JP3390468B2 - 新規の無水混合物法による遺伝子プローブの結合方法 - Google Patents
新規の無水混合物法による遺伝子プローブの結合方法Info
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Description
【産業上の利用分野】本発明は新規の混合無水物法によ
る効率的な遺伝子プローブの結合方法に関するものであ
る。
る効率的な遺伝子プローブの結合方法に関するものであ
る。
【従来の技術】遺伝子プローブは医療診断分野において
重要である。生体中の遺伝物質の同定は、その生体のあ
る病気にかかりやすい傾向を予測するのに役立つ。さら
に、感染した生体からの遺伝物質の同定は、病気の原因
を正確に突きとめるのに役立つ。この遺伝子プローブ分
野はここ数年来探求され、その技術に関して開示された
よく知られた文献が豊富にある。例えば、クラウスナー
らのBio/Technology、1983年８月、471 頁；バイリンス
キーのFortune 、1984年７月９日、140 頁；イングルバ
ーグのASM News、1991年57刊第４号、183 頁；ギレシュ
ピーのVeterinaryMicrobiology 、1990年24、217 を参
照のこと。遺伝子プローブ検査法において、使用される
基本的な反応体の１つは、活性分子種に結合した核酸プ
ローブである。核酸プローブは、相補的な一本鎖標的核
酸配列と結合（アニール）して二本鎖分子（ハイブリッ
ド）を形成する一本鎖核酸配列である。そのプローブ
は、全く合成のものであるか、生物学的供給源（組換え
ＤＮＡ）からのものであるか、その２つの組合せのいず
れかである。前記活性分子種には、ハプテン、リガンド
または発光標識などがある。ハプテンは不完全な抗原で
あり、それ自身では免疫応答を刺激することはできない
が、別の分子と適切に結合した場合には、該ハプテンを
特異的に認識する抗体を生成することができるようにな
る。リガンドは、それに対して受容体が天然に存在する
かまたは調製できるようなあらゆる化合物である。受容
体は、分子の特定の空間および極性機構、すなわちエピ
トープ部位を認識することができるあらゆる化合物であ
る。実例となる受容体には、抗体、酵素、抗体断片（Ｆ
ａｂ断片のような）、レクチン、補体成分、リウマトイ
ド因子、ホルモン、アビジン、ブドウ球菌タンパク質Ａ
等がある。発光標識には、より短い波長の光の形態（蛍
光）で伝達されるか化学転化の結果として、分子それ自
身で内部から生じた（化学発光）種々のエネルギー源に
より励起されるとより長い波長の光を放射することので
きる有機化学薬品、有機金属キレート錯体または生体高
分子のようなものがある。ある検査法、例えばサンドイ
ッチ法では、２種類の核酸プローブ複合体（捕獲プロー
ブおよびシグナルプローブ）が用いられる。捕獲プロー
ブにおけるハプテンまたはリガンドの主な機能は、固相
に固定化された抗ハプテンＩｇＧまたは受容体との結合
により、ハイブリッド形成した（アニーリングされた）
核酸（標的核酸と捕獲プローブからなる）の捕獲を仲介
することである。標的核酸の近隣部分とのハイブリッド
形成を通じて、シグナルプローブは、シグナルを発生さ
せることができるような、あるいは結合タンパク質に特
異的に結合して増幅したシグナルを運ぶかまたは発生さ
せることができるようなその包含されたシグナル標識の
効力により、挟まれたハイブリッドの検出を促進させ
る。増幅されたシグナルはビオチン／アビジン系により
説明され得る。巨大分子であるアビジンはいくつかのア
クリジニウムエステル基と反応し、その結果得られた修
飾アビジン分子は１つのアクリジニウムエステルのみが
存在する場合よりもより大きなシグナルを有する。それ
ゆえ、「増幅した」シグナルが得られる。増幅したシグ
ナルを運ぶ結合タンパク質のさらなる例は受容体／リポ
ソーム系である。細胞模倣小胞であるリポソームは、数
千の適切な修飾アクリジニウムエステル（親水性アクリ
ジニウムエステル）または他の発光化合物を封入するこ
とができ、その後、共有結合により、その外表面に多く
の受容体を付着させ得る。（同時系続出願第07/226,639
号参照。）捕獲プローブとシグナルプローブの両者の例
を図１に示す。シグナルの種類は我々の目的にとって厳
密ではなく、放射性シグナル、発光シグナル、蛍光シグ
ナルそして他の種類のシグナルがあり、例えば、アクリ
ジニウムエステル、フィコビリタンパク質および間接ビ
オチン−アビジンまたはアルカリ性ホスファターゼシス
テムを使用することができる。プローブと活性分子種と
を結合（coupling）させる多くの技術が知られている。
これらは、（１）ヌクレオチドのプリンまたはピリミジ
ン部分を修飾することまたは（２）プローブの５′また
は３′末端に、ある官能基を結合させることを含む。プ
ローブと標的核酸の間の妨害は最小限とすることができ
るので、核酸の５′または３′末端を官能化する後者の
方法が一般的に好ましいが、ここに開示されている技術
はまた、ポリヌクレオチドの個々の予め生成されている
塩基を修飾するのに用いられる。100 塩基をかなり超え
る長さのポリヌクレオチドの合成は、他の技術の中でホ
スフォアミジテ（phosphoramidite ）結合化学を用いる
ＤＮＡの合成装置の商業化以来、通常のできごととなっ
ている。５′または３′末端でプローブを官能化するい
くつかの技術が報告されている。アグラワル（Agrawal
）ら＜Nucleic Acid Res. 、14(1986)6227＞は、リボ
ヌクレオシドをデオキシオリゴヌクレオチドの５′末端
に結合させ、そのリボシル部分を過ヨウ素酸塩で酸化し
て結合のためのジアルデヒドの官能基を生成させた。さ
らに、対応するアミノアルキルまたはメルカプトアルキ
ル基を含む一連のデオキシオリゴヌクレオチド変更因子
が商業的に入手可能になっている（例えば、カリフォル
ニア州、パロアルト、ClontechLaboratories, In
c.,）。これらは、自動化された合成装置上でオリゴヌ
クレオチドの調製中に所望により（３′末端、オリゴマ
ー鎖の中間、または５′末端）加えられる。
重要である。生体中の遺伝物質の同定は、その生体のあ
る病気にかかりやすい傾向を予測するのに役立つ。さら
に、感染した生体からの遺伝物質の同定は、病気の原因
を正確に突きとめるのに役立つ。この遺伝子プローブ分
野はここ数年来探求され、その技術に関して開示された
よく知られた文献が豊富にある。例えば、クラウスナー
らのBio/Technology、1983年８月、471 頁；バイリンス
キーのFortune 、1984年７月９日、140 頁；イングルバ
ーグのASM News、1991年57刊第４号、183 頁；ギレシュ
ピーのVeterinaryMicrobiology 、1990年24、217 を参
照のこと。遺伝子プローブ検査法において、使用される
基本的な反応体の１つは、活性分子種に結合した核酸プ
ローブである。核酸プローブは、相補的な一本鎖標的核
酸配列と結合（アニール）して二本鎖分子（ハイブリッ
ド）を形成する一本鎖核酸配列である。そのプローブ
は、全く合成のものであるか、生物学的供給源（組換え
ＤＮＡ）からのものであるか、その２つの組合せのいず
れかである。前記活性分子種には、ハプテン、リガンド
または発光標識などがある。ハプテンは不完全な抗原で
あり、それ自身では免疫応答を刺激することはできない
が、別の分子と適切に結合した場合には、該ハプテンを
特異的に認識する抗体を生成することができるようにな
る。リガンドは、それに対して受容体が天然に存在する
かまたは調製できるようなあらゆる化合物である。受容
体は、分子の特定の空間および極性機構、すなわちエピ
トープ部位を認識することができるあらゆる化合物であ
る。実例となる受容体には、抗体、酵素、抗体断片（Ｆ
ａｂ断片のような）、レクチン、補体成分、リウマトイ
ド因子、ホルモン、アビジン、ブドウ球菌タンパク質Ａ
等がある。発光標識には、より短い波長の光の形態（蛍
光）で伝達されるか化学転化の結果として、分子それ自
身で内部から生じた（化学発光）種々のエネルギー源に
より励起されるとより長い波長の光を放射することので
きる有機化学薬品、有機金属キレート錯体または生体高
分子のようなものがある。ある検査法、例えばサンドイ
ッチ法では、２種類の核酸プローブ複合体（捕獲プロー
ブおよびシグナルプローブ）が用いられる。捕獲プロー
ブにおけるハプテンまたはリガンドの主な機能は、固相
に固定化された抗ハプテンＩｇＧまたは受容体との結合
により、ハイブリッド形成した（アニーリングされた）
核酸（標的核酸と捕獲プローブからなる）の捕獲を仲介
することである。標的核酸の近隣部分とのハイブリッド
形成を通じて、シグナルプローブは、シグナルを発生さ
せることができるような、あるいは結合タンパク質に特
異的に結合して増幅したシグナルを運ぶかまたは発生さ
せることができるようなその包含されたシグナル標識の
効力により、挟まれたハイブリッドの検出を促進させ
る。増幅されたシグナルはビオチン／アビジン系により
説明され得る。巨大分子であるアビジンはいくつかのア
クリジニウムエステル基と反応し、その結果得られた修
飾アビジン分子は１つのアクリジニウムエステルのみが
存在する場合よりもより大きなシグナルを有する。それ
ゆえ、「増幅した」シグナルが得られる。増幅したシグ
ナルを運ぶ結合タンパク質のさらなる例は受容体／リポ
ソーム系である。細胞模倣小胞であるリポソームは、数
千の適切な修飾アクリジニウムエステル（親水性アクリ
ジニウムエステル）または他の発光化合物を封入するこ
とができ、その後、共有結合により、その外表面に多く
の受容体を付着させ得る。（同時系続出願第07/226,639
号参照。）捕獲プローブとシグナルプローブの両者の例
を図１に示す。シグナルの種類は我々の目的にとって厳
密ではなく、放射性シグナル、発光シグナル、蛍光シグ
ナルそして他の種類のシグナルがあり、例えば、アクリ
ジニウムエステル、フィコビリタンパク質および間接ビ
オチン−アビジンまたはアルカリ性ホスファターゼシス
テムを使用することができる。プローブと活性分子種と
を結合（coupling）させる多くの技術が知られている。
これらは、（１）ヌクレオチドのプリンまたはピリミジ
ン部分を修飾することまたは（２）プローブの５′また
は３′末端に、ある官能基を結合させることを含む。プ
ローブと標的核酸の間の妨害は最小限とすることができ
るので、核酸の５′または３′末端を官能化する後者の
方法が一般的に好ましいが、ここに開示されている技術
はまた、ポリヌクレオチドの個々の予め生成されている
塩基を修飾するのに用いられる。100 塩基をかなり超え
る長さのポリヌクレオチドの合成は、他の技術の中でホ
スフォアミジテ（phosphoramidite ）結合化学を用いる
ＤＮＡの合成装置の商業化以来、通常のできごととなっ
ている。５′または３′末端でプローブを官能化するい
くつかの技術が報告されている。アグラワル（Agrawal
）ら＜Nucleic Acid Res. 、14(1986)6227＞は、リボ
ヌクレオシドをデオキシオリゴヌクレオチドの５′末端
に結合させ、そのリボシル部分を過ヨウ素酸塩で酸化し
て結合のためのジアルデヒドの官能基を生成させた。さ
らに、対応するアミノアルキルまたはメルカプトアルキ
ル基を含む一連のデオキシオリゴヌクレオチド変更因子
が商業的に入手可能になっている（例えば、カリフォル
ニア州、パロアルト、ClontechLaboratories, In
c.,）。これらは、自動化された合成装置上でオリゴヌ
クレオチドの調製中に所望により（３′末端、オリゴマ
ー鎖の中間、または５′末端）加えられる。
【発明が解決しようとする課題】アミノアルキル官能化
プローブを結合のために選択した場合、安定した複合体
(conjugate) を形成するために種々の官能基を運ぶリガ
ンドが用いられる。例えば、すでに活性化した形態のリ
ガンドであるイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）とともに
フルオレセインを使用することがNucleic Acid Res.,19
85年13巻1529に記載されている。Nucleic Acid Res.,19
86年14巻6227に記載されているビオチンをカルボキシレ
ートとともに使用すると、ビオチン−ＮＨＳを形成する
ためにＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）の予備
活性化を必要とする。しかしながら、どちらの場合にお
いても、反応を誘起し、合成オリゴヌクレオチドの使用
法を最大限とするために、500:1 より大きなモル比の非
常に過剰なリガンドが必要であった。このような高使用
量比を用いることは、この結合化学（coupling chemist
ry）を実行する者の間で広く行なわれており、これら２
つの活性化形態の水性不安定性および／または穏やかな
反応性のために、必要であると思われている。これらの
反応からのプローブ抱合体（probe conjugate)の収量は
適度に高い（80％より大きい）。しかしながら、１つの
反応物を過剰に使用することに関連した短所、すなわ
ち、作業が短調であきあきすること、精製が困難である
こと、およびコストなどが短所である。
プローブを結合のために選択した場合、安定した複合体
(conjugate) を形成するために種々の官能基を運ぶリガ
ンドが用いられる。例えば、すでに活性化した形態のリ
ガンドであるイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）とともに
フルオレセインを使用することがNucleic Acid Res.,19
85年13巻1529に記載されている。Nucleic Acid Res.,19
86年14巻6227に記載されているビオチンをカルボキシレ
ートとともに使用すると、ビオチン−ＮＨＳを形成する
ためにＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）の予備
活性化を必要とする。しかしながら、どちらの場合にお
いても、反応を誘起し、合成オリゴヌクレオチドの使用
法を最大限とするために、500:1 より大きなモル比の非
常に過剰なリガンドが必要であった。このような高使用
量比を用いることは、この結合化学（coupling chemist
ry）を実行する者の間で広く行なわれており、これら２
つの活性化形態の水性不安定性および／または穏やかな
反応性のために、必要であると思われている。これらの
反応からのプローブ抱合体（probe conjugate)の収量は
適度に高い（80％より大きい）。しかしながら、１つの
反応物を過剰に使用することに関連した短所、すなわ
ち、作業が短調であきあきすること、精製が困難である
こと、およびコストなどが短所である。
【課題を解決するための手段】本発明はハプテン、リガ
ンドまたは発光標識をポリヌクレオチドに結合させる(c
onjugate）新規の方法を提供するものである。この方法
は混合無水物を形成し、続いて、ＤＭＦ／水溶媒系中で
前記混合無水物中間体と求核基含有ポリヌクレオチドを
反応せしめることからなる。生成した化合物は遺伝子プ
ローブ分野において特に有用であることが判明した。カ
ルボキシレート基を有する化合物とアミノまたはスルヒ
ドリル基を有する化合物とを反応させて安定なアミドま
たはそれより安定性が小さいチオエステル結合を形成す
る技術が有機化学においてよく知られている。カルボキ
シレート基を活性化する通常の方法の１つは、非水性媒
体中で混合無水物誘導体を調製することである。この技
術はカルボキシレート基をアルキルクロロホルメートま
たはアリルクロロホルメートにより活性化させて反応性
混合無水物中間体を形成させることを含み、この中間体
はさらに第二の化合物のアミノ基またはスルフヒドリル
基と反応して複合体を形成する。例えばシュレダー（Sc
hroeder ）らのMethodsin Enzymology,57巻、424 頁、1
978年を参照のこと。この文献は、溶媒として無水有機
溶媒混合物を用いた混合無水物法によるチロキシン−イ
ソルミノール複合体の調製を報告している。ロー＜（9/
7/87に出願）同時係続出願07/094,667号＞は、無水クロ
ロホルム／ＤＭＦ混合物においてこの技術を用いてチロ
キシン−スクシネート−ホスファチジルエタノールアミ
ン複合体を調製している。水分に対する混合無水物中間
体の高い反応性と感度により、およびヌクレオチドのプ
リンまたはピリミジン環に生じる副反応であって、それ
ゆえハイブリッド形成を妨げる前記副反応の可能性のた
めに、水性雰囲気は避けられる。予期せぬことに、厳密
に選択した環境下で、混合無水物法により活性化された
リガンドが、ジメチルホルムアミド（ＤＭＨ）／水混合
物中のアミノアルキル官能化オリゴヌクレオチドとよく
反応して、20:1のより低い使用量比で、プローブ複合体
の匹敵する収量を得られることがわかった。その反応機
構は、反応Ａに示すように、結合反応の第一段階として
反応性混合無水物中間体を形成するために、無水有機溶
媒中においてカルボキシレート含有リガンドをアルキル
またはアリルクロロホルメートにより活性化することを
含むものである。
ンドまたは発光標識をポリヌクレオチドに結合させる(c
onjugate）新規の方法を提供するものである。この方法
は混合無水物を形成し、続いて、ＤＭＦ／水溶媒系中で
前記混合無水物中間体と求核基含有ポリヌクレオチドを
反応せしめることからなる。生成した化合物は遺伝子プ
ローブ分野において特に有用であることが判明した。カ
ルボキシレート基を有する化合物とアミノまたはスルヒ
ドリル基を有する化合物とを反応させて安定なアミドま
たはそれより安定性が小さいチオエステル結合を形成す
る技術が有機化学においてよく知られている。カルボキ
シレート基を活性化する通常の方法の１つは、非水性媒
体中で混合無水物誘導体を調製することである。この技
術はカルボキシレート基をアルキルクロロホルメートま
たはアリルクロロホルメートにより活性化させて反応性
混合無水物中間体を形成させることを含み、この中間体
はさらに第二の化合物のアミノ基またはスルフヒドリル
基と反応して複合体を形成する。例えばシュレダー（Sc
hroeder ）らのMethodsin Enzymology,57巻、424 頁、1
978年を参照のこと。この文献は、溶媒として無水有機
溶媒混合物を用いた混合無水物法によるチロキシン−イ
ソルミノール複合体の調製を報告している。ロー＜（9/
7/87に出願）同時係続出願07/094,667号＞は、無水クロ
ロホルム／ＤＭＦ混合物においてこの技術を用いてチロ
キシン−スクシネート−ホスファチジルエタノールアミ
ン複合体を調製している。水分に対する混合無水物中間
体の高い反応性と感度により、およびヌクレオチドのプ
リンまたはピリミジン環に生じる副反応であって、それ
ゆえハイブリッド形成を妨げる前記副反応の可能性のた
めに、水性雰囲気は避けられる。予期せぬことに、厳密
に選択した環境下で、混合無水物法により活性化された
リガンドが、ジメチルホルムアミド（ＤＭＨ）／水混合
物中のアミノアルキル官能化オリゴヌクレオチドとよく
反応して、20:1のより低い使用量比で、プローブ複合体
の匹敵する収量を得られることがわかった。その反応機
構は、反応Ａに示すように、結合反応の第一段階として
反応性混合無水物中間体を形成するために、無水有機溶
媒中においてカルボキシレート含有リガンドをアルキル
またはアリルクロロホルメートにより活性化することを
含むものである。
【化１】
クロロホルメート中のＲは、アリール、あるいは直鎖ま
たは側鎖のアルキルまたはアラルキル基を表わし、その
炭素原子数は１−20であり、好ましくは１−８であり、
さらに好ましくは１−４である。通常用いられるクロロ
ホルメートの例は、エチル、イソブチル、ベンジルまた
はフェニルクロロホルメートである。トリエチルアミン
のような有機塩基は、一般的にそのような反応に含ま
れ、混合無水物の形成における副生成物である塩酸の受
容体の代用となる。リガンド：クロロホルメート：有機
塩基のモル比は、１：１：１または数倍の過剰のクロロ
ホルメートおよび有機塩基までと設定され、それによっ
てリガンドのカルボキシレート基の完全な活性化が確保
される。使用する無水有機溶媒は好ましくは、リガンド
の溶解度により極性の少ないクロロホルムから極性の強
いＤＭＦまでの範囲にある非プロトン性溶媒である。種
々の比率の混合溶媒もまた用いられる。（同時係続出願
第07/249,620号参照のこと。）反応は一般的に周囲温度
で行なわれるが、好ましくは−20℃までのより低温で、
さらに最も好ましくは氷浴中で行なわれる。特にスケー
ルアップに際して、制御できない発熱反応または副反応
を避けるために、温度は周囲温度、または好ましくはそ
れより低く保持される。エチルクロロホルメートを使用
した反応では、０−15℃の範囲の温度が通常であると報
告されている。反応時間は数分から１時間に亘り、好ま
しくは全ての反応物の混合後、30分である。その反応
は、結合反応の第二段階に備えるため過剰のクロロホル
メートを除去すべく、全ての揮発性成分の完全な蒸発と
ともに行なわれるべきである。クロロホルメートとオリ
ゴヌクレオチドの官能基との間で望ましからぬ反応が生
じ得るような複雑さを避けるために、過剰のクロロホル
メートの除去（適応できる場合）を行なう。反応の第二
段階において（反応Ｂを参照のこと）、溶媒系として有
機溶媒と水の混合物を用いて、混合無水物中間体を、ア
ミノアルキルまたはメルカプトアルキルで官能化したオ
リゴヌクレオチドの３′または５′末端と反応せしめ
る。有機溶媒は、以下の反応機構に示されるように優先
的にジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）が用いられる。
Ｒ′は、好ましくはアミンまたはスルフヒドリルを運ぶ
変更因子の形態に応じて直鎖または側鎖アルキル基であ
るが、またヘテロ原子および／またはアリール基を含ん
でもよい。
たは側鎖のアルキルまたはアラルキル基を表わし、その
炭素原子数は１−20であり、好ましくは１−８であり、
さらに好ましくは１−４である。通常用いられるクロロ
ホルメートの例は、エチル、イソブチル、ベンジルまた
はフェニルクロロホルメートである。トリエチルアミン
のような有機塩基は、一般的にそのような反応に含ま
れ、混合無水物の形成における副生成物である塩酸の受
容体の代用となる。リガンド：クロロホルメート：有機
塩基のモル比は、１：１：１または数倍の過剰のクロロ
ホルメートおよび有機塩基までと設定され、それによっ
てリガンドのカルボキシレート基の完全な活性化が確保
される。使用する無水有機溶媒は好ましくは、リガンド
の溶解度により極性の少ないクロロホルムから極性の強
いＤＭＦまでの範囲にある非プロトン性溶媒である。種
々の比率の混合溶媒もまた用いられる。（同時係続出願
第07/249,620号参照のこと。）反応は一般的に周囲温度
で行なわれるが、好ましくは−20℃までのより低温で、
さらに最も好ましくは氷浴中で行なわれる。特にスケー
ルアップに際して、制御できない発熱反応または副反応
を避けるために、温度は周囲温度、または好ましくはそ
れより低く保持される。エチルクロロホルメートを使用
した反応では、０−15℃の範囲の温度が通常であると報
告されている。反応時間は数分から１時間に亘り、好ま
しくは全ての反応物の混合後、30分である。その反応
は、結合反応の第二段階に備えるため過剰のクロロホル
メートを除去すべく、全ての揮発性成分の完全な蒸発と
ともに行なわれるべきである。クロロホルメートとオリ
ゴヌクレオチドの官能基との間で望ましからぬ反応が生
じ得るような複雑さを避けるために、過剰のクロロホル
メートの除去（適応できる場合）を行なう。反応の第二
段階において（反応Ｂを参照のこと）、溶媒系として有
機溶媒と水の混合物を用いて、混合無水物中間体を、ア
ミノアルキルまたはメルカプトアルキルで官能化したオ
リゴヌクレオチドの３′または５′末端と反応せしめ
る。有機溶媒は、以下の反応機構に示されるように優先
的にジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）が用いられる。
Ｒ′は、好ましくはアミンまたはスルフヒドリルを運ぶ
変更因子の形態に応じて直鎖または側鎖アルキル基であ
るが、またヘテロ原子および／またはアリール基を含ん
でもよい。
【化２】
種々の長さのオリゴヌクレオチドとポリヌクレオチド
（これらの用語は互換性をもって用いられる）がこの反
応に用いられている。その機構には、ヌクレオチドが10
0 までの鎖長さのものまたはより長いものが有効である
が、好ましいのはヌクレオチドが40までの鎖長さのもの
である。求核体含有オリゴヌクレオチドを１から0.01ｍ
Ｍ、好ましくは0.1 から0.025ｍＭの範囲の濃度で水性
媒体中に溶解させる。例えば、オリゴヌクレオチドのア
ミノ基が自由に反応することを確実にするために、アミ
ノアルキル官能化オリゴヌクレオチド溶液を、100 倍モ
ル過剰までのトリエチルアミンのような過剰の有機塩基
で前処理することが必要である。この前処理は、オリゴ
ヌクレオチドを混合無水物中間体と混合する直前にまた
はその数時間前に行なわれる。新たに調製した混合無水
物中間体を含む残留物をＤＭＦ中に集めて、その溶液を
オリゴヌクレオチド溶液に滴下した。全ての反応物にと
って良好な溶解度を保持するために、最終反応混合物中
のＤＭＦ／水の比率は一般的に、９：１から１：９まで
の範囲、好ましくは４：１から１：４の範囲、さらに好
ましくは１：１あたりにある。最終的に必要なＤＭＦの
容積は一般的に、混合無水物中間体が適切な容積のＤＭ
Ｆ中に溶解し、大変小規模な反応における結合のために
所望の量の溶液の分取を可能にするように決定される。
混合無水物中間体を一般的に、５から500 倍未満、好ま
しくは10から200 倍、そして最も好ましくは20から100
倍の所望の過剰なモルだけ加える。結合反応は一般的
に、室温での場合、0.5 時間から一晩に亘って行なわれ
る。最も短い反応時間でかつより低い温度を用いること
が、不安定な反応物の安定性を改善するのに必要であ
る。複合体は二段階工程により精製される。第一段階
は、例えばゲル浸透クロマトグラフィーを用いた、大き
さに基づく分子成分の分離である。この工程において、
リガンドとその結合していない誘導体を含む小さな分子
成分を大きな分子のオリゴヌクレオチドから分離する。
さらに逆相ＨＰＬＣにより未反応オリゴヌクレオチドを
複合体から分離する。これら両方のクロマトグラフィー
技術（ゲル浸透および逆相ＨＰＬＣ）が当業者に知られ
ている。より親水性の強いリガンドの結合により、複合
体は一般的に、ＨＰＬＣカラム上により長く保持され、
未反応オリゴヌクレオチドから良好に分離される。オリ
ゴヌクレオチドの複合体への転化の効率は、積算器／記
録装置を備えたＨＰＬＣシステムにより決定される。結
合検定に広く用いられている多くのカルボキシレート含
有リガンドがこの混合無水物の活性化に適合することが
分かった（すなわち、複雑な副反応が生じない）。それ
らのリガンドは能率的にアミノ官能化核酸に結合され
る。この群の中には、ポリ置換（polysubstituted ）ア
リールアクリジニウムエステル（例えば、米国特許第4,
745,181 号に記載されているジメチルエーテル、ＤＭＡ
Ｅ）、ビオチンおよびジアセチル化−５′−カルボキシ
フルオレセインがあり、その構造を以下に示す。
（これらの用語は互換性をもって用いられる）がこの反
応に用いられている。その機構には、ヌクレオチドが10
0 までの鎖長さのものまたはより長いものが有効である
が、好ましいのはヌクレオチドが40までの鎖長さのもの
である。求核体含有オリゴヌクレオチドを１から0.01ｍ
Ｍ、好ましくは0.1 から0.025ｍＭの範囲の濃度で水性
媒体中に溶解させる。例えば、オリゴヌクレオチドのア
ミノ基が自由に反応することを確実にするために、アミ
ノアルキル官能化オリゴヌクレオチド溶液を、100 倍モ
ル過剰までのトリエチルアミンのような過剰の有機塩基
で前処理することが必要である。この前処理は、オリゴ
ヌクレオチドを混合無水物中間体と混合する直前にまた
はその数時間前に行なわれる。新たに調製した混合無水
物中間体を含む残留物をＤＭＦ中に集めて、その溶液を
オリゴヌクレオチド溶液に滴下した。全ての反応物にと
って良好な溶解度を保持するために、最終反応混合物中
のＤＭＦ／水の比率は一般的に、９：１から１：９まで
の範囲、好ましくは４：１から１：４の範囲、さらに好
ましくは１：１あたりにある。最終的に必要なＤＭＦの
容積は一般的に、混合無水物中間体が適切な容積のＤＭ
Ｆ中に溶解し、大変小規模な反応における結合のために
所望の量の溶液の分取を可能にするように決定される。
混合無水物中間体を一般的に、５から500 倍未満、好ま
しくは10から200 倍、そして最も好ましくは20から100
倍の所望の過剰なモルだけ加える。結合反応は一般的
に、室温での場合、0.5 時間から一晩に亘って行なわれ
る。最も短い反応時間でかつより低い温度を用いること
が、不安定な反応物の安定性を改善するのに必要であ
る。複合体は二段階工程により精製される。第一段階
は、例えばゲル浸透クロマトグラフィーを用いた、大き
さに基づく分子成分の分離である。この工程において、
リガンドとその結合していない誘導体を含む小さな分子
成分を大きな分子のオリゴヌクレオチドから分離する。
さらに逆相ＨＰＬＣにより未反応オリゴヌクレオチドを
複合体から分離する。これら両方のクロマトグラフィー
技術（ゲル浸透および逆相ＨＰＬＣ）が当業者に知られ
ている。より親水性の強いリガンドの結合により、複合
体は一般的に、ＨＰＬＣカラム上により長く保持され、
未反応オリゴヌクレオチドから良好に分離される。オリ
ゴヌクレオチドの複合体への転化の効率は、積算器／記
録装置を備えたＨＰＬＣシステムにより決定される。結
合検定に広く用いられている多くのカルボキシレート含
有リガンドがこの混合無水物の活性化に適合することが
分かった（すなわち、複雑な副反応が生じない）。それ
らのリガンドは能率的にアミノ官能化核酸に結合され
る。この群の中には、ポリ置換（polysubstituted ）ア
リールアクリジニウムエステル（例えば、米国特許第4,
745,181 号に記載されているジメチルエーテル、ＤＭＡ
Ｅ）、ビオチンおよびジアセチル化−５′−カルボキシ
フルオレセインがあり、その構造を以下に示す。
【化３】
カルボキシル基を有さないリガンドを扱うにあたって、
本発明の方法を用いてそれらをアミノ官能化ポリヌクレ
オチドに結合させるために、それらのリガンドをカルボ
キシル輸送類似体に誘導することが必要である。この技
術はまた、リガンドが異なる官能基＜例えば、２，４−
ジニトロフルオロベンゼン（ＤＮＦＢ）または２，４−
ジニトロベンゼンスルホネート（ＤＮＢＳ）＞を有する
場合、または活性化（例えば、アルサニル酸のジアゾ
化）により複合体／複合生成物が生じる場合に用いられ
る。カルボキシレート基を生成させる多くの方法が知ら
れている。例えば、ＤＮＦＢはβ−アラニンと反応し
て、カルボキシレート基を有する３−（２′，４′−ジ
ニトロフェニルアミノ）プロピオン酸（ＤＮＬ−Ａｌ
ａ）誘導体を形成する。このリガンド類似体は、新規の
混合無水物法によって官能プローブ複合体につくりかえ
られる。本発明の結合方法に用いられる他の例には、ｏ
−またはｐ−アルサニル酸がある。このリガンドはま
た、無水コハク酸のような環状無水物を用いて誘導さ
れ、カルボキシレート含有ヘミサクシンアミド−アルサ
ニル酸となる。あるいは、カルボキシレート基およびフ
ェノール部を運ぶ二官能化合物はまた、ジアゾ化アルサ
ニル酸と反応してカルボキシレート含有アゾアルサニル
酸誘導体を形成するのに用いられる。この化合物を以下
に示す。
本発明の方法を用いてそれらをアミノ官能化ポリヌクレ
オチドに結合させるために、それらのリガンドをカルボ
キシル輸送類似体に誘導することが必要である。この技
術はまた、リガンドが異なる官能基＜例えば、２，４−
ジニトロフルオロベンゼン（ＤＮＦＢ）または２，４−
ジニトロベンゼンスルホネート（ＤＮＢＳ）＞を有する
場合、または活性化（例えば、アルサニル酸のジアゾ
化）により複合体／複合生成物が生じる場合に用いられ
る。カルボキシレート基を生成させる多くの方法が知ら
れている。例えば、ＤＮＦＢはβ−アラニンと反応し
て、カルボキシレート基を有する３−（２′，４′−ジ
ニトロフェニルアミノ）プロピオン酸（ＤＮＬ−Ａｌ
ａ）誘導体を形成する。このリガンド類似体は、新規の
混合無水物法によって官能プローブ複合体につくりかえ
られる。本発明の結合方法に用いられる他の例には、ｏ
−またはｐ−アルサニル酸がある。このリガンドはま
た、無水コハク酸のような環状無水物を用いて誘導さ
れ、カルボキシレート含有ヘミサクシンアミド−アルサ
ニル酸となる。あるいは、カルボキシレート基およびフ
ェノール部を運ぶ二官能化合物はまた、ジアゾ化アルサ
ニル酸と反応してカルボキシレート含有アゾアルサニル
酸誘導体を形成するのに用いられる。この化合物を以下
に示す。
【化４】
この技術を用いて作られたプローブは、カンピロバクタ
ー菌γＲＮＡの新しいハイブリッド形成検定に使用され
ている（10/24/89に出願された同時係続出願第07/426,3
87号参照のこと）。＜しかしながら、本出願のプローブ
に用いられた命名法／ナンバリングシステムは前記出願
07/426,387号に用いられたものとは異なっていることに
注目する。＞しかしながら、そこにはこれらの化合物の
使用の開示はなく、またその合成法も以前に開示されて
いない。
ー菌γＲＮＡの新しいハイブリッド形成検定に使用され
ている（10/24/89に出願された同時係続出願第07/426,3
87号参照のこと）。＜しかしながら、本出願のプローブ
に用いられた命名法／ナンバリングシステムは前記出願
07/426,387号に用いられたものとは異なっていることに
注目する。＞しかしながら、そこにはこれらの化合物の
使用の開示はなく、またその合成法も以前に開示されて
いない。
【実施例】以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明
する。この実施例は本発明の技術を使用して作られた化
合物の調製、精製および分析の種々の特徴を記載するも
のである。しかしながら、これらの例は本発明の新たな
技術の有用性を制限することを意図するものではない。 ［例１］ カルボキシレート基を有さない標識のカルボキシル基を
運ぶ類似体への誘導３−（２′，４′−ジニトロフェニ
ルアミノ）プロピオン酸（ＤＮＰ−Ａｌａ）の調製 ２，４−ジニトロフルオロベンゼン（10.4ｇ，56ｍモ
ル）のエタノール溶液100 ｍｌをベータ−アラニン（1.
0 ｇ，11.1ｍモル）の１モル濃度ＮａＨＣＯ３溶液50ｍ
ｌに添加した。反応混合物を室温で２時間撹拌し、蒸発
せしめて真空内で（vacuo ）揮発成分を除去した。残留
物を水とともに分離漏斗に移送してエチルエーテルで２
度洗浄した。沈殿が完了するまで、その水性層を１規定
のＨＣｌで酸性化した。その混合物を濾過して、湿った
固形物をエーテルで洗浄した。１モル濃度ＮａＨＣＯ３
に固形物を溶解させ、エーテルにより洗浄し、そして
１規定のＨＣｌで沈殿させることよりなるこの精製工程
を同様に繰り返し、黄色の固形物（1.6 ｇ，77％）を得
た。ｅ（ＭｅＯＨ）＝7900（260 ｎｍ），15900 （350
ｎｍ）。ＮＭＲスペクトル分析は、構造と一致した。 ［例２］ 複合体の調製 新規の混合無水物法によるリガンド−核酸複合体を調製
する一般的な工程を、例として５′−ビオチン−プロー
ブＣＪ641.31の調製を用いて、以下に記載する。プロー
ブＣＪ641.31は、５′−ＴＧＴ ＧＣＣ ＴＣＴ ＣＣ
Ｃ ＴＣＡ ＣＴＣ ＴＡＧ ＡＣＴ ＡＴＧ ＡＧＴ
Ｔ−３′の配列を有する。 （Ａ） ビオチン−混合無水物（ビオチン−ＭＡ）の中
間体の調製：トリエチルアミン（6.9 μｌ，49μモル）
とエチルクロロホルメート（2.4 μｌ，25μモル）を氷
浴で数分予冷したビオチン（２ｍｇ，8.2 μモル）（注
意１）の乾燥ＤＭＦ（ウィスコンシン州、ミルウォーキ
ー、アルドリッヒ、Ｃａｔ＃22,705-6）２ｍｌに添加し
た。反応混合物を30分間氷浴中で撹拌し、２ｍｌのキシ
レンで処理して、真空内で蒸発せしめて乾燥物を得た。 （Ｂ） ５′−アミノアルキル−ＣＪ641.31とビオチン
−混合無水物の結合：５′−アミノアルキル−ＣＪ641.
31（４ｎモル、ウィスコンシン州、マジソン、Promega
Corp. ）の水溶液200 μｌを1/8 インチ×1/2 インチの
撹拌棒を備えた２−４ｍｌの薬びんに添加した。その溶
液をトリエチルアミン（400 ｎモル）のＤＭＦ約７μｌ
で処理し、室温で３時間撹拌した。１ｍｌのＤＭＦを、
活性ビオチンを含む調製（Ａ）で得られた残留物に添加
した。活性ビオチンの400 ｎモル当量を含むこのビオチ
ン−ＭＡ溶液の一部48.8ｎモルを前記ＣＪ641.31溶液に
添加した。別に145 μｌのＤＭＦとＤＭＦ７μｌ中の40
0 ｎモルのトリエチルアミンを直ちに前記ＣＪ641.31溶
液に添加した。その反応混合物を室温で一晩撹拌した。 （Ｃ） ビオチン−ＣＪ641.31複合体の２段階単離 １． ゲル−浸透：調製（Ｂ）からの反応混合物につい
て、セファデックスＧ25（微粒）カラム（１×40ｃｍ）
を通過させ、水で溶離した。260 ｎｍで観察された空隙
容積ピーク部を集め、回転式蒸発器上で約0.5 ｍｌに濃
縮した。集めたピーク部について、別の新たなセファデ
ックスＧ25カラムを洗浄分離と同様な方法で通した。 ２． ＨＰＬＣ：クロマトグラフィーの条件を以下に示
す。：カラム：アクアポアＣ８、ＲＰ−３００、4.6 ｍ
ｍ×25ｃｍ（マサチューセッツ州、ウォバーン、Raini
n） 溶媒：0.１Ｍ Ｅｔ３ ＮＨＯＡｃ ｐＨ7.2-7.4 （溶
媒Ａ）、アセトニトリル（溶媒Ｂ） 勾配（線形）：20分以上８％から20％のＢ、10分以上40
％までのＢ、５分以上90％までのＢ 流速：１ｍｌ／分 検出：254 または260 ｎｍ 12.7分付近の保持時間の主要ピークとして現れたプロー
ブ複合体を集め、オリゴヌクレオチドマーカーの測定と
平行して、変性12％ポリアクリルアミドゲル上で正確な
移動度および純度を測定した。見やすくするために、ゲ
ル電気泳動により分析した全ての試料を、それぞれ32Ｐ
−含有リン酸塩またはコルジセピントリリン酸塩を用い
てそれぞれ５′または３′末端において酵素的に予備標
識化した。そのゲルを展開した後、オートラジオグラフ
ィーを行なってフイルム上に各試料の移動度（帯）模様
を得た。このゲルオートラド技術は分子生態学研究所に
おいて日常に行なわれていることである（参考文献：分
子クローニング：研究所マニュアル、173 頁、1982年、
T.Maniatis 編集、Cold Spring Harbor Laboratory
）。 注：秤量の簡素化のため、ビオチンを過剰に用いた。全
てのビオチン−ＭＡが結合に利用されなかったことに比
例して、調製（Ａ）の規模を縮小した。 ［例３］ カンピロバクター菌の検出に有効なプローブの調製 例２に用いられた技術を以下の他のプローブの調製に同
様に用いた。そのプローブの配列を本出願の「配列リス
ト」に示す： プローブＣＪ437.27 プローブＣＦ1107.27 プローブＣＪ706.27 例２に記載されたプローブＣＪ641.31に加え、これらの
３つのプローブがカンピロバクター菌の検出に有効であ
ることが分かった。 ［例４］ 核酸と複合体の調製 新たな混合無水物法による３′−アミノアルキル官能化
核酸および３′−リガンド−核酸複合体の一般的な工程
を、例として３′−ＤＭＡＥ−ＳＹＯＭＰＡ480.24の調
製を用いて以下に記載する。このプローブの配列を「配
列リスト」に示す。このプローブはサルモネラの検出に
有効であることが分かった。 （Ａ） ３′−アミノアルキル−ＳＹＯＭＰＡ 480.24
の調製：表題の化合物の合成を、Clontech Laboratorie
s,Inc.からのトリチル−ＯＮプログラムおよび１μモル
の３′−アミン−ＯＮカラムを用いた応用バイオシステ
ム391 ＤＮＡ合成装置に基づいて行なった。ＣＰＧから
の完成したオリゴヌクレオチドの開裂および水酸化アン
モニウムによる脱保護を２時間室温で行ない、一晩55℃
で放置した。溶液を乾燥させ、残留物を水中に移送し、
以下の条件を用いたＨＰＬＣにより精製した： カラム：アクアポアＣ８、ＲＰ−３００、7.0 ｍｍ×25
ｃｍ（マサチューセッツ州、ウォバーン、Rainin） 溶媒：0.１Ｍ Ｅｔ３ ＮＨＯＡｃ ｐＨ7.4 （溶媒
Ａ）とアセトニトリル（溶媒Ｂ）の混合物 勾配（線形）：３分以上８％から18％のＢ、５分間18％
で保持したＢ、20分以上18％のＢから20％までのＢ 流速：2.32ｍｌ／分 検出：254 ｎｍ ５′−トリチル−３′−アミノアルキル−ＳＡ24を含む
15−16分の主要ピーク部を集め、蒸発させて600 μｌの
水中に移送した。その溶液を、室温で８分間ｎ当量の２
％トリフルオロ酢酸で処理し、次いでＮＨ４ ＯＨ濃縮
物を10倍に希釈した600 μｌで中和することにより脱ト
リチル化を行なった。反応混合物を回転式蒸発器上で乾
燥した。残留物を水中に移送し、以下の条件を用いたHP
LCにより精製した： カラム：前述と同様 溶媒：前述と同様 勾配：20分以上５％のＢから13％のＢ、５分間以上13％
のＢから40％のＢ、５分以上40％のＢから60％までのＢ 流速：前述と同様 検出：前述と同様 20−21分の主要なピーク部を集め、蒸発させ、以下の条
件を用いたＨＰＬＣにより再精製した： カラム：前述と同様 溶媒：前述と同様 勾配：50分以上５％のＢから15％のＢ 流速：前述と同様 検出：前述と同様 34-35 分の主要なピーク部を集め、乾燥させ、水中に移
送した。 （Ｂ） ３′−アミノアルキル−ＳＹＯＭＰＡ480.24と
ＤＭＡＥ混合無水物の複合体：３′−アミノアルキル−
ＳＹＯＭＰＡ480.24を、室温で３時間、100 モルの過剰
のトリエチルアミンにより前処理した。ＤＭＡＥ−混合
無水物を、例２のセクション（Ａ）におけるビオチン混
合無水物について記載されたのと同様な方法により調製
した。結合反応は、100 モルの過剰のＤＭＡＥ−混合無
水物とほぼ同量のトリエチルアミンとともに、それぞれ
150 μｌのジメチルホルムアミドおよび水中で行なわれ
た。反応混合物を室温で一晩撹拌し、セファデックスG2
5カラムを通過させ、水で溶離した。最初のピークのも
のを集め、回転式蒸発器で濃縮した。その濃縮物をさら
に、以下の条件を用いてＨＰＬＣにより精製した： カラム：アクアポアＣ８、ＲＰ−３００、7.0 ｍｍ×25
ｃｍ（マサチューセッツ州、ウォバーン、Rainin） 溶媒：0.1 Ｍ Ｅｔ３ ＮＨＯＡｃ ｐＨ7.4 （溶媒
Ａ）とアセトニトリル（溶媒Ｂ）の混合物 勾配（線形）：20分以上８％のＢから20％のＢ、10分以
上20％のＢから40％のＢ、10分以上40％のＢから60％ま
でのＢ 流速：2.32ｍｌ／分 検出：254 ｎｍ 所望の生成物として21分のピークのものを集め、乾燥し
た。残留物を400 μｌの水中にいれ、プローブ複合体溶
液の少量部分を例２に記載したように分析した。 ［例５］ 反応の最適化 リガンドを活性化させるのに用いた異なる化学種の効
果、およびポリヌクレオチド上の異なる末端基の反応性
を評価する実験を行なった。（表１参照）多くの活性ジ
メチルアクリジニウムエステル（ＤＭＡＥ）とポリヌク
レオチドとの反応の研究により、末端５′−水酸基
（５′−ＯＨ−ＰＭ１）を有するポリヌクレオチドは象
徴的に混合無水物中間体とは反応しないことが示され、
オリゴヌクレオチドのプリンまたはピリミジン基との副
反応が最小限であることが示された。さらに、Ｎ−ヒド
ロキシサクシンイミドにより活性化されたＤＭＡＥ（Ｄ
ＭＡＥ−ＮＨＳ）は、象徴的に20：１の低い装填比では
ポリヌクレオチドとは反応しない。
する。この実施例は本発明の技術を使用して作られた化
合物の調製、精製および分析の種々の特徴を記載するも
のである。しかしながら、これらの例は本発明の新たな
技術の有用性を制限することを意図するものではない。 ［例１］ カルボキシレート基を有さない標識のカルボキシル基を
運ぶ類似体への誘導３−（２′，４′−ジニトロフェニ
ルアミノ）プロピオン酸（ＤＮＰ−Ａｌａ）の調製 ２，４−ジニトロフルオロベンゼン（10.4ｇ，56ｍモ
ル）のエタノール溶液100 ｍｌをベータ−アラニン（1.
0 ｇ，11.1ｍモル）の１モル濃度ＮａＨＣＯ３溶液50ｍ
ｌに添加した。反応混合物を室温で２時間撹拌し、蒸発
せしめて真空内で（vacuo ）揮発成分を除去した。残留
物を水とともに分離漏斗に移送してエチルエーテルで２
度洗浄した。沈殿が完了するまで、その水性層を１規定
のＨＣｌで酸性化した。その混合物を濾過して、湿った
固形物をエーテルで洗浄した。１モル濃度ＮａＨＣＯ３
に固形物を溶解させ、エーテルにより洗浄し、そして
１規定のＨＣｌで沈殿させることよりなるこの精製工程
を同様に繰り返し、黄色の固形物（1.6 ｇ，77％）を得
た。ｅ（ＭｅＯＨ）＝7900（260 ｎｍ），15900 （350
ｎｍ）。ＮＭＲスペクトル分析は、構造と一致した。 ［例２］ 複合体の調製 新規の混合無水物法によるリガンド−核酸複合体を調製
する一般的な工程を、例として５′−ビオチン−プロー
ブＣＪ641.31の調製を用いて、以下に記載する。プロー
ブＣＪ641.31は、５′−ＴＧＴ ＧＣＣ ＴＣＴ ＣＣ
Ｃ ＴＣＡ ＣＴＣ ＴＡＧ ＡＣＴ ＡＴＧ ＡＧＴ
Ｔ−３′の配列を有する。 （Ａ） ビオチン−混合無水物（ビオチン−ＭＡ）の中
間体の調製：トリエチルアミン（6.9 μｌ，49μモル）
とエチルクロロホルメート（2.4 μｌ，25μモル）を氷
浴で数分予冷したビオチン（２ｍｇ，8.2 μモル）（注
意１）の乾燥ＤＭＦ（ウィスコンシン州、ミルウォーキ
ー、アルドリッヒ、Ｃａｔ＃22,705-6）２ｍｌに添加し
た。反応混合物を30分間氷浴中で撹拌し、２ｍｌのキシ
レンで処理して、真空内で蒸発せしめて乾燥物を得た。 （Ｂ） ５′−アミノアルキル−ＣＪ641.31とビオチン
−混合無水物の結合：５′−アミノアルキル−ＣＪ641.
31（４ｎモル、ウィスコンシン州、マジソン、Promega
Corp. ）の水溶液200 μｌを1/8 インチ×1/2 インチの
撹拌棒を備えた２−４ｍｌの薬びんに添加した。その溶
液をトリエチルアミン（400 ｎモル）のＤＭＦ約７μｌ
で処理し、室温で３時間撹拌した。１ｍｌのＤＭＦを、
活性ビオチンを含む調製（Ａ）で得られた残留物に添加
した。活性ビオチンの400 ｎモル当量を含むこのビオチ
ン−ＭＡ溶液の一部48.8ｎモルを前記ＣＪ641.31溶液に
添加した。別に145 μｌのＤＭＦとＤＭＦ７μｌ中の40
0 ｎモルのトリエチルアミンを直ちに前記ＣＪ641.31溶
液に添加した。その反応混合物を室温で一晩撹拌した。 （Ｃ） ビオチン−ＣＪ641.31複合体の２段階単離 １． ゲル−浸透：調製（Ｂ）からの反応混合物につい
て、セファデックスＧ25（微粒）カラム（１×40ｃｍ）
を通過させ、水で溶離した。260 ｎｍで観察された空隙
容積ピーク部を集め、回転式蒸発器上で約0.5 ｍｌに濃
縮した。集めたピーク部について、別の新たなセファデ
ックスＧ25カラムを洗浄分離と同様な方法で通した。 ２． ＨＰＬＣ：クロマトグラフィーの条件を以下に示
す。：カラム：アクアポアＣ８、ＲＰ−３００、4.6 ｍ
ｍ×25ｃｍ（マサチューセッツ州、ウォバーン、Raini
n） 溶媒：0.１Ｍ Ｅｔ３ ＮＨＯＡｃ ｐＨ7.2-7.4 （溶
媒Ａ）、アセトニトリル（溶媒Ｂ） 勾配（線形）：20分以上８％から20％のＢ、10分以上40
％までのＢ、５分以上90％までのＢ 流速：１ｍｌ／分 検出：254 または260 ｎｍ 12.7分付近の保持時間の主要ピークとして現れたプロー
ブ複合体を集め、オリゴヌクレオチドマーカーの測定と
平行して、変性12％ポリアクリルアミドゲル上で正確な
移動度および純度を測定した。見やすくするために、ゲ
ル電気泳動により分析した全ての試料を、それぞれ32Ｐ
−含有リン酸塩またはコルジセピントリリン酸塩を用い
てそれぞれ５′または３′末端において酵素的に予備標
識化した。そのゲルを展開した後、オートラジオグラフ
ィーを行なってフイルム上に各試料の移動度（帯）模様
を得た。このゲルオートラド技術は分子生態学研究所に
おいて日常に行なわれていることである（参考文献：分
子クローニング：研究所マニュアル、173 頁、1982年、
T.Maniatis 編集、Cold Spring Harbor Laboratory
）。 注：秤量の簡素化のため、ビオチンを過剰に用いた。全
てのビオチン−ＭＡが結合に利用されなかったことに比
例して、調製（Ａ）の規模を縮小した。 ［例３］ カンピロバクター菌の検出に有効なプローブの調製 例２に用いられた技術を以下の他のプローブの調製に同
様に用いた。そのプローブの配列を本出願の「配列リス
ト」に示す： プローブＣＪ437.27 プローブＣＦ1107.27 プローブＣＪ706.27 例２に記載されたプローブＣＪ641.31に加え、これらの
３つのプローブがカンピロバクター菌の検出に有効であ
ることが分かった。 ［例４］ 核酸と複合体の調製 新たな混合無水物法による３′−アミノアルキル官能化
核酸および３′−リガンド−核酸複合体の一般的な工程
を、例として３′−ＤＭＡＥ−ＳＹＯＭＰＡ480.24の調
製を用いて以下に記載する。このプローブの配列を「配
列リスト」に示す。このプローブはサルモネラの検出に
有効であることが分かった。 （Ａ） ３′−アミノアルキル−ＳＹＯＭＰＡ 480.24
の調製：表題の化合物の合成を、Clontech Laboratorie
s,Inc.からのトリチル−ＯＮプログラムおよび１μモル
の３′−アミン−ＯＮカラムを用いた応用バイオシステ
ム391 ＤＮＡ合成装置に基づいて行なった。ＣＰＧから
の完成したオリゴヌクレオチドの開裂および水酸化アン
モニウムによる脱保護を２時間室温で行ない、一晩55℃
で放置した。溶液を乾燥させ、残留物を水中に移送し、
以下の条件を用いたＨＰＬＣにより精製した： カラム：アクアポアＣ８、ＲＰ−３００、7.0 ｍｍ×25
ｃｍ（マサチューセッツ州、ウォバーン、Rainin） 溶媒：0.１Ｍ Ｅｔ３ ＮＨＯＡｃ ｐＨ7.4 （溶媒
Ａ）とアセトニトリル（溶媒Ｂ）の混合物 勾配（線形）：３分以上８％から18％のＢ、５分間18％
で保持したＢ、20分以上18％のＢから20％までのＢ 流速：2.32ｍｌ／分 検出：254 ｎｍ ５′−トリチル−３′−アミノアルキル−ＳＡ24を含む
15−16分の主要ピーク部を集め、蒸発させて600 μｌの
水中に移送した。その溶液を、室温で８分間ｎ当量の２
％トリフルオロ酢酸で処理し、次いでＮＨ４ ＯＨ濃縮
物を10倍に希釈した600 μｌで中和することにより脱ト
リチル化を行なった。反応混合物を回転式蒸発器上で乾
燥した。残留物を水中に移送し、以下の条件を用いたHP
LCにより精製した： カラム：前述と同様 溶媒：前述と同様 勾配：20分以上５％のＢから13％のＢ、５分間以上13％
のＢから40％のＢ、５分以上40％のＢから60％までのＢ 流速：前述と同様 検出：前述と同様 20−21分の主要なピーク部を集め、蒸発させ、以下の条
件を用いたＨＰＬＣにより再精製した： カラム：前述と同様 溶媒：前述と同様 勾配：50分以上５％のＢから15％のＢ 流速：前述と同様 検出：前述と同様 34-35 分の主要なピーク部を集め、乾燥させ、水中に移
送した。 （Ｂ） ３′−アミノアルキル−ＳＹＯＭＰＡ480.24と
ＤＭＡＥ混合無水物の複合体：３′−アミノアルキル−
ＳＹＯＭＰＡ480.24を、室温で３時間、100 モルの過剰
のトリエチルアミンにより前処理した。ＤＭＡＥ−混合
無水物を、例２のセクション（Ａ）におけるビオチン混
合無水物について記載されたのと同様な方法により調製
した。結合反応は、100 モルの過剰のＤＭＡＥ−混合無
水物とほぼ同量のトリエチルアミンとともに、それぞれ
150 μｌのジメチルホルムアミドおよび水中で行なわれ
た。反応混合物を室温で一晩撹拌し、セファデックスG2
5カラムを通過させ、水で溶離した。最初のピークのも
のを集め、回転式蒸発器で濃縮した。その濃縮物をさら
に、以下の条件を用いてＨＰＬＣにより精製した： カラム：アクアポアＣ８、ＲＰ−３００、7.0 ｍｍ×25
ｃｍ（マサチューセッツ州、ウォバーン、Rainin） 溶媒：0.1 Ｍ Ｅｔ３ ＮＨＯＡｃ ｐＨ7.4 （溶媒
Ａ）とアセトニトリル（溶媒Ｂ）の混合物 勾配（線形）：20分以上８％のＢから20％のＢ、10分以
上20％のＢから40％のＢ、10分以上40％のＢから60％ま
でのＢ 流速：2.32ｍｌ／分 検出：254 ｎｍ 所望の生成物として21分のピークのものを集め、乾燥し
た。残留物を400 μｌの水中にいれ、プローブ複合体溶
液の少量部分を例２に記載したように分析した。 ［例５］ 反応の最適化 リガンドを活性化させるのに用いた異なる化学種の効
果、およびポリヌクレオチド上の異なる末端基の反応性
を評価する実験を行なった。（表１参照）多くの活性ジ
メチルアクリジニウムエステル（ＤＭＡＥ）とポリヌク
レオチドとの反応の研究により、末端５′−水酸基
（５′−ＯＨ−ＰＭ１）を有するポリヌクレオチドは象
徴的に混合無水物中間体とは反応しないことが示され、
オリゴヌクレオチドのプリンまたはピリミジン基との副
反応が最小限であることが示された。さらに、Ｎ−ヒド
ロキシサクシンイミドにより活性化されたＤＭＡＥ（Ｄ
ＭＡＥ−ＮＨＳ）は、象徴的に20：１の低い装填比では
ポリヌクレオチドとは反応しない。
【表１】
配列リスト
（１）概要
（ｉ）出願人：ロー、エス．ジェイ．（Law,S.J.）
ルキンスキー、エイチ．（Lukinsky,H. ）
（ｉｉ）発明の名称：新規の混合無水物法による効率的な遺伝子プローブ
結合方法
（ｉｉｉ）配列リストの数：５
（ｉｖ）住所：
（Ａ）名称：チバ コーニング ダイアグノスティクス社
（Ciba Corning Diagnostics Corp.）
（Ｂ）ストリート：63 ノース ストリート
（Ｃ）市：メッドフィールド
（Ｄ）州：マサチューセッツ
（Ｅ）国：米国
（Ｆ）郵便番号：02052
（ｖ）コンピュータ読取可能フォーム：
（Ａ）媒体の種類：3.50インチディスク、1.44 Mb 記憶装置
（Ｂ）コンピュータ：ＩＢＭ ＰＳ／２
（Ｃ）オペレーティング・システム：ＩＢＭ−ＤＯＳ 4.00
（Ｄ）ソフトウェア：ワード・パーフェクト 5.1
（ｖｉ）カレント応用データ：未だ利用できず
（ｖｉｉ）先行応用データ：応用できず
（ｖｉｉｉ）代理人情報
（Ａ）氏名：モーゲンシュテルン（Morgenstern,A.S.）
（Ｂ）登録番号：28,244
（Ｃ）事件整理番号：CCD-055
（ｉｘ）遠隔通信情報：
（Ａ）電話番号：508-359-3836
（Ｂ）ファックス番号：508-359-3885
（２）配列識別番号：437.27の情報
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：27塩基
（Ｂ）種類：ＤＮＡ
（Ｃ）鎖：一本
（ｘｉ）配列識別番号437.27の配列記載
ＧＡＴ ＣＣＧ ＴＣＡ ＧＡＡ ＴＴＣ ＴＴＣ ＣＣＴ Ａ
ＡＧ ＡＡＡ
（３）配列識別番号：480.24の情報
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：24塩基
（Ｂ）種類：ＤＮＡ
（Ｃ）鎖：一本
（ｘｉ）配列識別番号480.24の配列記載
ＡＡＡ ＧＣＴ ＣＡＧ ＧＧＣ ＧＴＴ ＣＡＧ ＴＴＧ Ａ
ＣＣ
（４）配列識別番号：641.31の情報
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：31塩基
（Ｂ）種類：ＤＮＡ
（Ｃ）鎖：一本
（ｘｉ）配列識別番号641.31の配列記載
ＴＣＴ ＧＣＣ ＴＣＴ ＣＣＣ ＴＣＡ ＣＴＣ ＴＡＧ Ａ
ＣＴ ＡＴＧ ＡＧＴ Ｔ
（５）配列識別番号：706.27の情報
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：27塩基
（Ｂ）種類：ＤＮＡ
（Ｃ）鎖：一本
（ｘｉ）配列識別番号706.27の配列記載
ＧＣＣ ＴＴＣ ＧＣＡ ＡＴＧ ＧＧＴ ＡＴＴ ＣＴＴ Ｇ
ＧＴ ＧＡＴ
（６）配列識別番号：1107.27 の情報
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：27塩基
（Ｂ）種類：ＤＮＡ
（Ｃ）鎖：一本
（ｘｉ）配列識別番号1107.27 の配列記載
ＴＧＴ ＴＡＧ ＣＡＡ ＣＴＡ ＡＡＴ ＡＣＴ ＴＧＧ Ｇ
ＴＴ ＧＣＧ
【図面の簡単な説明】
【図１】捕獲プローブおよび信号プローブの両者を有す
る、いくつかの遺伝子プローブサンドイッチ法複合体の
例を示す。
る、いくつかの遺伝子プローブサンドイッチ法複合体の
例を示す。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(56)参考文献 特開 昭63−295596（ＪＰ，Ａ)
特開 昭63−99093（ＪＰ，Ａ)
欧州特許出願公開425217（ＥＰ，Ａ
１)
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12Q 1/68
C12N 15/00 - 15/90
Claims (22)
- 【請求項１】 アミノアルキル官能化ポリヌクレオチド
に標識を結合させる方法であって： ａ．無水有機溶媒中において該標識を活性化させて、反
応性混合無水物中間体を形成し；さらに ｂ．有機／水溶媒混合系中において該中間体をポリヌク
レオチドと反応させる；各工程を含むことを特徴とする
方法。 - 【請求項２】 前記有機／水溶媒混合系がジメチルホル
ムアミドおよび水を含むことを特徴とする請求項１記載
の方法。 - 【請求項３】 前記有機溶媒がジメチルホルムアミドで
あることを特徴とする請求項１記載の方法。 - 【請求項４】 前記標識が、ハプテン、リガンドまたは
発光標識を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。 - 【請求項５】 前記中間体の形成が、有機塩基の存在下
で標識をクロロホルメートと反応させることを含むこと
を特徴とする請求項１記載の方法。 - 【請求項６】 前記クロロホルメートがＲＯＣ（Ｏ）Ｃ
ｌの構造を有し、ここでＲが２０以下の炭素原子を有す
るアリールあるいは直鎖もしくは側鎖を有するアルキル
またはアラルキル基であることを特徴とする請求項５記
載の方法。 - 【請求項７】 前記Ｒ基が８以下の炭素原子を含むこと
を特徴とする請求項６記載の方法。 - 【請求項８】 前記Ｒ基が４以下の炭素原子を含むこと
を特徴とする請求項７記載の方法。 - 【請求項９】 前記標識がカルボキシレート含有標識で
あることを特徴とする請求項５記載の方法。 - 【請求項１０】 まずカルボキシレートを含有しない標
識をカルボキシレート含有化合物と反応させて、クロロ
ホルメートとの反応の前にカルボキシレート含有標識を
形成することを特徴とする請求項５記載の方法。 - 【請求項１１】 前記有機塩基がトリエチルアミンであ
ることを特徴とする請求項５、９または１０記載の方
法。 - 【請求項１２】 前記ポリヌクレオチドがその３′また
は５′末端に反応性アミンを有することを特徴とする請
求項１記載の方法。 - 【請求項１３】 アミノアルキル官能化ポリヌクレオチ
ドにハプテン、リガンドまたは発光標識を結合させる方
法であって： ａ．無水有機溶媒中において該ハプテン、リガンドまた
は発光標識を活性化させて、反応性混合無水物中間体を
形成し；さらに ｂ．ジメチルホルムアミド／水溶媒混合系中において該
中間体をポリヌクレオチドと反応させる； 各工程を含むことを特徴とする方法。 - 【請求項１４】 アミノアルキル官能化ポリヌクレオチ
ドに標識を結合させる方法であって： ａ．無水有機溶媒中において該標識を活性化させて、反
応性混合無水物中間体を形成し；さらに ｂ．該混合無水物中間体をポリヌクレオチドと反応させ
る； 各工程を含むことを特徴とする方法。 - 【請求項１５】 水に対する有機溶媒の比率が９：１か
ら１：９の範囲にあることを特徴とする請求項１または
１３記載の方法。 - 【請求項１６】 前記比率が４：１から１：４の範囲に
あることを特徴とする請求項１５記載の方法。 - 【請求項１７】 前記比率がほぼ１：１であることを特
徴とする請求項１６記載の方法。 - 【請求項１８】 前記ポリヌクレオチドが１００以下の
ヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項１、１３ま
たは１４記載の方法。 - 【請求項１９】 前記ポリヌクレオチドが４０以下のヌ
クレオチドを含むことを特徴とする請求項１８記載の方
法。 - 【請求項２０】 遺伝子プローブを調製する方法であっ
て： ａ．無水有機溶媒中において標識を活性化させて、反応
性混合無水物中間体を形成し；さらに ｂ．ジメチルホルムアミド／水溶媒混合系中において該
中間体をポリヌクレオチドと反応させる； 各工程を含むことを特徴とする方法。 - 【請求項２１】 前記混合無水物中間体の形成に続い
て、反応混合物を蒸発せしめて揮発性物質を除去する工
程をさらに含むことを特徴とする請求項１，１３または
２０記載の方法。 - 【請求項２２】 前記遺伝子プローブがカンピロバクタ
ー １６ｓ ｒＲＮＡまたはサルモネラ ＯｍｐＡ 遺
伝子に特異的であり、さらに該プローブが ａ．プローブ ＣＪ ４３７．２７：５′−ＧＴＡ ＣＣＧ ＴＣＡ ＧＡＡ ＴＴＣ ＴＴＣ ＣＣＴ ＡＡＧ ＡＡＡ−３′、 ｂ．プローブ ＣＪ ６４１．３１：５′−ＴＣＴ ＧＣＣ ＴＣＴ ＣＣＣ ＴＣＡ ＣＴＣ ＴＡＧ ＡＣＴ ＡＴＧ ＡＧＴ Ｔ−３′、 ｃ．プローブ ＣＦ １１０７．２７：５′−ＴＧＴ ＴＡＧ ＣＡＡ ＣＴＡ ＡＡＴ ＡＣＧ ＴＧＧ ＧＴＴ ＧＣＧ−３′、 ｄ．プローブ ＣＪ ７０６．２７：５′−ＧＣＣ ＴＴＣ ＧＣＡ ＡＴＧ ＧＧＴ ＡＴＴ ＣＴＴ ＧＧＴ ＧＡＴ−３′および ｅ．プローブ ＳＹＯＭＰＡ ４８０．２４：５′−ＡＡＡ ＧＣＴ ＣＡＧ ＧＧＣ ＧＴＴ ＣＡＧ ＴＴＧ ＡＣＣ−３′ から選択されるヌクレオチド配列を含むことを特徴とす
る請求項２０記載の方法。
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