JP2007215496A

JP2007215496A - 核酸解析法におけるプローブ核酸の蛍光標識方法

Info

Publication number: JP2007215496A
Application number: JP2006040725A
Authority: JP
Inventors: Hidekatsu Yoneda; 英克米田; Manabu Harada; 学原田; Yasuhide Okumoto; 泰秀奥本
Original assignee: FILGEN Inc
Current assignee: FILGEN Inc
Priority date: 2006-02-17
Filing date: 2006-02-17
Publication date: 2007-08-30

Abstract

【課題】ターゲット核酸の蛍光標識を短時間に行うことができ、遺伝子発現解析を短時間で、かつハイスループットに行うことを可能にする。ターゲット核酸に対して蛍光分子を定量標識することができ、遺伝子発現の定量解析を可能にする。ターゲット核酸の蛍光標識を短時間に行うことができ、遺伝子発現解析を短時間で、かつ低コストに行うことを可能にする。ターゲット核酸に対して蛍光分子を定量標識することができ、遺伝子発現の定量解析を可能にする。
【解決手段】固相合成法によりヌクレオチドが配列されたプライマーの末端に蛍光分子を結合する工程と、蛍光標識されたプライマーをプローブ核酸に結合させる工程とによりプローブ核酸を蛍光標識してターゲット核酸の遺伝子発現量を解析可能にする。
【選択図】図２

Description

本発明は、多数のRNAやDNA等のターゲット核酸を使用して遺伝子発現を解析する核酸解析法に使用するプローブ核酸の蛍光標識方法に関する。

近年、疾患の特定や臨床検査、組換え作物、微生物検査、各種診断や検査、また疾患に有効な薬物の特定と創薬等を可能にするため、ゲノムの遺伝子発現の解析が行われている。遺伝子発現の解析方法としては、例えば基板上にターゲット核酸である多数のDNAが固相配列されたDNAチップを使用し、DNAに、細胞から抽出されてmRNAに対して蛍光標識したプローブ核酸と基板上のターゲット核酸とのハイブリダイゼーションにより細胞内の遺伝子の発現を特定可能にしている。

ハイブリダイゼーションしたmRNAを特定するには、mRNAを蛍光分子で標識し、ターゲット核酸にハイブリダイゼーションしたmRNAにレーザ光を照射して標識された蛍光分子を励起させて検出することにより特定している。

mRNAに蛍光分子を標識する従来の方法としては、mRNAを鋳型として逆転写反応によりそれぞれの蛍光分子が結合したヌクレオチドを取込ませてプローブ核酸を作製する方法が公知である。しかしながら、上記方法により得られたプローブ核酸は、遺伝子配列や鎖長により取込まれる蛍光分子数にバラツキが生じるため、同一遺伝子の発現差は有効に解析できるが、蛍光分子の発光量（強度）にバラツキが発生して、遺伝子発現量を定量解析できない問題を有している。

この問題点は、更にリアルタイムPCR法等により、mRNAを増幅させながらその蛍光量を定量することにより遺伝子発現を定量解析することができるが、１回の実験での解析処理サンプル数に限界があり、ロースループットである問題を有している。
特開２００１−２８９８５１号公報

解決しようとする問題点は、ターゲット核酸を蛍光標識するのに時間がかかり、遺伝子発現定量解析を短時間で、かつハイスループットに行えない点にある。ターゲット核酸に対して蛍光分子を定量標識することができず、遺伝子発現を定量解析できない点にある。

本発明の請求項１は、多数のターゲット核酸に対し、蛍光標識されたプローブ核酸をハイブリダイゼーションして蛍光物質を励起することにより遺伝子発現を解析する核酸解析法において、固相合成法によりヌクレオチドが配列されたプライマーの末端に蛍光分子を結合する工程と、蛍光標識されたプライマーをプローブ核酸に結合させる工程とによりプローブ核酸を蛍光標識してターゲット核酸の遺伝子発現量を解析可能にすることを特徴とする。

請求項２は、多数のターゲット核酸に対し、蛍光標識されたプローブ核酸をハイブリダイゼーションして標識された蛍光分子を励起することにより遺伝子発現を解析する核酸解析法において、固相合成法によりヌクレオチドが配列されたプライマーの末端をアミノ修飾する工程と、アミノ修飾されたプライマーの末端に蛍光分子を共有結合する工程と、蛍光標識されたプライマーをプローブ核酸に結合させる工程とによりプローブ核酸を蛍光標識してターゲット核酸の遺伝子発現量を解析可能にすることを特徴とする。

請求項３は、多数のターゲット核酸に対し、蛍光標識されたプローブ核酸をハイブリダイゼーションして標識された蛍光物質を励起することにより遺伝子発現を解析する核酸解析法において、固相合成法によりヌクレオチドが連続配列されたプライマーの末端を一方の結合パートナーにより修飾する工程と、一方の結合パートナーにより修飾されたプライマーをプローブ核酸に結合させる工程と、結合パートナー修飾プライマーを結合させたプローブ核酸をターゲット核酸に結合させる工程と、ターゲット核酸に結合したプローブ核酸に修飾された一方の結合パートナーに対して、他方の結合パートナーを有する蛍光分子を相互作用させる工程とによりプローブ核酸を蛍光標識してターゲット核酸の遺伝子発現量を解析可能にすることを特徴とする。

本発明は、ターゲット核酸の蛍光標識を短時間に行うことができ、遺伝子発現解析を短時間で、かつハイスループットに行うことを可能にする。また、ターゲット核酸に対して蛍光分子を定量標識することができ、遺伝子発現の定量解析を可能にする。

本発明は、固相合成法によりヌクレオチドが配列されたプライマーの末端に蛍光分子を結合する工程と、蛍光標識されたプライマーをプローブ核酸に結合させる工程とによりターゲット核酸を蛍光標識することを最良の形態とする。

以下に実施形態を示す図に従って本発明を説明する。
図１に示すように、真核生物の細胞から抽出されたプローブ核酸としてのmRNAは、5'・・・・・・・・AAAA3'の3'末端にポリアデニン（poly A）が付加されている。一方、プライマーとしてのoligo-dTは、ホスホロアミダイト法等の固相合成法によりヌクレオチドが連続配列されたd・・・TTTTで、その5'末端に蛍光分子Fluorが結合される。

上記蛍光物質Fluorは、CyDye化合物、alexa化合物で、CyDye化合物の具体例としては、Cy３、Cy５、Cy７（いずれも商品名）、alexa化合物の具体例としては、「alexa Fluor 555」、「alexa Fluor 647」（何れも商品名）が適している。

そして図２に示すように、上記mRNAの溶液及び5'末端に蛍光物質が共有結合されたoligo-dTの溶液を混ぜ合せると、oligo-dTは、mRNA 3'末端のポリアニデル酸poly Aを標的としてmRNAのヌクレオチドA・・・Aに対してoligo-dTのヌクレオチドT・・・Tが水素結合と塩基の重なりによるスタッキング相互作用により結合し、mRNA 3'末端にoligo-dTを介して蛍光分子Fluorを標識させる。

mRNAは、１分子毎に蛍光分子Fluorが3'末端に結合して蛍光標識されるため、mRNAの分子数と蛍光分子Fluorが一致して蛍光発光量が比例関係になるため、異なる遺伝子間の定量解析を可能にさせる。

図３に示すように、上記と同様にして生成されたoligo-dTの5'末端を、アミノ修飾ホスホアミダイト試薬等によりアミノ基化させる。そしてアミノ基化されたoligo-dTの5'末端に対し、蛍光分子Fluorを共有結合により強固に結合される。

図４に示すように、上記mRNAの溶液及び5'末端に蛍光物質が特異結合されたoligo-dTの溶液を混ぜ合せると、oligo-dTは、mRNA 3'末端のポリアニデル酸poly Aを標的としてmRNAのヌクレオチドA・・・Aに対してoligo-dTのヌクレオチドT・・・Tが水素結合と塩基の重なりによるスタッキング相互作用により結合し、mRNA 3'末端に蛍光分子Fluorを標識させる。

本実施例においては、oligo-dTに対して蛍光分子Fluorが共有結合されるため、mRNAの蛍光標識を安定化させることができる。

尚、上記実施例１及び２において蛍光標識されたmRNAの溶液を、DNAチップの基板表面に固相配列されたターゲット核酸としてDNAにスポッティングし、相補関係になるDNA とmRNAをハイブリダイゼーションさせる。その後、緩衝液により基板表面からハイブリダイゼーションしていないmRNAを洗浄した後、基板の表面にレーザ光を照射してDNA にハイブリダイゼーションしたmRNAに標識された蛍光分子Fluorを励起してmRNAがハイブリダイゼーションしたDNAに基づいてmRNAを特定する。

図５に示すように、上記したoligo-dTの5'末端を、ビオチンで修飾される。図５においては、oligo-dTの5'末端がビオチンで修飾された例を示す。

そしてmRNAの溶液に、ビオチン修飾されたoligo-dTの溶液を混ぜ合せると、図６に示すようにmRNAに対し、ビオチン修飾されたoligo-dTを、3'末端のポリアデニンpoly Aを標的にしてヌクレオチドA及びTの水素結合と塩基の重なりによるスタッキング相互作用により結合させる。

図７に示すように、上記3'末端にビオチン修飾されたoligo-dTが結合されたmRNAの溶液を、DNAチップの基板表面に固相配列された各DNA をスポッティングし、相補関係にあるDNA とmRNAをハイブリダイゼーションさせる。
その後、緩衝液により基板表面からハイブリダイゼーションされていないmRNAを洗浄した後、図８に示すようにRNAチップにおける基板上のDNA にハイブリダイゼーションしたmRNAに複数分子のアビジン、ストレプトアビジン等によりアビジン修飾された蛍光分子Fluorの溶液を混合させると、mRNAの3'末端に共有結合したoligo-dTに修飾されたビオチンに対し、蛍光分子Fluorに修飾されたアビジンが相互作用してmRNAを蛍光標識させる。このとき、アビジンに複数の蛍光分子が標識されているため、mRNAに対して複数の蛍光分子Fluorが結合してmRNAを蛍光標識させる。

尚、mRNAに標識される蛍光分子Fluorの数は、アビジンに結合している蛍光分子数を調整することにより任意に設定することができる。

上記処理後、上記と同様にDNA チップの基板表面を洗浄して余分な蛍光分子Fluor溶液を除去した後、DNAチップの基板表面にレーザ光を照射してDNAにハイブリダイゼーションしたmRNAに標識された蛍光分子Fluorを励起させる。このとき、上記のようにmRNA、１分子に対して複数分子の蛍光分子Fluorが標識されるため、蛍光発光量（発光強度）を高くすることができ、遺伝子発現を高感度で検出することができる。

上記実施例１乃至３においては、基板上に多数のDNA を固相配列したDNA チップに使用した遺伝子発現解析法としたが、容器やチューブ内に多数のターゲット核酸を液相し、これに上記方法で蛍光標識されたプローブ核酸をハイブリダイゼーションして遺伝子発現を解析する方法であっても、適用できる。

（Ａ）はプローブ核酸としてのmRNA、（Ｂ）は蛍光標識されたoligo-dTを示す説明図である。蛍光標識されたmRNAを示す説明図である。（Ａ）はmRNA、（Ｂ）は蛍光標識されたoligo-dTを示す説明図である。蛍光標識されたmRNAを示す説明図である。（Ａ）はmRNA、（Ｂ）はビオチン標識されたoligo-dTを示す説明図である。 oligo-dTが結合したmRNAを示す説明図である。 DNAチップにおけるDNAに対するmRNAのハイブリダイゼーションの状態を示す説明図である。ハイブリダイゼーションしたmRNAの蛍光標識状態を示す説明図である。

符号の説明

cRNA ターゲット核酸
mRNA プローブ核酸
oligo-dT プライマー
Fluor 蛍光分子
A・T ヌクレオチド

Claims

多数のターゲット核酸に対し、蛍光標識されたプローブ核酸をハイブリダイゼーションして蛍光物質を励起することにより遺伝子発現を解析する核酸解析法において、
固相合成法によりヌクレオチドが配列されたプライマーの末端に蛍光分子を結合する工程と、
蛍光標識されたプライマーをプローブ核酸に結合させる工程と、
によりプローブ核酸を蛍光標識してターゲット核酸の遺伝子発現量を解析可能にするプローブ核酸の蛍光標識方法。
多数のターゲット核酸に対し、蛍光標識されたプローブ核酸をハイブリダイゼーションして標識された蛍光分子を励起することにより遺伝子発現を解析する核酸解析法において、
固相合成法によりヌクレオチドが配列されたプライマーの末端をアミノ修飾する工程と、
アミノ修飾されたプライマーの末端に蛍光分子を共有結合する工程と、
によりプローブ核酸を蛍光標識してターゲット核酸の遺伝子発現量を解析可能にするプローブ核酸の蛍光標識方法。
多数のターゲット核酸に対し、蛍光標識されたプローブ核酸をハイブリダイゼーションして標識された蛍光物質を励起することにより遺伝子発現を解析する核酸解析法において、
固相合成法によりヌクレオチドが連続配列されたプライマーの末端を一方の結合パートナーにより修飾する工程と、
一方の結合パートナーにより修飾されたプライマーをプローブ核酸に結合させる工程と、
結合パートナー修飾プライマーを結合させたプローブ核酸をターゲット核酸に結合させる工程と、
ターゲット核酸に結合したプローブ核酸に修飾された一方の結合パートナーに対して、他方の結合パートナーを有する蛍光分子を相互作用させる工程と、
によりプローブ核酸を蛍光標識してターゲット核酸の遺伝子発現量を解析可能にするプローブ核酸の蛍光標識方法。
請求項１乃至３のプライマーは、固相合成法によりdTを連続配列したOligo-dTとした核酸解析法におけるプローブ核酸の蛍光標識方法。
請求項３において、プライマー末端に修飾される一方の結合パートナーに相互作用する他方の結合パートナーに対して、複数個の蛍光分子で標識する核酸解析法におけるプローブ核酸の蛍光標識方法。
請求項３の結合パートナーは、ビオチン−アビジン相互作用を利用した核酸解析法におけるプローブ核酸の蛍光標識方法。