JPH03261798A - 変性ヌクレオチド - Google Patents

変性ヌクレオチド

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JPH03261798A
JPH03261798A JP2010469A JP1046990A JPH03261798A JP H03261798 A JPH03261798 A JP H03261798A JP 2010469 A JP2010469 A JP 2010469A JP 1046990 A JP1046990 A JP 1046990A JP H03261798 A JPH03261798 A JP H03261798A
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deazapurine
pyrimidine
dna
biotin
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JP2010469A
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David C Ward
ディビド　シー．ウォード
Pennina R Langer
ペニナ　アール．ランガー
Iii Alexander A Waldrop
アレグザンダー　エイ．ウォルドロップ　ザ　サード
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Original Assignee
Yale University
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Publication date
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 生物医学研究に）いて用いられる多くの手順とＤＮＡ組
換え手法は水素（３Ｈ）、燐（３２Ｐ）。
炭素（１４Ｃ）、もしくはヨウ素（１２５Ｉ）の同位元
素によって放射能ラベルされたヌクレオチドもしくはポ
リヌクレオチド誘導体の使用に大巾にたよっている。こ
のような放射性化合物は単に甚だしく少量の存在であっ
ても使用者が核酸の検出、監視２位置決め、単離等を行
うことを可−能にする有用な指針探査を提供する。今日
１で、放射性物質はもつとも敏感な、そして汐くの場合
多くの重要な実験もしくは分析試験を遂行するための唯
一の手段を提供して来た。しかしながら放射性化合物の
使用に関連して重大なる制限と障害がある。第一に、放
射性物質を取扱かう作業者は放射能の危険な水準に曝さ
れるおそれがアシ得るから手の込んだ安全な予防策が放
射性同位元素の調製、利用、そして廃棄処分の間゛に維
持されていなければならない。第二に放射性ヌクレオチ
ドには主として適当な保護手段、生産者−使用者健康監
筏サービス、そして廃棄処分計画を提供するに必要な装
置や人力の費用によるものであるが購入や使用のために
美大な費用がかかる。第三に放射性物質は屡々非常に不
安定であシ限られた保存期間を有し、そしてそのために
更に使用費用が増大する。この不安定性は放射性同位元
素それ自身の崩壊に関連する破壊効果による放射線的分
解、そして多くの放射性同位元素（例えば３２１−よび
１２５　Ｉ）はたった数日の半減期しか有しないと言う
事実に帰因するものである。
ハプテンは抗体と結合し得るが担体と結合した場合にお
いてのみ免疫性応答を行い得ると言うことは知られてい
る。この性質は検出シよび識別試験に利用されることが
出来る。
筐たビオチンやイミノビオチンはアピヂン。
卵白からの６８，０００ダルト／グリコプロテインと強
力に相互作用を行うことも知られている。
この相互作用は自然にみられる最とも堅固な非共有結合
常数（Ｋｄｉｓ＝１０　　　）の一つを示す。
もしアピヂンが例えばフルオレセイ７ｔ７’ｃｌｄ０−
ダミンのような螢光染料、例えばフェリチン。
ヘモシアニンもしくはコロイダルな金のような高電子密
度試薬、もしくは例えばパーオキシダーゼもしくはアル
カリホスファターゼのような不溶解性反応生成物を沈積
し得る酵素を含む顕示し得る能力のある指標分子と結び
つけられるｉらばビオチンプローブの存在２位置、もし
くは量は証明せられることが出来るであろう。イミノビ
オチンはビオチンようも若干弱くアビヂンと結合するけ
れども、同様な反応がその検出のために用いられ得る。
更に、溶液のｐＨを減少させることによってイミノビオ
チンーアビヂン相互作用が転換され得ることはある応用
にかいて顕著な利点を提供する。
ビオチンーアビヂン錯体の特性と保持力は近年細胞上も
しくは細胞の中の特定の蛋白質、リピド、もしくは炭水
化物を可視的に位置決めするための方法を開発するため
に用いられて来ている（　Ｅ、　Ａ、ベーヤーとＭ、ウ
ィルチエクツ生化学分析の手法、２６．１．１９８０に
釦いて検討される）。ＲＮＡの染色体位置はビオチン化
した蛋白質、化学的にＲＮＡと架橋されたチトクローム
Ｃ０を交配探査子として用いて電子顕微鏡によって測定
されている。交配の場所はアピヂンービオチン相互作用
によって仲介されるアビヂンー７ェリチンもしくはアビ
ヂンーメタクリレート領域の結合を介して可視化された
（Ｊ、Ｅ、マニング、　Ｎ、　Ｄ、バージエイ、Ｔ。
Ｒ，ブローカー、Ｍ、ペレグリー二、Ｈ，Ｋ。
ミッチェル、）よびＮ、デピッドソン、染色体。
５３　、１０７　、１９７５　；　Ｊ、　Ｅ、マニング
２Ｍ、ペレグリ一二、およびＮ、デビクドンン、生化学
。
６１．１３６４．１９７７　；　Ｔ、Ｒ，ブローカー、
Ｌ。
Ｍ、アンシェラ−、Ｐ、Ｈ，イエン、Ｎ、Ｄ。
バージエイ、しよびＮ、デピクドンン、核酸研究、５．
３６３．１９７８　；Ａソーヤ）よびＮ、デビッドソン
、核酸研究、、５．３８３，１９７８．）ポリヌクレオ
チド連鎖の検出に対するこのアプローチは高度に反復さ
れた連鎖のような特殊化せられた場合においては試験が
成功したけれども単一もしくは低い複写数に釦いて存在
するポリヌクレオチドの分析に対しては一般的に有用で
はない。
更にビリミヂンやプリン環に化学部分を付加する方法が
知られている。数年前に簡単なそして迅速なアセトキシ
水銀化反応が水銀原子の共有的結合をヌクレオチドおよ
びポリヌクレオチドの両方におけるピリミヂン環の５−
位置、プリン環のＣ−８位置もしくは７−デアザプリン
環のＣ−７位置の中に導入するために開発された。（Ｒ
，Ｍ、に、ゾール、Ｄ、Ｃ，リビングストンおよびり、
　Ｃ，ワード、米国自然科学学会会報、７０．２２３８
．１９７３；　Ｒ，Ｍ、に、ゾール。
Ｅ、マーテン、Ｄ、Ｃ，リビングストンおよびり、　Ｃ
，ワード、生化学、　１４　、２４４７　、１９７５．
）有機水銀化合物がバラヂウム触媒の存在下においてオ
レフィン化合物と反応して炭素−炭素結合を形成するこ
とは数年前に知られていた。
（Ｒ，Ｆ、　　ヘック、米国化学会誌−Ｓｏｃ、＋　９
０　ｒ５５１８　、１９６８　；Ｒ，Ｆ、ヘンクツ同上
、、９０゜５５２６．１９６８；Ｒ，Ｆ、ヘック、同上
、、９０゜５５３１　、１９６８　；Ｒ，Ｆ、ヘクク、
同上、、９０゜５５３５　、１９６８　；およびＲ，Ｆ
、ヘツク、米国化学会誌、　９１　、６７０７　、１９
６９．）バーゲスドームと共同研究者（Ｊ、Ｌ、ルーズ
）よびり、　Ｅ。
バーゲスドーム、有機化学雑誌、　、　４３　、２８７
０゜１９７８；釦よびり、　Ｅ、パーゲスドーム釦よび
Ｍ、に、オガヮ、米国化学会誌、１００．８１０６゜１
９７８、）釦よびビッグ９等（Ｃ，Ｆ、　ビッグ。
Ｐ、カラリティス、Ｊ、Ｒ，デックおよびＭ。
Ｐ、マーテス、米国化学会誌、　、　１０２　、２０３
３　。
１９８０、）は最近この反応をＣ−５置換ビリミヂンヌ
クレオチド化合物の合成に応用しようと企てた。
最後にヌクレオチドを変性するために特定の抗体が調製
されることが出来、そして該変性ヌクレオチドの特定な
構成を単離しそして特徴づけるために用いられることが
出来ることは知られている（Ｔ、Ｗ、　　ミューンズお
よびＭ、Ｋ。
リスゼ７スキイ、核酸研究の進歩シよび分子生物学、２
４．１０９．１９８０．）ＯＬかしながら、今日筐でに
自然に生ずるヌクレオチドに対して調製される抗体のい
かなるものもそれが二重螺旋構造のＲＮＡもしくはＤＮ
Ａ複合体中に存在する時、もしくはＤＮＡ−ＲＮＡ交配
分子中に存在する時、これらヌクレオチド測定子との反
応を示さなかった。
放射能的に標識付けされたプローブもしくは今迄に利用
された化学および生物学的プローブの限界を回避するた
めにピリミヂンもしくはプリン環と共有的に結合してい
るビオチン、イミノピオチン、リボ酸、そして他の測定
子が合成されている。これらヌクレオチド誘導体はそれ
らを含んでいるポリヌクレオチドや補酵素と同様にアピ
ヂンもしくは抗体のような蛋白質と選択的にそして特有
に相互作用を行うであろう。
変性ヌクレオチドと特定の蛋白質との間の相互作用は最
近生物医学的にそしてＤＮＡ組換え手法において用いら
れている多くの手順に釦いて核酸成分の検出釦よび配置
のための放射性同位元素に代るものとして利用されるこ
とが出来る。
これら変性ヌクレオチド−蛋白質相互作用を用いる方法
は放射性同位元素を利用する手順に等しいかそれようも
大きｉ検出能力を有し、そしてそれらは屡々よう迅速に
そしてより大きな分解能によって遂行されることが出来
る。
これら新らしいヌクレオチド誘導体は以下により完全に
検討されるように開発せられそして画一化せられて来た
化学的手順によって比較的安価に調製せられることが出
来る。更に意義深いことには本発明のヌクレオチドプロ
ーブもそれらに用いられる蛋白質試薬も放射性ではない
から該化合物は放射性同位元素の取扱かい上要求される
手の込んだ安全手順なくして調製せられ、利用せられ、
そして処理される。更にこれらヌクレオチド誘導体は化
学的に安定であって数年もしくはそれ以上の可使保存期
間を有することが期待されることが出来る。最後にこれ
ら化合物はよう安全な、よう経済的な、よう迅速な、そ
してよう再現性のある研究および診断手順の開発を可能
ならしめる。
ここにＢは糖部分の１′−位置に共有的に結合されたプ
リン、７−デアザプリンまたはピリミジン部分を表わし
、Ｂがプリンまたは７−デアザプリンの時、該結合は該
プリンまたはデアザプリンのＮ９−位置に存し、Ｂがピ
リミジンの時、該結合はＮ１−位置に存するものと規定
せられ、 Ａはビオチン、イミノビオチン。
からなる組から選ばれ、ポリペプチドと共に検知可能な
錯体を形威し得る部分を表わし、該プリンの８−位置に
存し、もしＢが７−デアザプリンであれば該化学鎖は該
デアザプリンの７−位置に存し、そしてもしＢがピリミ
ジンであれば該化学鎖は該ピリミジンの５−位置に存す
るものと規定せられ、そしてＸ。
ｙおよび２の各々は 　　　Ｏ Ｉ ＯＨＯＨＯＨ 筐たはＨＯ−Ｐ−０−Ｐ−０−Ｐ−０−０ＨＯＨＯＨ を表わす。
を有する化合物が提供せられ、該化合物は生物医学研究
およびＤＮＡ組換え手法におけるプローブとして広く有
用である。
この構造の範囲に包含される化合物のうち特に有用なも
のは更に次に示す善性の一つもしくはそれ以上を有する
二Ａは非芳香性である；Ａは少くともＣ５である：Ｂと
Ａとからなる化学結合は一つのα−オレフィン結合を含
む：Ａはビオチンもしくはイミノビオチンである；そし
てＢはビリミヂンもしくは７−デアザプリンである。
これら化合物は （ａ）　　構造式 造式 ｚ を有する化合物と水銀塩とを適当な溶媒中で適当な条件
下において反応せしめて構造式を有する水銀化合物を形
成すること。
（ｂ）　　上記水銀化合物を該水銀化合物の−Ｈｇ”部
分と反応し得、そして式・・・Ｎによって表わされる化
学部分と反応せしめること、上記反応は水性溶媒中で、
そしてに２ＰｄＣ１４の存在下に、適当な条件下におい
て行われ、構ｚ ここにＮは反応性末端官能基もしくはＡである０ を有する化合物を形成する。
そして （ｃ）　　該化合物を上記変性ヌクレオチドとして回収
すること、ＮかＡの時筐たはＮが反応性末端基の時、該
化合物は構造式Ｍ−Ａを有する化合物、ここにＭはＮと
反応可能な官能基を表わす、と水性溶媒中適当な条件下
に釦いて反応せしめられて上記変性ヌクレオチドを生威
し、それから該変性ヌクレオチドが回収せられる。
以上の段階を含む工程によって調製せられるであろう。
本発明はまた構造式 Ｂ　、　Ｂ’、またはＢ′のいづれかがプリン筐たはデ
アザプリンの時、該結合は該プリンまたはデアザプリン
のＮ９−位置に存し、Ｂ　、　Ｂ’、ｔたはＢ’のいづ
れかがピリミジンの時、該結合はＮ１−位置に存するも
のと規定せられ、Ａはピオチン、イミノビオチン。
０　　　　　　　０　　　　　　　　　ＮＯ２ここにＢ
、Ｂ、およびＢ′の各々は糖部分の０１′−位置に共有
的に結合されたプリン、デアザプリン、オたはピリミジ
７部分を表わし、からなる組から選ばれ、該複合体もし
くはハイプリ・７ドが二重螺旋構造のリボ核酸、デオキ
シリボ核酸複合体、またはＤＮＡ−ＲＮＡハイプリ・ン
ドの中へ取入れられた時ポリペプチドと共に検知可能な
錯体を形成し得る部分を表わし、 点線はＢとＡとを結合する化学鎖または基を表わし、も
しＢがプリンであれば該化学鎖は該プリンの８−位置に
存し、もしＢが７−デアザプリンであれば該化学鎖は該
デアザプリンの７−位置に存し、そしてもしＢがピリミ
ジンであれば該化学鎖はピリミジンの５−位置に存する
ものと規定せられ、 ２はＨ−またはＨＯ−を表わし、 そしてｍとｎは０から約１００，０００″＆での整数を
表わす。
を有する化合物を提供するものである。
られているオリゴ−およびポリヌクレオチドは生物医学
研究、臨床診断、そしてＤＮＡ組換え手法におけるプロ
ーブとして用いられるであろう０これらの種々の有用性
はポリペプチド・の中に本来的に存在する性質によるか
、あるいはポリペプチドに結合されるかもしくはそれと
相互作用を行う検出可能な部分によって順番に検出され
ることの出来る安定な錯体をポリペプチドと共に形成す
る該分子の能力に基づくものであるＯ これら化合物は本発明の変性ヌクレオチドを含むヌクレ
オチドの混合物の酵素的重合によって調製されることが
出来る。それに代えてオリゴ−もしくはポリヌクレオチ
ド中に存在するヌクレオチドは化学的方法を用いて変性
されるであろう。
いくらかの用途は例えばバクテリアやウィルスのような
核酸を含む病因の検出と識別、抗生物質耐性に対するバ
クテリアのスクリーニング、例えばサラセミアや鎌状細
胞貧血症のような遺伝的欠陥の診断、染色体核型分類、
そして腫瘍細胞の識別を含む。
本発明の実施によって変性されるヌクレオチドそしてそ
の中に該変性ヌクレオチドが取入れ本発明を以下に詳細
に説明する。
自然に発生したヌクレオチドの放射性標識付けされた形
状に置き代わるものとして変性ヌクレオチドが一般的に
適するためにはいくらかの本質的な却準が満足されなけ
ればならない。第一に、該変性化合物は独特な、即ちヌ
クレオチドもしくはポリヌクレオチドに関連して正常に
は見出されない置換基もしくはプローブを含んでいなけ
ればならない。第二に、該プローブは化学的もしくは生
物学的試薬と特別に反応して鋭敏な検出システムを提供
しなければならない。
第三に、多くの実際の応用が、該相似物が酵素的に代謝
され、例えば該相似性が核酸ポリメラーゼに対する基質
としての役目をすべきことを要求しているので該相似物
は一般的に研究されている核酸酵素に対する比較的効果
的な基質でなければならない。この目的のために、プロ
ーブ部分は立体的位置に関して、あるいは逆に、塩基の
正常なワトソンークリック水素結合能カを妨害する環位
置に配置されてはならない。さもなければ該置換体はポ
リメラーゼ基質として不活性な化合物を得るであろう。
形状変化は通常ヌクレオチド誘導体をポリメラーゼ基質
として受容することが出来ないようにするので正常な゛
アンチ′ヌクレオシド形状を変更するような環位置の置
換はまた避けられなければならない０ 第四に、該検出システムは核酸交配方法学と矛盾しない
ために一重螺旋構造シよび二重螺旋構造の両方のポリヌ
クレオチドの中に取入れられるプローブ置換体と相互作
用を行う能力を有すべきである。この基準を満足せしめ
るには、それが抗体、その他の検出蛋白質、もし←は化
学試薬と容易に相互作用を行うことが出来るように化学
結合もしくはゝ結合手′を介して該プローブ部分がプリ
ンもしくはピリミヂンと結合されていることが鎖管しい
。
第五に、プローブ置換体の少数を含んでいるポリヌクレ
オチドの物理的および生化学的性質は放射性交配プロー
ブを用いる最近の手順が広範囲にわたって変性される必
要がないがために大巾に変更されるべきではない０この
規準は該プローブが酵素的に導入されるかまたは直接化
学的手段で導入されるかのいづれの場合に）いても満足
せしめられねばならない。
最後に、該プローブが付加される結合は正常なヌクレオ
チドおよびポリヌクレオチドが日常支配されているすべ
ての実験的条件、例えば高温に）ける長期の交配時間、
フェノールおよび有機溶剤抽出、電気泳動等に耐えるべ
きである。
これら規準のすべてはここに記述される変性ヌクレオチ
ドによって満足せしめられる。
ここにＢは糖部分のＣ１’−位置に共有的に結合された
プリン、７−デアザプリンまたはピリミジン部分を表わ
し、Ｂがプリンまたは７−デアザプリンの時、該結合は
該プリン筐たはデアザプリンのＮ９−位置に存し、Ｂが
ピリミジンの時、該結合はＮ１−位置に存するものと規
定せられ、 Ａはビオチン、イミノビオチン。
０　　　　　　　０　　　　　　　　　ＮＯ２該変性ヌ
クレオチドとは構造式 からなる組から選ばれ、ポリペプチドと共に検知可能な
錯体を形成し得る部分を表わし、点線はＢとＡとを結合
する化学鎖または基を表わし、もしＢがプリンであれば
該化学鎖は該プリンの８−位置に存し、もしＢが７−デ
アザプリンであれば該化学鎖は該デアザプリンの７−位
置に存し、そしてもしＢがピリミジンであれば該化学鎖
は該ピリミジンの５−位置に存するものと規定せられ、 そしてＸＩｙおよび２の各々は ＯＯＯ ＯＨＯＨＯＨ ＯＯＯ ０ＨＯＨＯＨ を表わす。
を有する化合物である。
これら化合物は生物医学研究会よびＤＮＡ組換え手法に
釦けるプローブとして広く有用である０ この構造式の範囲に包含されるすべての化合物は主とし
て本発明の実施によって調製されそして使用されるであ
ろうけれども、該化合物のいくらかのものより容易に調
製されもしくは／そして使用され、そしてそれ故に目下
の所よう望ましいものである。
かくしてプリン、ピリミジン、釦よび７−デアザプリン
は主として有用なものであるけれども、ピリミジン、お
よび７−デアザプリンはプリン８−位置置換体が該核酸
をポリメラーゼ基質として無効にするから望ましいもの
である。
かくして変性プリンはある点では有用であるけれどもビ
リミヂン釦よび７−デアザプリン程−般的に有用ではな
い。更に本発明に有用なピリミジンおよび７−デアザプ
リンは夫々５−もしくは７−位置に当然置換されてはな
らない。結果として、チミン、５−メチルシトシン、）
よび５−ハイドロキシメチルシトシンのようないくらか
の塩基は有用でない。目下の所有用な塩基はシトシン、
ウラシル、デアザアデニン、）よびデアザグアニンであ
る。
Ａは少くとも三個の炭素原子を有し、そして変性ヌクレ
オチドがデオキシリボ核酸かりポ核酸かのいづれかに取
入れられた時ポリヌクレオチドと検出可能な錯体を形成
し得るいかなる部分にも相当する。
Ａはそれ故に適当な波体に付加した時単に免疫原的であ
るが、しかし適当な抗体と相互作用を行って錯体を形成
し得るハプテンを含むこれら性質を有しているいかｉる
リガンドにも相当するであろう。有用であるこれら部分
の例は次の通うである。
０　　　　　　　０　　　　　　　ＮＯ２これら望まし
いＡ部分としてはビオチン、シよびイミノビオチンがあ
る。
更に芳香性部分は塩基と対になっている螺旋構造の中に
介入せんとする傾向があるので、部分Ａは非芳香性であ
ることが望ましい。またより小さい部分はポリペプチド
との分子相互作用が充分でないから、充分な相互作用が
起って安定な錯体を形成せしめるためにはＡは少くとも
Ｃ５であることが望ましい。ピオチンとイミノピオチン
はこれら基準の両方を満足する。しかしながら、該化学
鎖はＢに関連してα−位置にオレフィン結合を含むこと
が一般的に望ましい。
このようなα−オレフィン結合の存在は塩基が良く知ら
れている二重螺旋形状にシいて他のものと対をなす時、
部分Ａが該塩基から離れた所に維持する役目を果す。こ
れはポリペプチドとの相互作用をより容易に行わしめ、
それによって錯体の形成を促進せしめる。更に大きな回
転自由度を有する一重結合は必ずしも螺旋から該部分を
光分離れた所に維持してポリペプチドによる認識および
ポリペプチドとの錯体の形成を行わしめるわけではない
。
該化学鎖が第一級アミンから誘導され、そして−ＣＨ２
−ＮＨ−構造を有することは、このような化学結合が良
く知られたアミン変性反応のいかなるものも利用して容
易に形成されるからさらによシ望ましいことである。ア
リルアミン釦よびアリル−（３−アミノ−２−ハイドロ
キシ−１−プロピル）エーテル基から誘導される望まし
い化学鎖の例は夫々式 −ＣＨ−ＣＭ−ＣＨ２−ＮＨ−釦よび −ＣＨ−ＣＭ−ＣＨｚ−０−ＣＨ２−ＣＨ−ＣＨ２−Ｎ
Ｈ−Ｈ を有する。
これらの化学鎖は望ましいものではあるけれども、特に
例えばチオール、カルボン酸、訃よびエポキシド官能基
のような他の変性可能な官能基を有するオレフィン結合
手を含むその他のものも使用されることが出来る。
該化学鎖は特別な位置、即ちピリミヂンの５−位置、プ
リンの８−位置、もしくはデアザプリンの７−位置に結
合する。前に述べたように、７”　ＩＪンの８−位置の
置換はここに検討されるすべての方法において有用な変
性ヌクレオチドを形成しない。プリンの７−位置は窒素
原子で占められているが、化学鎖が結びつく点になり得
るであろう。しかしながら今日用いられそしてここに検
討される化学的置換方法はこの目的には適していない。
記号ｘ　、　ｙ、シよび２は糖部分５’　ｇ　３１　）
よび２′位置に結びついている基を表わす。これらは Ｈ Ｈ Ｈ Ｏ ＯＨＯＨＯＨ のうちのいづれかである。
考えられ得ることではあるけれども、Ｘ　＊　７　ｓ訃
よび２のすべてが同時に同一のものであることはあうそ
うにない。よりありそうなことは少くともＸｓ’！ｓｋ
よび２のうち一つがモノ−ジー、もしくはトリーホスフ
ェイトのいづれかのホスフェイト含有基であシ、そして
少くとも一つがＨＯ−もしくはＨ−であることである。
容易に評価されるように、最もありそうな２の正体は夫
々リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチド
を示しているＨＯ−もしくはＨ−である。かようなヌク
レオチドの例は５′−リボヌクレオシドモノホスフェイ
ト、５′−リボヌクレオシドジホスフエイト、５−リボ
ヌクレオシドトリホスフェイト、５−デオキシリボヌク
レオシドモノホスフェイト、５′−デオキシリポヌクレ
オシドジホスフェイト、５−デオキシリボヌクレオシド
トリホスフェイト、５′Ｐ−リボヌクレオシド３’　Ｐ
　ｓ　）よび５’Ｐ−デオキシリボヌクレオシド３’Ｐ
を含む、よシ特殊な例はＡがピオチンもしくはイミノビ
オチン、化学鎖が−ＣＨ−ＣＨ−ＣＨ２−ＮＨ−もしく
は−ＣＨ−ＣＨ−ＣＨ２−０−ＣＨ２−ＣＨ−ＣＨ２−
ＮＨ−ＯＨ そしてＢがウラシルもしくはシトシンであるこのタイプ
の変性ヌクレオチドを含む。
化学鎖手釦よびプローブ部分を塩基上へ導入するために
採用せられる一般的合成方法は上記に検討せられる（　
Ｊ、　Ｌ、ルース釦よヒＤ、　Ｅ。
バーゲスドーム、有機化学雑誌、　　４３．２８７０゜
１９７８　：　Ｄ、　　Ｅ、バーゲスドームおよびＭ、
　Ｋ。
オガワ、米国化学会誌、　１００．８１０６．１９７８
：釦よびＣ，Ｆ、　　ビッゲ、Ｐ、カラリティス、Ｊ。
Ｒ，デック釦よびＭ、　Ｐ、マーテス、米国化学会誌、
　　１０２．２０３３．１９８０．をみよ）しかしなが
ら、ここに用いられるオレフィン置換体は以前には用い
られたことがない。プローブ部分Ａの結びつきを容易に
するために、例えばアリルアミン〔ＡＡ〕、もしくはア
リル−（３−アミノ−２−ハイドロキシ−１−プロピル
）エーテル（ＮＡＧＥ）のようｉ第一級アミン官能基を
有するオレフィンを用いることが特に望ましいことが見
出され、そして該オレフィンは例えば ■ −ＣＨ２ＮＨ２＋Ｒ−Ｎ−Ｃ−８→−ＣＨ２ＮＨＣＮＨ
Ｒイソチオシアナート −ＣＨ２ＮＨ２＋Ｒ−Ｃ−ＯＲ→−ＣＨ２ＮＨＣＲイミ
デート のような標準的なアミン変性反応によってプローブを結
びつけることを可能にする。
アンハイドライド 調製の容易さのために、ＮＨ３−エステルをプローブの
付加のために用いることが望筐しいことが見出されてい
る。しかしながら、例えばチオール、カルボン酸、エポ
キシドのような他の変性可能な官能基を有するオレフィ
ン結合鎖手もまた用いられることが出来る。更にまた、
結合鎖手とプローブの両方共が１筐しいと思われるなら
ば単一段階において付加されることが出来る。
Ａはピオチン、イミノビオチン。
特に構造式 ここにＢは糖部分のｃ１′−位置に共有的に結合された
プリン、７−デアザプリン筐たはピリミジン部分を表わ
し、Ｂがプリンまたは７−デアザプリンの時、該結合は
該プリン筐たはデアザプリンのＮ９−位置に存し、Ｂが
ピリミジンの時、該結合はＮ１−位置に存するものと規
定せられ、 からたる組から選ばれ、ポリペプチドと共に検知可能な
錯体を形成し得る部分を表わし、点線ばＢとＡとを結合
する化学鎖塘たは基を表わし、もしＢがプリンであれば
該化学鎖はプリンの８−位置に存し、もしＢが７−デア
ザプリンであれば該化学鎖は該デアザプリンの７−位置
に存し、そしてもしＢがピリミジンであれば該化学鎖は
該ピリミジンの５−位置に存するものと規定せられ、 そしてＸ　ｌ　３’％および２の各々はＯＨ ＯＨ ＯＯＯ Ｉ１ １たはＨＯ−Ｐ−０−Ｐ−０−Ｐ−０−０ＨＯＨＯＨ を表わす。
を有する変性ヌクレオチドは （ａ）　　構造式 を有する水銀化合物を形成すること。
（ｂ）　　上記水銀化合物を該水銀化合物の−Ｈｇ＋部
分と反応し得、そして式・・・Ｎによって表わされる化
学部分と反応せしめること、上記反応は水性溶媒中で、
そしてに２ＰｄＣ１４の存在下に、適当な条件下に釦い
て行われ、構造式 を有する化合物と水銀塩とを適当な溶媒中で適当な条件
下に訃いて反応せしめて構造式ここにＮは反応性末端官
能基もしくはＡである０ を有する化合物を形成する。
そして （ｃ）　　該化合物を上記変性ヌクレオチドとして回収
すること、ＮがＡの時またはＮが反応性末端基の時、該
化合物は構造式Ｍ−Ａを有する化合物、ここにＭはＮと
反応可能な官能基を表わす、と水性溶媒中適当な条件下
にかいて反応せしめられて上記変性ヌクレオチドを形成
し、それから該変惺ヌクレオチドが回収せられる。
以上の段階によって調製されることが出来る。
以下に実例集を示す。
該反応はｐＨ１と同程度に低い水素イオン濃度で、もし
くはｐＨ１４と同程度に高い水素イオン濃度で行われる
ことが出来るけれども、約４から８１での範囲にかいて
行うことが１普しい。このことはこの範囲以外のｐＨに
おいては加水分解される例えばヌクレオシドポリホスフ
ェイト、ポリヌクレオチド、釦よびヌクレオチド補酵素
のような不安定な化合物を取扱かう場合には特に真実で
ある。同様に標識付けされた有機基質の分解の可能性を
防止するために約２０℃から３０℃の範囲の温度で行う
ことが望ましい。しかしながら、該反応は約５°Ｃから
１００℃の温度で行われ得る。化学反応においては通常
のことであるが、よう高温は反応速度を促進し、そして
よシ低温はそれを遅くする。
かくして５°Ｃから１００°Ｃｔでの温度範囲において
、最適反応時間は約１０分から９８時間迄変化するであ
ろう。１筐しい温度範囲においては、反応時間は通常３
から２４時間迄変化する。
ｐＨを所望の範囲に維持するための１筐しい手順はバッ
ファーを用いることによる。種々なバッファーが用いら
れ得る。これらは例えば、酢酸ソーダもしくはカリウム
、クエン酸ソーダもしくはカリウム、クエン酸−燐酸カ
リウム。
トリス酢酸、そしてホウ酸、水酸化ソーダバッファーを
含む。使用時のバッファーの濃度は約２．０モルｉでの
広い範囲にわたって変化し得る。
水銀化反応およびパラジウム触媒を用いる付加反応の特
別な利点はこれらが水中で行われ得ることであるが、有
機溶媒の少量が溶解性補助として有用に含１れることか
出来る。通常選択される有機溶媒は水と混和性を有する
ものである。これらは例えばメタノール、エタノール。
プロパツール、グリセリン、ジオキサン、アセトン、ビ
リデン、およびジメチルホルムアミド（７）！ウナエー
テル、アルコール、エステル、ケトン、アミド等から選
ばれるであろう。しかしながら、例えばメタノールのよ
うなアルコールの存在は屡々オレフイン二重結合に対す
るアルコキシ付加の原因となるので、溶解性補助として
用いられる有機溶媒は注意深く選択されなければならな
い。アルコキシ置換基のａ−’たはβ−外環炭素原子に
対する導入は屡々酵素基質として利用されて非常に効果
の少ない化合物の生成の原因となる。
種々の水銀塩が利用されるけれども、現在望ましい塩は
酢酸水銀である。また、前に示されたように、該化合物
は先づ結合鎖子を付加し、そしてそれから部分Ａを付加
することによってか、もしくは既に部分Ａが結びついて
いる結合鎖を付加することによって調製される。かくし
て式・・・Ｎで表わされる化学部分は所望の化合物の形
成を最終的にもたらすものであればいかなるものでもよ
い。
例としては −ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＮＨ２゜ −ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ−ＣＨ２−Ｎ
Ｈ２。
Ｈ ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２ＮＨ−ｂｉｏｔｉｎ　、によび−Ｃ
Ｈ＝ＣＨ２−ＣＨ２−０−ＣＨ２−ＣＨ−ＣＨ２−ＮＨ
−イＨ ミノピオチン。
を含む。
これらの反応にシいて用いられる反応物の量は広く変化
する。しかしながら水銀化されていない化合物、水銀化
された化合物、）よびパラヂウム含有化合物の量は一般
的に略化学量論的であるが、−力水銀塩）よび化合物・
・・Ｎは過剰モル、例えば夫々の水銀化されている化合
物もしくは水銀化されていない化合物のモルに対してＮ
・・・Ｎもしくは水銀塩の５〜２０モル存在せられる。
実際には、量は反応条件や反応物の詳細な性質の変化に
よって変化する。
酵素基質として機能することが出来るヌクレオチド誘導
体に直接結びつけられているピオチンプローブを有する
ことは遂行され得る実験原案に）いても、分析のために
利用され得る検出方法（顕微鏡的釦よび非顕微鏡的）に
おいても可成シ広範囲にわたる可能性を提供する。例え
ばピオチンヌクレオチドは細胞によって、もしくは粗細
胞抽出物による合成過程中に存するポリヌクレオチドの
中に導びかれることが出来、かくして発生期（成長期）
のポリヌクレオチド鎖を検出釦よび／すたは単離するこ
とを可能ならしめる。このような手順はいかなる直接化
学的変性方法によってもすることが不可能である。
更に、酵素は例えばピオチンのようなプローブをポリヌ
クレオチド中の高度に選択性のある、または位置特性の
ある配置の中へ導入するための試薬として用いられるこ
とが出来る。同様なプＯ−プ変性生成物の化学約合或は
どうみても達成することが甚だ困難であろう。
ピオチンもしくはイミノピオチンを含むヌクレオチドの
合或は以下に記述される実施例において詳しく述べられ
るようにして達成される。
Ｃ−５炭素原子に結びついているこれらプローブのいづ
れかを含むピオチンヌクレオチドは原始根もしくは真生
核の両方に起因する精製された核酸ポリメラーゼの種々
なものに対して優れた基質として役立つ。これらはＥ、
Ｃｏ１１のＤＮＡポリメラーゼ■、バクテリオファージ
Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、ネヅミ１−９）＞よびヒ）（
ＨｅＬａ）細胞からのＤＮＡポリメラーゼα）よびβ、
そしてヘルペス単純ウィルスのＤＮＡポリメラーゼを含
む。確認データはリグビイ等のニック転換条件（Ｐ、　
Ｗ、　Ｊ、リグビイ、Ｍ。
デイックマン、Ｃ，ローデス）よヒＰ、バーク。
分子生物学雑誌、　１１３　、２３７　、１９７７、　
）もしくはバーガイノン等によって述べられている間隙
充填反応（Ｇ、Ｊ、バーガイノン、Ｐ、Ｊ、タラターサ
ルおよびり、　Ｃ，ワード、ウィルス学雑誌２０　、２
９０　、１９７６、）のいづれかを用いることによジ、
Ｅ、　ｃｏｌｉ　　ＤＮＡポリメラーゼについて得られ
た。Ｂｉｏ−ｄＵＴＰ　ｉたはミラー等の方法（Ｍ、Ｒ
，ミラー、Ｊ、Ｃ，キャステロット。
Ｊｒ、：ＴｈよびＡ−、Ｂ、バーデイ、細胞研究速報。
１２０．４２１．１９７９．）によるリソレチンを用い
た処理によって透過され九ＣＨＯ細胞においても、そし
てヘルペス単純ウィルス感染ＢＨＫ細胞から調製された
核複製システムにおいてもポリメラーゼ基質として機能
することが見出されている。ビオチン化リボヌクレオシ
ドトリホスフェイトはＥ　、ｃｏ　１１％およびバクテ
リオファージＴ７のＲＮＡポリメラーゼに対する基質と
して機能することが見出されたけれども、これらのデオ
キシリボヌクレオチドトリホスフェイト相当物と同様な
利用効率はない。事実、それらは実験せられる真生核Ｒ
ＮＡポリメラーゼ（ＨｅＬａ細胞ＲＮＡポリメラーゼ狙
、子牛胸腺ＲＮＡポリメラーゼ川、用よびマウス細胞Ｒ
ＮＡポリメラーゼ■）によって多少なりとも不完全に取
入れられる。この基質機能の限定された範囲はいくらか
の生体的もしくは試験管的な転写研究にシいて有用性を
限定するのであるが、ビオチン標識性されたＲＮＡプロ
ーブはＤＮＡ鋳型からＥ、　ｃｏｌｉもしくはＴ７ＲＮ
Ａポリメラーゼを用いて、もしくは例えばピオチン化−
ｐＣｐのような化合物と共にＲＮＡＩＪガーゼを用いる
末端ラベル付は方法によって酵素的に調製され得る。Ｕ
ＴＰのＡＡ−＞よびＮＡＧＥ誘導体はしかしながら上記
の真正族ＲＮＡポリメラーゼに対する基質である。これ
ら類似物に対する抗体の有効性によれば、免疫学的もし
くは親和力方法による発生期転写の単離は実行可能であ
る。
ビオチンもしくはイミノビオチン置換体を含むヌクレオ
チドの酵素的重合はこれらのプローブのいづれもが放射
性ラベル付けられてはいないので直接に監視されない。
しかしながら実験的証拠の二つの系列は明らかにビオチ
ン化ヌクレオチドが取入れられたことを示している。第
一はビオチンヌクレオチドの存在において合成されるポ
リヌクレオチドはアピヂンもしくはストレプトアビチン
親和性カラムでクロマトグラフした時、選択的に保持さ
れていることである。
（第１およびＩ表）。例えば　Ｐ−ｄＡＭＰでニック転
換された正常ＤＮＡは０．５　Ｍ　ＮａＣ１の添加にお
いて定量的に流出するのに、ビオチン化ＤＮＡもしくは
イ□ノピオチン化ＤＮＡの膨大な量が高濃度塩、尿素、
グアニヂンーＭＣＩホルムアミド、もしくは５０　ｍＭ
　ＮａＯＨによる長時間の洗滌の後ですらもレジンに結
合して残っている。これら洗滌条件によって流出される
放射性ラベルの小フラクションは二度目にレジンに対し
て適用された時には保持されず、放射性がビオチン置換
の行われていないＤＮＡ断片と結合されていることを暗
示する。証拠の第二の系列は精製アンチ−ビオチンＩｇ
Ｇ、次いでホルマリン固定されたスタフィロコン力ス　
アウレウスによって処理された時、ビオチンラベルされ
たポリヌクレオチドのみが免疫沈澱されることである（
第■表）。ビオチンの極めて少量がこの方法によって検
知されることはこれら表中のデータから明らかである。
これら結果は筐たもし抗体結合もしくはアピヂン親和力
方法が交配手法を用いるプローブ検出において有用であ
ればビオチン分子はアピヂン、ストレプトアビヂン、も
しくは固有の抗体によって認められることが出来る一方
、ＤＮＡはい筐だその本来の、二重螺旋構造形能、即ち
絶対的に本質的な条件下にある。
第 表 第Ｈ表 アビチン−セファローズ上のビオチン 化ＤＮＡの選択的保持性 化ＤＮＡ（７）親和クロマトグラフ 流出物 ＤＮＡ　　嘩 １０　ｒｒｌＭ　トリス７．５ ０．２　Ｍ　　ＮａＣ１ ０，５Ｍ　　ＮａＣ１ １，０Ｍ　　ＮａＣｌ ８Ｍ尿素 ６　　Ｍ　グアニヂン−（（Ｃ１ ９９％　　ホルムアルデヒド ２ｍＭ　ビオチン ５０　　ｒｒ＃ｆ　　ＮａＯＨ １００％ ９９．７ ９４．７ ９７．６ ８９．５ ０．１ ＜　Ｏ，ｏ　ｌ ＜０．０１ ＜０．０１ ＜ｏ、ｏ　１ （０，０１ （０，０１ 負荷−１０ｍＭ）リス−ＨＣ１，８，３５０ｍＭ　Ｎａ
Ｃ１ （１）　　Ｏ，１Ｍ　ＮａＣ１ （２）　　１．ＯＭ　　ＮａＣ１ （３）　８　Ｍ尿素 （４１６ＭグアニチンーＨＣＩ （５）　　５０ｍＭＮＨ４１萌浚 ｐＨ４，０ ０，８ ＜０．１ ＜　０．０１ ＜０．０１ ＜　０．０１ ＜０．０１ ９７．５ ９７、Ｏ ＜０．０１ ９９．７ ９９．７ ９９．４ ９８．５ ９７．０ ９６．５ （６）　　５０ｒ！１ＭＮＨ４−酢酸 ｐＨ４，０ ＜０．０１　　（Ｑ、Ｑｌ　　０．０１２ｍＭ　ビオチ
ン 第　■ 表 かくして構造式 によるＢ　Ｉ　０−ＤＮＡの選択的免疫沈澱−ＤＮＡ −ＤＮＡ −ＤＮＡ 抗−バイオＩｇＧ 非免疫　ＩｇＧ ）ζイオーＤＮＡ バイオ−ひ浪 ノζイオーＤＮＡ 抗−バイオＩｇＧ　　　３３４７ 非免疫　ＩｇＧ　　　　６０ ＊Ｎ。
Ｔ。
ｐＢＲ−３２２ＤＮＡ、３２Ｐ−ラベル１％ビオチン置
換体 相対活性　２ｘｌｏ　ｅｐｍ／Ｉ１ｇ ビオチ／検出０．００１−０．０１ピコモルここにＢ　
、　Ｂ’、およびＢ′の各々は糖部分の０１′−位置に
共有的に結合されたプリン、デアザプリン、筐たはピリ
ミジン部分を表わし、Ｂ　、　Ｂ’、またはＢ′のいづ
れかがプリンまたはデアザプリンの時、該結合は該プリ
ンまたはデアザプリンのＮ９−位置に存し、Ｂ、Ｂ’、
またはＢ′のいづれかがピリミジンの時、該結合はＮ１
−位置に存するものと規定せられ、Ａはビオチン、イミ
ノビオチン。
０　　　　　　０　　　　　　　　　ＮＯ２からなる組
から選ばれ、ポリペプチドと共に検知可能な錯体を形成
し得る部分を表わし、点線はＢとＡとを結合する化学鎖
筐たは基を表わし、もしＢがプリンであれば該化学鎖は
該プリンの８−位置に存し、もしＢが７−デアザプリン
であれば該化学鎖は該デアザプリンの７−位置に存し、
そしてもしＢがピリミジンであれば該化学鎖はピリミジ
ンの５−位置に存するものと規定せられ、 ２はＨ−４たはＨＯ−を表わし、 そしてｒｎ！＝ｎは０から約１００，０００箇での整数
を表わす。
を有する新規な化合物を調製することが可能である。
勿論、その場合には該化合物は単に前述したように変性
ヌクレオチドになるから、一般的にはｍおよびｎは同時
にＯではないことは容易に理解せられるべきことである
。一般的にＢおよびＢ′は同じオリゴ−もしくはポリヌ
クレオチドの中にあって変化し、夫々ウラシル、シトシ
ン。
チミン、グアニン、アデニン等となるｏ１九−般的に、
該変化はよく知られている遺伝コードによるペプチド合
成に対するコードを行うヌクレオチドの整列された連鎖
に一致するだろう。
しかしながら、示される該構造はまたもし本発明によっ
て核酸が変性されることのみであれば、子牛胸腺ＤＮＡ
　、　Ｅ、ｃｏｌｉもしくはイーストのＲＮＡ、バクテ
リオファージＲＮＡおよびＤＮＡ（Ｒ１７，ｆｄ）、動
物ウィルス（ＳＶ４０ＤＮＡ）、染色体ＤＮＡ等のみな
らず、例えばポリＣ，ポリＵ、ポリｒ（Ａ−Ｕ）および
ポリｄ（Ａ−Ｕ）のようなポリヌクレオチドをも包含す
ることを留意すべきである。
該構造は例えば２から３０の変性ヌクレオチドからなる
オリゴマーもしくはポリマー中に存在する一つ以上の変
性ヌクレオチドを含むこともまた理解されるべきである
。この配慮における重大な因子は変性の数があ！重大で
はないのでポリヌクレオチドは意図された用途には効果
がないことである。
最後に変性オリゴ−釦よびポリヌクレオチドは合同して
末端基が相溶性もしくは反応性を与えられる限シにおい
て同一構造を有するよう長い実体を形成し得ることは理
解せられるべきである。
これら化合物は適当な条件下で合成を指揮する核酸鋳型
の存在下にかいて適当な核酸、特にヌクレオチドトリホ
スフェイトの酵素的重合によって造られ得る。このよう
な条件は用いられる酵素、存在するヌクレオチドの量、
そしてその他の変数によって広く変化する。酵素の実例
ハＥ、ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファ
ージＴ４ＤＮＡポリメラーゼ、ネズミおよびヒト（Ｈｅ
ｌａ）細胞からのＤＮＡポリメラーゼａおよびβ、ヘル
ペス単純ウィルスからのＤＮＡポリメラーゼ、　Ｅ、　
ｃｏｌｉのＲＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＴ
７のＲＮＡポリメラーゼ＋　Ｈｅ　１　ａ細胞ＲＮＡポ
リメラーゼ■。
子牛胸腺ＲＮＡポリメラーゼ■、およびマウス細胞ＲＮ
Ａポリメラーゼｌを含む真生核ＲＮＡを含むものである
。
また該化合物はオリゴ−もしくはポリヌクレオチドを末
端付加して付加が５９もしくは３′位置に行われるかど
うかによってｍもしくはｎがＯである化合物を形成する
ことによって調製せられることが出来る。更に塩基がビ
オチン化されている例えばｐＣｐもしくはｐＵｐＯよう
々化合物は酵素ＲＮＡＩＪガーゼを用いて目下の分子に
付加され得る。
変性オリゴ−およびポリヌクレオチドはまた前記した個
々のヌクレオチドの変性のための方法を目下のオリゴ−
もしくはポリヌクレオチドの化学的変性によっても調製
され得る。
本発明の種々な変性ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド
、およびポリヌクレオチドはもし該ポリペプチドが一つ
の錯体もしくは複数個の錯体が形成される時に一般的に
通常の検出手法によって検出され得る一個もしくはそれ
以上の部分を含んでいるとすれば適当な条件下で該化合
物をそれらと錯体を形成し得るポリペプチドと接触させ
て錯体を形成させることによって検出されるであろう。
ビオチン型プローブに対する一つのポリペプチド検出子
はアビヂンである。アピヂンービオチン相互作用は自然
にみられる最とも強固な非共有結合定数（Ｋｄｉｓ＝１
０　　）の一つを示す。もしアピヂンが例えば螢光染料
（フルオロセイン。
ローダミン）、高電子密度試薬（フェリチン。
ヘモシアニン、金コロイド）もしくは不溶性反応生成物
を沈積し得る酵素のような潜在的に明瞭な指示分子と結
合されたならばビオチンプローブの位置的および／また
は量的存在は設定せられるであろう。
アピヂンは不率にも核酸もしくはクロマチン物質と連絡
せられて用いられる時、ビオチン−指示蛋白質としては
余り１筐しくなくなる一つの性質を有している。アビヂ
ンが濃縮クロマチンもしくは核酸の大量を含む副細胞区
画に対してビオチン結合性質から独立した様式で強固に
結合することは報告されている（Ｍ、Ｈ，ヘゲネス、染
色技術、　、　５２　、１６５　、１９７７　；Ｍ、　
Ｈ。
ヘゲネスおよびＪ、　Ｆ、・アシュ、細胞生物学雑誌、
　、７３，７８３，１９７７；Ｅ、　Ａ、ベーヤーおよ
びＭ、ウィルチェク、生物学分析の手法２６゜１　、１
９８０．）アピヂンは１０．５のｐｉを有する塩基性蛋
白質であるから、そのヒストン様特性またはその炭水化
物部分はこれら観察される非特定相互作用に対して最と
も責任がありそうである。
ビオチン含有ヌクレオチドおよびその誘導体に対する望
！しいプローブは土壌菌、ストレプトミセス、アビヂン
によって合成されたアピヂン様蛋白であるストレプトミ
セスンである。その諷製と精製はホフマン等、自然科学
学会誌。
７７　、４６６６　（１９８０）に記載されている。ス
トレブトアビヂンはより低いｐＩ（５，０）を有し、グ
リコジル化されておらず、そしてアビヂンよりもＤＮＡ
に対するよう非常に低い非特定結合性を示し、そしてそ
れ故に核酸検出方法論を含む応用において潜在的な利点
を提供する。
ビオチン様プローブ検出に対する最も望ｌしい蛋白質は
単一特定ラピッ）　Ｉ　ｇＧ　、アンピチオチン免疫グ
ロブリンである。この化合物は前述のように（Ｍ、バー
ガー、酵素学における手法、　６２　、３１９　　ｒ１
９７９Ｊ　）、ビオチンとウシ科血清アルブミン変性ビ
オチンによって免疫化された２ピツトによってＡ製せら
れ、そして親和性クロマトグラフによって精製せられる
。免疫グロブリン−ハプテンの会合定数はアビヂンービ
オチン錯体に対してよジも可成り低いＫａｓｓｎ（１０
６から１０）値を有するけれども、それらはアピヂンー
イミノビオチン錯体で観察される値と略等しい。更にア
ンチ−ビオチン抗体はもしあったとしても抗体とクロマ
チン物質との非特定結合は僅かしか起らないので生体内
原位置交配による染色体上の特定ポリヌクレオチド連鎖
の検出に）いて非常に有用であることが証明されている
。
本発明の変性ポリヌクレオチドは交配プローブとしてこ
れらの使用に適合する条件下において変質および回復の
能力を有する。熱的変質の様相といくらかのピオチン置
換ＤＮＡおよびＲＮＡポリマーの交配特性の分析は明ら
かにこれを示す。例えば、ニック転換を行なってキロペ
ースに対して約１０〜１００ピオチン残渣を導入したｐ
ＢＲ３２２ＤＮＡもしくはλＤＮＡは対照のピオチンを
含１ないＤＮＡのＴｍ値と本質的に同一であるＴｍ値を
有する。更に　Ｐ−フベルされたピオチン置換体ｐＢＲ
３２２ＤＮＡはプラスミドを含むバクテリア群の検出に
対する交配プローブとして用いられた時、対照であるチ
□ヂン含有ＤＮＡと同様な程度の特性および自動放射線
記録信号強度を示した。
−本の糸（５ｋｂに対して全体で１２５０）におけるす
べてのチミヂン残渣がビオチン化ヌクレオチドによって
置き換えられる例えばＭＶＦＲＦ　　ＤＮＡのようなり
ＮＡ複合体においては、該Ｔｍは置換されていない対照
のそれよりも小さくたった５°Ｃである。各々の塩基対
が一つのｂｉｏ−ｄＵＭＰ残渣を含んでいるポリｄ（Ａ
−ｂｉｏＵ）のＴｍはポリｄ（Ａ−Ｔ）対照よりも低い
１５°Ｃであるけれども、変性および回復の両方の間に
観察せられる協調性の度合釦よび紫外線吸収性の範囲は
該二つのポリマーに対するものと同じである。ＲＮＡ複
合体とＤＮＡ／ＲＮＡ交配体の平行分析はこれらのＴｍ
の値がポリマーのビオチン含有量の増加にともなって！
た減少すると言うことを示している。しかしながらビオ
チン分子の実質的な数がポリマーの交配特性を顕著に変
えることなく導入されることが出来ることは明らかであ
る。
これらの結果はビオチン置換ポリヌクレオチドが染色体
、固定細胞において特定のポリヌクレオチド連鎖を検出
釦よび／または位置決めするためのプローブとして用い
られ得るのであろうことを強く示唆するものである。ピ
オチン置換プローブを検出するための一般的な原案は以
下に図示される。
生体内原位置群もしくは北方／南方交配方法による坑プ
ローブ連鎖 ３）検　出 １）不溶性パーオキクト→生成物：ＤＡＢ２）抗体サン
ドインチ寸法 この一般的な図は遺伝子地図（細胞遺伝学的）および組
換えＤＮＡ手法に対して用いられた手順のみを説明する
ものである。しかしながら臨床試料に）けるバクテリア
、ウィルス、薗、もしくは寄生源の核酸連鎖の検出に対
してそれは同様都合よく適用され得、そしてこれは放射
性同位元素の使用に依存しない臨床診断に対する有力な
新らしい方法の基礎を形成する。
ピオチンの検出に対する免疫学的および組織化学的方法
は該基礎的方法が生体内インジッツ交配の遺伝子地図を
作成する迅速な方法および汚染交配方法による特定核酸
連鎖の検出のための非放射能性手順のために使用可能で
あることを示している。用途は新らしい臨床診断手順の
、開発に）けるこの手法からなるものである。
この方法を用いれば、特定デオキシリポ核酸筐たはリポ
核酸分子、特に例えばバクテリア、曹。
ウィルス、イーストもしくは哨乳類から誘導される分子
の存在を測定することが可能である。これは患者もしく
はその他の被検体に釦ける核酸含有病因の順次の診断を
可能ｉらしめる。
更に抗体耐性を測定することはバクテリアのスクリーニ
ングに対する方法を提供する。かくして、例えば、スト
レプトコッカス　ピオゲネスもしくはネイセリス　メニ
ンギチディスに釦けるペニシリン耐性、スタフィロコツ
カス　アウレウス、カンヂダ　アルビカンス、ブシュ−
トモナス　アエルギノザ、ストレプトコッカス　ビオゲ
ネシスもしくはネイセリア　ゴノロエアエに釦けるテト
ラサイクリン耐性、釦よびミコバクテリウム　テユバキ
ュロシスにかけるアミノグリコシド耐性は測定されるこ
とが出来るのである。
これらの方法にふ・いては、生物もしくはその抗生物質
耐性を巷徴づける核酸鎖と対をなす。そして更に本発明
による変性核酸の一つもしくはそれ以上を含むポリヌク
レオチドが調製される。このポリヌクレオチドは精査下
にシいて生物から得られた核酸によって交配される。交
配のための欠陥は生物もしくは耐性特性の不在を示す。
交配された核酸複合体はそれから核複合体と検出可能な
部分を担持する適当なポリペプチドとの錯体を形成し、
そして適当な検出手法を使用して該錯体の存在を検出す
ることによって識別される。
陽性検出は錯体、複合体、そしてそれ故に関心のある核
酸鎖が存在することを示す。
この方法は例えばサラセくアおよび鎌状細胞貧血症のよ
うな遺伝的欠陥の診断に拡張され得る。
その存在もしくは不存在が該欠陥と関連しているＣｔラ
セミアの場合）デオキシリボヌクレオチド酸遺伝子鎖は
適当な検出可能なポリヌクレオチドによる錯体形成に基
づく本発明によるポリヌクレオチドグローブとの下記の
交配によって検出されることが出来る。
遺伝子の地図を作成することもしくは染色体上の特定の
位置に対するこれらの転写は細胞融合や体細胞遺伝の手
法を主として含む冗長な時間を消費する仕事であった。
生体内インジッツ交配は例えばドロソフィラのような染
色体ポリテン化を受ける種に釦いて、−重複写遺伝子連
鎖の地図を作成するためには首尾よく用いられて来たけ
れども、大部分のよう高度な真生核染色体における特有
の連鎖遺伝子の検出は例え不可能ではないにしても標準
交配方法を用いては著るしく困難であった。
非常に高度に特定されている放射性のポリヌクレオチド
プローブが交配位置の自動放射能記録位置決めを容易に
するための必要性はまた探査子の急速な放射性分解と、
銀粒状沈澱物の背後ノイズにおける付随的な増加を招来
する。低度から中度の特定放射性を有する交配プローブ
の使用は例えばリボゾームＲＮＡ遺伝子もしくは衛星Ｄ
ＮＡのような多重複写連鎖を検出する場合でさえも、多
くの日数もしくは週にわたる露出時間を必要とする。
組換えＤＮＡ手法は真生核細胞中に見出される殆んどす
べての一重複写連鎖の分子クローン化を実行可能してい
るから、かようなりローン化された遺伝的断片の染色体
超厚の地図を作成するための迅速なそして鋭敏な方法を
有することは非常に有益なことである。
変性ヌクレオチドは放射性同位元素の使用を回避する生
体内インジッツ交配による遺伝子地図の作成において用
いられるであろう。この手順はＤＮＡプローブの中ヘニ
ツク転換によって酵素的に取入れられ得るビオチンを含
むチミヂン類似物を利用する。生体内原位置交配の後、
ビオチン分子は精製されたラビットアンチ−ビオチン抗
体の親和力のための抗原として役立つ。フルオレセイン
標識性されたヒツジのアンチ−ラビットＩｇＧと共に形
成される免疫螢光抗体サンドインチは緑−黄バンドとし
てクローン化された遺伝子連鎖の迅速なそして明確な細
胞遺伝学的位置決めを準備する。この方法は生体内原位
置遺伝子位置決めの通常の自動放射能記録方法に比して
より少ない背後ノイズ、バンド間の分解能力の向上、プ
ローブ交配の位置測定に要する時間の短縮、そして化学
的に安定な交配プローブという四つの主な利点を提供す
る。この方法はドロンフィラ　ミラツガスターのポリテ
ィ染色体およびマウス中期染色体上の衛星ＤＮＡにおけ
る反復されたそして独特なりＮＡ鎖の位置決めに対して
首尾よく適用されて来た。
かくしてポリテン染色体が生体内原位置遺伝子地図作成
に対する間接的免疫螢光性によって検出されるのである
が、本発明による変性ヌクレオチドを用いたプローブの
効能を証明するための試験システムとして用いられるこ
とが出来ると云うことは見出されている。該プローブは
例えば約５から約２２キロベースの範囲の大きさの挿入
によるプラスミドベクトルの中におけるクローン化され
たｔＲＮＡ遺伝子のようなオツトー　シュミツ）　＞よ
びデイ−ター　ゼルから得られたクローン化ドロソフィ
ラ連鎖の変種を含んでいた。これらクローンの多くのも
のは既に放射性同位元素を用いた通常の生体内インジッ
ツ交配方法によってドロソフイラ染色体地図上に特有な
バンドを割当てられている。
ＤＮＡプローブはＢｉｏ−ｄＵＴＰの存在下においてニ
ック転換せしめられた。時々３ＨｄＡＴＰおよび／−！
たは３ＨｄＣＴＰが該ニック転換反応混合液中に含！れ
た。このことは単一染色体広がｂ上の連鎖の自動放射能
記録的および免疫螢光的の双方の位置決めを可能にする
。生体内インジノッ交配はＭ、Ｌ、バー１エウ、および
Ｊ、　Ｇ、ガール、細胞生物学における手法、、１０．
１（１９７５）中に記載されたと同様に遂行された。交
配されていないプローブを除去するための最後の２ＸＳ
ＳＣ洗滌の後、スライドはＰＢＳ　（燐酸で緩衝化され
た塩類）です＼がれ、そしてＰＢＳおよび１０　ｍｇ／
ｍｌ　ＢＳＡ中の２．５μｇ／ｍｌラビットアンチービ
オチンと共に３７°Ｃ２〜１６時間評置された。これに
つづいて該スライドはＦＩＴＣ標識付標識札たヒツジア
ンチーラビットＩｇＧ（マイルス研究所、ＰＢＳ）よび
１０　ｍｇ／ｍｌ　Ｂ　Ｓ　Ａ中１：１００に希釈され
ている）と共に１〜４時間時間言置た。エバンス　ブル
ーは屡々螢光照明によって染色体を見るために赤色遊着
色剤として必要とせられる。
夫々５ｋｂ　と２２ｋｂ挿入を含むプラスミドｐＢＲ１
７ＤとｐｐＷ　５３９がこの方法によって交配された時
、交配のパターンは広がシから広がジヘ再現され、そし
て与えられたスライド上に染色体拡がりの９０％以上が
明瞭に観察されることが見出された。
クローン化されている置換可能要素ｐＡｃ１０４はドロ
ンフィラゲノムに沿って多くの位置に地図を形成するも
のとして知られている。このプローブの生体内インジッ
ッ交配によって得られた自動放射能記録と螢光写真の比
較はこの方法の大きな利点、即ち銀粉の拡散地域が自動
放射能記録上に現われる所に二重性たは一連のバンドが
免疫螢光標識付けによって識別出来るということを示す
。
この方法の他の直ちに明らかな利点は間接免疫螢光によ
ってなされるべき遺伝子指定に必要とされる時間におけ
る著しるしい短縮である。特定バンドに対するＤＮＡ断
片の指定は６時間の交配の範囲でなされることが出来る
。これは自動放射能記録露出方法に必要とされる数日間
もしくは数週間と比べれば明らかである。この要因は分
解能の向上と合わせて間接免疫螢光によって検出される
変性ヌクレオチドの使用をこれよう従前の方法に比して
直接より望！しいものとじてしるのである。
この免疫学的方法は！た衛星ＤＮＡがマウス中期染色体
の動原体領域の地図を作成したところの哺乳類染色体を
動かすことが示されている。該結果はヒトおよびその他
の哺乳類からの染色体中の単一複写（独特）連鎖のため
の単一遺伝子地図作成手順の開発に対する基礎を提供す
る。かような手順は染色体の遺伝的構成についての我々
の理解を極めて容易にしそして臨床細胞遺伝的診断をよ
シ迅速かつ実際化するのである。
染色体拡がりがラビットアンチ−ビオチンＩｇＧと共に
交配の後に注目される単一段階゛抗体サントイ、チ′方
法は成功はするであろうが、この原案は明確な遺伝子指
定のために充分な螢光を発しない。しかしながら、ラム
等（１９７２）、フォシー等（１９７４）によって記述
された゛ハプテンー抗体サンドインチ手法′を用いるこ
とによってよシ強力な螢光的信号が得られることが出来
る。この手順においては第一次抗体、我々の場合は単一
種的。
即ちラビット　アンチ−ビオチンＩｇＧは望１しくは免
疫グロブリンが一つの抗原親和性カラム（ビオチン−セ
ファローズＴＭ）に結びついていル間ニ例えば２，４−
ジニトロフルオロベンゼンのようなハプテン化試薬によ
って化学的に変性される０１５〜２０だけのハプテン（
ＤＮＰ）グループが親和性もしくは特性を抱束している
その抗原を減少することなくして第一次抗体に結合され
ることが出来る（ワレースふ・よびフオシー、　１９７
９）。
該試験試料の第一次抗体処理に続いて螢光標識付けされ
たアンチ−ＩｇＧよシもむしろ螢光標識付けされたアン
チ−ハプテンＩｇＧ抗体と共に養生が行われるならば、
螢光信号にふ・ける５から７倍の増加が得られることが
出来る。！た単一種的ギニアビッグ　アンチ−ＤＮＰ　
ＩｇＧが利用出来るので、我々はこの第二次抗体をビオ
チンでハプテン化しかくして二つのアンチーノ・ブテン
ＩｇＧ集団、ＤＮＰ−標識付けされたアンチ−ビオチン
ＩｇＧとピオチン標識付けされたアンチ＝ＤＮＰＩｇＧ
とを作ることが出来る。もしこれらがハプテン−抗体サ
ンドインチを行なうために交互に用いられ、そしてそれ
から多くの噴孔動物種からの　ＩｇＧ分子に固有的に結
びついているスタフィロコッカス。
アウレウスからの螢光標識付けされた蛋白質Ａに従かわ
れるならば、それは付随の有用性と共に第一次抗体信号
の美大な増幅を結果として生ずる。
ス、トレプトミセス　アビヂンからの蛋白質ストレプト
アビヂンは結合された可視化システム〔例えば螢光プロ
ーブ（上）もしくは組織化学試薬（下）〕を交配された
ビオチン含有ポリヌクレオチドの位置に対して固有的に
指向を行なうための乗物として可能性ある選択物である
。アンチ−ビオチンＩｇＧに対してストレプトアピヂン
が優る一つの点はハプテン−ＩｇＧ相互作用の会合常数
が１０７から１０１０であるのに対してビオチンに対す
るそれの親和性はＫａｓｓｎ＝１０１５であることであ
る。
迅速な反応速度と美大な親和性はビオチン化されたプロ
ーブの位置決めに要する時間が免疫学的試薬における時
間単位に対してストレプト　アビヂンに釦いては分単位
になることであろう。
ストレプト　アビヂン検出システムの最初の評価は現在
進行中である。ビオチン化ＤＮＡ１査子と交配されたポ
リテン染色体はストレブトアビヂンと共に装置せられ、
次いでビオチンおよびＦＩＴＣ（ＦＩＴＣ，ビオチン化
−ＢＳＡ）で二重に標識付けされたウシ血清アルブミン
と共に後装置されるであろう。四つのストレプトアビヂ
ン亜単位のうちの只−つだけが各々のビオチン化ＤＮＡ
位置の結合の中に含壕れることが可能であると思われる
から、一つの標識性されたＢＳＡ分子が該ストレプトア
ビヂンーピオチン化ヌクレオチド錯体のうちの残存する
三つの非共役亜単位の各々と結合することが出来る可能
性を有する。この単一ストレプトアピヂン＋ＦＩＴＣ，
ビオチン化ＢＳＡからの螢光信号は先に述べた基礎の゛
抗体サンドインチ方法′を用いて対照と比較されるであ
ろう。
もし１抗体サンドイッチ′とストレブトアビヂン＋ＦＩ
ＴＣ、ピオチン化ＢＳＡ検出強度が比較出来るならば、
ストレプトアビヂン＋ＦＩＴＣ，ピオチン化−ＢＳＡシ
ステムは多重１ハプテン−抗体サンドイッチ′方法と匹
敵する様式で単一複写の複写感度に迄高めることが企て
られ得る。ＢＳＡ上のビオチン基のいくらかのものはス
トレプトアピヂンの第−層には結合されていないので、
ストレプトアビヂンの第二層は充分な信号が得られる寸
で付加されることが出来る。例えばもし第二層にふ゛い
て只二つのストレプトアビヂンプロモーターが第−層Ｂ
ＳＡの各々と結合しそしてこれらストレプトアビヂンプ
ロモーターの各々が三つのＦＩＴＣ−ビオチン化ＢＳＡ
分子と結合するならば、第二層強度は第−層からのそれ
の二倍になう、第三層に対しては化学量論的に結合して
いる類似物と共に螢光強度は第−層のそれの１２倍にな
り、それ故に全強度は引続いて加えられる層と共に急速
に増加するであろう。
結び付けられている螢光物質とビオチンプローブの量を
最大にするためにＢＳＡようもむしろ甲状腺グロブリン
のような大きな担体蛋白質が用いられる計画がある。ビ
オチンプローブと担体蛋白質との間のより長い結合調子
を用いることはまた必要であろう。よシ長い結合調子は
ビオチン化された螢光性担体分子を各々の非共役ストレ
プトアビヂン亜単位に理論的に配達することを分子空間
的に最適化し、そして該ビオチン化された螢光性担体と
結び付くであろう後続の層におけるストレブトアビヂン
プロモーターの数を最大にする。先のように、適当な対
照は螢光プローブとビオチンを有する担体蛋白質の置換
は溶解性ふ・よび／または非特定結合問題を生じない。
ストレプトアビヂンー担体配達システムはその配達速度
に加えて免疫螢光方式と比べて二つの重大な利点を有す
る。第一に、只二つの蛋白質成分が層形成に必要とされ
るのみである。第二に、只−つの担体蛋白質が変性のた
めに必要でありそしてそれは官能性を維持する必要がな
くまたはピオチン基と同程度の長さの全構造形態でさえ
もストレプトアビヂンに接近し得る。
交配されたプローブを可視化するための螢光方法の一つ
の選択されたものは例えばパーオキシダーゼ、β−ガラ
クトシダーゼのアルカリホスファターゼのような酵素を
可溶性基質を不溶性着色沈澱物に酵素的に転換すること
が光顕微鏡で可視化せしめられ得る交配位置に指向する
ことである。
この手法の重要な利点は組織化学的方法が螢光検出より
も１０から１００倍以上敏感であることである。加うる
に、着色沈澱物は広範囲にわたる光露出によっても色が
あせず、かくして螢光光顕微鏡検査の一般的な欠点を回
避するものである。これら酵素は例えばグルタルアルデ
ヒドのような二官能性試薬を用いる゛ハプテンー抗体サ
ンドインチ手法において、またパーオキシダーゼの場合
はバーオキ、シダーゼ炭水化物部分をアルデヒドに酸什
しそしてこれらの残渣を所望の蛋白質のε−アミノ基と
結合することによって螢光プローブの代シに最終的な抗
体に結合せしめられ得る。ストレプトアビヂンービオチ
ン化担体蛋白質方法に対しては、それと結合されるピオ
チン基を有する酵素は螢光的にビオチン化された担体シ
ステムを置き代えることが出来た。交互に該酵素はビオ
チン化されたＢＳＡもしくは甲状腺グロブリンを用いて
先の層の中に形成されたストレブトアビヂン位置の増幅
をともなってビオチンによってストレプトアビヂンの最
後の層に結合され得た。我々は必要な組織化学的試薬お
よび生体内原位置交配を背後問題なくして可視化するた
めの適当な基質／不溶解生成物結合体の開発に間もなく
着手するであろう。
信号増幅に対する組織化学的研究はそれ故に１９８１年
の夏に試験の準備がなされるべきである。
螢光の非常に低いレベルを検出および／または推定する
ことはレーザおよび光増感剤からなる現在用いられてい
る像増強物もしくはシステムを用いることによって可能
である。これらの方法は個々の光子のレベル程度に低い
光の検出を可能ならしめる。像の例えば各々の映写像で
ある各々の点が目的物の点によって発せられる光子の数
に厳密に比例する適当なディジタル処理システムによっ
て、像が形成されることが出来る。この種のシステムも
しくは細胞の全部もしくは一部がレーザ光線を通り過ぎ
て流動する流動システムを用いて、１００から目視で検
出され得る１０００以上壕以上間の因子からの螢光物質
に対する検出感度増強が得られることが出来る。この増
強は単一複写遺伝子の螢光を検出するに充分である。
望！しい変性において、アリルアミン結合調子を介して
ピ１７　ミヂン環のＣ−５位置に共有的に結合されてい
るピオチン分子を含むｄＵＴＰ＞よびＵＴＰ類似物は合
成されている。これらビオチン化−ヌクレオチドは試験
管内でのＤＮＡおよびＲＮＡポリメラーゼの種々のもの
に対する効果的な基質である。ピオチン置換体の低レベ
ル（５０分子もしくはそれ以下／キロペース）を含んで
いるＤＮＡは置換されていない対ＪＩＦＦ、　Ｄ　Ｎ　
Ａのそれから区別することの出来ない変性、再合同、そ
して交配特性を有する。
かくして本発明はｌた染色体核型形成の方法を提供する
。この方法においては、変性されたポリヌクレオチドが
既知の遺伝子に相当しそして変性ヌクレオチドを含む変
性ポリヌクレオチドが調製される。これらヌクレオチド
は染色体デオキシリボ核酸と交配せられ、生じた複合体
は適轟な條件下において適当なポリペプチドと接触せし
められ、錯体を形成する。該゛ポリヌクレオチドは検出
可能な部分を含み、それ故に該錯体の位置は測定が可能
でありそして固有な遺伝子の位置はそれによって固定さ
れる。
本発明の他の実施例はウラシル塩基のいくらかが変性さ
れてプローブを含むポリＵを用いるポリＡ含有連鎖の検
出を含む。更に他の実施例ではＸ。
ｙ釦よび２のうちの二つが反応せしめられて環状部分 を形成する環状変性ヌクレオチドを含む。
このような環状変性ヌクレオチドはそれから癌もしくば
腫瘍細胞を検出する方法として順次に用いられる細胞表
面上のホルモン受入れ位置の識別のために用いられる。
なポリペプチドの生成に関連するデオキシリボ核酸遺伝
子連鎖から合成され、その存在が特定の腫瘍細胞に対す
る診断に役立つメツセンジャーリボ核酸と対をなすポリ
ヌクレオチドの調製によって診断され得る。かくして交
配複合体の交配トよび検出は腫瘍細胞の検出のための方
法を提供する。
以下の実施例は本発明の種々の様相を説明するためのも
のであるが、「特許請求の範囲」中に記載されるよりも
本発明の技術的範囲をより詳細に如何なる方法において
も制限する意図を有するものではない。
実施例１および２ ビオチン化−ＵＴＰとビオチン化−ｄＵＴＰの合成 最後に、腫瘍細胞は本発明によって変性され、例えばα
−胎児蛋白質もしくは癌胚種抗原のよう（ａ）水銀化ヌ
クレオチドの調製 ＤＴＰ（５７０ｍｇ、１．０ミリモル）もしくはｄＵＴ
Ｐ（５５４ｍｇ　、Ｌ、０２９モル）が０．１Ｍ酢酸ン
ーダバッファーｐＨ６，０の１００ｍ１溶解されそして
酢酸水銀（１，５９ｇｍ　、　５．０　ミ’）モル）が
添加された。該溶液は５０°Ｃで４時間加熱せられ、そ
れから氷上で冷却された。塩化リチウム（３９２ｍｇ。
９、ｏ　ミリモル）が添加せられそして該溶液は酢酸エ
チルの等量によって６回抽出せられて過剰のＨｇＣ１□
を除去された。該抽出過程の効率は４，４−ビス（ジメ
チルアミノ）−チオベンゾフェノンを用いて有機層中の
水銀イオン濃度を測定することによって監視された（Ａ
、Ｎ、クリストファーアナリスト、９４，３９２（１９
６９））。ゾール等（Ｒ，Ｍ、に、ゾール、　Ｄ、　Ｃ
，ワード、Ｄ、Ｃ，リビングストン、およびＥ、マーチ
ン、核酸研究。
２．９１５Ｃ１９７５））によって述べられているよう
に水性溶液の一部分をとってそれをヨウ素化し、その後
分光分析を行なうことによって測定せられたヌクレオチ
ド水銀化の程度は通常９０から１００多壕での間であっ
た。水性層中の該ヌクレオチド生成物は酢酸エチル抽出
の間に屡々濁るようになるのであるが、水冷エタノール
の３倍量の添加により沈澱せられそして遠心分離によっ
て集められた。沈澱物は冷純エタノールで二回、エチル
エーテルで一回洗滌せられ、そしてそれから風乾せられ
た。かくして調製せられた水銀化ヌクレオチドは更なる
精製を行なうことなくしてアリルアミン−ヌクレオチド
の台底に用いられる。
（ｂ）アリルアミン−ｄ　Ｕ　Ｔ　Ｐ　訃よびアリルア
ミン−ＵＴＰＯ合威 水合成ヌクレオチド（段階ａの）はｐＨ５，０の０．１
Ｍ酢酸ソーダバッファー中に溶解せられそして２０ミリ
モル（２６７ｎｍで２０００Ｄ／ｍｌ　）に調節された
。水性酢酸中の酢酸アリルアミンの新らしい２．０モル
溶液が１．５ｍｌのアリルアミン（１３，３ミリモル）
を８．５ｍｌの水冷４Ｍ酢酸にゆっくり添加することに
よって調製せられた。中和されたアリルアミンストック
の３ｍ１（６，０ミリモル）かヌクレオチド溶液の２５
ｍ１（０，５ミリモル）に添加された（、４ｍｌの水中
に溶解され九に２ＰｄＣ１４（１６３ｍｇ　、　０．５
ミリモル）の一つのヌクレオチド相当量が添加せられて
反応が開始された。、＜ラヂウム塩（アルファーペント
ロン）の添加に釦いて、反応容器の壁面に生ずる金属（
ＨｇおよびＰｄ）沈積物によって溶液は次第に黒色に変
化した。１８〜２４時間室温に放置した後、該反応混合
物は０．４５　ｍｍ膜フイルタ−（ナルゲン）を通して
残存する金属沈澱物の殆んどを除去した。該黄色Ｐ液は
５倍に希釈せられＤＥＡＥ　　−セファデックスＴＭＡ
−２５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）の１００ｍ１カラムに
適用された。ｐＨ５，０の０．１Ｍ酢酸ソーダの１カラ
ム容量による洗滌の後、該生成物はｐＨ８〜９の酢酸ソ
ーダもしくはｐＨ７，５の重炭酸トリエチルアンモニウ
ム塩のいづれかの１！線型勾配（０，１〜０．６モル）
を用いて流出せしめられた。所望の生成物は０．３０と
０．３５Ｍ塩の間に流出する主ＵＶ吸収部分中に存在し
た。スペクトル分析はこのピークが幾らかの生成物を含
んでいることを示し、最終的な精製はｐＨ３，３の０．
５　ＭＮＨ４Ｈ２ＰＯ４バッファー（分析的分離）もし
くはｐＨ４，３の０．５Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム
（予備分離）のいづれかを用いてＰａｒｔｉｓｉｌ　−
ＯＤＳ　２のカラム上での逆層−ＨＰＬＣクロマトグラ
フィーによって行われた。５（３−アミノプロペン−１
−イル）ウリヂン（ウリヂンのアリルアミンアダクト）
の５−トリホスフェイトが該ＨＰＬＣカラムから流出さ
れるべき最後の部分でありそしてこれらはい壕だ特性付
けされていないけれども三種の夾雑物から明確に分離せ
られた。これらヌクレオチドはプロドロＮＭＲ元素分析
によって［ＡＡ　−ｄＵＴＰ（Ｃ１２Ｎ１６　Ｎ３０１
４　Ｐ３　Ｎａ４　・ｌＨ２Ｏ）　：理論値、　Ｃ、２
２，９１；Ｈ，２，８８；Ｎ、６．６８；Ｐ　、　１４
．７７゜根拠値、Ｃ，２３，１０；Ｈ，２，８５；Ｎ、
６．４９；Ｐ。
１４．７５．　ＡＡ　ＵＴＰ　（Ｃ１２Ｎ１６　Ｎ３０
１５　Ｐ３　Ｎａ４・４Ｈ２０）：理論値、　Ｃ２０，
６１；　Ｈ，３，４６；Ｎ。
６．０１；Ｐ、　１３．３．根拠値Ｃ、２０，６７；Ｈ
，４，ｉｌ　；Ｎ、　５．３９；Ｐ　、　１３．５４　
）であるとスペクトル的にそしてクロマトグラフ的に特
徴付けられた。
（ｃ）　ＡＡ　−ｄＵＴＰ　”ｉたはＡＡ−ＵＴＰのビ
オチン化ビオチン化−Ｎ−ハイドロキシサクシミドエス
テル（ＮＨ３Ｂ）は前述したように（Ｈ，）・イツマン
およびＦ、　Ｍ、　ＩＪチャーズ、米国自然科学学会会
報、７１，３５３７Ｃ１９７４〕）、ビオチン（Ｓｉｇ
ｍａ）から調製せられた。ＡＡ−ｄＵＴＰ　−Ｈ２Ｏ（
６３ｍｇ　、　０．１ミリモル）もしくはＡＡ−ＵＴＰ
　・４Ｈ２０（７０ｍｇ　、　０．１　ミリモル）がｐ
Ｈ８，５の０．１Ｍホウ酸ソーダバッファーの２０ｍ１
中に溶解せられ、セしてジメチルフォルムアルデヒドの
２ｍｌ中に溶解せられ九ＮＨ８Ｂ（３４，１ｍｇ。
０．１ミリモル）が添加された。反応混合物は４時間室
温に放置されそしてそれからｐＨ７，５の０．１ＭＴＥ
ＡＢによって予備平衡化されているＤＥＡＥ−セファデ
ックスＴＭＡ−２５の３０ｍ１　　カラム上に直接負荷
された。該カラムはＴＥＡＢの４００ｍ１線型勾配（０
，１〜０．９　Ｍ　）によって流出された。０．５５と
０．６５Ｍ　ＴＥＡＢ間に流出したビオチン化−ｄＵＴ
Ｐもしくはビオチン化−ＵＴＰを含む区画はメタノール
存在下でロータリーエバポレーションによって脱塩せら
れそして水に再溶解された。時々若干濁った溶液が得ら
れた。ある種のＴＥＡＢ溶液中の夾雑物の故であるこの
濁りは０．４５ｍｍフィルターを通して濾過することに
よって除去された。長期間の貯蔵に対しては、該ヌクレ
オチドはＤｏｗｅｘ　ＴＭ　５０　（Ｎａ　　型）の存
在中で該溶液を短時間攪拌することによってソーダ塩に
変換された。濾過の後、該ヌクレオチドは冷エタノール
の３倍量の添加によって沈澱せしめられ、エチルエーテ
ルで洗滌せられ、水酸化ソーダペレット上で真空乾燥せ
られ、そして−２０°Ｃでデシケータ−中にて貯蔵され
た。直接の使用に対しては、該ヌクレオチド溶液はｐＨ
７，５のトリス−ＨＣｌ中に２０ｍＭとされそして最終
ヌクレオチド濃度を５ｍＭに調節される。ストック溶液
は一２０°Ｃにて凍結貯蔵される。
該ｂｉｏ−ｄＵＴＰ　釦よびｂｉｏ−ＵＴＰ生成物の元
素分析は次の結果を得る。Ｂｉｏ−ｄＵＴＰ（Ｃ２２Ｈ
３０Ｎ５０１ｇ　Ｐ３　ＳＩ　Ｎａ４　　・Ｉ　Ｈ２Ｏ
）、理論値；Ｃ，２９，８０；　Ｈ，３，３８；Ｎ、　
７．８９；Ｐ、　１０．４７　；Ｓ。
３．６１　、根拠値；Ｃ，３０，１４Ｈ，３，２２；Ｎ
、　７．６３；Ｐ。
１０．３１　；　Ｓ　、　３．７０．　　Ｂｉｏ　＋　
ＵＴＰ　（Ｃ２２Ｈ３ｏＮ５０１ｇ　Ｐ３　ＳＩ　Ｎａ
４　・３　Ｈ２Ｏ）　：理論値；Ｃ２２９，１５；Ｈ，
３，１９；Ｎ、７．４５　；Ｐ、９．８９　；　Ｓ。
３．４１．根拠値；　Ｃ、２８，７６；　Ｈ，３，３５
；　Ｎ。
７．６８　；　Ｐ　、　９．８１　；　Ｓ　、　３．３
２゜ｐＨ７，５におけるｂｉｏ−ｄＵＴＰとｂ　ｉ　ｏ
　−ＵＴＰのスペクトル性質〔λｍａＸ＊　２８９ｎｍ
（ｃ＝＝７，１００）；λｍａｘ＋　２４０ｎｍ（ｇ＝
１０＋７００）；　’１ｍ１ｎ、２６２ｎｍ（ε＝４，
３００）：ｌはピリミヂン環と共役する一つの外環二重
結合の存在を反映している。エタノール性硫酸中のＰ−
ジメチルアミノシンナムアルデヒドで処理するピオチン
定量分析に用いられる方法（Ｄ、Ｂ、　マコーミック訃
よびＪ、　Ａ、ルース、生化学分析、、３４，３２６．
１９７０）を行なった時、これらヌクレオチドは筐た強
い陽性反応を示す。しかしながら、これらはもはやＡＡ
−ｄＵＴＰＡ−よびＡＡ−ＵＴＰ出発物質の特徴的反応
であるニンヒドリン反応を示さない。
実施例３シよび４ ピオチン化−ＣＴＰとビオチン化−ｄＣＴＰの合成ＣＴ
ＰとｄＣＴＰは本質的には実施例１に記述したように（
ａ）水銀化され、（ｂ）アリルアミンと反応せられ、（
ｃ）ＮＨＳ−ピオチンでビオチン化された。
ＣＴＰ　（５６，３ｍｇ、０．１ミリモル）もしくはｄ
　ＣＴＰ（５９，１ｍｇ、０．１ミリモル）がｐＨ５，
０の０．１　Ｍ酢酸ソーダバッファーの２０ｍ１中に溶
解せられそして酢酸水銀（０，１５９ｇｍ、０．５ミリ
モル）が添加された。該溶液は５０″Ｃで４，５時間加
熱せられそれから氷上で冷却せられた。塩化リチウム（
３９，２ｍｇ　、　０．９　ミリモル）が添加せられそ
して該溶液は酢酸エチルで６回抽出せられた。水性層中
の該ヌクレオチド生成物は冷エタノールの３倍量の添加
によって沈澱せられ、該沈澱物は純エタノール、エチル
エーテルで洗滌せられ、そしてそれから乾燥せられた。
これら生成物は夫々ＡＡ−ＣＴＰふ−よびＡＡ−ｄＣＴ
Ｐの合成のために更なる精製を行なうことなくして用い
られた。該水銀化ヌクレオチドはｐＨ５，０の０．１Ｍ
酢酸ンーダバンファ−の中に溶解せられそして１０ｍＭ
　（２７５ｎｍ１ｃ＞いて９２０Ｄ／ｍｌ）の濃度に調
節せられた。２．０Ｍ酢酸アリルアミンストック（実施
例１に述べたと同様に調製せられた）の０．６ｍ１（１
，２ミＩＪモル）がヌクレオチド溶液（０，１ミリモル
）の１０ｍ１に添加せられ次いで１．０ｍｌのＨ２０に
溶解せられたヌクレオチド溶液（０，１□リモル）　Ｋ
２ＰｄＣ１４（３２、６ｍｇ　＋　０．１　ミ’Ｊモル
）が添加された。室温で２４時間放置した後、該溶液は
０．４５ｍｍ膜を通してｒ過を行ｉい金属沈澱物を除去
した。該ｒ液は５倍に希釈されそしてｐＨ７，５の５０
ｍＭ　　ＴＥＡＨによって予備平衡化されたＤＥＡＥ−
セファデックスＡ−２５の５０ｍ１カラム上に負荷され
た。該ヌクレオチド生成物はｐＨ７，５の５００ｍ１線
型勾配（０，０５〜０．６Ｍ）の応力によって分別され
た。所望の生成物は０，２８と０．３８　Ｍ塩の間に流
出する主ＵＶ吸収部分中に存在した。集められた試料は
ロータリーエバポレーションによって脱塩せられ、ｐＨ
４，２に０．５Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム中に溶解
され、そして最終的な精製は０．５Ｍ酢酸トリエチルア
ンモニウムを流出液として用いてＰａｒｔｉｓｉｌ　Ｏ
ＤＳ　−２のカシム上でＨＰＬＣクロマトグラフを行う
ことによって違或せられた。適当な区画が集められ凍結
真空乾燥せられ、そして生成物はＨ２０中に溶解せられ
た。該ヌクレオチドはＤｏｗｅｘＴＭ５０　（Ｎａ型）
の存在にかいて短時間攪拌することによってＮａ塩に変
換せられた。
Ｄｏｗｅｘレジンを除去するためのｆ通抜、ヌクレオチ
ドは冷エタノールの３倍量の添加によって沈澱せられた
。該沈澱物はエーテルで洗滌されそしてそれから風乾せ
られた。分析結果：　ＡＡ−ｄＣＴＰ（Ｃ１２Ｈ１７Ｈ
４０１３Ｐ３　Ｎａ４　”　２Ｈ２０）　；理論値、　
Ｃ、２２，２９；Ｅ（、２，６３；　Ｎ、　　８．６７
、　Ｐ。
１４．４０　、根拠値Ｃ，２２，１６；Ｈ，２゜８９；
Ｎ、８．７７；　Ｐ　、　　１４．１８．　ＡＡ−ＣＴ
Ｐ　（Ｃ１２Ｈ１７Ｎ４０．４Ｎａ４　”　２Ｈ２０）
　；理論値　Ｃ，２１，７５；　Ｈ，２，５７；Ｎ、　
８．４６　；　Ｐ　、　１４．０１．根拠値、　Ｃ、２
２，０３；Ｈ，２，４７；　Ｎ、　８．６９；　Ｐ　、
　１３．８１　；ｐＨ８，０の０．１Ｍホウ酸塩バッフ
ァー中のスペクトル性質。
１ｍａｘ３０１ｎｍ（ｔ＝６＋４００）ｒ″ｋｍｉｎ　
２７１ｎｍ（ｔ＝３，９５０）λｍａｘ　　２５０　ｎ
ｍ（ｔ＝９．７００）。
ＡＡ−ｄＣＴＰおよびＡＡ−ＣＴＰの双方共に陽性ニン
ヒドリン試験を示した。
ＡＡ−ＣＴＰ（６゜６ｒｎｇ　、　０．０１ミリモル）
もしくはＡＡ−ｄＣＴＰ　（６，４ｍｇ、０．０１ミリ
モル）がｐＨ８，５の０．１Ｍホウ酸ソーダバッファー
の５ｍｌ中に溶解せられ、そしてジメチルホルムアミド
の０．２ｍｌ中に溶解せられているＮＨＳ−ビオチン（
３，４ｍｇ。
０．０１ミリモル）が添加された。室温で４時間放置後
、該試料はｐＨ７，５のＴＥＡＢの１５０ｍ１線型勾配
（０，１〜０．９Ｍ）　　を流出液として用いてＤＥＡ
Ｅ−セファデックスＡ−２５の１０ｍ１カラム上でクロ
マトグラフにかけられた。０．５０と０．６０ＭＴＥＡ
Ｂ間に流出したビオチン化−ＣＴＰもしくはピオチン化
−ｄＣＴＰを含む区画は集められ、ロータリーエバポレ
ーションによって脱塩せられ、そしてｐＨ７，５の０．
０２Ｍ　）リスー塩酸バッファー中で５ｍＭの最終濃度
に調節された後、−２０℃で凍結された。該生成物はエ
タノール性硫酸中にてｐ−ジメチルアミノシンナムアル
デヒドによってビオチンに対する強い陽性反応を示すが
、ニンヒドリンによるスプレー時には第一級アミンに対
する陰性反応を示す。これら生成物の更なる構造的特徴
づけは現在進行中である。
実施例５および６ イミノビオチン化−ＵＴＩ−よびイミノビオチン化−ｄ
ＵＴＰＯ合威 イミ合成オチンハイドロプロマイトは前述したようにし
てビオチンから調製された（Ｋ、ホフマン、Ｄ、Ｂ、　
　メルピールおよびＶ−ｄｕピグニード。
生化学雑誌、１４１，２０７−２１１，１９４１；Ｋ・
ホフマンおよびＡ、　Ｅ、アキセルロンド、同上、。
１８７．２９−３３．１９５０）、イミノビオチンのＮ
−ハイドロキシサクシニミド（ＮＨ８）エステルはＮＨ
３−ビオチ／の合成のために先に記述された原案（Ｈ，
ハイラマン釦よびＦ、　Ｍ、　　リチャーズ。
米国自然科学学会誌、７１，５５３７．１９７４）を用
いて調製せられた。実施例１（ｂ部）において詳細に説
明されたようにしてＡＡ−ＵＴＰ　（７，Ｏｍｇ。
０．０１ミリモル）もしくはＡＡ−ｄＵＴＰ　（６，３
ｍｇ。
０．０１ミリモル）が調製せられｐＨ８，５の０．１　
Ｍホウ酸ソーダバッファーの５ｍｌ中に溶解せられ、ジ
メチルホルムアミドの０．５　ｍｌ中に溶解せられたＮ
Ｈ３−イミノビオチン（３，５ｍｇ　、　０．０１　ミ
リモル）が添加された。該反応混合物は室温で１２時間
放置されそしてそれからｐＨ７，５の０．０５　ＭＴＥ
ＡＢで予備平衡化され九ＤＥＡＥ−セファデックスＡ−
２５の１０ｍ１カラム上に直接負荷された。
該カラムはＴＥＡＢの１５０ｍ１線型勾配（０，０５〜
０．６Ｍ）にヨッテ流出された。０．３５と０．４０Ｍ
ＴＥＡＢ間に流出したイミノビオチン−ＤＴＰもＬ〈は
イミノビオチン−ｄＵＴＰを含む区画はメタノール存在
におけるロータリーエバポレーションによって脱塩せら
れ、Ｈ２Ｏ中に溶解せられた。アリルアミン−ヌクレオ
チドアダクトの少量を不純分として含む該生成物はニン
ヒドリン試験に訃いて弱い陽性を示した。最終的な精製
はアビチン−セファローズ上の親和性クロマトグラフィ
ーによって行われた。ｐ）（８，５のホウ酸ソーダバッ
ファー中にて０．ＩＭにせられた不純生成物の区画はア
ビジン−セファローズの５ｍｌカラムに適用されそして
同じバッファーの２５ｍ１によって洗滌せられた。
カラムはそれからｐＨ４，０の５０ｍＭ酢酸アンモニウ
ムで洗滌せられ、それは鋭いピークで所望のイ□ノピオ
チンーヌクレオチド生成物を流出した。
該ヌクレオチドは冷エタノールの３倍量の添加によって
沈澱せられ、エチルエーテルで洗滌せられ、水酸化ソー
ダペレット上で真空乾燥せられ、−２０°Ｃのデシケー
タ−中で保存せられた。生成物はスペクトルおよびクロ
マトグラフ的性質のみならず元素分析によっても特徴付
けられた。
実施例７釦よび８ ＮＡＧＥ−ＤＴＰ釦よびＮＡＧＥ−ｄＵＴＰの合成アリ
ル（３−アミノ−２−〕１イドロキシー）プロピルエー
テル、ＮＡＧＥと省略されるが、アリルグリシジルエー
テル（Ａｇｅ）（アルドリッチケミカルカンパニーから
得られた）から調製せられたｏ　Ａｇｅ（８４ミリモル
）の１０ｍ１が９Ｍ水酸化アンモニウムの５０ｍ１にゆ
っ〈シ（蒸気よけフード中にて）添加されそして該混合
物は６時間室温で放置せしめられた。過剰のアンモニア
が減圧下ロータリーエバポレーションによって除去せら
れて粘ちょうな黄色油を得た。プロトンＮＭＲによると
の生成物の分析はそれが要求せられる構造を有している
ことを示した。５−水銀−ｄＵＴＰ（０，１ミリモル）
もしくは５−水銀−ＵＴＰ（０，２ミリモル）がｐｌ（
５，０の０．２Ｍ酢酸ソーダバッファーの２〜４ｍｌ中
に溶解され、使用に先立ちｐＨ５，０に酢酸で調節され
たＮＡＧＥの１６倍モル過剰量が添加せられた。最終的
な反応容量（４，３および８．４ｍ１）は夫々４３およ
び４２ｍＭのヌクレオチド濃度を有する。Ｋ２ＰｄＣ１
４の一当量（０，１もしくは０．２−□リモル）が反応
を開始するために添加せられた。室温で１８時間放置の
後、該反応混合物は０．４５μｍＭ膜を通してｒ過せら
れ、該試料は５倍に希釈せられ、そして酢酸ソーダの線
型勾配（０，１−０，６Ｍ）を用いてＤＥＡＥ−セファ
デックスＡ−２５のカラム上にクロマトグラフされた。
ＵＶスペクトルとＰａｒｔｉｓｉｌＯＤＳ　−２上の特
徴的なＨＰＬＣ流出様相によって判定せられるのである
が、所望の生成物を含む区画は集められ、希釈せられ、
そして更にｐＨ８，５の重炭酸アンモニウムの浅薄勾配
（０，１〜０．５Ｍ）を用いたＤＥＡＥ−セファデック
ス上での再クロマトグラフィーによって精製せられた。
これらの條件下において、該ＮＡＧＥ−ｄＵＴＰ（−１
たはＮＡＧＥ　−ＵＴＰ　）の大部分が残存する不純物
からきれいに分離されることが出来た。
ヌクレオチドが凍結真空乾燥されそしてＤ２０中に再溶
解されたのみにプロトンＮＭＲスペクトルがこの精製の
段階で得られた０元素分析に対して、該生成物はソーダ
塩型に変換された０典型的な分析結果は次の通り：　Ｎ
ａｇｅ　　ｄＵＴＰ　（Ｃ１５Ｈ２２Ｎ３０１６　Ｐ３
　Ｎａ４　・２Ｈ２０）　、理論値１ｃＩ２４．９９；
　Ｈ，３，６３；Ｎ、５．８３；　Ｐ、１２．８Ｂ、根
拠値、Ｃ，２５゜３９；Ｈ，３，７１；Ｎ、　５．６３
；Ｐ、　１２．８８実施例９ ラベルされたＤＮＡ鎖の用途 ■核型分類 （ａ）　　約１００から２００のクローンを人間遺伝子
貯蔵庫から選ぶ。上記のようにしてそれらを標識付けし
、そして各々のクローンについて可視的にもしくは低光
レベルビデオシステムによって交配の位置を決定する。
特有な連鎖遺伝子に相当するこれらクローンに対してこ
れは特殊なヒト染色体中のクローン化されたＤＮＡの位
置を測定する。各々の染色体について幾つかのクローン
を得る。これらラベルされたクローンの各々は特殊な染
色体を識別するために用いられることが出来る。これら
は筐た４６個の染色体の各々を２２個の常染色体対の一
つもしくはＸ染色体もしくはＹ染色体であるとして識別
するために結合して用いられ得る。
ラベルされたクローンの一組を染色体と交配せしめるこ
とによって、クローンの該組とそれらの位置とが可視化
され得そして特殊な色で螢光を発するであろう。ラベル
されたクローンの第二組はそれから使用せられて第二螢
光染料と反応せしめられ得る。同様な過程が何回か繰返
えされ得る。かくして、もし所望なれば染色体の各々の
上に異なったしかし固有な位置に訃いて細胞ＤＮＡと結
び付けられている螢光ラベルの幾組かを有することが出
来る。これらラベルは可視的もしくはコンピューター化
された自動核型分類のために用いられることが出来た。
（ｂ）　　自動核型分類のために、各々の染色体上のラ
ベルした位置の数に相当するスポットの組を見出すこと
によって４６個の染色体の各々の大体の位置はクローン
の一組を用いて識別せられ得る。かくして染色体が更な
る分析に１で手を拡げるに適するかどうかを測定するこ
とがディジタル化された像のコンピー−ター分析によっ
て可能となる。
もしこれらが手を拡げるに適しているならば、各々の上
のラベルされたスポットの位置釦よび分散によって個々
の染色体の各々を識別することがコンピューター分析を
用いて可能とｉる。
螢光スポットが各々の染色体上の固有な位置に配置され
得ると云う事実を用いて、このような標識のない場合よ
シばはるかに効果的にマニュアルもしくは自動的な核型
分類のいずれかを行なうことが可能となる。
し必要とあれば、ラベルの二組、即ち染色体２３に対し
て固有的である一つとそしていくらかの他の染色体に対
する一つとが用いられ得る。異なった色であろう該二つ
のラベルの比率を各々の細胞において測定することによ
って、染色体２３番の異常数を示す細胞を識別すること
が可能である。
この手順は低光レベルビデオシステムによるスライド上
で、筐たはレーザ賦活を用いる流動チトメーターシステ
ムにおいてのいづれかを用いることが出来る。
■遺伝的欠陥の診断 例えば２３番のような特殊な染色体に固有的に結合して
いるクローンを選択することによって、例え染色体が中
期に釦いて濃縮されていない場合においてすらも細胞中
の特殊な染色体の複写の数を数えることが可能である。
かくして三倍体染色体２１の胎児期の診断のために胎児
の細胞が得られた時には診断は例え染色体が中期におい
て濃縮されていない場合に）いてすらもなされ得る。も
■微生物検出および識別 上記のようなりＮＡの固有鎖のラベル付けは個々のバク
テリアの識別と計数を可能にする。ＤＮＡの特殊断片が
交配されている個々のバクテリアを識別するために、感
度は単一ラベルされた構造が検出される程度でなければ
ならない。これは低光レベルビデオシステムおよび像の
コンピューター総和を用いて、もしくは光像を強化する
ためのいくらかの他の装置を用いて遺戒され得る。流動
システムは！たもし感度が充分大きくされるならば用い
られ得る。もしスライド上のバクテリアが不動化せられ
るならば、これらの位置は見出されかような螢光スポッ
トの数は数えられることが出来る。これは利用される特
殊クローンで交配され有るＤＮＡを含むこれらバクテリ
アのすべてを計数することを提供するであろう。もしク
ローンが特殊な系列もしくはバクテリアに対して固有で
あるとして選択されるならば、その系列の生物の数が数
えられ得る。加うるに、特殊彦遺伝子が識別されている
いかなる抗生物質耐性も抗生物質耐性遺伝子中に含１れ
ているＤＮＡ鎖をプローブとして用いる同様な方法にお
いて特徴付けられることが出来る。加うるに、−個筐た
はそれ以上の抗生物質耐性遺伝子を含んでいる耐性プラ
スミドに対して固有的である探査子が用いられ得る。個
々のバクテリアに加えて、もしそれらが小さなスポット
中に位置付けせられそれ故にスポット中の交配されたＤ
ＮＡに対して固有な全螢光が測定され得るならば特殊系
列のバクテリア細胞の集団が検出せられそしてそれらの
数が定められる。この方法においては特殊ＤＮＡ連鎖を
含んでいる生物の数はバクテリアの混合体において測定
され得る。
以上

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ここにＢは糖部分のＣ＾１＾’−位置に共有的に結合さ
    れたプリン、７−デアザプリンまたはピリミジン部分を
    表わし、Ｂがプリンまたは７−デアザプリンの時、それ
    は該プリンまたはデアザプリンのＮ＾９−位置に存し、
    Ｂがピリミジンの時、それはピリミジンのＮ＾１−位置
    に存するものと規定せられ、Ａは▲数式、化学式、表等
    があります▼；▲数式、化学式、表等があります▼； ▲数式、化学式、表等があります▼；▲数式、化学式、
    表等があります▼；および ▲数式、化学式、表等があります▼ からなる群から選ばれた部分を表わし、点線はＢとＡと
    を結合する連結基を表わし、もしＢがプリンであれば該
    連結基はプリンの８−位置に存し、もしＢが７−デアザ
    プリンであれば該連結基は該デアザプリンの７−位置に
    存し、そしてもしＢがピリミジンであれば該連結基は該
    ピリミジンの５−位置に存するものと規定せられ、 そしてｘ、ｙおよびｚの各々は Ｈ−、ＨＯ−、▲数式、化学式、表等があります▼、▲
    数式、化学式、表等があります▼、 または▲数式、化学式、表等があります▼ を表わす。 を有する化合物。 ２、Ｂはウラシル、シトシン、デアザアデニン、または
    デアザグアニンである特許請求の範囲１に記載の化合物
    。 ３、該ＢとＡとを結合する連結基はＢに関連してα−位
    置に存するオレフィン結合を含む特許請求の範囲１に記
    載の化合物。 ４、該連結基は−ＣＨ＿２−ＮＨ−部分を含む特許請求
    の範囲１に記載の化合物。 ５、該連結基は−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＿２ＮＨ−および ▲数式、化学式、表等があります▼ からなる群から選ばれる特許請求の範囲１に記載の化合
    物。
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