, in denen m oder n 0 ist, abhängig davon, ob die Addition an der 5'- oder 3'-Position erfolgt. Darüberhinaus können die Verbindungen, wie z. B. pCp oder pUp; bei denen die Base biotinyliert ist, unter Verwendung des Enzyms RNA-Ligase an vorliegende Moleküle angefügt werden.
Modifizierte Oligo- und Polynucleotide können auch durch chemische Modifikation von vorliegenden Oligo- oder Polynucleotiden hergestellt werden, indem vorgegangen wird, wie vorher für die Modifikation einzelner Nucleotide beschrieben.
Die verschiedenen modifizierten Nucleotide, Oligonucleotide und Polynucleotide der vorliegenden Erfindung können nachgewiesen werden, indem die Verbindungen mit Polypeptiden in Kontakt gebracht werden, die befähigt sind, mit ihnen unter Bedingungen, die zur Komplexbildung geeignet sind, Komplexe zu erzeugen, mit der Maßgabe, daß die Polypeptide einen oder mehrere Reste umfassen, der/die nachgewiesen werden kann/können, wenn der Komplex oder die Komplexe gebildet wurde bzw. wurden, wobei im allgemeinen herkömmliche Nachweistechniken eingesetzt werden.
Ein Polypeptid-Detektor für die Sonde vom Biotinyl-Typ ist Avidin. Die Avidin-Biotin-Wechselwirkung weist eine der höchsten nicht-kovalenten Bindungskonstanten auf (Kdis = 10&supmin;¹&sup5;), die in der Natur vorkommen. Wenn Avidin an nachweisbare Indikatormoleküle, z. B. fluoreszierende Farbstoffe (Fluorescein, Rhodamin), elektronendichte Reagenzien (Ferritin, Hämocyanin, kolloidales Gold) oder Enzyme, die unlösliche Reaktionsprodukte erzeugen können (Peroxidase, alkalische Phosphatase), gekoppelt wird, kann das Vorliegen, die Lage und/oder die Menge der Biotin-Sonde ermittelt werden.
Leider weist Avidin eine Eigenschaft auf, die für ein Biotin-Indikatorprotein weniger wünschenswert ist, sofern es in Verbindung mit Nucleinsäuren oder Chromatinmaterial eingesetzt wird. Es wurde berichtet (M. H. Heggeness, Stain Technol. 52 (1977), 165; M. H. Heggeness und J. F. Ash, J. Cell. Biol. 73 (1977), 783; E. A. Bayer und M. Wilchek, Methods of Biochemical Analysis 26 (1980), 1), daß Avidin fest an kondensiertes Chromatin oder an subzelluläre Fraktionen, die große Mengen Nucleinsäure enthalten, auf eine Weise bindet, die von seiner Biotin-bindenden Eigenschaft unabhängig ist. Da Avidin ein basisches Glykoprotein mit einem pI-Wert von 10,5 ist, sind für diese beobachteten unspezifischen Wechselwirkungen höchstwahrscheinlich seine Histon-artige Beschaffenheit oder seine Kohlenhydratreste verantwortlich.
Eine bevorzugte Sonde für Biotin-enthaltende Nucleotide und Derivate ist Streptavidin, ein Avidin-ähnliches Protein, das durch den Bodenorganismus Steptomyces avidinii synthetisiert wird. Seine Herstellung und Reinigung wird in Hoffman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 77 (1980), 4666, beschrieben. Streptavidin hat einen viel niedrigeren pI-Wert (5,0), ist nicht-glykosyliert und zeigt eine viel geringere unspezifische Bindung an DNA als Avidin, und es bietet deshalb deutliche Vorteile bei Anwendungen, bei denen Verfahren zum Nucleinsäurenachweis beteiligt sind.
Ein am stärksten bevorzugtes Protein für den Sondennachweis mittels Biotin ist das monospezifische Kaninchen-IgG Anti-Biotin-Immunglobulin. Diese Verbindung wurde hergestellt, indem Kaninchen mit an Rinderserumalbumin konjugiertem Biotin immunisiert wurden, wie früher beschrieben (M. Berger, Methods in Enzymology 62 (1979), 319), und durch Affinitätschromatographie gereinigt. Zwar weisen die Assoziationskonstanten von Immunglobulin-Haptenen Kassn-Werte auf (10&sup6; bis 10¹&sup0;), die viel niedriger sind als die der Avidin-Biotin-Komplexe, sie sind jedoch im wesentlichen gleich groß wie die Werte, die beim Avidin-Iminobiotin-Komplex festgestellt wurden. Außerdem haben sich die Anti-Biotin-Antikörper beim Nachweis spezifischer Polynucleotidsequenzen auf Chromosomen durch in situ-Hybridisierung als außerordentlich nützlich erwiesen, da, wenn überhaupt, nur eine geringe unspezifische Bindung des Antikörpers an Chromatinmaterial erfolgt.
Die modifizierten Polynucleotide der vorliegenden Erfindung sind zur Denaturierung und Renaturierung unter Bedingungen befähigt, die mit ihrer Verwendung als Hybridisierungssonden vereinbar sind. Dies kann durch eine Analyse der thermischen Denaturierungsprofile und der Hybridisierungseigenschaften verschiedener Biotin-substituierter DNA- und RNA-Polymere eindeutig gezeigt werden. Z. B. weisen pBR322-DNA oder λ-DNA, die zur Einführung von etwa 10 bis 100 Biotinresten pro Kilobase Nick-translatiert wurden, Tm-Werte auf, die im wesentlichen mit denjenigen der Biotin-freien Kontroll-DNAs identisch sind. Außerdem zeigte ³²P-markierte, Biotin-substituierte pBR322-DNA den gleichen Grad von Spezifität und die gleiche Intensität des autoradiographischen Signals wie die Thymidin-enthaltende Kontroll-DNA, wenn sie als Hybridisierungssonde zum Nachweis von Bakterienkolonien, die das Plasmid enthielten, eingesetzt wurde.
In DNA-Doppelsträngen, wie z. B. MVM-RF-DNA, in denen jeder Thymidinrest in dem einen Strang (1250 in toto pro 5 Kb) durch ein Biotinyl-Nucleotid ersetzt ist, liegt der Tm-Wert lediglich 5ºC unter dem der unsubstituierten Kontrolle. Obwohl der Tm-Wert von Poly-d(A-bioU), in dem jedes Basenpaar einen Bio-dUMP-Rest enthält, 15ºC niedriger liegt als für die Poly- d(A-T)-Kontrolle, zeigten die beiden Polymere sowohl während der Denaturierung als auch während der Renaturierung den gleichen Grad der Anlagerung und die gleiche Stärke der Färbung. Eine gleichzeitig durchgeführte Analyse von RNA-Doppelsträngen und DNA/RNA-Hybriden zeigt, daß ihre Tm-Werte auch mit der Steigerung des Biotin-Gehaltes des Polymers sinken. Jedoch wird deutlich gemacht, daß eine wesentliche Anzahl von Biotinmolekülen eingeführt werden kann, ohne die Hybridierungseigenschaften des Polymers signifikant zu verändern.
Diese Ergebnisse legten nahe, daß Biotin-substituierte Polynucleotide als Sonden zum Nachweis und/oder zur Lokalisierung spezifischer Polynucleotidsequenzen in Chromosomen, in fixierten Zellen oder in Gewebeschnitten eingesetzt werden können.
Das allgemeine Protokoll zum Nachweis der Biotin-substituierten Sonde wird im folgenden schematisch erläutert. ALLGEMEINES PROTOKOLL ZUM SONDENNACHWEIS MITTELS IN SITU-VER- FAHREN DER KOLONIE- ODER NORTHERN/SOUTHERN-HYBRIDISIERUNG Anti-Sonde-Sequenz
Dieses allgemeine Schema erläutert nur Verfahren, die zur Genkartierung (Cytogenetik) und in DNA-Rekombinationstechniken verwendet werden können. Jedoch kann es genausogut auch zum Nachweis von Nucleinsäuresequenzen aus Bakterien, Viren, Pilzen oder Parasiten in klinischen Proben verwendet werden, und dies stellt die Grundlage für eine neue, sehr wirkungsvolle Vorgehensweise bei klinischen Diagnoseverfahren dar, wobei keine Radioisotopen mehr eingesetzt werden müssen.
Immunologische und histochemische Verfahren zum Nachweis von Biotin haben gezeigt, daß die grundlegende Vorgehensweise für ein Schnellverfahren zur Genkartierung durch in situ-Hybridisierung und für nicht-radioaktive Verfahren zum Nachweis spezifischer Nucleinsäuresequenzen durch Blot-Hybridisierungstechniken verwendet werden kann. Eingesetzt werden kann diese Technologie für die Entwicklung neuer klinischer Diagnoseverfahren.
Unter Einsatz dieser Vorgehensweise kann das Vorliegen eines spezifischen Desoxyribonucleinsäure- oder Ribonucleinsäuremoleküls bestimmt werden, insbesondere eines solchen Moleküls, das aus einem lebenden Organismus stammt, z. B. Bakterium, Pilz, Virus, Hefe oder Säuger. Dies wiederum ermöglicht die Diagnose von Nucleinsäure-enthaltenden Krankheitserregern in einem Patienten oder einem anderen Individuum.
Außerdem wird ein Verfahren zum Absuchen von Bakterien bereitgestellt, wobei die Antibiotikaresistenz bestimmt wird. Auf diese Weise kann z. B. die Penicillin-Resistenz in Streptococcus pyogenes oder Neisseria meningitidis, die Tetracyclin- Resistenz in Staphylococcus aureus, Candida albicans, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus pyogenes oder Neisseria gonorrhoeae und die Aminoglykosid-Resistenz in Mycobacterium tuberculosis bestimmt werden.
In diesen Verfahren wird ein Polynucleotid hergestellt, das zu einer Nucleinsäuresequenz komplementär ist, die für den Organismus oder seine Antibiotikaresistenz charakteristisch ist und die außerdem ein oder mehrere modifizierte Nucleotide gemäß der vorliegenden Erfindung enthält. Dieses Polynucleotid wird mit der Nucleinsäure hybridisiert, die aus dem zu testenden Organismus erhalten wurde. Wenn keine Hybridisierung erfolgt, zeigt dies, daß der Organismus oder die Resistenzeigenschaft nicht vorliegt. Die hybridisierten Nucleinsäure-Doppelsträngen werden sodann durch die Bildung eines Komplexes zwischen dem Doppelstrang und einem geeigneten Polypeptid identifiziert, wobei das Polypeptid einen nachweisbaren Rest enthält, so daß das Vorliegen des Komplexes unter Verwendung einer geeigneten Nachweistechnik nachgewiesen werden kann. Ein positiver Nachweis zeigt, daß der Komplex, der Doppelstrang und folglich die fragliche Nucleinsäuresequenz vorliegen.
Diese Vorgehensweise kann auch auf die Diagnose von genetischen Störungen angewendet werden, wie z. B. Thalassämie und Sichelzellenanämie. Die Desoxyribonucleinsäure-Gensequenz, deren Vorliegen oder Abwesenheit (im Fall von Thalassämie) mit der Störung assoziiert ist, kann nachgewiesen werden, indem eine Hybridisierung mit einer erfindungsgemäßen Polynucleotidsonde erfolgt und die Komplexbildung mit einem geeigneten nachweisbaren Polypeptid nachgewiesen wird.
Die Kartierung von Genen oder ihrer Transkripte auf spezifische Loci auf den Chromosomen war bisher eine umständliche und zeitaufwendige Beschäftigung, wobei hauptsächlich Techniken der Zellfusion und Körperzellgenetik eingesetzt wurden. Die in situ-Hybridisierung wurde zwar erfolgreich für die Kartierung von Einzelkopie-Gensequenzen eingesetzt, jedoch nur bei Arten, bei denen Polytänchromosomen gebildet werden, wie z. B. Drosophila, dagegen war bei den meisten höheren eukaryotischen Chromosomen der Nachweis von Genen mit einmalig vorkommender Sequenz unter Verwendung der herkömmlichen Hybridisierungsverfahren extrem schwierig, wenn nicht ganz unmöglich. Wenn man nun Polynucleotidsonden mit einer sehr hohen spezifischen Radioaktivität einsetzt, um die autoradiographische Lokalisierung der Hybridisierungsstelle zu erleichtern, führt dies auch zu einer schnelleren Radiozersetzung der Sonde und gleichzeitig zu einem Anstieg des Hintergrundgeräusches durch Silberkorn-Ablagerungen. Die Verwendung von Hybridisierungssonden mit niedrigen bis mittleren spezifischen Radioaktivitäten macht Expositionszeiten von mehreren Tagen oder Wochen erforderlich, auch wenn Multicopy-Sequenzen nachgewiesen werden, wie z. B. ribosomale RNA-Gene oder Satelliten-DNA. Seit die DNA-Rekombinationstechnik die molekulare Clonierung von im Grunde genommen jeder, in eukaryotischen Zellen vorkommenden Einzelkopie-Sequenz möglich macht, wäre es sehr vorteilhaft, ein schnelles und empfindliches Verfahren zur Verfügung zu haben, mit dem der chromosomale Ursprung solcher clonierten genomischen Fragmente kartiert werden kann.
Modifizierte Nucelotide eignen sich zum Einsatz in einem Verfahren der Genkartierung mittels in situ-Hybridisierung, wobei die Verwendung von Radioisotopen vermieden wird. In diesem Verfahren werden die Vorteile eines Biotin-enthaltenden Thymidin-Analogons genutzt, das enzymatisch durch Nick-Translation in DNA-Sonden eingebaut werden kann. Nach der in situ- Hybridisierung dienen die Biotin-Moleküle als Antigene für Affinitäts-gereinigte Anti-Biotin-Antikörper den Kaninchens. Durch immunfluoreszierende Antikörper-Sandwiches, die mit Fluorescein-markiertem Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG gebildet wurden, können die clonierten Gensequenzen schnell und spezifisch cytogenetisch als grüngelbe Banden lokalisiert werden. Dieses Verfahren bietet gegenüber herkömmlichen autoradiographischen Verfahren der in situ-Genlokalisierung vier wichtige Vorteile; weniger Hintergrundgeräusch; eine bessere Auflösung zwischen den Banden; eine kürzere Zeit ist erforderlich, um die Stelle der Sondenhybridierung zu bestimmen; und chemisch stabile Hybridisierungssonden. Dieses Verfahren wurde erfolgreich für die Lokalisierung von wiederholten und einmaligen DNA-Sequenzen im Polytänchromosom von Drosophila melanogaster und in Satelliten-DNA auf Metaphasenchromosomen der Maus eingesetzt.
Somit wurde gefunden, daß Polytänchromosomen als Testsystem verwendet werden können, um die Wirksamkeit von Sonden bei der in situ-Genkartierung festzustellen, wobei die modifizierten Nucleotide gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt und durch indirekte Immunfluoreszenz nachgewiesen werden. Die Sonden umfaßten verschiedene clonierte Drosophila-Sequenzen, die von Otto Schmidt und Dieter Söll bereitgestellt wurden, wie z. B. tRNA-Gene, cloniert in Plasmidvektoren mit Einschüben der Größe im Bereich von etwa 5 bis etwa 22 Kilobasen. Viele dieser Clone wurden bereits durch herkömmliche in situ-Hybridisierungsverfahren unter Verwendung von Radioisotopen spezifischen Banden auf der Drosophila-Chromosomenkarte zugewiesen.
Die DNA-Sonden wurden in Gegenwart von Bio-dUTP Nicktranslatiert. Gelegentlich wurde(n) zum Nick-Translations-Reaktionsgemisch ³H-dATP und/oder ³H-dCTP zugegeben. Dann konnte die Lokalisierung einer Sequenz auf einem einzelnen gespreiteten Chromosompräparat sowohl durch Autoradiographie als auch durch Immunofluoreszenz erfolgen. Die in situ-Hybridisierung wurde durchgeführt, wie in M. L. Pardue und J. G. Gall, Methods in Cell Biol. 10 (1975), 1, beschrieben. Nach der letzten Waschung mit 2 · SSC zur Entfernung der nichthybridisierten Sonde wurden die Objektträger mit PBS (Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung) gespült und bei 37ºC mit 2,5 ug/ml Kaninchen-Anti-Biotin in PBS und 10 mg/ml BSA zwei bis 16 Stunden inkubiert. Hierauf folgte die ein- bis vierstündige Inkubation der Objektträger mit FITC-markiertem Ziegen-Anti-Kaninchen IgG (Miles Laboratories, verdünnt 1 : 100 in PBS und 10 mg/ml BSA). Häufig war Evans Blau als rote Gegenfärbung erforderlich, um die Chromosomen mit einer fluoreszierenden Färbung erkennen zu können.
Wenn die Plasmide pBR17D und pPW539, die Einschübe von 5 bzw. 32 Kb enthielten, durch dieses Verfahren hybridisiert wurden, wurde gefunden, daß das Hybridisierungsmuster von einem gespreiteten Präparat zu einem anderen reproduzierbar war und bei mehr als 90% der gespreiteten Chromosomen auf einem bestimmten Objektträger eindeutig festgestellt werden konnte.
Von dem clonierten transposablen Element pAC104 weiß man, daß es sich an vielen Stellen auf dem Drosophila-Genom kartieren läßt. Der Vergleich des Autoradiogramms und des Fluoreszenz-Bildes, die durch in situ-Hybridisierung dieser Sonde erhalten wurden, zeigt einen wichtigen Vorteil dieses Verfahrens, d. h., wo auf einem Autoradiogramm diffuse Bereiche mit Silberkörnern zu sehen sind, sind durch Immunfluoreszenz-Markierung Doppelbanden oder eine Reihe von Banden zu unterscheiden.
Der andere Vorteil dieses Verfahrens, der sofort ins Auge sticht, ist die enorme Verkürzung der Zeit, die für eine Genzuordnung mittels indirekter Immunfluoreszenz erforderlich ist. Eine Zuordnung eines DNA-Fragments zu einer spezifischen Bande kann innerhalb von sechs Stunden Hybridisierung erfolgen. Dies muß mit Tagen oder Wochen verglichen werden, die für autoradiographische Verfahren erforderlich sind. Dieser Faktor und dazu noch eine bessere Auflösung machen deutlich, daß die Verwendung der modifizierten Nucleotide, die durch indirekte Immunfluoreszenz nachgewiesen werden, den klassischen Verfahren direkt vorzuziehen sind.
Es wurde gezeigt, daß dieses immunologische Verfahren auch mit Säugerchromosomen funktioniert, wobei Satelliten-DNA auf die Centromer-Regionen von Metaphasenchromosomen der Maus kartiert wurde. Das Ergebnis stellt einen fundierten Grundstock für die Entwicklung eines einfachen Genkartierungs-Verfahrens bereit, das für Einzelkopie- (einmalige) Sequenzen in Chromosomen aus dem Menschen oder anderen Säugern geeignet ist. Mit Hilfe eines solchen Verfahrens sollte es möglich sein, unser Wissen über die genetische Organisation der Chromosomen deutlich zu erweitern und ein klinisches cytogenetisches Diagnoseverfahren zu entwickeln, das viel schneller und einfacher ist.
Während bei einem einstufigen "Antikörper-Sandwich"-Verfahren, wobei das gespreitete Chromosom getestet wird, die Post-Hybridisierung mit Kaninchen-Anti-Biotin-IgG möglicherweise erfolgreich ist, kann es jedoch sein, daß diese Versuchsanordnung nicht genügend Fluoreszenz erzeugt, um ein Gen eindeutig zuordnen zu können. Dagegen kann ein viel stärkeres fluorometrisches Signal erhalten werden, wenn die "Hapten-Antikörper-Sandwich-Technik" verwendet wird, die von Lamm et al., (1972); Wofsy et al., (1974), beschrieben wird. In diesem Verfahren wird der primäre Antikörper, in unserem Fall das monospezifische Kaninchen-Anti-Biotin-IgG, mit einem Haptenisierungsreagens, wie z. B. 2,4-Dinitrofluorbenzol, chemisch modifiziert, vorzugsweise während das Immunglobulin an eine Antigen-Affinitätssäule (Biotin-SepharoseTM) gebunden ist. 15 bis 20 Hapten (DNP)-Gruppen können an den primären Antikörper gekoppelt werden, ohne daß seine Antigen-bindende Affinität oder Spezifität vermindert wird (Wallace und Wofsy, (1979)). Wenn auf die Behandlung der Testprobe mit dem primären Antikörper eine Inkubation mit einem fluoreszierend markierten Anti-Hapten-IgG-Antikörper, anstelle eines fluoreszierend markierten Anti-IgG, folgt, kann eine fünf- bis siebenfache Steigerung des Fluoreszenzsignals erreicht werden. Da man auch das monospezifische Anti-DNP-IgG des Meerschweinchens zur Verfügung hat, kann man diesen sekundären Antikörper mit Biotin hapteni sieren und auf diese Weise zwei Anti-Hapten-IgG-Populationen erzeugen, das DNP-markierte Anti-Biotin-IgG und das Biotinmarkierte Anti-DNP-IgG. Wenn man diese abwechselnd einsetzt und mehrere Runden des Hapten-Antikörper-Sandwich-Verfahrens durchführt, und wenn anschließend noch ein fluoreszierend markiertes Protein A aus Staphylococcus aureus folgt, das spezifisch an IgG-Moleküle aus vielen Säugerarten bindet, kann dies zu einer enormen Steigerung des primären Antikörpersignals führen und folglich seine Anwendungsmöglichkeit erweitern.
Das Protein Streptavidin aus Streptomyces avidini stellt eine mögliche Alternative zum Anti-Biotin-IgG als ein Träger dar, um ein daran gekoppeltes Visualisierungssystem [z. B. fluoreszierende Sonden (vorstehend) oder histochemische Reagenzien (nachstehend)] spezifisch zu der Stelle des hybridisierten Biotin-enthaltenden Polynucleotids zu führen. Einer der Vorteile von Streptavidin gegenüber Anti-Biotin-IgG besteht darin, daß seine Affinität für Biotin Kassn = 10¹&sup5; beträgt, während die Assoziationskonstanten für Hapten-IgG-Interaktionen 10&sup7; bis 10¹&sup0; ausmachen. Die schnelle Reaktionsgeschwindigkeit und die extreme Affinität bedeuten, daß die Zeit, die für die Lokalisierung der biotinylierten Sonde erforderlich ist, mit Streptavidin Minuten dauert, gegenüber Stunden mit immunologischen Reagenzien.
Die ersten Untersuchungen mit einem Streptavidin-Nachweissystem sind zur Zeit im Gange. Polytänchromosomen, die mit biotinylierten DNA-Sonden hybridisiert waren, werden mit Streptavidin inkubiert, worauf eine weitere Inkubation mit Rinderserumalbumin folgt, das mit Biotin und FITC doppelt markiert worden war (FITC+Biotinyl-BSA). Da vermutlich nur eine der vier Streptavidin-Untereinheiten an der Bindung an jede biotinylierte DNA-Stelle beteiligt ist, kann an jede der restlichen drei nicht-konjugierten Untereinheiten des Streptavidin-Biotinyl-Nucleotid-Komplexes ein markiertes BSA-Molekül binden. Das Fluoreszenzsignal aus dieser einfachen Streptavidin plus FITC+Biotinyl-BSA-Schicht wird mit einer Kontrolle verglichen, bei der das früher beschriebene, grundlegende "Antikörper-Sandwich-Verfahren" verwendet wird.
Wenn die Nachweisintensitäten vom "Antikörper-Sandwich" und von Streptavidin plus FITC+Biotinyl-BSA vergleichbar sind, kann man versuchen, das Streptavidin plus FITC+Biotinyl-BSA- System bis zu einer Einzelkopie-Empfindlichkeit zu steigern, wobei man vorgeht, wie beim mehrteiligen "Hapten-Antikörper- Sandwich". Da einige der auf BSA vorliegenden Biotingruppen nicht an die erste Streptavidin-Schicht gebunden sind, kann eine zweite Streptavidin-Schicht zugegeben werden, bis ausreichend Signal erhalten wird. Wenn z. B. in der zweiten Schicht lediglich zwei Streptavidin-Promotoren an jedes BSA der ersten Schicht gebunden sind und wenn jeder dieser Streptavidin-Promotoren drei FITC+Biotinyl-BSA-Moleküle bindet, zeigt die zweite Schicht eine Intensität, die doppelt so groß ist wie die der ersten Schicht; für die dritte Schicht, mit analogen Bindungsstöchiometrien, beträgt die Fluoreszenzintensität dann das Zwölffache der Intensität der ersten Schicht, so daß die Gesamtintensität mit jeder weiter zugegebenen Schicht rasch zunimmt.
Es liegen Pläne vor, anstelle von BSA ein größeres Trägerprotein, wie z. B. Thyroglobulin, einzusetzen, um die Mengen der angelagerten fluoreszierenden und Biotin-Sonden zu steigern. Außerdem kann es erforderlich sein, zwischen der Biotin- Sonde und dem Trägerprotein einen längeren Linkerarm zu verwenden. Ein längerer Linkerarm sollte theoretisch die Hinführung eines biotinylierten fluoreszierenden Trägermoleküls zu jeder nicht-konjugierten Streptavidin-Untereinheit sterisch optimieren und die Zahl der Streptavidin-Promotoren in der anschließenden Schicht, die an den biotinylierten fluoreszierenden Träger binden, bestmöglich steigern. Wie vorher werden geeignete Kontrollen durchgeführt, um sicherzustellen, daß die Substitution des Trägerproteins mit fluoreszierenden Sonden und Biotin keine Probleme mit Löslichkeit und/oder unspezifischer Bindung verursacht.
Das Streptavidin-Trägerprotein-Hinführungssystem hat gegenüber der Vorgehensweise mit Immunfluoreszenz zusätzlich zur Geschwindigkeit der Hinführung noch zwei signifikante Vorteile. Erstens sind nur zwei Proteinkomponenten erforderlich, um die Schichten zu bilden. Zweitens muß nur das Trägerprotein modifiziert sein, und es ist nicht nötig, die funktionelle oder sogar die gesamte strukturelle Integrität aufrechtzuerhalten, so lange die Biotingruppen für Streptavidin zugänglich sind.
Eine Alternative zum Fluoreszenzverfahren, um hybridisierte Sonden sichtbar zu machen, besteht darin, Enzyme, wie z. B. Peroxidase, alkalische Phosphatase oder β-Galactosidase, zur Stelle der Hybridisierung zu leiten, wo die enzymatische Umwandlung von löslichen Substraten zu unlöslichen gefärbten Niederschlägen eine Sichtbarmachung durch die Lichtmikroskopie ermöglicht. Der wichtige Vorteil dieser Technik besteht darin, daß die histochemischen Verfahren 10- bis 100-mal empfindlicher sind als der Nachweis mittels Fluoreszenz. Außerdem bleichen die gefärbten Niederschläge unter starkem Licht nicht aus, womit einer der allgemeinen Nachteile der Fluoreszenzmikroskopie vermieden wird. Diese Enzyme können in der "Hapten- Antikörper-Sandwich"-Technik anstelle der fluoreszierenden Sonden an den endgültigen Antikörper gekoppelt werden, wobei bifunktionelle Reagenzien, wie z. B. Glutaraldehyd, verwendet werden, oder, im Fall von Peroxidase, via Oxidation der Peroxidase-Kohlenhydratreste zu Aldehyden und Kupplung dieser Reste mit den -Aminogruppen des gewünschten Proteins. Bei dem Streptavidin-biotinylierten Trägerprotein-Verfahren kann ein Enzym mit daran gekoppelten Biotinylgruppen ein fluoreszenzbiotinyliertes Trägersystem ersetzen. Alternativ kann das Enzym über Biotin an die letzte Streptavidin-Schicht gekoppelt werden, wobei die in vorhergehenden Schichten unter Verwendung von biotinyliertem BSA oder Thyroglobulin aufgebauten Streptavidin-Stellen vermehrt werden. Wir werden in Kürze damit beginnen, die erforderlichen histochemischen Reagenzien und die geeigneten Kombinationen aus Substrat und unlöslichem Produkt für die Sichtbarmachung der in situ-Hybridisierungen ohne Hintergrundprobleme zu entwickeln. Die histochemischen Vorgehensweisen zur Verstärkung des Signals sollten im Sommer 1981 so weit sein, daß sie getestet werden können.
Der Nachweis und/oder die Bildverarbeitung von sehr schwachem fluoreszierendem Licht ist möglich, indem die zur Zeit verfügbaren Bildverstärker oder Systeme verwendet werden, die aus Lasern und Photovervielfachern bestehen. Mit diesen Verfahren ist der Nachweis von Licht sogar auf der Ebene einzelner Photonen möglich. Mit geeigneten digitalen Verarbeitungssystemen können Bilder erzeugt werden, bei denen jeder Punkt, d. h. jedes Pixel, des Bildes streng proportional ist zur Anzahl der Photonen, die durch einen Punkt des Objektes emittiert werden. Unter Verwendung von Systemen dieser Art oder von Fließsystemen, bei denen die Zellen oder Teile der Zellen an einem Laserstrahl vorbeifließen, kann man eine Steigerung der Nachweisempfindlichkeit für fluoreszierendes Material mit Faktoren zwischen 100 und 1000 gegenüber den durch das Auge nachweisbaren Werten erhalten. Diese Steigerung reicht aus, um die Fluoreszenz von Einzelkopie-Genen nachweisen zu können.
In einer bevorzugten Modifikation wurden Analoga von dUTP und UTP synthetisiert, die ein Biotinmolekül enthalten, das kovalent über einen Allylamin-Linkerarm an der Position C-5 des Pyrimidinrings gebunden ist. Diese Biotinyl-Nucleotide sind in vitro effiziente Substrate für verschiedene DNA- und RNA-Polymerasen. Eine DNA, die eine geringe Biotin-Substitution aufweist (50 Moleküle oder weniger pro Kilobase), zeigt bei der Denaturierung, Reassoziation und Hybridisierung Eigenschaften, die von denjenigen der unsubstituierten Kontroll-DNA nicht zu unterscheiden sind.
Somit stellt diese Erfindung außerdem ein Verfahren zur chromosomalen Karyotypisierung bereit. In diesem Verfahren werden modifizierte Polynucleotide hergestellt, die bekannten Genen entsprechen und modifizierte Nucleotide enthalten. Diese Polynucleotide werden mit chromosomaler Desoxyribonculeinsäure hybridisiert und die resultierenden Doppelstränge mit den entsprechenden Polypeptiden unter geeigneten Bedingungen in Kontakt gebracht, so daß die Komplexbildung stattfinden kann. Die Polypeptide umfassen nachweisbare Reste, so daß die Lokalisierung der Komplexe bestimmt und dadurch die Lage spezifischer Gene fixiert werden kann.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt den Nachweis von Poly-A-enthaltenden Sequenzen unter Verwendung von Poly-U, in dem einige der Uracilbasen modifi ziert wurden, daß sie eine Sonden enthalten. Eine andere Ausführungsform umfaßt cyclische modifizierte Nucleotide, in denen zwei der Reste x, y und z miteinander reagiert haben, so daß sie den cyclischen Rest
erzeugen. Solche cyclischen modifizierten Nucleotide können sodann eingesetzt werden, um die Hormonrezeptorstellen auf den Zelloberflächen zu identifizieren, dieses Verfahren kann seinerseits zum Nachweis von Krebs- oder Tumorzellen verwendet werden.
Schließlich können Tumorzellen diagnostiziert werden, indem Polynucleotide hergestellt werden, die gemäß der vorliegenden Erfindung modifiziert sind und die zu der Messenger-Ribonucleinsäure komplementär sind, die aus einer Desoxyribonucleinsäure-Gensequenz synthetisiert wird, die mit der Produktion von Polypeptiden, wie z. B. Alpha-Fetoprotein oder carcinoembryonales Antigen, assoziiert ist, deren Vorliegen zur Diagnose für spezifische Tumorzellen dient. Die Hybridisierung und der Nachweis von Hybrid-Doppelsträngen stellt somit ein Verfahren zum Nachweis von Tumorzellen bereit.
Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung verschiedener Aspekte der vorliegenden Erfindung, sie sollen jedoch in keiner Weise den Umfang der Erfindung, der in den Patentansprüchen genauer dargestellt ist, einschränken.

Beispiele 1 und 2

Synthese von Biotinyl-UTP und Biotinyl-dUTP

a) Herstellung von mercurierten Nucleotiden

UTP (570 mg, 1,0 mMol) oder dUTP (554 mg, 1,0 mMol) wurde in 100 ml 0,1 M Natriumacetatpuffer, pH 6,0, gelöst und mit Quecksilber(II)-acetat (1,59 g, 5,0 mMol) versetzt. Die Lösung wurde vier Stunden bei 50ºC erhitzt und anschließend auf Eis abgekühlt. Lithiumchlorid (392 mg, 9,0 mMol) wurde zugegeben und die Lösung sechsmal mit dem gleichen Volumen Essigsäure ethylester extrahiert, wodurch überschüssiges HgCl&sub2; entfernt wurde. Die Effizienz des Extraktionsprozesses wurde überwacht, indem die Konzentration der Quecksilberionen in der organischen Phase unter Verwendung von 4,4'-Bis(dimethylamino)thiobenzophenon ermittelt wurde (A. N. Christopher, Analyst 94 (1969), 392). Das Ausmaß der Nucleotid-Mercurierung, das nach der Iodierung eines Aliquots der wäßrigen Lösung spektrophotometrisch bestimmt wurde, wie von Dale et al. beschrieben (R. M. K. Dale, D. C. Ward, D. C. Livingston und E. Martin, Nucleic Acid Res. 2 (1975), 915), lag normalerweise zwischen 90 und 100%. Die Nucleotidprodukte in der wäßrigen Phase, die während der Extraktion mit Essigsäureethylester häufig trüb wurde, wurden durch Zusatz von drei Volumina eiskaltem Ethanol gefällt und abzentrifugiert. Der Niederschlag wurde zweimal mit kaltem absolutem Ethanol und einmal mit Ethylether gewaschen und sodann luftgetrocknet. Die auf diese Weise hergestellten mercurierten Nucleotide wurden ohne weitere Reinigung für die Synthese der Allylamin-Nucleotide verwendet.

b) Synthese von Allylamin-dUTP und Allylamin-UTP

Die mercurierten Nucleotide (aus Schritt a) wurden in 0,1 M Natriumacetatpuffer, pH 5,0, gelöst und auf eine Konzentration von 20 mM eingestellt (200 OD/ml bei 267 nm). Eine frische 2,0 M Lösung von Allylaminacetat in wäßriger Essigsäure wurde hergestellt, indem 1,5 ml Allylamin (13,3 mMol) langsam zu 8,5 ml eiskalter 4 M Essigsäure zugegeben wurden. Drei ml (6,0 mMol) der neutralisierten Allylamin-Vorratslösung wurden zu 25 ml (0,5 mMol) Nucleotidlösung zugefügt. Sodann wurde ein Nucleotidäquivalent K&sub2;PdCl&sub4; (163 mg, 0,5 mMol), gelöst in 4 ml Wasser, zugegeben, um die Umsetzung zu starten. Bei Zusatz des Palladiumsalzes (Alfa-Ventron) wurde die Lösung nach und nach schwarz, was auf Metallniederschläge (Hg und Pd) zurückzuführen war, die an den Wänden des Reaktionsgefäßes abgelagert wurden. Nach 18- bis 24-stündigem Stehen bei Raumtemperatur wurde das Reaktionsgemisch durch ein 0,45 mm-Membranfilter (Nalgene) filtriert, wodurch der größte Teil des restlichen Metallniederschlags entfernt wurde. Das gelbe Filtrat wurde fünffach verdünnt und auf eine 100 ml-Säule mit DEAE-Sephadex TM A-25 (Pharmacia) aufgetragen. Nachdem mit einem Säulenvolu men von 0,1 M Natriumacetatpuffer, pH 5,0, gewaschen worden war, wurden die Produkte eluiert, wobei ein Liter eines linearen Gradienten (0,1 bis 0,6 M) entweder von Natriumacetat, pH ca. 8 bis 9, oder von Triethylammoniumbicarbonat (TEAB), pH 7,5, verwendet wurde. Das gewünschte Produkt lag im UV-absorbierenden Hauptteil, der zwischen 0,30 und 0,35 M Salz eluiert wurde. Die Spektralanalyse zeigte, daß dieser Peak mehrere Produkte enthielt, die endgültige Reinigung wurde durch Umkehrphasen-HPLC-Chromatographie auf Säulen mit Partisil ODS-2 durchgeführt, wobei als Elutionsmittel entweder 0,5 M NH&sub4;H&sub2;PO&sub4;-Puffer, pH 3, 3, (analytische Trennungen) oder 0,5 M Triethylammoniumacetat, pH 4,3, (präparative Trennungen) verwendet wurde. Die 5'-Triphosphate von 5-(3-Aminopropen-1-yl)- uridin (das Allylamin-Addukt von Uridin) wurden als letztes aus der HPLC-Säule eluiert und waren deutlich von drei bisher nicht charakterisierten Verunreinigungen getrennt. Diese Nucleotide wurden durch Protonen-NMR-Elementaranalyse spektral und chromatographisch charakterisiert; tAA-dUTP (C&sub1;&sub2;H&sub1;&sub6;N&sub3;O&sub1;&sub4;P&sub3;Na&sub4; · 1H&sub2;O): Theorie: C, 22,91; H, 2,88; N, 6,68; P, 14,77; gefunden: C, 23,10; H, 2,85; N, 6,49; P, 14,75; AA-UTP (C&sub1;&sub2;H&sub1;&sub6;N&sub3;O&sub1;&sub5;P&sub3;Na&sub4; · 4H&sub2;O): Theorie: C, 20,61; H, 3,46; N, 6,01; P, 13,3; gefunden: C, 20,67; H, 4,11; N, 5,39; P, 13, 54.

c) Biotinylierung von AA-dUTP oder AA-UTP

Biotinyl-N-hydroxysuccinimidester (NHSB) wurde aus Biotin (Sigma) hergestellt, wie früher beschrieben (H. Heitzmann und F. M Richards, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71 (1974), 3537). AA-dUTP · H&sub2;O (63 mg, 0,1 mMol) oder AA-UTP · 4H&sub2;O (70 mg, 0,1 mMol) wurden in 20 ml 0,1 M Natriumboratpuffer, pH 8,5, gelöst und mit NHSB (34,1 mg, 0,1 mMol), gelöst in 2 ml Dimethylformamid, versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde vier Stunden bei Raumtemperatur gelassen und anschließend direkt auf eine 30 ml-Säule mit DEAE-Sephadex TM A-25 aufgetragen, die mit 0,1 M TEAB, pH 7,5, voräquilibriert worden war. Die Säule wurde mit 400 ml eines linearen Gradienten (0,1 bis 0,9 M) von TEAB eluiert. Die Fraktionen, die Biotinyl-dUTP oder Biotinyl-UTP enthielten, die zwischen 0,55 und 0,65 M TEAB eluiert wurden, wurden durch Rotationsverdampfung in Gegenwart von Methanol entsalzt und wieder in Wasser gelöst. Gelegentlich kam eine leicht trübe Lösung zustande: diese Trübung, die auf eine Verunreinigung in einigen TEAB-Lösungen zurückzuführen war, wurde durch Filtration durch ein 0,45 mm-Filter entfernt. Für eine langfristige Lagerung wurden die Nucleotide in das Natriumsalz umgewandelt, indem die Lösung kurz in Gegenwart von Dowex TM 50 (Na&spplus;-Form) gerührt wurde. Nach Filtration wurde das Nucleotid durch Zusatz von drei Volumina kaltem Ethanol gefällt, mit Ethylether gewaschen, in vacuo über Natriumhydroxid-Pellets getrocknet und in einem Exsikkator bei -20ºC gelagert. Für die sofortige Verwendung wurde die Nucleotidlösung mit Tris-HCl, pH 7,5, auf 20 mM gebracht und auf eine Nucleotid-Endkonzentration von 5 mM eingestellt. Vorratslösungen wurden bei -20ºC gefroren aufbewahrt.
Die Elementaranalyse der Bio-dUTP- und Bio-UTP-Produkte ergab die folgenden Ergebnisse. Bio-dUTP (C&sub2;&sub2;H&sub3;&sub0;N&sub5;O&sub1;&sub8;P&sub3;S&sub1;Na&sub4; · 1H&sub2;O); theoretisch: C, 29,80; H, 3,38; N, 7,89; P, 10,47; S, 3,61; gefunden: C, 30,14; H, 3,22; N, 7,63; P, 10,31; S, 3,70; Bio-UTP (C&sub2;&sub2;H&sub3;&sub0;N&sub5;O&sub1;&sub9;P&sub3;S&sub1;Na&sub4; · 3H&sub2;O); theoretisch: C, 29,15; H, 3,19; N, 7,45; P, 9,89; S. 3,41; gefunden: C, 28,76; H, 3,35; N, 7,68; P, 9,81; S, 3,32.
Die Spektraleigenschaften von Bio-dUTP und Bio-UTP bei pH 7,5 [λ max 289 nm (&supmin; = 7 100); λ max 240 nm (&supmin; = 10 700); λ min 262 nm (&supmin; = 4 300)] zeigen das Vorliegen einer exocyclischen Doppelbindung in Konjugation mit dem Pyrimidinring. Diese Nucleotide ergeben auch eine stark positive Reaktion (eine orangerote Farbe), wenn sie mit p-Dimethylaminozimtaldehyd in ethanolischer Schwefelsäure behandelt werden, ein Verfahren, das zur quantitativen Biotin-Bestimmung eingesetzt wird (D. B. McCormick und J. A. Roth, Anal. Biochem. 3A. (1970), 326). Jedoch reagieren sie nicht mehr mit Ninhydrin, dies ist eine charakteristische Reaktion der Ausgangsverbindungen AA-dUTP und AA-UTP.

Beispiele 3 und 4

Synthese von Biotinyl-CTP und Biotinyl-dCTp

CTP und dCTP wurden a) mercuriert, b) mit Allylamin umgesetzt und c) mit NHS-Biotin biotinyliert, im wesentlichen wie in Beispiel 1 beschrieben. CTP (56,3 mg, 0,1 mMol) oder dCTP (59,1 mg, 0,1 mMol) wurden in 20 ml 0,1 M Natriumacetatpuffer, pH 5,0, gelöst und mit Quecksilber(II)-acetat (0,150 g, 0,5 mMol) versetzt. Die Lösung wurde 4,5 Stunden bei 50ºC erhitzt und anschließend auf Eis gekühlt. Lithiumchlorid (39,2 mg, 0,9 mMol) wurde zugegeben und die Lösung sechsmal mit Essigsäureethylester extrahiert. Die Nucleotidprodukte in der wäßrigen Phase wurden durch Zusatz von drei Volumina kaltem Ethanol gefällt und der Niederschlag abzentrifugiert. Der Niederschlag wurde mit absolutem Ethanol und Ethylether gewaschen und anschließend luftgetrocknet. Diese Produkte wurden ohne weitere Reinigung für die Synthese für AA-CTP bzw. AA-dCTP eingesetzt. Die mercurierten Nucleotide wurden in 0,1 M Natriumacetatpuffer, pH 5,0, gelöst und auf eine Konzentration von 10 mM eingestellt (92 OD/ml bei 275 nm). 0,6 ml (1,2 mMol) einer 2,0 M Allylaminacetat-Vorratslösung (hergestellt, wie in Beispiel 1 beschrieben) wurde zu 10 ml Nucleotidlösung (0,1 mMol) zugegeben, sodann folgte die Zugabe von K&sub2;PdCl&sub4; (32,6 mg, 0,1 mMol), gelöst in 1,0 ml H&sub2;O. Nach 24-stündigem Stehen bei Raumtemperatur wurde die Lösung durch eine 0,45 mm-Membran filtriert, wodurch die Metallniederschläge entfernt wurden. Das Filtrat wurde fünffach verdünnt und auf eine 50 ml-Säule mit DEAE-Sephadex A-25 aufgetragen, die mit 50 mM TEAB, pH 7,5, voräquilibriert worden war. Die Nucleotidprodukte wurden durch Anwendung von 500 ml eines linearen Gradienten (0,05 bis 0,6 M) von TEAB, pH 7,5, fraktioniert. Das gewünschte Produkt befand sich im größten UV-absorbierenden Anteil, der zwischen 0,28 und 0,38 M Salz eluiert wurde. Die vereinigten Proben wurden durch Rotationsverdampfung entsalzt, in 0,5 M Triethylammoniumacetat, pH 4,2, gelöst und die endgültige Reinigung durch HPLC-Chromatographie auf Säulen mit Partisil ODS- 2 durchgeführt, wobei 0,5 M Triethylammoniumacetat als Elutionsmittel verwendet wurde. Die geeigneten Fraktionen wurden vereinigt, gefriergetrocknet und die Produkte in H&sub2;O gelöst. Die Nucleotide wurden in das Na&spplus;-Salz umgewandelt, indem sie kurz in Gegenwart von Dowex TM 50 (Na&spplus;-Form) gerührt wurden. Nach Filtration zur Entfernung des Dowex-Harzes wurden die Nucleotide durch Zusatz von drei Volumina kaltem Ethanol gefällt. Der Niederschlag wurde mit Ether gewaschen und an schließend luftgetrocknet. Analytische Ergebnisse: AA-dCTP (C&sub1;&sub2;H&sub1;&sub7;N&sub4;O&sub1;&sub3;P&sub3;Na&sub4; · 2H&sub2;O): Theorie: C, 22,29; H, 2,63; N, 8,67; P, 14,40; gefunden: C, 22,16; H, 2,89; N, 8,77; P, 14,18; AA-CTP (C&sub1;&sub2;H&sub1;&sub7;N&sub4;O&sub1;&sub4;P&sub3;Na&sub4; · 2H&sub2;O): Theorie: C, 21,75; H, 2,57; N, 8,46; P, 14,01; gefunden: C, 22,03; H, 2,47; N, 8,69; P, 13,81; Spektraleigenschaften in 0,1 M Boratpuffer, pH 8,0, λ max 301 nm (&supmin; = 6 400); λ min 271 nm (&supmin; = 3 950); λ max 250 nm (&supmin; = 9 700). Sowohl AA-dCTP als auch AA-CTP ergeben einen positiven Ninhydrin-Test. AA-CTP (6,6 mg, 0,01 mMol) oder AA- dCTP (6,4 mg, 0,01 mMol) wurde in 5 ml 0,1 M Natriumboratpuffer, pH 8,5, gelöst und mit NHS-Biotin (3,4 mg, 0,01 mMol), gelöst in 0,2 ml Dimethylformamid, versetzt. Nach vierstündigem Absetzen bei Raumtemperatur wurde die Probe auf einer 10 ml-Säule mit DEAE-Sephadex A-25 chromatographiert, wobei als Elutionsmittel 150 ml eines linearen Gradienten (0,1 bis 0,9 M) von TEAB, pH 7,5, eingesetzt wurden. Die Fraktionen, die Biotinyl-CTP oder Biotinyl-dCTP enthielten, die zwischen 0,50 und 0,60 M TEAB eluiert wurden, wurden vereinigt, durch Rotationsverdampfung entsalzt und, nachdem sie in 0,02 M Tris-HCl-Puffer, pH 7,5, auf eine Endkonzentration von 5 mM eingestellt worden waren, bei -20ºC eingefroren. Die Produkte ergeben mit p-Dimethylaminozimtaldehyd in ethanolischer Schwefelsäure eine starke positive Reaktion auf Biotin, jedoch ist der Test auf primäre Amine mittels Besprühen mit Ninhydrin negativ. Die weitere strukturelle Charakterisierung dieser Produkte ist in Bearbeitung.

Beispiele 5 md 6

Synthese von Iminobiotinyl-UTP und Iminobiotinyl-dUTp

Iminobiotin-Hybrobromid wurde aus Biotin hergestellt, wie früher beschrieben (K. Hofmann, D. B. Melville und V. du Vigneaud, J. Biol. Chem. 141 (1941), 207-211; K. Hofmann und A. E. Axelrod, ibid. 187 (1950), 29-33). Der N-Hydroxysuccinimid (NHS)-Ester von Iminobiotin wurde hergestellt, indem das früher für die Synthese von NHS-Biotin beschriebene Protokoll angewendet wurde (H. Heitzmann und F. M. Richards, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 21 (1974), 5537). AA-UTP (7,0 mg, 0,01 mMol) oder AA-dUTP (6,3 mg, 0,01 mMol), hergestellt wie in Beispiel 1 (Abschnitt b) beschrieben, wurde in 5 ml 0,1 M Natriumborat puffer, pH 8,5, gelöst und mit NHS-Iminobiotin (3,5 mg, 0,01 mMol), gelöst in 0,5 ml Dimethylformamid, versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 12 Stunden bei Raumtemperatur gelassen und anschließend direkt auf eine 10 ml-Säule mit DEAE-Sephadex A- 25 aufgetragen, die mit 0,05 M TEAB, pH 7,5, voräquilibriert worden war. Die Säule wurde mit 150 ml eines linearen Gradienten (0,05 bis 0,06 M) von TEAB eluiert. Die Fraktionen, die Iminobiotin-UTP oder Iminobiotin-dUTP enthielten, die zwischen 0,35 und 0,40 M TEAB eluiert wurden, wurden durch Rotationsverdampfung in Gegenwart von Methanol entsalzt und in Wasser gelöst. Die Produkte enthielten als Verunreinigung eine kleine Menge Allylamin-Nucleotid-Addukt, was durch ein schwaches positives Ergebnis beim Ninhydrin-Test gezeigt wurde. Eine endgültige Reinigung wurde durch die Affinitätschromatographie auf Avidin-Sepharose erreicht. Die Fraktionen des unreinen Produktes, die mit Natriumboratpuffer, pH 8,5, auf 0,1 M gebracht wurden, wurden auf eine 5 ml-Säule mit Avidin-Sepharose aufgetragen und mit 25 ml des gleichen Puffers gewaschen. Anschließend wurde die Säule mit 50 mM Ammoniumacetatpuffer, pH 4,0, gewaschen, wobei das gewünschte Iminobiotin-Nucleotid- Produkt in einem scharfen Peak eluiert wurde. Das Nucleotid wurde durch Zusatz von drei Volumina kaltem Ethanol gefällt, mit Ethylether gewaschen und in vacuo über Natriumhydroxid- Pellets getrocknet und in einem Exsikkator bei -20ºC gelagert. Die Produkte wurden durch Elementaranalyse und außerdem durch ihre Spektral- und Chromatographieeigenschaften charakterisiert.

Beispiele 7 und 8

Synthese von NAGE-UTP und NAGE-dUTP

Allyl-(3-amino-2-hydroxy)propylether, abgekürzt NAGE, wurde aus Allylglycidylether (Age) (bezogen von Aldrich Chemical Co.) hergestellt. 10 ml Age (84 mMol) wurden langsam (im Abzug) zu 50 ml 9 M Ammoniumhydroxid zugegeben und das Gemisch sechs Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Überschüssiger Ammoniak wurde durch Rotationsverdampfung unter vermindertem Druck entfernt, wodurch ein zähflüssiges gelbes Öl erhalten wurde. Die Analyse dieses Produktes durch Protonen-NMR zeigte, daß es die erforderliche Struktur aufwies. 5-Quecksil- ber-dUTP (0,1 mMol) oder 5-Quecksilber-UTP (0,2 mMol) wurde in 2 bis 4 ml 0,2 M Natriumacetatpuffer, pH 5,0, gelöst und mit einem 16-fachen molaren Überschuß von NAGE versetzt, der vor Verwendung mit Essigsäure auf einen pH-Wert von 5,0 eingestellt wurde. Die endgültigen Reaktionsvolumina (4,3 und 8,4 ml) wiesen Nucleotidkonzentrationen von 43 bzw. 42 mM auf. Ein Äquivalent von K&sub2;PdCl&sub4; (0,1 oder 0,2 mMol) wurde zugegeben, um die Reaktion zu starten. Nach 18-stündigem Stehen bei Raumtemperatur wurden die Reaktionsgemische durch 0,45 um-Membranen filtriert, die Proben fünffach verdünnt und auf Säulen mit DEAE-Sephadex A-25 chromatographiert, wobei lineare Gradienten (0,1 bis 0,6 M) von Natriumacetat verwendet wurden. Die Fraktionen, die die gewünschten Produkte enthielten, was durch ihre UV-Spektren und ihre charakteristischen HPLC-Elutionsprofile auf Partisil ODS-2 festgestellt wurde, wurden vereinigt, verdünnt und durch erneute Chromatographie auf DEAE-Sephadex weiter gereinigt, wobei flache Gradienten (0,1 bis 0,5 M) von Ammoniumbicarbonat, pH 8,5, verwendet wurden. Unter diesen Bedingungen konnte der größte Teil des NAGE-dUTP (oder NAGE-UTP) von den restlichen Verunreinigungen sauber getrennt werden. In diesem Stadium der Reinigung wurden Protonen-NMR-Spektren aufgenommen, nachdem die Nucleotide gefriergetrocknet und wieder in D&sub2;O gelöst worden waren. Für die Elementaranalyse wurden die Produkte in ihre Natriumsalz-Form überführt. Typische analytische Ergebnisse sehen folgendermaßen aus: NAGE-dUTP (C&sub1;&sub5;H&sub2;&sub2;N&sub3;O&sub1;&sub6;P&sub3;Na&sub4; · 2H&sub2;O); Theorie: C, 24,99; H,3,63; N, 5,83; P, 12,88; gefunden: C, 25,39; H, 3,71; N,5,63; P, 12,88.

Beispiel 9

Verwendung markierter DNA-Sequenzen

I. Karyotypisierung

(a) Aus einer menschlichen Genbank werden etwa 100 bis 200 Clone ausgewählt. Diese werden markiert, wie vorstehend beschrieben, und für jeden Clon seine Stelle oder Stellen der Hybridisierung visuell oder mit einem Schwachlicht-Videosystem ermittelt. Für die Clone, die einer einmaligen Gensequenz entsprechen, wird damit die Lage der clonierten DNA auf einem bestimmten menschlichen Chromosom gezeigt. Für jedes Chromosom werden mehrere Clone eingesetzt. Jeder dieser markierten Clone kann verwendet werden, um bestimmte Chromosomen zu identifizieren. Sie können auch in Kombination eingesetzt werden, wodurch jedes der 46 Chromosomen als eines der 22 autosomalen Paare oder als das X- oder das Y-Chromosom identifiziert werden kann. Wenn man einen Satz von markierten Clonen mit den Chromosomen hybridisieren läßt und anschließend eine fluoreszierende Färbung an die Markierung anfügt, kann man auf diese Weise den Satz von Clonen und ihre Positionen sichtbar machen, wobei sie mit einer bestimmten Farbe fluoreszieren. Ein zweiter Satz von markierten Clonen kann sodann eingesetzt und mit einem zweiten fluoreszierenden Farbstoff umgesetzt werden. Die gleiche Vorgehensweise kann mehrmals wiederholt werden. Auf diese Weise kann man erreichen, sofern gewünscht, daß an der zellulären DNA mehrere Sätze von fluoreszierenden Markierungen an verschiedenen, jedoch spezifischen Stellen jedes Chromosoms angelagert werden. Anhand dieser Markierungen kann eine visuelle oder eine computerisierte automatische Karyotypisierung durchgeführt werden.
(b) Für die automatische Karyotypisierung kann ein Satz von Clonen eingesetzt werden, wobei die ungefähre Lage jedes der 46 Chromosomen bestimmt werden kann, indem Gruppen von Punkten gefunden werden, die der Zahl der Markierungsstellen auf jedem Chromosom entsprechen. Auf diese Weise ist es möglich, durch Computeranalyse der digitalisierten Bilder zu bestimmen, ob die Chromosomen für die weitere Analyse ausreichend gespreitet sind. Sofern sie ausreichend gespreitet sind, kann anhand der Computeranalyse jedes einzelne Chromosom durch die Lage und die Verteilung der markierten Punkte auf dem Chromosom identifiziert werden.
Aufgrund der Tatsache, daß die fluoreszierenden Punkte an spezifischen Stellen auf jedem Chromosom gesetzt werden können, kann man eine manuelle oder eine automatische Karyotypisierung sehr viel effizienter durchführen als ohne solche Markierungen.

II. Diagnose genetischer Störungen

Indem man die Clone auswählt, die spezifisch an ein bestimmtes Chromosom, z. B. die Nummer 23, binden, ist es mög lich, die Zahl der Kopien des bestimmten Chromosoms in einer Zelle zu zählen, auch wenn die Chromosomen nicht kondensiert in der Metaphase vorliegen. Wenn somit fetale Zellen zur pränatalen Diagnose der Trisomie 21 erhalten werden, kann die Diagnose auch dann durchgeführt werden, wenn die Chromosomen nicht kondensiert in der Metaphase vorliegen. Sofern erforderlich können zwei Sätze von Markierungen verwendet werden - einer, der für Chromosom 23 spezifisch ist, und einer, der für ein anderes Chromosom spezifisch ist. Wenn man nun in jeder Zelle das Verhältnis der beiden Markierungen, die z. B. unterschiedliche Farben aufweisen, mißt, kann man die Zellen identifizieren, die eine abnorme Zahl der Chromosomen Nr. 23 zeigen. Dieses Verfahren kann entweder auf Objektträgern mit einem Schwachlicht-Videosystem oder in einem Durchflußcytometer- System unter Einsatz von Laseranregung erfolgen. Anhand dieses Verfahrens kann eine beliebige abnorme Chromosomenzahl bestimmt werden.

III. Nachweis und Identifizierung von Mikroorganismen

Die Markierung spezifischer DNA-Sequenzen, wie vorstehend beschrieben, ermöglicht die Identifizierung und die Zählung individueller Bakterien. Um die individuellen Bakterien identifizieren zu können, mit denen ein bestimmtes DNA-Fragment hybridisiert, muß die Empfindlichkeit so groß sein, daß eine einzelne markierte Struktur nachgewiesen werden kann. Dies kann erreicht werden, indem ein Schwachlicht-Videosystem und die Summenbildung der Bilder durch den Computer oder indem eine andere Vorrichtung zum Intensivieren des Bildes eingesetzt wird. Auch ein Fließsystem kann verwendet werden, sofern die Empfindlichkeit groß genug ist. Wenn man die Bakterien auf einem Objektträger immobilisiert, kann man ihre Lage feststellen und die Zahl dieser fluoreszierenden Punkte zählen. Auf diese Weise erhält man die Anzahl aller derjenigen Bakterien, die DNA enthalten, die mit dem spezifischen eingesetzten Clon hybridisieren kann. Wenn der Clon so ausgewählt wird, daß er für einen bestimmten Bakterienstamm spezifisch ist, kann man die Anzahl der Organismen dieses Stammes zählen. Außerdem kann auf ähnliche Weise eine beliebige Antibiotikaresistenz, für die ein bestimmtes Gen identifiziert wurde, charakterisiert werden, wobei als Sonde die DNA-Sequenz verwendet wird, die im Antibiotikaresistenz-Gen enthalten ist. Ferner könnte eine Sonde eingesetzt werden, die für ein Resistenz-Plasmid spezifisch ist, das eines oder mehrere Antibiotikaresistenz-Gene enthält. Zusätzlich zu individuellen Bakterien können noch Gruppen von bakteriellen Zellen eines bestimmten Stamms nachgewiesen und ihre Zahl abgeschätzt werden, sofern sie in einem kleinen Bereich liegen, so daß die Gesamtfluoreszenz, die für die hybridisierte DNA spezifisch ist, in dem Bereich gemessen werden kann. Auf diese Weise kann die Anzahl der Organismen, die eine spezifische DNA-Sequenz enthalten, in einem Gemisch von Bakterien gemessen werden.

Claims

1. Oligo- oder Polynucleotid, das ein Nucleotid der folgenden Struktur enthält,

wobei B einen Purin-, 7-Desazapurin- oder Pyrimidinrest darstellt, der an der Position C1' des Zuckerrestes kovalent gebunden ist, mit der Maßgabe, daß, wenn B ein Purin oder 7-Desazapurin ist, der Zuckerrest an der Position N&sup9; des Purins oder 7-Desazapurins angelagert ist, und wenn B ein Pyrimidin ist, der Zuckerrest an der Position N¹ des Pyrimidins angelagert ist;

wobei A mindestens drei Kohlenstoffatome umfaßt und mindestens eine Komponente einer Signaleinheit darstellt, die befähigt ist, ein nachweisbares Signal zu erzeugen, mit der Maßgabe, daß A nicht Biotin oder Iminobiotin ist;

wobei B und A direkt oder über eine Bindungsgruppe kovalent gekoppelt sind, wodurch die charakteristische Fähigkeit des Oligo- oder Polynucleotids, mit einer Nucleinsäure zu hybridisieren, nicht wesentlich beeinträchtigt wird und die Erzeugung der Signaleinheit oder der Nachweis des nachweisbaren Signals nicht wesentlich beeinträchtigt wird, mit der Maßgabe, daß, wenn B ein Purin ist, A oder die Bindungsgruppe an der Position 8 des Purins angelagert ist, wenn B ein 7-Desazapurin ist, A oder die Bindungsgruppe an der Position 7 des Desazapurins an gelagert ist, und wenn B ein Pyrimidin ist, A oder die Bindungsgruppe an der Position 5 des Pyrimidins angelagert ist;

wobei einer der Reste x und y einen Rest der Formel

bedeutet und der andere der Reste x und y fehlt oder eine Hydroxylgruppe oder ein Wasserstoffatom darstellt; und

wobei z ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxylgruppe bedeutet.

2. Oligo- oder Polynucleotidsequenz, die mindestens einen Rest der Struktur

-BA

umfaßt, wobei B einen Purin-, 7-Desazapurin oder Pyrimidinrest darstellt, der für den Einbau in ein Polynucleotid geeignet ist; und

wobei B und A direkt oder über eine Bindungsgruppe kovalent gekoppelt sind, wodurch die charakteristische Fähigkeit der Sequenz, mit einer Nucleinsäure zu hybridisieren, nicht wesentlich beeinträchtigt wird und die Erzeugung der Signaleinheit oder der Nachweis des nachweisbaren Signals nicht wesentlich beeinträchtigt wird, mit der Maßgabe, daß, wenn B ein Purin ist, A oder die Bindungsgruppe an der Position 8 des Purins angelagert ist, wenn B ein 7-Desazapurin ist, A oder die Bindungsgruppe an der Position 7 des Desazapurins angelagert ist, und wenn B ein Pyrimidin ist, A oder die Bindungsgruppe an der Position 5 des Pyrimidins angelagert ist.

3. Oligo- oder Polynucleotid, das einen Zuckerrest der folgenden Struktur enthält,

wobei A mindestens drei Kohlenstoffatome umfaßt und mindestens eine Komponente einer Signaleinheit darstellt, die befähigt ist, ein nachweisbares Signal zu erzeugen, mit der Maßgabe, daß A nicht Biotin oder Iminobiotin ist; und

wobei B und A direkt oder über eine Bindungsgruppe kovalent gekoppelt sind, wodurch die charakteristische Fähigkeit des Oligo- oder Polynucleotids, mit einer Nucleinsäure zu hybridisieren, nicht wesentlich beeinträchtigt wird und die Erzeugung der Signaleinheit oder der Nachweis des nachweisbaren Signals nicht wesentlich beeinträchtigt wird, auch mit der Maßgabe, daß, wenn B ein Purin ist, A oder die Bindungsgruppe an der Position 8 des Purins angelagert ist, wenn B ein 7-Desazapurin ist, A oder die Bindungsgruppe an der Position 7 des Desazapurins angelagert ist, und wenn B ein Pyrimidin ist, A oder die Bindungsgruppe an der Position 5 des Pyrimidins angelagert ist.

4. Oligo- oder Polynucleotid nach Anspruch 3, wobei an der Position C3' des Zuckerrestes ein Rest der Formel angelagert ist, der aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist

5. Oligo- oder Polynucleotid nach Anspruch 3, wobei an der Position C5' des Zuckerrestes ein Rest der Formel angelagert ist, der aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist

6. Oligo- oder Polynucleotid nach Anspruch 3, wobei an der Position C2' des Zuckerrestes ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxylgruppe angelagert ist.

7. Oligo- oder Polynucleotid oder Sequenz nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei B ein Pyrimidin ist.

8. Oligo- oder Polynucleotid oder Sequenz nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei B aus der Gruppe ausgewählt ist, die Uracil, Cytosin, Desazaadenin und Desazaguanin umfaßt.

9. Oligo- oder Polynucleotid oder Sequenz nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei die Bindungsgruppe eine olefinische Bindung an der Position α, bezogen auf B, umfaßt.

10. Oligo- oder Polynucleotid oder Sequenz nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei die Bindungsgruppe den Rest der Formel -CH&sub2;-NH- umfaßt.

11. Oligo- oder Polynucleotid oder Sequenz nach Anspruch 9, wobei die olefinische Bindungsgruppe den Rest der Formel -CH=CH-CH&sub2;-NH- darstellt.

12. Oligo- oder Polynucleotid nach Anspruch 9, wobei die olefinische Bindungsgruppe den Rest der Formel

13. Oligo- oder Polynucleotid nach Anspruch 1, wobei z eine Hydroxylgruppe darstellt.

14. Oligo- oder Polynucleotid nach Anspruch 1, wobei z ein Wasserstoffatom darstellt.

15. Oligo- oder Polynucleotid oder Sequenz nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei A einen Rest darstellt, der aus mindestens fünf Kohlenstoffatomen besteht.

16. Oligo- oder Polynucleotid oder Sequenz nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei A einen Liganden darstellt.

17. Oligo- oder Polynucleotid oder Sequenz nach Anspruch 16, wobei der Ligand aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Hapten, einem Antigen und einem Cofaktor besteht.

18. Oligo- oder Polynucleotid oder Sequenz nach Anspruch 16, wobei der Ligand aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Dinitrophenol, Liponsäure und einer olefinischen Verbindung besteht.

19. Oligo- oder Polynucleotid oder Sequenz nach Anspruch 16, wobei der Ligand befähigt ist, einen Komplex zu erzeugen, indem er sich mit einem nachweisbaren Polypeptid verbindet.

20. Oligo- oder Polynucleotid oder Sequenz nach Anspruch 19, wobei das nachweisbare Polypeptid aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Antikörper, einem Enzym, Streptavidin und Avidin besteht.

21. Oligo- oder Polynucleotid oder Sequenz nach Anspruch 19, wobei ein Indikatormolekül mit dem nachweisbaren Polypeptid assoziiert ist oder daran gebunden ist.

22. Oligo- oder Polynucleotid oder Sequenz nach Anspruch 21, wobei das Indikatormolekül fluoreszierend ist, elektronendicht ist oder ein Enzym darstellt, das befähigt ist, unlösliche Reaktionsprodukte abzulagern.

23. Oligo- oder Polynucleotid oder Sequenz nach Anspruch 22, wobei das Enzym aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus alkalischer Phosphatase, Peroxidase und β-Galactosidase besteht.

24. Oligo- oder Polynucleotid oder Sequenz nach Anspruch 22, wobei das fluoreszierende Indikatormolekül aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Fluorescein und Rhodamin besteht.

25. Oligo- oder Polynucleotid oder Sequenz nach Anspruch 22, wobei das elektronendichte Indikatormolekül aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Ferritin, Hämocyanin und kolloidalem Gold besteht.

26. Oligo- oder Polynucleotid oder Sequenz nach Anspruch 21, wobei das Indikatormolekül an das nachweisbare Polypeptid kovalent gebunden ist.

27. Oligo- oder Polynucleotid oder Sequenz nach Anspruch 21, wobei das nachweisbare Polypeptid indirekt nachweisbar ist, indem das nachweisbare Polypeptid mit einem zweiten Polypeptid, das mit einem Indikatormolekül kovalent verknüpft ist, spezifisch komplexiert wird.

28. Oligo- oder Polynucleotid oder Sequenz nach Anspruch 27, wobei das nachweisbare Polypeptid aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Avidin und Streptavidin besteht.

29. Oligo- oder Polynucleotid oder Sequenz nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei A ein Indikatormolekül umfaßt.

30. Oligo- oder Polynucleotid oder Sequenz nach Anspruch 29, wobei das Indikatormolekül fluoreszierend ist, elektronendicht ist oder ein Enzym darstellt, das befähigt ist, unlösliche Reaktionsprodukte abzulagern.

31. Oligo- oder Polynucleotid oder Sequenz nach Anspruch 30, wobei das Enzym aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus alkalischer Phosphatase, Peroxidase und β-Galactosidase besteht.

32. Oligo- oder Polynucleotid oder Sequenz nach Anspruch 30, wobei das fluoreszierende Indikatormolekül aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Fluorescein und Rhodamin besteht.

33. Oligo- oder Polynucleotid oder Sequenz nach Anspruch 30, wobei die elektronendichte Verbindung aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Ferritin, Hämocyanin und kolloidalem Gold besteht.

34. Oligo- oder Polynucleotid oder Sequenz nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei A ein Polypeptid ist.

35. Verfahren zur Herstellung des Oligo- oder Polynucleotids nach Anspruch 1, das die folgenden Schritte umfaßt:

(a) Umsetzung eines Oligo- oder Polynucleotids, das ein Nucleotid der folgenden Struktur enthält,

mit einem Quecksilbersalz in einem geeigneten Lösungsmittel unter geeigneten Bedingungen, so daß ein mercuriertes Derivat der folgenden Struktur erzeugt wird:

(b) Umsetzung des mercurierten Derivats mit einem chemischen Rest, der mit der -Hg&spplus;-Einheit der mercurierten Verbindung reagiert und durch die Formel ···N dargestellt ist, wobei die Umsetzung in einem wäßrigen Lösungsmittel und in Gegenwart einer Palladium-enthaltenden Verbindung unter geeigneten Bedingungen durchgeführt wird, so daß eine Verbindung der folgenden Struktur erzeugt wird,

wobei N einen reaktiven terminalen funktionellen Rest darstellt oder A ist; und,

(c) wenn N A bedeutet, Gewinnung des Oligo- oder Polynucleotids nach Anspruch 1; oder, wenn N einen reaktiven terminalen Rest darstellt, Umsetzung der Verbindung mit einer Verbindung der Struktur M-A, wobei M einen funktionellen Rest darstellt, der in einem wäßrigen Lösungsmittel unter geeigneten Bedingungen mit N reagiert, so daß das Oligo- oder Polynucleotid nach Anspruch 1 erzeugt wird, und Gewinnung des Oligo- oder Polynucleotids.

36. Verfahren nach Anspruch 35, wobei die geeigneten Bedingungen einen pH-Wert im Bereich von etwa 4 bis 8, eine Temperatur im Bereich von etwa 20 bis 30ºC und eine Reaktionszeit von etwa 3 bis 24 Stunden umfassen.

37. Verfahren nach Anspruch 35, wobei das Quecksilbersalz Quecksilber(II)-acetat ist.

38. Verfahren nach Anspruch 35, wobei die Palladium-enthaltende Verbindung K&sub2;PdCl&sub4; ist.

39. Verfahren nach Anspruch 35, wobei der durch die Formel ···N dargestellte chemische Rest -CH= CH-CH&sub2;-NH&sub2; bedeutet.

40. Verfahren nach Anspruch 35, wobei der durch die Formel ···N dargestellte chemische Rest

bedeutet.

41. Verfahren nach Anspruch 35, wobei die wäßrigen Lösungsmittel einen Puffer umfassen.

42. Verfahren nach Anspruch 41, wobei der Puffer aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Natriumacetat, Kaliumacetat, Natriumcitrat, Kaliumcitrat, Kaliumcitrat-Phosphat, Tris-Acetat und Borat-Natriumhydroxid besteht.

43. Verfahren nach Anspruch 41, wobei die Konzentration des Puffers unter etwa 2,0-molar liegt.

44. Verfahren nach Anspruch 35, wobei in Schritt (b) das wäßrige Lösungsmittel außerdem ein organisches Lösungsmittel umfaßt.

45. Verfahren nach Anspruch 44, wobei das organische Lösungsmittel mit Wasser mischbar ist.

46. Verfahren nach Anspruch 44, wobei das organische Lösungsmittel aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Alkoholen, Ketonen und Amiden besteht.

47. Verfahren nach Anspruch 46, wobei das organische Lösungsmittel aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Methanol, Ethanol, Propanol, Glycerin, Dioxan, Aceton, Pyridin und Dimethylformamid besteht.

48. Verfahren nach Anspruch 35, wobei M einen N-Hydroxysuccinimidester darstellt.

49. Verfahren nach Anspruch 35, wobei M aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Imidat, Anhydrid, Isothiocyanat und Epoxid besteht.

50. Verfahren nach Anspruch 35, wobei ···N aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Thiol, Carbonsäure, Epoxid und Amin besteht.

51. Doppelsträngige Polynucleotid-Duplex, die das Oligo- oder Polynucleotid nach Anspruch 1 oder 3 umfaßt.

52. Duplex nach Anspruch 51, wobei die Polynucleotidstränge Ribonucleinsäuremoleküle sind.

53. Duplex nach Anspruch 51, wobei die Polynucleotidstränge Desoxyribonucleinsäuremoleküle sind.

54. Verfahren, mit dem das Vorliegen oder die Abwesenheit einer Nucleinsäure in einer Probe nachgewiesen werden kann, umfassend (a) das Inkontaktbringen der Probe mit dem Oligo- oder Polynucleotid nach Anspruch 1 oder 3 unter Hybridisierungsbedingungen und (b) den Nachweis des Oligo- oder Polynucleotids, wodurch die Nucleinsäure nachgewiesen wird.

55. Verfahren nach Anspruch 54, wobei A ein Ligand ist.

56. Verfahren nach Anspruch 55, wobei der Ligand befähigt ist, durch Bindung an ein nachweisbares Polypeptid einen Komplex zu erzeugen.

57. Verfahren nach Anspruch 56, wobei das nachweisbare Polypeptid aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Antikörper, einem Enzym, das befähigt ist, unlösliche Reaktionsprodukte abzulagern, Streptavidin und Avidin besteht.

58. Verfahren nach Anspruch 56, wobei die Probe mit dem nachweisbaren Polypeptid in Kontakt gebracht wird, nachdem die Hybridisierung des Oligo- oder Polynucleotids nach Anspruch 1 oder 3 mit der Nucleinsäure unter geeigneten Bedingungen zur Erzeugung des Komplexes erfolgt ist.

59. Verfahren nach Anspruch 54, wobei die Probe mit einem Oligo- oder Polynucleotid nach Anspruch 1 oder 3 in Kontakt gebracht wird, wobei A ein erstes Indikatormolekül ist, und weiter mit einem Oligo- oder Polynucleotid nach Anspruch 1 oder 3 in Kontakt gebracht wird, wobei A ein zweites Indikatormolekül ist.

60. Verfahren nach Anspruch 59, wobei man das Oligo- oder Polynucleotid nach Anspruch 1 oder 3, das mit dem ersten Indikator markiert ist, mit der Nucleinsäure hybridisieren läßt und es nachgewiesen wird, und man anschließend das Oligo- oder Polynucleotid nach Anspruch 1 oder 3, das mit dem zweiten Indikator markiert ist, mit der Nucleinsäure hybridisieren läßt und es nachgewiesen wird.

61. Verfahren nach Anspruch 54, wobei die Signaleinheit befähigt ist, ein nachweisbares Signal zu erzeugen, wenn das Oligo- oder Polynucleotid nach Anspruch 1 oder 3 in eine doppelsträngige Ribonucleinsäure, Desoxyribonucleinsäure- Duplex oder ein DNA-RNA-Hybrid eingebaut ist.

62. Verfahren nach Anspruch 54, wobei der Nachweisschritt (b) durchgeführt wird, wenn das Oligo- oder Polynucleotid nach Anspruch 1 oder 3 mit der Nucleinsäure hybridisiert ist.

63. Verfahren nach Anspruch 54, wobei die Nucleinsäure auf einem festen Träger immobilisiert ist.

64. Verfahren nach Anspruch 54, wobei die Nucleinsäure aus einem lebenden Organismus stammt.

65. Verfahren nach Anspruch 64, wobei der lebende Organismus aus der Prokaryonten und Eukaryonten umfassenden Gruppe ausgewählt ist.

66. Verfahren nach Anspruch 54, wobei vermutet wird, daß die Probe einen Krankheitserreger enthält, und die Nucleinsäure mit dem Krankheitserreger assoziiert ist.

67. Verfahren nach Anspruch 66, wobei die Probe menschlichen oder tierischen Ursprungs ist und der Krankheitserreger aus der Gruppe ausgewählt ist, die Bakterien, Viren und Pilze umfaßt.

68. Verfahren nach Anspruch 54, wobei die Probe einen Mikroorganismus umfaßt, von dem angenommen wird, daß er eine Nucleinsäure enthält, die Resistenz gegenüber einem Antibiotikum verleiht, und wobei das Oligo- oder Polynucleotid nach Anspruch 1 oder 3 mindestens zum Teil zu der Nucleinsäure des Mikroorganismus komplementär ist, die die Resistenz gegenüber dem Antibiotikum verleiht.

69. Verfahren nach Anspruch 68, wobei, wenn der Mikroorganismus Streptococcus pyrogenes oder Neisseria meningitidis ist, das Antibiotikum Penicillin ist, wenn der Mikroorganismus Staphylococcus aureus, Candida albicans, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus pyrogenes oder Neisseria gonorrhoeae ist, das Antibiotikum ein Tetracyclin ist, und wenn der Mikroorganismus Mycobacterium tuberculosis ist, das Antibiotikum ein Aminoglykosid ist.

70. Verfahren nach Anspruch 54, wobei angenommen wird, daß die Probe eine Nucleinsäure enthält, die mit einer genetischen Störung assoziiert ist, und wobei das Oligo- oder Polynucleotid nach Anspruch 1 oder 3 mindestens zum Teil zu der mit der genetischen Störung assoziierten Nucleinsäure komplementär ist.

71. Verfahren nach Anspruch 54, wobei angenommen wird, daß die Probe eine Nucleinsäure enthält, die mit Thalassämie assoziiert ist oder die bei Thalassämie fehlt, wobei das Oligo- oder Polynucleotid nach Anspruch 1 oder 3 mindestens zum Teil zu der Nucleinsäure komplementär ist, die mit dieser Krankheit assoziiert ist oder die bei Thalassämie-Patienten fehlt.

72. Verfahren nach Anspruch 54 für eine chromosomale Karyotypisierung, umfassend das Inkontaktbringen der Probe mit einer Reihe von Oligo- oder Polynucleotiden nach Anspruch 1 oder 3, die zu einer Reihe von bekannten genetischen Nucleinsäuren, die auf Chromosomen liegen, komplementär sind.

73. Verfahren nach Anspruch 54, wobei angenommen wird, daß die Probe eine Nucleinsäure enthält, die die Expression eines Polypeptids codiert, das mit einer Tumorzelle assoziiert ist, und wobei das Oligo- oder Polynucleotid nach Anspruch 1 oder 3 mindestens zum Teil zu der Messenger- Ribonucleinsäure komplementär ist, die von einer an der Herstellung des Polypeptids beteiligten Desoxyribonucleinsäure transkribiert wird.

74. Verfahren nach Anspruch 73, wobei das Polypeptid alpha- Fetoprotein ist.