JP3289911B2 - タグ試薬およびアッセイ法 - Google Patents
タグ試薬およびアッセイ法Info
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Description
生化学的および化学的分析において、レポーター基で
標識された被検体分子の使用は日常のことである。本発
明は一つまたはそれ以上のレーポーター基に連結された
少なくとも二つの被検基を持つ試薬を提供する考えを提
出している。以下に記載する方法においてそのような試
薬は、一つのもので標識された被検体よりもはるかに多
くの分析的情報を発生させるために使用できる。多被検
基および多レポーター基を運ぶ試薬が一緒に合成でき、
同時に使用できかつレポーター分子が分析段階で分解で
きるようにレポーター基を設計することは可能である。 WO93/06121（Affymax）は多数の異なるメンバーを含
む合成オリゴマーライブラリーを記載しており、各々の
メンバーはオリゴマー中のモノマーの配列を同定する一
つまたはそれ以上の同定タグに連結されたモノマーの配
列からなるオリゴマーを含んでいる。オリゴマーと同定
タグ間の結合は好適には固形粒子を含む。同定タグは好
適にはオリゴヌクレオチドである。 本発明の一つの態様では ａ） 少なくとも二つの被検基を含み、およびｂ）に連
結された被検部分、 ｂ） 質量分析法による検出に適応した一つまたはそれ
以上のレポーター基を含むタグ部分 を含む試薬が提供され、 ここでレポーター基は被検残基を示し、かつタグ部分の
各々の位置のレポーター基は被検部分の決められた位置
の被検残基を示すように選択される。 好適には被検部分は切断可能な（例えば、光切断可能
な）結合でタグ部分に連結されている。被検部分および
タグ部分が両方結合される連結基が提供されるであろ
う。好適には、被検部分はｎ個の被検残基の鎖であり、
およびタグ部分はｎ個までのレポーター基の鎖であり、
タグ鎖の各々の位置のレポーター基は被検鎖の対応する
位置の被検残基を示すように選択される。ｎは２以上の
整数であり、好適には３から20である。 本発明は興味あるすべての被検体の検出に使用される
であろう。これらには蛋白質／ペプチド鎖、したがって
被検残基はアミノ酸残基；核酸／オリゴヌクレオチド
鎖、したがって被検残基はヌクレオチド残基；炭化水素
鎖、したがって被検残基は糖残基；が含まれるが、これ
らに制限されるわけではない。さらに、被検体は生物学
的、薬学的または治療的活性を持つ小さな分子の類でも
よい。例えば、質量分析タグと組合わさった様式で種々
の置換基（例えば、アルキル、エステル、アミン、エー
テルなど）を変化させる能力を持つコア分子であっても
よい。 タグ部分および／またはその中の各々のレポーター基
は被検部分および／またはその中の被検残基の性質につ
いての情報を提供するように観察可能／検出可能／分析
可能である。 一つの実施態様において、試薬は式Ａ−Ｌ−Ｒを持っ
ており、式中Ａは被検部分を構成するｎ個の被検残基の
鎖であり、およびＬは連結基であり、Ｒはタグ部分を構
成するｎ個までのレポーター基の鎖であり、ｎは２−20
であり、ここでタグ部分は被検部分の被検残基の位置を
規定する情報を含んでいる。 タグ部分は質量により区別可能な一つまたはそれ以上
のレポーター基から成っており、従って質量分析法によ
り分析可能である。レポーター基は化学的に異なってい
てもよく、従ってお互いに分子量により区別される。ま
たは、レポーター基は化学的には同じであるがお互いに
異なった同位元素（例えば、以下に説明されるように12
C/13Cおよび1H/2H）を含むことにより区別されてもよ
い。タグ部分（および／またはレポーター基）は、例え
ば光化学的にまたは他の手段で試薬から切断された後、
質量分析法による分析に適しまたは適応している。 検出系としての質量分析法の利点は：その高い感度−
良好な信号を与えるのに数百の分子しか必要とされな
い；その広いダイナミックレンジおよび高い分解能−10
0から200,000ダルトンの質量範囲の分子が0.01より小さ
い分解能で分析できる；その融通性−多くの異なった化
学構造の分子が容易に分析される；質量分析法と例えば
走査レーザー脱離法を組み合わせることによる画像分析
の可能性；単に定性的測定ではなく定量的測定ができる
能力がある。 質量標識は放射能および蛍光の利点をあわせたもので
あり、新規の応用を示唆するさらなる特質を持ってい
る。 別の態様において、本発明は上記試薬のライブラリー
を提供し、ここでライブラリーは各々ｎ個の被検残基の
異なった被検部分を含む多数の試薬から構成されてい
る。例えば、ライブラリーは各々ｎ個のヌクレオチド残
基の異なったオリゴヌクレオチドの鎖を含む4nの試薬か
ら成っているであろう。ライブラリーの試薬は溶液中に
一緒に混合されて存在するであろう。 別の態様において、本発明は：標的物質を用意し；少
なくとも一つの試薬の標的物質への結合が生じる条件下
で標的物質と前記試薬のライブラリーをインキュベート
し；非結合試薬を除去し；各々の結合試薬のタグ部分を
回収し；標的物質へ結合された被検部分の性質の指標と
して回収されたタグ部分を分析する、の各工程を含むア
ッセイ法を提供する。 標的物質は、非結合試薬から結合試薬を分離するのに
都合のよい手段を提供するために固定化されているであ
ろう。一つの態様では、標的物質は微生物または組織ま
たは細胞の集団であり、本アッセイは候補薬剤の一群を
スクリーニングするために実施されるであろう。別の態
様において標的物質は核酸であり、この態様は以下に非
常に詳細に説明される。 付随する図を参照されたい： −図１は本発明による試薬合成のための一般的スキーム
である。 −図２はレポーター基を含んでいるタグ鎖の３つの異な
ったシステムを持つ試薬を示している。 −図3aはコードされたオリゴヌクレオチドの合成を示し
ている図であり、および −図3bはタグ鎖のコードの読みとりを示している図であ
る。 −図４は累進的ライゲーションによる配列分析を示して
いる図である。 −図５はオリゴヌクレオチドアッセイでのハイブリッド
形成により読みとられた配列の伸長を示す図である。 図１および２の説明は本明細書の最後に含まれてい
る。 以下の応用の実施例を参照すると、本方法が如何に核
酸配列の分析および候補薬剤のスクリーニングに応用さ
れるかが説明されている。 コードされたタグの合成 同時に多被検体にタグを付けるために使用された方法
の原理は、結合された核酸配列でペプチドをコードする
ためにBrennerおよびLerner（1992）により提案された
ものと同様である。彼らの考えの概念は、ポリメラーゼ
連鎖反応により増幅されおよび産生されたDNA分子の配
列決定により読みとられることができるタグを付加する
ことである。 試薬の構造は如何にしてそれらを作製しうるかを考え
ることにより最もよく示される。一つの方向に被検体へ
残基を付加し、別の方向に残基特異性レポーター基を付
加して段階的に伸長できる二価または多価連結基から合
成が始まる（図１）。もし有機化合物の混合物を作りた
いならば、合成の各々の段階で異なった残基が導入され
る。例えば、混合物は異なったアミノ酸配列を持つペプ
チドまたは異なった塩基配列を持つオリゴヌクレオチ
ド、またはコア構造に結合された異なった基を持つ医薬
活性を持つ可能性のある変異体の組を含むことができ
る；各々の場合において各々の構造変異体を独特のタグ
で標識することが望まれる。このことは異なった残基が
問題とする化合物に加えられる各々の工程において合成
物を分割し、対応する残基をタグに加えることにより達
成される。 例として、各々が独特のタグを持つ4096のヘキサヌク
レオチドの混合物を作りたいと仮定する。二価連結基の
四つの試料が各々の塩基および塩基に対して独特のレポ
ーターと結合されるであろう（図3a）。四つの試料は次
に混合され、四つに分割され、この過程を再度繰り返
す。結果は各々独特のタグを持つジヌクレオチドの組で
ある。この過程を６回の結合工程が完了するまで繰り返
す。 連結基およびレポーター基 連結基は被検体合成と合致する一つの基を持たなけれ
ばならない−ヒドロキシ、アミノまたはスルフヒドリル
基はすべてオリゴヌクレオチド合成の開始に適してお
り、例えばポリペプチド合成などの他の経路の開始には
類似の基を見いだすことができる。ある種の化合物に対
しては、被検体の一部を形成する“コア”化合物から出
発するのが望ましいであろう。レポーターの付加を開始
するための基の選択はレポーター基の性質およびそれら
の結合に使用される化学に依存している。この化学は被
検体の合成に使用される化学と合致されていなければな
らない。オリゴヌクレオチド合成の例では、多くの変法
が存在する。確立された方法は塩基を保護するためにベ
ンゾイルおよびイソプロピル基、カップリング間の5'−
OH基の一時的保護に酸に反応活性なトリチル基、および
リン酸を保護するのにβ−シアノエチル基を使用してい
る。レポーターのカップリングのために使用される方法
はこれらの保護基またはオリゴヌクレオチドのその他の
結合を攻撃してはならず、タグの合成はオリゴヌクレオ
チドの伸長に使用されるカップリング、酸化および脱保
護により影響されるべきではない。 被検体はレポーター構造の組合わさった組へ結合され
るので、レポーターモノマーのカップリングまたは鎖の
キャッピングは各々の工程で不完全であろう（図２、Ｂ
およびＣ）。このことはタグの組成からの被検体の構造
の演繹をより簡単にするであろう（図1;図３）。合成を
より容易にするため、連結基は被検体またはレポーター
基の分解を起こさずに切断できる結合により固形支持体
へ結合されているのが望ましい。もしくは、連結基は試
薬からの中間体および最終生成物の分離を可能にするよ
うな荷電基または親油性基のような基を持っているであ
ろう。 レポーター基は多くの形をとることができるが、質量
分析法によりタグの組成または配列が読み取れるという
要求を主として考慮する。可能性としては、異なった長
さまたは異なった同位元素組成の脂肪族鎖のような異な
った原子または式量の基が挙げられる。同位元素で標識
したメチレン基を用いて、独特の式量の基を四つの異な
ったレポーターの各々に帰属させることが可能である
（表１）。 表１ 水素および炭素の同位元素に基づいたレポーターの例： 同位体組成 式量（−OCH2） 記号 塩基 12CH2 30 γ30 Ａ 12CHD、13CH2 31 γ31 Ｃ 12CD2、13CHD 32 γ32 Ｇ 13CD2 33 γ33 Ｔ オリゴヌクレオチドを例にすると、これらのタグはそ
のシリーズの部分生成物の質量の増加からオリゴヌクレ
オチド中の各々の位置の塩基を読み取ることを可能にす
るセットを作ることができる（表２）。レポーターを加
えることによる最も少ない増加分が最も小さいレポータ
ーと最も大きいレポーターの間の質量相違より大きいな
らば、すべてのオリゴヌクレオチド配列は一連の独特の
タグ断片質量を与えるであろう。 質量分析のためには、被検体からタグ鎖を切断する簡
単な方法があることが望まれるであろう。いくつかの可
能性が存在する。オリゴヌクレオチドおよびペプチド被
検体に合致する方法には：光反応活性連結の光誘導切
断；酵素切断、例えばエステル連結；フリーラジカル誘
導切断がある。 さらに要求されることは、タグは分析に使用される化
学的および生化学的過程に合致可能でなければならない
ことであり：分子ハイブリッド形成に使用されるオリゴ
ヌクレオチドの例または提案された配列決定法の一つに
ついては、それらは溶解可能でなければならず、および
分析で使用されるであろうある種の酵素反応を阻害して
はならない。表１に示されたメチレン類似体と同様なオ
リゴエチレングリコール結合がオリゴヌクレオチドの分
子再会合に合致することが経験から示された。さらに、
そのような結合は、ヘキサエチレングリコール連結基を
通してガラスにつながれたオリゴヌクレオチドがポリヌ
クレオチドキナーゼおよびATP処理により5'−ホスホモ
ノエステルへ変換できることを示したように、少なくと
もいくつかの酵素反応と合致している。 連結基の望まれる性質 考えられる応用のために、連結基分子は以下の性質を
持っていることが望まれる： 中間体の煩わしい精製を必要とせずに、被検体および
対応するタグを産生する合成サイクルを進行させること
を可能にするため、連結基は固形支持体に連結可能でな
ければならない。合成サイクルに続いて、連結基は被検
体およびタグが無傷のまま残される条件下で固形支持体
から除去可能でなければならない。タグ合成のための官
能基は、質量分析によりお互いに区別可能であるタグの
容易な合成を可能にするようなものでなければならな
い。 連結基は、被検体およびタグの別々の伸長を、その一
つための化学が他方の化学を妨害しない条件下で可能に
するような保護された官能基を持っていなければならな
い。 連結基は好適には質量分析をマトリックス非存在下で
実施できるように荷電された基を持っていなければなら
ない。さらにこの目的のために、タグは電気噴霧のよう
な複雑な技術によらずに質量分析器内で十分に蒸発する
ように揮発性である化合物を含むことが望まれる。タグ
は安定なイオンかまたは対応する被検体の同定に使用で
きる特徴的なパターンに断片化するイオンを生じるべき
である。 タグをレーザー照射により質量分析器内で直接切断で
きるように、タグと被検体の間の結合は好適には光で切
断可能でなければならず、ライゲーションなどのような
生化学的工程を可能にするように完全に除去するための
更なる切断はランプに暴露することにより都合良く実施
できる。 連結された生成物は好適には、生化学的反応に使用で
きるように水性溶媒に可溶でなければならない。 ここに記載された実施例はこれらの望まれる性質を持
つ連結基を示している。 光切断可能基 光切断可能基は既知の光反応活性ｏ−ニトロベンジル
基に基づいてきた。この基はオリゴヌクレオチド合成に
おいてリン酸基および2'ヒドロキシ基の両方の保護基と
して使用されてきた［Pillai Synthesis １（1980）
の総説を参照されたい］。それ自身ではｏ−ニトロベン
ジル基は、タグおよび被検体間の連結器の続いての結合
のための更なる官能化が欠けている。商業的に入手可能
なものは化合物５−ヒドロキシ−２−ニトロベンジルア
ルコールである。光反応活性性を有意に減少させること
なく５、４位にOMe基を付加させることができることが
知られている（Pillai総説参照）。従って、５−ヒドロ
キシ−２−ニトロベンジルアルコールがベンジルアルコ
ールからのDNA合成の伸長を目的とする出発点として、
および５−ヒドロキシ基でのエーテルカップリングから
タグへの連結基鎖として使用された。 存在すべき官能基に必要とされることは被検体とタグ
の組合わさった合成を可能にすることである。従って、
光切断可能な基からタグ合成のために必要とされる官能
基への連結基の腕が必要とされる。組み合わせ合成が固
形支持体上で実施されることもまた一層高く評価され
る。このように、連結基の腕は官能基が二価でなければ
ならず、選択的な合成的変換を可能にするため直交する
保護旗を持っている。好適なタグ試薬はグリコール結合
／エーテル結合を含んでいる。合成のため、オリゴヌク
レオチドは通常3'ヒドロキシおよびコハク酸エステル結
合を通して長鎖アミノCPG支持体に結合されている。こ
のように、必要とされる官能基はアルコールであるべき
と思われた。 下記の中間体化合物が合成された。 この中間体は： −被検体合成のためのメトキシトリチル基（−CH2ODM
T）； −光切断のためのｏ−ニトロ基； −タグ合成のためのｏ−ｔ−ブチルジフェニルシリル基
（OTBDPS）； −質量分析法による分析のために正に荷電した基への転
換のための三級アミン基； −および支持体への結合のためのＮ−ヒドロキシスクシ
ンイミジル基を 持つ芳香族連結基を含んでいる。 被検体がペプチドである場合、条件の少しの変更しか
考えなくて良い。２−ニトロベンジル基はペプチド合成
のほとんどの条件下で安定であり、それおよび関連する
類似体はペプチド合成においてすでに光反応活性基とし
て使用されている（Pillaiの総説およびそこに含まれて
いる文献を参照されたい）。異なった切断様式によるペ
プチド合成に適したいくつかの樹脂が存在する。被検体
およびタグ合成のための直交保護基はｔ−ブトキシカル
ボニルおよび２−メトキシエトキシメチルに基づいてい
るであろう。ｔ−ブトキシカルボニル基はトリフルオロ
酢酸処理により影響される切断からアミノ酸のアミノ基
を保護するために使用される。２−メトキシエトキシメ
チルはタグ形成基および上記のような１の質量相違のｎ
アルキルジオール誘導体に基づいたタグの保護に使用さ
れるであろう。ｔ−ブトキシカルボニル基の切断は２−
メトキシエトキシメチル保護基と合致することが示され
ている。２−メトキシエトキシメチル保護基はジクロロ
メタン中、臭化亜鉛により選択的に切断できる。本方法
を上に例示してきたが、当業者は直交保護基のこの組は
代表的な例として出されたものであり、それによって制
限されるわけではないことを認識するであろう。 レポーターの検出および分析 光切断は被検体からのタグの放出に好ましい方法であ
る；迅速であり、乾燥状態で実施でき、および非常に小
さい規模での画像化に走査型レーザーが使用でき、すな
わち細胞内の様相を画像化するのに十分に小さいので
（de Vriesら、1992）、提案された方法は細胞の表面
または内部または組織切片中の異なった細胞の“染色”
に使用された特異的被検体（例えば候補薬剤などのよう
なリガンドとそれらの受容体間の相互佐用の画像化に必
要とされるであろうもの）の位置を検出するのに使用で
きる。 光感受性保護基は非常に広い範囲の光学残基に利用可
能であろう（Pillaiの総説、1980）。広い範囲の化合物
に対して保護基として使用できる光反応活性ｏ−ニトロ
ベンジル基は考えられる多くの被検体（中でもペプチド
およびオリゴヌクレオチド）のための連結基の理想的出
発物質である。オリゴヌクレオチドを例にとると、定量
的に分解できてヒドロキシ基を与える光感受性連結基が
提供される。これは以下の配列決定法に記載されるよう
に脱保護オリゴヌクレオチドのライゲーション伸長を起
こすことを可能にするであろう。さらに、この基はオリ
ゴヌクレオチド合成の間は安定であることが知られてい
る。タグ合成を開始するために使用できる基を与えるた
めにベンジル環を修飾する必要があろう；上記のオリゴ
エチレングリコール系列のようなレポーターはｏ−ニト
ロベンゾイル基の光化学切断反応を妨害しない（Pillai
前掲文献中に）。切断を促進する他の基を芳香環に加え
ることができる；そのような基は質量分析計での分析を
簡単にするための荷電基の付加に利用できるであろう。
現在の質量分析計は100分の１ダルトンより高い分離能
で、全質量200kDまでを数百分子で測定できる。好適な
光反応活性連結基は以下のように表現できるであろう；
正に荷電した基Ｒは芳香環に直接結合されているか、ま
たは連結基の腕の一つに存在してもよい。 計測 提案された分子タグは質量分析法のいくつかの型の一
つで分析されるであろう。被検体からタグを切断するの
が望ましいであろうが、多くの目的にはタグを断片化す
る必要はないであろうし、そのことは曖昧さのもとにな
るので実際には望まれないであろう。質量分析計の最近
の進歩は多くの断片化をしくなくても非常に大きな分子
の測定が可能であり；および残りのタグが安定な条件下
で容易に切断できるように連結基を設計することが可能
であるので、測定の間のタグ断片化は避けられるべきで
ある。ほとんどの場合、被検基はタグより揮発性が低い
であろうし、および多くの応用では固形基質に結合され
ているであろうので質量分析法を妨害しない。 上に例示した連結基はほとんど大多数の共有結合の切
断を起こさない条件下、光子照射に対して非常に反応活
性である。適した装置はすでに記載されている（de Vr
iesら、1992）。これは１μｍより小さな点に焦点を合
わすことができるレーザーを使用している。250mmまで
の画像が台を0.1μｍ間隔で動かしてスキャンできる。 この装置はまた脱離レーザーにより持ち上げられた化
学種と相互作用させるように台の表面を横切ってイオン
化レーザーを放つことにより測定されるべき標本のイオ
ン化が可能である。このことは、もしタグ中に荷電残基
を含ませることが不可能であったならば、またはタグの
読みとりに断片化が望まれるならば本方法に有用であり
うる。 別の態様において、本発明は標的核酸の配列決定法を
提供し、その方法は以下の工程を含んでいる： ａ） 支持体上に固定化されたオリゴヌクレオチドを提
供し、 ｂ） 標的核酸と固定化オリゴヌクレオチドをハイブリ
ダイズさせ、 ｃ） ライブラリーの第一の試薬のオリゴヌクレオチド
鎖を固定化オリゴヌクレオチドに隣接する標的核酸にハ
イブリダイズするようにｂ）からのハイブリッドと、定
義したように試薬が溶液中に一緒に混合されているライ
ブラリーをインキュベートし、 ｄ） 隣接するオリゴヌクレオチドをライゲーション
し、このようにライゲーションされた第一の試薬を形成
させ、 ｅ） 他の非結合試薬を除去し、および ｆ） 標的核酸の最初の部分の配列を示すものとして、
ライゲーションされた第一の試薬のタグ部分を回収し分
析する。 応用例 核酸分析においてコードされたオリゴヌクレオチドが
使用できる方法を参照することにより応用の可能性を例
示する。 1.累進的ライゲーションによる核酸配列の決定。（図
４） 決定されるべき配列は最初に工程ｂ）で固形支持体に
結合されたオリゴヌクレオチドとハイブリダイズされ
る。もし配列決定されるべきDNAがバクテリオファージM
13のような一本鎖ベクターにクローン化されていたら、
固形支持体上の“プライマー”オリゴヌクレオチドはベ
クター配列の一部であるように選ぶことができる。工程
ｃ）において、工程ｂ）からのハイブリッドを運ぶ固形
支持体をコードされたオリゴヌクレオチド試薬の溶液と
インキュベートする（例えば、与えられた長さのすべて
の配列、4096のヘキサヌクレオチド（一般には4nのｎ−
mer）の前記のライブラリーと）。工程ｄ）において、
標的DNAの最初の六つの塩基と相補的なヘキサヌクレオ
チドが固定化プライマーオリゴヌクレオチドに連結され
るようにリガーゼが導入される。この工程によりライブ
ラリーからの第１のコードされたオリゴヌクレオチド試
薬が、そのオリゴヌクレオチド鎖の固定化プライマーオ
リゴヌクレオチドへのライゲーションにより連結され、
ここではライゲーションされた第一の試薬と称される。 工程ｅ）において、例えば洗浄によりライゲーション
されていない試薬が除去される。工程ｆ）において、ラ
イゲーションされた第一の試薬の連結基がタグ鎖を離す
ために破壊され、タグ鎖は回収されて標的DNAの第１の
部分の配列の指標として分析される。 好適には、連結基の除去はまた第１のオリゴヌクレオ
チド鎖の末端のヒドロキシまたはリン酸基を露出させ、
第二の試薬のオリゴヌクレオチド鎖との結合に利用可能
にする。光化学的および酵素的および化学的加水分解を
含む連結基分解のためのいくつかの方法はさらなる結合
のために必要とされる3'−ヒドロキシルまたは5'−リン
酸基の発生に使用できる。次に工程ｃ）、ｄ）、ｅ）お
よびｆ）を繰り返す。これらの工程にはライブラリーか
ら第二の試薬のハイブリッド形成、ライゲーション、ラ
イゲーションされた第二の試薬のタグの回収および分
析、およびさらなるライゲーションのために必要とされ
る別の3'−ヒドロキシルまたは5'−リン酸基の発生を含
んでいる。この過程は全DNA配列が読み取られるまで、
または反応の収率が非常に低くなって有効でなくなるま
で繰り返すことができる。 この系列の四つの段階は図式的に図４に示されてい
る。最初の図は一回目の工程ｅ）の最後の状態に対応し
ている。第二の図は工程ｆ）の最後の状態に対応してい
る。第三の図は二回目の工程ｅ）の最後の状態に対応し
ている。第四の図は二回目の工程ｄ）の最後の状態に対
応している。本技術の循環的性質が示されている。 2.連続的ライゲーションによる多数の鋳型の核酸配列決
定 第一の例を拡大して、多くの配列が同時に分析できる
であろうことが考えられる。例えば、配列決定されるべ
きDNAの個々のクローンが固定化できるであろう： ａ） 各々の末端に固定化された同一のベクターオリゴ
ヌクレオチドを持つ針のアレイが使用できる。標的DNA
の個々のクローンを各々の個々の針に固定化されたオリ
ゴヌクレオチドへハイブリダイズさせる。次にこれらの
ハイブリッドを運ぶ針のアレイはコードされたオリゴヌ
クレオチド試薬のライブラリー溶液（ライゲーションの
ための成分も含んでいる）とインキュベートする。この
工程の結果、各々の針は異なったライゲーションされた
試薬を運んでいる。最後に、前記のように各々のライゲ
ーションされた試薬のタグ鎖を回収し分析する。もしア
レイの針が適切に配置されていたら、それらはマイクロ
タイタープレートのウェル内へ浸してもよく、第一のプ
レートは配列決定されるべき鋳型を含んでおり、第二の
プレートは試薬のライブラリーおよびライゲーション溶
液、および第三のプレートは針からタグ鎖を切断するた
めの試薬を含んでいる。 ｂ） もしくは、表面がプライマーオリゴヌクレオチド
で被覆されていてもよく、好適にはその5'末端またはさ
もなくばいくつかの他の場所を通して共有結合で結合さ
れている。配列決定されるべきDNAの個々のクローンを
被覆された支持体上の離れた位置へスポットし、標的DN
Aの各々の個々のクローンが支持体上の個々の離れた位
置で固定化されたオリゴヌクレオチドへハイブリダイズ
するようにする。支持体は次に試薬のライブラリーおよ
びライゲーションのための成分を含んだ溶液とインキュ
ベートする。非結合試薬を除去する。続いて各々離れた
位置のライゲーションされた試薬の連結基を切断し、タ
グを回収し分析する。切断は表面の小さな領域に向ける
ことができるレーザー脱離のような方法により好適に達
成される。この方法の利点は非常に多数のDNA配列が一
緒に分析できることである。 3.オリゴヌクレオチドへのハイブリッド形成による配列
決定のための伸長法 ａ）型Ｉ 膜上に高濃度でDNAをスポッティングする方法はよく
確立されている（Hoheiselら、1992;Rossら、1992）。
フィンガープリンティングおよび配列決定のためには、
ハイブリッド形成パターンが解釈するには複雑すぎない
ようにオリゴヌクレオチドは単一でまたは小さな組で適
用されなければならない；その結果、分析の各々の回で
は鋳型の少しの比率しか信号を与えない。各々のハイブ
リッド形成からの信号が配列の決定を可能にするコード
情報を含んでいたら、より複雑な混合物が使用できハイ
ブリッド形成の各々の回でより多い情報が集められる。
混合物の複雑さはDNA鋳型の長さおよび混合されたオリ
ゴヌクレオチド中の配列を分割する分析法の能力に依存
しているであろう。 これらの質量分析法タグまたはレポーター基でコード
された核酸プローブは多プローブの使用が便利である場
合（例えば、DNAフィンガープリンティングまたは突然
変異分析）に非常に有用であろう。質量分析法タグは多
重送信の利点を提供する。 各々が自身の独特で適切な質量分析法タグで標識され
た多数の異なったプローブは典型的な核酸ハイブリッド
形成アッセイに一緒に使用できる。ハイブリダイズする
各々の個々のプローブの配列は、質量分析におけるタグ
の分離および分割のため他のものの存在下で特異的に決
定できる。 この態様において、本発明は標的核酸の配列決定法を
提供し、この方法は以下の工程を含んでいる； ｉ） 支持体上に固定化された標的核酸を用意する。好
適には、標的核酸の個々のクローンは支持体上離れた位
置に固定化されている。 ii） 異なった試薬のオリゴヌクレオチド鎖が支持体上
の標的核酸にハイブリダイズするようにｉ）からの固定
化された標的核酸と上記の多数のコードされたオリゴヌ
クレオチド試薬をインキュベートし、 iii） ハイブリダイズしていない試薬を除去し、およ
び iv） 標的核酸の一部を配列の指標として各々の試薬の
タグ部分を回収して分析する。 好適にはその後、試薬のライブラリーをハイブリッド
形成に使用し、ライゲーション、切断および分析工程を
循環的に繰り返し、標的核酸の配列についての追加の情
報が提供される。 ｂ）型II オリゴヌクレオチドのアレイへハイブリダイズした場
合、形成されたデュープレックスのパターンから核酸配
列を決定することが可能である。決定できる配列の長さ
は大体アレイの大きさの平方根であり；もし全部で65,5
36のオクタヌクレオチドのアレイが使用されたならば、
決定されるべき配列は約200bpであろう（Southernら、1
992）。大きさの制限は、決定されるべき配列において
８塩基の並びが２度以上生じてはならない束縛により課
せられている。アレイおよび配列決定におけるその使用
は国際特許出願WO89/10977に記載されており；固定化さ
れた（例えば、表面上にそれらの5'−末端またはそれら
の3'−末端により）オリゴヌクレオチドのアレイを提供
する方法は国際特許出願WO90/03382に記載されている。 本発明の方法によると決定できる配列長を非常に長く
することができる。本発明のこの態様において、本方法
は以下の工程を含んでいる： ａ） 支持体上の間隔をとった位置に固定化されたオリ
ゴヌクレオチドのアレイを提供し、一つの位置のオリゴ
ヌクレオチドは別の位置のオリゴヌクレオチドと異なっ
ている。好適には支持体上の各々間隔をとった位置に共
有結合で固定されているオリゴヌクレオチドの配列が知
られている、 ｂ） 支持体上の一つまたはそれ以上の間隔をとった位
置でハイブリッドを形成するように標的核酸と固定化オ
リゴヌクレオチドのアレイをインキュベートし、 ｃ） ライブラリーの試薬のオリゴヌクレオチド鎖が各
々の固定化されたオリゴヌクレオチドに隣接する標的核
酸にハイブリダイズするようにｂ）からのハイブリッド
とコードされたオリゴヌクレオチド試薬のライブラリー
をインキュベートし、 ｄ） 隣接するオリゴヌクレオチドをライゲーション
し、このことにより支持体上の一つまたはそれ以上の間
隔をとった位置でライゲーションされた試薬を形成し、 ｅ） 他のライゲーションしていない試薬を除去し、お
よび ｆ） 標的核酸の一部の配列の指標として各々のライゲ
ーションされた試薬のタグ部分を回収して分析する。 好適には、各々間隔をとった位置のタグ鎖の切断はレ
ーザーにより光化学的に達成される。好適には、タグ鎖
の分析は質量分析法による。好適には上記のように、標
的核酸の配列についての追加の情報を得るためにハイブ
リッド形成、ライゲーション、切断および分析工程が循
環的に繰り返される。 好適な操作の順番は図５を構築する四つの図に示され
ている。最初の図は工程ｂ）の出発時の状態を示してい
る。第二の図は工程ｂ）の最後の状態を示しており、標
的核酸の一部がアレイの一部を形成している繋がれたオ
リゴヌクレオチドへハイブリダイズしている。第三の図
は工程ｃ）の最後の状態を示しており、第四の図は工程
ｄ）の最後の状態を示しており；ライブラリーからの試
薬が標的核酸にハイブリダイズされ、固定化オリゴヌク
レオチドにライゲーションされた。 既知の方法のこの伸長の結果は劇的である。タグを読
み取るのに用いられる方法が混合物を分離することがで
きれば、アレイ中のオリゴヌクレオチドの長さに等しい
長さ分の一回の伸長は、読みとることができる全部の長
さと一致している。この場合、八つの塩基により伸長さ
れたオクタヌクレオチドの配列から読みとることができ
る長さは約60,000塩基である。 タグを付けたオリゴヌクレオチドを含むハイブリッド分
析と下記の方法の比較： ａ）ゲルに基づく方法 自動化配列分析について最も進歩した装置は一日当た
り約40000塩基を読みとることができる。これはゲルに
加えられる反応液を提供するのに主要な生物学的および
生化学的過程のための時間は含まれていない。もし鋳型
を表面にミリメートル平方当たり１の密度で適用できる
と仮定すると（Hoheiselら、1992;Rossら、1992）、100
x100mmの領域に10000を適用できるであろう。ハイブリ
ッド形成後、各々のセルのタグを付けたオリゴヌクレオ
チドは数ｆモルであろうので、レーザーの一回の２ナノ
秒パルスは読みとりに十分なタグを放出するであろう
が、たとえ100のパルスが必要とされると仮定しても、
読みとられるべきセルに対しての総時間は数ミリ秒であ
り、したがって10000のセルすべてを数分間で読み取る
ことができる。もしオリゴヌクレオチドがヘキサマーで
あったとしても、得られた生のデータは60000塩基であ
ろう。配列決定に対して、このことはゲルからの等しい
生データほど情報が豊かではないであろう、なぜなら、
より長い連続的な長さがゲルから読みとられるからであ
る。ゲルにおけるこの利点は、もちろん、もしアレイか
ら読まれた配列がそれ以上の回数の分析により伸長でき
るならば失われるであろう。しかし、アレイに基づいた
方法の基本的利点は、数千の鋳型を一緒に分析すること
を可能にする平行法であり；ゲル上で分析できる数はゲ
ルの巾により制限され、15未満である。 ｂ）現在のアレイに基づく方法 現存のアレイに基づく方法の主たる欠点は： ａ） 大きさＮのアレイから読むことができる配列は のみであり、アレイのほとんどのセルは空である。タグ
を付けたオリゴヌクレオチドを加えることにより、アレ
イの占拠率はほとんど完全に近くなり、そのためほとん
どのセルから情報が得られるであろう。この理由はタグ
からの付加的な情報が、標的配列中に短い列が多く存在
することによる曖昧さを除く助けとなるからである（表
３）。 ｂ）ハブリッド形成によるオリゴヌクレオチドとの各々
の相互作用から読み取れる配列の長さは必然的にオリゴ
ヌクレオチドの長さに制限される。このことは単一塩基
の並びのような繰り返し配列の読みとりに問題を起こし
ている。ライゲーションによる読みとりの拡大は繰り返
しされたライゲーションにより通過できるかぎり読みと
りを可能にするであろう。 ｃ）現在の検出法のうち、放射能は高い感度を持ってい
るが分解能が悪く、蛍光は低い感度と高い分解能を持っ
ている；両方とも比較的遅い。質量分析法を使用する案
は分解能、速度および感度を改良でき、ならびにタグの
配列を読みとる可能性を加えた。 薬理活性の可能性を持つ被検体 多くの薬剤は組織特異的である。それらの作用はしば
しば細胞表面レセプターとの相互作用に依存している。
コア構造に基づいた薬剤の一群がある；例えば、短いペ
プチドを含むいくつかのもの。候補薬剤を追跡してどの
細胞または組織を標的としているのかを観察できること
は有用である。多くの異なった候補を同時に追跡できる
ことは有用であろう。コードされた質量タグでタグを付
けた被検体のライブラリーを用いると、質量分析計中で
細胞または組織を試験することにより相互作用を追跡す
ることが可能であろう。もしタグに光反応活性保護基が
結合されているとしたら、質量分析計と組み合わされた
走査レーザー切断を用いて動物全体または組織切片を画
像化できるであろう。 以下の実施例は本発明をさらに例示している。 実施例１から６は、被検体合成のためのメチルオキシ
トリチル基（−CH2ODMT）；光切断のためのｏ−ニトロ
基；タグ合成のためのＯ−ｔ−ブチルジフェニルシリル
基（OTBDPS）；質量分析法による分析のための正に荷電
した基への変換のための三級アミノ基；および支持体へ
の結合のためのＮ−ヒドロキシスクシンイミジル基を有
する芳香族連結基を含む化合物（８）の合成における反
応スキーム１に従った工程を示している。 実施例７および８は反応スキーム２に従った続いての
工程を示している。 実施例９および10は反応スキーム３に従った、プロパ
ン−1,3−ジオールに基づいたレポーター基（13）を合
成する工程を示している。 実施例11から13は反応スキーム４に従った、レポータ
ー基としての保護プロパン−1,3−ジオール残基の化合
物（６）への結合に関与する工程を示している。 実施例14から19は本発明に従った種々の試薬の調製、
特徴づけおよび使用を記載している。 一般的項目 ５−ヒドロキシ−２−ニトロベンジルアルコールは、
Aldrich社より購入し、長鎖アルキルアミノ制御孔ガラ
スはSigmaより購入した。無水溶媒は、窒素雰囲気下で
包装したAldrich Sure Seal等級のものである。トリ
エチルアミンは水素化カルシウムから前蒸留し、使用ま
で窒素雰囲気下に保存した。他の溶媒および試薬は、市
販の範囲のものから入手可能である。 1H−NMRは、Jeol 270MHz機器で、指示された溶媒を
用い、テトラメチルシランを参照として得た。 赤外吸収は、Nicolet 5DXC F.T.IR機器で、指示さ
れるように、臭化カリウムディスクまたはクロロホルム
溶液として得た。 融点は、Gallenkamp融点装置を用いて求め、修正しな
かった。 TLCは、指示された溶媒系を用いて、Kieselgel 60F
254アルミニウム裏張TLCプレートで行った。プレート
は、紫外線および／またはモリブドリン酸の３％w/vエ
タノール性溶液に浸漬し次にホットエアガンで加熱する
ことの両方により可視化した。トリチル含有種は明るい
オレンジ色のスポットとして、アルコールは青いスポッ
トとして現れる。 シリカゲルクロマトグラフィーは、粒子サイズ40→63
μｍのフラッシュ等級シリカゲルを用いて実施した。 反応スキームおよび本文中においては、次の略号を使
用する。 DMT 4,4'−ジメトキシトリチル THF テトラヒドロフラン TBDPS tert−ブチルジフェニルシラン DMAD ４−ジメチルアミノピリジン DCCI ジクロロヘキシルジカルボジイミド CH2Cl2 ジクロロメタン CPG 制御孔ガラス MeI ヨードメタン Tresyl 2,2,2−トリフルオロエチルスルホニル 実施例１ ５−ヒドロキシ−Ｏ−（4,4'−ジメトキシトリチル）−
２−ニトロベンジルアルコール（化合物２、スキーム
１）の合成 無水ピリジン（40ml）に溶解した５−ヒドロキシ−２
−ニトロベンジルアルコール（5.11g,30.2mmol）に、塩
化4,4'−ジメトキシトリチル（10.25g,30.2mmol）を加
え、フラスコに栓をした。次に、反応混合物を室温で合
計72時間撹拌した。TLC分析（エーテル／石油エーテル4
0−60℃,65％/35％）は、RF＝0.27の新たなトリチル陽
性含有物質の存在および出発アルコールの消失を示し
た。次に、回転蒸発によりピリジンを除去し、最後の痕
跡量はトルエンとの共蒸発（×２）により除去した。得
られたガムを酢酸エチルに溶解し、溶液を水（×１）お
よびブライン（×１）で洗浄した。次に、酢酸エチル溶
液を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、蒸発させて、赤茶
色ガムを得た。ガムをCH2Cl2（20ml）に溶解し、次にシ
リカゲルカラム（14cm×6.5cm）にかけ、エーテル／石
油エーテル40−60℃,65％/35％で溶出した。生成物分画
を合わせ、回転蒸発により溶媒を除去して、灰白色固体
を得た（13.49g,95％,mp.80−82℃（分解））。分析用
試料は、クロロホルム／石油エーテル40−60℃から再結
晶することにより調製した。mp.134−７℃（分解）。1 H−NMR（270MHz,CDCl3,δ）:3.79（s,6H,DMT−OCH3）,
4.63（s,2H,CH2−ODMT）,6.77−6.85（m,5H,アリー
ル）,7.22−7.49（m,9H,アリール）,7.63（s,1H,アリー
ル）,8.06（d,1H,J＝9.06Hz,アリール）。 IR（KBrディスク）:1610,1509,1447,1334,1248,1090,10
60,1033,828cm-1。 実施例２ Ｏ−（4,4'−ジメトキシトリチル）５−［１−（３−ブ
ロモ−１−オキシプロピル）］−２−ニトロベンジルア
ルコール（化合物３、スキーム１）の合成 アセトン（150ml）に溶解した化合物２（10.18g,21.6
mmol）に、1,3−ジブロモプロパン（11ml,108mmol）お
よび炭酸カリウム（4.47g,32.3mmol）を加えた。次に、
反応混合物を80℃で合計３時間加熱し、次に室温でさら
に16時間撹拌した。TLC分析（エーテル／石油エーテル4
0−60℃,60％/40％）は、出発材料が完全に消失し、RF
＝0.48（メジャー）およびRF＝0.23（マイナー）の２つ
の新たなトリチル含有物質の形成を示した。次に、回転
蒸発によりアセトンを除去し、得られた残渣を水とジク
ロロメタンとの間に分配した。ジクロロメタン溶液を分
離し、ブライン（×１）で洗浄した。次に、ジクロロメ
タン溶液を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、蒸発させて
ガムを得た。ガムをジクロロメタン（20ml）に溶解し、
次にシリカゲルカラム（6.5cm×14cm）にかけ、エーテ
ル／石油エーテル40−60℃,60％/40％で溶出した。純粋
生成物分画を合わせ、回転蒸発により溶媒を除去して、
化合物３を白色固体として得た（8.18g,64％,mp.132→
４℃,RF＝0.48 エーテル／石油エーテル40−60℃,60％
/40％。分析のために、少量の試料を酢酸エチル／石油
エーテルから再結晶した。mp.132−４℃。1 H−NMR（270MHz,CDCl3,δ）:2.40（m,2H,−CH2−CH2−
CH2）,3.64（t,2H,J＝6.32Hz,CH2Br）,3.79（s,6H,OC
H3）,4.27（t,2H,J＝6.04Hz,−OCH2CH2）,4.66（s,2H,A
rCH2ODMT）,6.84（d,4H,J＝8.79Hz,DMTアリール）,7.20
−7.50（m,10H,9DMTアリール、１アリール）,7.68（s,1
H,アリール）,8.1（d,1H,J＝9.06Hz,アリール）。 IR（KBrディスク）:1608,1577,1511,1289,1253,1230,11
74,1065,1030cm-1。 実施例３ Ｎ−［Ｏ−（tert−ブチルジフェニルシリル）−２−オ
キシエチル）］−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）アミン
（化合物５、スキーム１）の合成 水素化ナトリウム（油中60％分散液0.76g,19mmol）
に、N2雰囲気下で無水THF（15ml）を加え、次に、水素
を発生させるような速度でTHF（30ml）中のジエタノー
ルアミンのスラリー（2g,19mmol）を加えた。次に、反
応混合物をN2雰囲気下で室温で30分間撹拌し、この間に
灰色の析出物が形成した。tert−ブチルクロロジフェニ
ルシラン（4.95ml,19mmol）を加えることにより生成し
たアルコキシドを急冷し、次に反応液をN2雰囲気下で室
温で撹拌した。TLC分析（酢酸エチル）は、出発物質に
対して２つの新たなUV陽性スポットの生成を示した。RF
＝0.05（メジャー）、RF＝0.60（マイナー）。回転蒸発
によりTHFを除去し、残渣を0.1M炭酸水素ナトリウム溶
液に溶解した。次に生成物を酢酸エチル（×２）で抽出
した。次に酢酸エチル抽出物を合わせ、ブライン（×
１）で洗浄した。次に酢酸エチル溶液を無水硫酸マグネ
シウムで乾燥し、蒸発させて油状物を得た。この油状物
をシリカゲルカラムにかけ、クロロホルム／メタノー
ル、90％/10％で溶出した。RF＝0.33の分画を合わせ、
回転蒸発させて、化合物５を白色結晶質固体として得た
（3.93g,60％）。mp.73→75℃。分析のために、少量の
試料を酢酸エチル／石油エーテル40−60℃から再結晶し
た。mp.76→77℃。1 H−NMR（270MHz,CDCl3,δ）:1.06（9H,tBu）,2.13（br
s,1H,OH,D2O交換可能）,2.78（m,4H,CH2NHCH2−）,3.63
（t,2H,J＝5.22Hz,−CH2OSi−）,3.78（t,2H,J＝5.22H
z,CH2OH）,7.40（m,6H,アリール）,7.66（m,4H,アリー
ル）。 IR（KBrディスク）:3100,1430,1114,1080,969,749,738,
707cm-1。 実施例４ Ｎ−［Ｏ−（tert−ブチルジフェニルシリル）−２−オ
キシエチル］−Ｎ−［Ｏ−（３（Ｏ−（4,4'−ジメトキ
シトリチル）−１−オキシメチル）−４−ニトロフェニ
ル）−３−オキシプロピル］−Ｎ−（２−ヒドロキシエ
チル）アミン（化合物６、スキーム１）の合成 １−メチル−２−ピロリジノン（65ml）中に溶解した
化合物３（7.46g,12.6mmol）に、化合物５（8.63g,25.2
mmol）を加えた。次に、反応混合物を80℃で合計５時間
加熱し、放置して冷却させ、室温でさらに16時間撹拌し
た。TLC分析（酢酸エチル）は、RF＝0.51の新たなトリ
チル含有種の形成および残余量の２つの出発物質を示し
た。反応混合物を水（600ml）とブライン（100ml）との
混合物中に注ぎ、生成物を酢酸エチル（３×200ml）で
抽出した。次に、酢酸エチル抽出物を合わせ、無水硫酸
マグネシウムで乾燥した。次に、回転蒸発により酢酸エ
チルを除去して、茶色ガムを得た。このガムから、結晶
質生成物がゆっくり形成した。結晶質生成物（化合物５
の臭化水素塩）を濾過しうるように、最少量の酢酸エチ
ルを加えて残渣ガスを溶解した。次に、酢酸エチル溶液
をシリカゲルカラム（13cm×6.5cm）にかけ、酢酸エチ
ルで溶出した。このカラムでは、残余の化合物３と所望
の生成物との分離が不十分であったため、生成物分画を
合わせ、蒸発させてガムを得た。このガムを必要最少量
の酢酸エチルに溶解し、別のシリカゲルカラム（14cm×
6.5cm）にかけ、最初に酢酸エチル／石油エーテル40−6
0℃,50％/50％で、次に酢酸エチルで、勾配溶出を用い
て溶出した。生成物分画を合わせ、回転蒸発により溶媒
を除去して、化合物６をガムとして得た。最後の痕跡量
の溶媒は、ガムを高真空下に１時間置くことにより除去
した。生成物の収量は7.64g,71％であった。1 H−NMR（270MHz,CDCl3,δ）:1.04（s,9H,tBu）,1.97
（m,2H,−CH2CH2CH2−）,2.7（m,6H,NCH2）,3.56（m,2
H,CH2OH）,3.75（m,2H,CH2OSi）,3.78（s,6H,DMT−OC
H3）,4.12（m,2H,ArOCH2CH2）,4.64（s,2H,ArCH2ODM
T）,6.74−6.85（m,5H,アリール）,7.2−7.65（m,20H,
アリール）,8.05（d,1H,アリール）。 IR（KBrディスク）:1608,1579,1509,1287,1251,1232,11
12,1092,1064,1035,826,754,730,613cm-1。 実施例５ Ｎ−［Ｏ−（tert−ブチルジフェニルシリル）−２−オ
キシエチル］−Ｎ−［Ｏ−（３（Ｏ−（4,4'−ジメトキ
シトリチル）−１−オキシメチル）−４−ニトロフェニ
ル）−３−オキシプロピル］−Ｎ−［Ｏ−（３−カルボ
キシラートプロピオニル）−２−オキシエチル］アミン
（化合物７、スキーム１）の合成 無水ジクロロメタン（40ml）および無水ピリジン（50
ml）に溶解した化合物６（5.64g,6.59mmol）に、コハク
酸無水物（2.06g,20.6mmol）およびジメチルアミノピリ
ジン（210mg,1.72mmol）を加え、フラスコに栓をした。
次に、反応混合物を室温で合計72時間撹拌した。TLC分
析（メタノール／酢酸エチル、10％/90％）は、RF＝0.4
5の新たなトリチル含有種の形成および出発物質の消失
を示した。回転蒸発により溶媒を除去し、トルエンとの
共蒸発（×２）により最後の痕跡量のピリジンを除去し
た。次に、得られたガムをクロロホルムと水との間に分
配した。有機相を分離し、水相をさらにクロロホルム
（×１）で抽出した。次に、有機相を合わせ、ブライン
（×１）で洗浄した。次に、クロロホルム溶液を無水硫
酸マグネシウムで乾燥し、蒸発させてガムを得た。次
に、ガムを高真空下に１時間置くことにより最後の痕跡
量の溶媒を除去し、化合物７を得た。6.75g。この生成
物を、さらに精製することなく次の段階で用いた。1 H−NMR（270MHz,CDCl3,δ）:1.0（s,9H,tBu）,1.9（m,
2H,CH2CH2CH2）,2.5（m,4H,COCH2CH2COOH）,2.7（m,6H,
N−CH2）,3.7（m,2H,CH2OSi）,3.75（s,6H,DMT−OC
H3）,4.1（m,4H,CH2OCOおよびAr−OCH2CH2）,5.6（s,2
H,ArCH2ODMT）,6.7（d,1H,アリール）,6.8（d,4H,アリ
ール）,7.2→7.7（m,20H,アリール）,8.02（d,1H,アリ
ール）。 IR（CHCl3溶液）:1736,1608,1579,1509,1288,1251,123
2,1175,1158,1112,1093,1065,1035,755,703cm-1。 実施例６ Ｎ−［Ｏ−（tert−ブチリジフェニルシリル）−２−オ
キシエチル］−Ｎ−［Ｏ−（３（Ｏ−（4,4'−ジメトキ
シトリチル）−１−オキシメチル）−４−ニトロフェニ
ル）−３−オキシプロピル］−Ｎ−［（Ｏ−（スクシニ
ル（３−カルボキシラートプロピオニル）））−２−オ
キシエチル］アミン（化合物８、スキーム１）の合成 無水ジクロロメタン（30ml）に溶解した化合物７（2.
99g,3.13mmol）に、ジシクロヘキシルカルボジイミド
（0.710g,3.45mmol）およびＮ−ヒドロキシスクシンイ
ミド（0.396g,3.44mmol）を加え、フラスコに栓をし
た。次に、反応混合物を室温で18時間撹拌し、この間に
白色析出物が形成した。白色析出物を濾別し、ジクロロ
メタン溶液を水（×１）およびブライン（×１）で洗浄
した。次に、ジクロロメタン溶液を無水硫酸マグネシウ
ムで乾燥し、溶媒を回転蒸発させて、泡状物3.26g（99
％）を得た。TLC分析（酢酸エチル）は、RF＝0.74の唯
一のトリチル含有種を示し、有意の混入物はなかった。
少量の物質をシリカゲルカラムに通すことにより、分析
用試料を得ようと試みたが、活性エステルが分解して酸
に戻った（化合物７）。したがって、この物質をさらに
精製することなく、以下のすべての実験において用い
た。1 H−NMR（270MHz,CDCl3,δ）:1.04（s,9H,tBu）,1.97
（m,2H,CH2CH2CH2）,2.50→2.75（m,6H,スクシニルCH2
＋−OCCH2）,2.76−2.86（m,6H,NCH2）,3.08（m,2H,CH2
CO2スクシニル）,3.77（s,6H,DMTOCH3）,3.86（m,2H,CH
2OSi）,4.1→4.2（m,4H,ArOCH2＋CH2O2C）,4.63（s,2H,
ArCH2ODMT）,6.7→6.9（m,5H,アリール）,7.01→7.7
（m,20H,アリール）,8.05（d,1H,アリール）。 IR（KBrディスク）:1742,1713,1509,1288,1251,1211,11
75,1090,1067cm-1。 実施例７ 誘導化長鎖アルキルアミノ制御孔ガラス（化合物９、ス
キーム２） 長鎖アルキルアミノ制御孔ガラス（Sigma Chemical
Co.3.5g）を、ジクロロメタン（50ml）に溶解したト
リクロロ酢酸（1.5g）で2.5時間前処理し、ジクロロメ
タン（総量100ml）および無水エーテル（総量100ml）の
アリコートで洗浄し、真空下に乾燥した。次に、CPG支
持体に、無水ピリジン（35ml）、ジメチルアミノピリジ
ン（42mg,344μmol）、トリエチルアミン（280μl,201m
mol）および化合物８（スキーム１を参照のこと）（736
mg,700μmol）を加えた。次に、混合物を合計18時間穏
やかに撹拌し、その後、ビーズをピリジン（７×10m
l）、メタノール（５×15ml）およびクロロホルム（５
×15ml）で多数回洗浄し、次に真空下に乾燥した。 実施例８ CPG支持体に結合した第３アミノ基のメチル化（化合物1
0、スキーム２） 誘導化長鎖アルキルアミノ制御孔ガラス（化合物９、ス
キーム２）（1.01g）に、無水THF（10ml）およびヨード
メタン（0.5ml,8mmol）を加えた。次に、混合物を合計1
8時間穏やかに撹拌し、その後、ビーズを無水THF（５×
10ml）で多数回洗浄し、次に真空下に乾燥した。 実施例９ モノ保護1,3−プロパンジオール誘導体の合成（化合物1
2aおよび12b、スキーム３）−一般的方法 N2雰囲気下で、水素化ナトリウム（油中60％分散物1.
05g,26.3mmol）に、無水THF（10ml）を加え、続いて無
水THF（20ml）に溶解した1,3−プロパンジオール誘導体
（26.3mmol）を滴加した。さらにN2雰囲気下で30分間撹
拌して、灰色析出物の形成により示されるアルコキシド
形成を確実にした。無水THF（20ml）に溶解したtert−
ブチルクロロジフェニルシラン（7.24g,26.3mmol）を滴
加することにより生成したアルコキシドを急冷し、反応
混合物をN2雰囲気下でさらに40分間撹拌した。次に、回
転蒸発によりTHFを除去し、残渣をジクロロメタンと0.1
M炭酸水素ナトリウム溶液との間に分配した。ジクロロ
メタン溶液を分離し、ブライン（×１）で洗浄した。次
に、ジクロロメタン溶液を硫酸マグネシウムで乾燥し、
蒸発させて油状物を得た。この油状物をシリカゲルカラ
ム（16cm×5cm）にかけ、エーテル／石油エーテル40−6
0℃、30％/70％混合物で溶出した。生成物分画を合わ
せ、回転蒸発させて、所望の1,3−プロパンジオール誘
導体を得た。 化合物の個別の詳細は以下のとおりである。 12a １−Ｏ−tert−ブチルジフェニルシリル−1,3−プ
ロパンジオール，白色結晶質固体,RF＝0.21 エーテル
／石油エーテル40−60℃,30％/70％,7.61g,92％,mp.40
→42℃。 IR（KBrディスク）:3400,1448,1112,822,734,702,689,5
06,488cm-1 1 H−NMR（270MHz,CDCl3,δ）:1.06（s,9H,tBu）,1.80
（m,2H,CH2CH2CH2）,2.45（t,1H,OH）,3.84（m,4H,OCH2
CH2CH2O−）,7.40（m,6H,アリール）,7.68（m,4H,アリ
ール）。 12b ２−メチル−１−Ｏ−tert−ブチルジフェニルシ
リル−1,3−プロパンジオール，無色油状物,RF＝0.21
エーテル／石油エーテル40−60℃,30％/70％,6.60g,77
％。 IR（薄膜）:3400,1472,1428,1087,1040,823,740,702cm
-1 1 H−NMR（270MHz,CDCl3,δ）:0.82（d,3H,J＝6.87Hz,CH
3）,1.06（s,9H,tBu）,2.0（m,1H,CH−CH3）,2.68（t,1
H,OH）,3.64（m,4H,CH2CH（CH3）CH2）,7.40（m,6H,ア
リール）,7.68（m,4H,アリール）。 対称1,n−ジオールのモノシリル化の一般的方法につ
いては、P.G.McDougal et al.,JOC,51,3388（1986）
を参照のこと。 実施例10 トレスレート（treslate）誘導体（化合物13aおよび13
b、スキーム３）の合成−一般的方法 無水ジクロロメタン（10ml）に溶解したアルコール誘
導体（4.94mmol）および乾燥トリエチルアミン（0.84m
l,6.03mmol）に、N2雰囲気下で、−15℃から−30℃に冷
却して、無水ジクロロメタン（5ml）中の塩化トレシル
（1g,5.48mmol）を、20−40分間かけて滴加した。N2雰
囲気下で−15℃から−30℃においてさらに30分間撹拌し
て反応を完了させた。次に、反応混合物を分離フラスコ
に移し、氷冷1.0M塩酸（×１）、氷冷水（×１）および
氷冷ブライン（×１）で洗浄した。次に、ジクロロメタ
ン溶液を硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を回転蒸発さ
せて、トレスレートを得た。このトレスレートは、必要
となるまでN2下で−20℃で保存した。 化合物の個別の詳細は以下のとおりである。 13a １−Ｏ−tert−ブチルジフェニルシリル３−Ｏ−
トレシル−1,3−プロパンジオール，白色結晶質固体,1.
74g,77％,mp.34→35℃。他の反応に加えるために、反応
の後処理の前にこの反応混合物3mlを除去した。1 H−NMR（270MHz,CDCl3,δ）:1.06（s,9H,tBu）,1.97
（m,2H,CH2CH2CH2）,3.77（t,2H,J＝5.49Hz,CH2−Ｏ−S
i）,3.84（q,2H,J＝8.79Hz,CF3−CH2−Ｏ）,4.54（t,2
H,J＝6.05Hz,トレシルＯ−CH2）,7.42（m,6H,アリー
ル）,7.64（m,4H,アリール）。 IR（KBrディスク）:1386,1329,1274,1258,1185,1164,11
37,1094,941,763,506cm-1 13b ２−メチル−Ｏ−tert−ブチルジフェニルシリル
−３−Ｏ−トレシル−1,3−プロパンジオール，無色油
状物,2.57g,99％。1 H−NMR（270MHz,CDCl3,δ）:0.97（d,3H,J＝6.87Hz,CH
3）,1.06（s,9H,tBu）,2.10（m,1H,CHCCH3）,3.6（m,2
H,CH2OSi）,3.8（q,2H,J＝8.79Hz,CF3CH2）,4.40（t,2
H,トレシルＯ−CH2）,7.40（m,6H,アリール）,7.64（m,
4H,アリール）。 トレスレートの一般的詳細については、R.K.Crosslan
d et al.,JACS,93,4217（1971）を参照のこと。 実施例11 Ｎ−［アセトキシ−２−オキシエチル］−Ｎ−［Ｏ−
（３（Ｏ−（4,4'−ジメトキシトリチル）−１−オキシ
メチル）−４−ニトロフェニル）−３−オキシプロピ
ル］−Ｎ−２−ヒドロキシエチル］アミン（化合物15、
スキーム４）の合成 無水THF（20ml）に溶解した化合物11（1.72g,1.92mmo
l）に、フッ化テトラブチルアンモニウム（THF中1M溶液
0.55ml,1.92mmol）を加えた。次に、反応混合物を室温
で合計２時間撹拌した。次に、反応混合物を水（50ml）
で希釈し、回転蒸発によりTHFを除去した。次に、水性
溶液をクロロホルム（×１）で抽出した。有機溶液を無
水硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発させてガムを得た。生
成物をシリカゲルクロマトグラフィーで精製し、カラム
を酢酸エチルで溶出した。生成物分画を合わせ、回転蒸
発させて、化合物12を無色ガムとして得た。これは放置
するとゆっくり結晶化した。0.73g,58％,mp.95→97℃,R
F＝0.26 酢酸エチル。1 H−NMR（270MHz,CDCl3,δ）:1.75（brs,1H,OH）,2.0→
2.1（m,5H,O2CCH3＋CH2CH2CH2）,2.70→2.81（m,6H,CH2
N）,3.58（m,2H,CH2OSi）,3.79（s,6H,DMT−OCH3）,4.1
7（m,4H,CH2O）,4.46（s,2H,ArCH2ODMT）,6.83（d,4H,D
MT−アリール）,7.2→7.5（m,10H,アリール）,7.69（s,
1H,アリール）,8.10（d,1H,アリール） IR（KBrディスク）:3459,1738,1608,1577,1506,1444,13
13,1288,1250,1230,1175,1154,1070,1035,984cm-1 実施例12 Ｎ−［Ｏ−（tert−ブチルジフェニルシリル）−２−オ
キシエチル］−Ｎ−［Ｏ−（３（Ｏ−（4,4'−ジメトキ
シトリチル）−１−オキシメチル）−４−ニトロフェニ
ル）−３−オキシプロピル］−Ｎ−［アセトキシ−２−
オキシエチル］アミン（化合物14、スキーム４）の合成 無水ピリジン（10ml）に溶解した化合物６（1.73g,2.
02mmol）に、無水酢酸（0.5ml,4.54mmol）および４−ジ
メチルアミノピリジン（55mg,0.45mmol）を加え、フラ
スコに栓をした。次に、反応混合物を室温で合計16時間
撹拌した。この後、TLC分析（メタノール／酢酸エチル,
5％/95％）は、出発物質の完全な消失および新たなトリ
チル含有スポット,RF＝0.80の形成を示した。回転蒸発
によりピリジンを除去し、最後の痕跡量はトルエン（×
２）との共蒸発により除去した。得られたガムをクロロ
ホルムと水との間に分配した。クロロホルム溶液を分離
し、ブライン（×１）で洗浄した。次に、クロロホルム
溶液を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を回転蒸発
させて、無色ガムを得た。1.94g。この物質は、さらに
精製することなく次の段階で用いるのに十分純粋であっ
た。1 H−NMR（270MHz,CDCl3,δ）:1.04（s,9H,tBu）,1.9
（m,2H,CH2CH2CH2）,2.01（s,3H,−O2CCH3）,2.74（m,6
H,CH2N）,3.7（m,2H,CH2OSi）,3.8（s,6H,DMT−OCH3）,
4.1（m,4,CH2O）,4.63（s,2H,ArCH2ODMT）,6.78（d,1H,
アリール）,6.83（d,4H,DMTアリール）,7.2→7.8（m,20
H,アリール）,8.05（d,2H,アリール）。 実施例13 Ｎ−［アセトキシ−２−オキシエチル］−Ｎ−［Ｏ−
（３（Ｏ−（4,4'−ジメトキシトリチル）−１−オキシ
メチル）−４−ニトロフェニル）−３−オキシプロピ
ル］−Ｎ−［Ｏ−（tert−ブチルジフェニルシリル）−
３−オキソ−６−オキシヘキシル］アミン（化合物16、
スキーム４）の合成 無水アセトニトリル（5ml）に溶解した化合物12（66m
g,0.10mmol）に、炭酸カリウム（55mg,0.4mmol）および
化合物13a（反応混合物1ml,約0.30mmol）を加え、次に
フラスコに塩化カルシウム乾燥チューブで栓をした。次
に、反応混合物を室温で合計22時間撹拌し、その後、炭
酸カリウムを濾別し、回転蒸発により溶媒を除去した。
次に、得られた油状物をシリカゲルカラム（14cm×1c
m）にかけ、生成物をエーテル／石油エーテル40−60℃,
75％/25％混合物で溶出した。純粋生成物分画を合わ
せ、蒸発させて透明ガムを得た。6mg,6％,RF＝0.47 エ
ーテル／石油エーテル40−60℃,80％/20％。1 H−NMR（270MHz,CDCl3,δ）:1.05（s,9H,tBu）,1.8
（m,2H,CH2CHCH2OSi）,1.9（m,5H,O2CCH3＋ArOCH2−）,
2.76−2.92（m,6H,CH2N）,3.51（t,2H,J＝6.6Hz,OCH2CH
2CH2OSi）,3.79（s,6H,DMT−OCH3）,3.85（m,2H,CH2OS
i）,4.12→4.23（m,4H,ArOCH2CH2＋NCH2CH2OCOCH3）,4.
64（s,2H,ArCH2ODMT）,6.84（m,5H,1アリール＋DMT−ア
リール）,7.23→7.50（m,16H,アリール）,7.68（m,4H,
アリール）,8.10（d,1H,J＝9.06Hz,アリール）。 上述と類似の反応条件により、トレスレート13bを用
いて以下の化合物も合成した。 Ｎ−［アセトキシ−２−オキシエチル］−Ｎ−［Ｏ−
（３（Ｏ−（4,4'−ジメトキシトリチル）−１−オキシ
メチル）−４−ニトロフェニル）−３−オキシプロピ
ル］−Ｎ−［Ｏ−（tert−ブチルジフェニルシリル）−
５−メチル−３−オキソ−６−オキシヘキシル］アミ
ン。この化合物は、透明ガムである。RF＝0.53 エーテ
ル／石油エーテル40−60℃,80％/20％。1 H−NMR（270MHz,CDCl3,δ）:0.88（d,3H,CH−CH3）,1.
00（s,9H,tBu）,1.9→2.1（m,6H,O2CCH3＋CH−CH3＋CH2
CH22CH2）,2.7→3.0（m,6H,CH2N）,3.4→3.7（m,4H,CH2
O−）,3.79（s,6H,DMT−OCH3）,4.0→4.4（m,6H,CH2O
−）,4.64（s,2H,ArCH2ODMT）,6.83（m,5H,アリー
ル）、7.2→7.7（m,20H,アリール）,8.01（d,1H,アリー
ル）。 実施例14 固体支持体上でのオリゴヌクレオチドの合成 連結基９および10（スキーム２の化合物９および10）
を有する制御孔ガラスを自動オリゴヌクレオチド合成器
（ABI381A）において用いられるカラム中に装填した。
用いた量は0.2または１μmolスケールの合成用の量であ
る。カラムを自動合成器中に挿入し、次にこれを適当な
サイクル用にプログラムした。２つの異なるタイプのヌ
クレオチド前駆体を用いた:5'ヒドロキシル上にジメト
キシトリチル保護基を有する通常のホスホルアミダイ
ト;5'ホスホルアミダイトおよび3'ヒドロキシル上にジ
メトキシトリチル保護基を有する「逆シントン」。これ
らの支持体上で合成したオリゴヌクレオチドの一覧は表
４に示される。ここでR9およびR10はそれぞれ化合物９
および10に由来するものである。収量は、それぞれのカ
ップリングにおいて放出されたジメトキシトリチル基の
量から監視した。これらの収量は、通常のオリゴヌクレ
オチド合成について用いられるCPG支持体上で得られる
ものに対応した。 実施例15 被検体を無傷のまま残す条件下におけるタグの合成 支持体９上で5'R9T5を合成した後、固体支持体を分割
し、一部をTHF中の5mMフッ化テトラブチルアンモニウム
で室温で10分間処理して、ｔ−ブチルジフェニルシリル
保護基を除去した。両方の試料を29％アンモニアで室温
で一夜処理して、固体支持体から生成物を除去した。真
空下にアンモニアを除去し、固体残渣を水に溶解した。
HPLCは、上首尾にシリル保護基が除去されDMT基が残っ
ていたことを示した。この実施例は、他方をその場に残
す条件下で２つの保護基を除去しうることを示し、さら
に、保護基の除去によりオリゴヌクレオチド鎖が無傷で
残ることを示す。 実施例16 タグを付けた被検体の生化学反応 16a.タグを付けたオリゴヌクレオチドの酵素的リン酸化 5'末端にホスフェート基を有するオリゴヌクレオチド
を得ることは、多くの目的のために有用であろう。その
ような基は、ライゲーション反応においてオリゴヌクレ
オチドを供与体として用いようとする場合に必要であ
り、生化学的特性を試験するために放射性基を導入する
有用な方法である。 3'末端に結合したタグR9およびR10を有するオリゴヌ
クレオチドA5、A10およびT5を、シリル保護基を除去す
るかまたは除去せずに製造した（これは、まだ固体支持
体上にあるオリゴヌクレオチドを、アセトニトリル中の
5mMフッ化テトラブチルアンモニウム溶液で、室温で15
分間処理することにより実施した）。これらのオリゴヌ
クレオチドを、供給元により推奨される標準的なプロト
コールにしたがって、T4ポリヌクレオチドキナーゼおよ
びガンマー33P−ATPを用いてリン酸化した。0.5炭酸水
素アンモニウムで発色させたポリエチレンイミン（PE
I）充満セルロース上の生成物の薄層クロマトグラフィ
ーは、それぞれの場合において、標識されたリンがほぼ
完全にオリゴヌクレオチドに移動したことを示した。 16b.タグを付けたオリゴヌクレオチドの酵素的ライゲー
ション タグを付けたオリゴヌクレオチドのいくつかの応用の
ためには、これらをレセプターにライゲーションするこ
とが有用であろう。我々は、以下の試験により、タグを
付けたオリゴヌクレオチドが酵素的ライゲーションを行
い得ることを示した 。 （１） 5'末端にタグを付けたオリゴヌクレオチド この試験においては、鋳型は であった。これを、放射性リンを用いて5'−末端でリン
酸化した供与体 にハイブリダイズさせた。それぞれ、鋳型中の５つのＡ
の並びにハイブリダイズさせた後に供与体の5'リン酸化
末端にライゲーションしうる配列T5の修飾を用いて、４
つのライゲーション反応を実施した。反応において用い
られた４つのオリゴＴは、その5'−末端の性質において
異なっていた。１つはヒドロキシルを介して結合したジ
メトキシトリチル基を有していた。第２および第３のも
のは、ホスホジエステル結合を介して5'−末端に結合し
たタグR9およびR10を有していた。第４のものは、正常
な5'OHを有する正の対照であった。負の対照は、オリゴ
Ｔを欠失したものであった。ライゲーション反応は、T4
リガーゼを用いて、供給元の指示にしたがって実施し
た。反応は、0.75M炭酸水素アンモニウム溶液で発色さ
せたPEI−セルロース上のTLCにより分析した。４つのす
べての反応は、クロマトグラム上に、供与体より移動度
の低い追加のスポットを示した。予期されたように、負
の対照は追加のスポットを示さなかった。このことは、
異なるタグを有するオリゴヌクレオチドがいかに配列特
異的ライゲーション反応に関与しうるかを示す。 Cozzarelliら（1967）は、相補的鋳型の存在下におい
て、固体支持体に結合したポリヌクレオチドを受容体に
ライゲーションしうることを示した。 実施例17 タグを付けたオリゴヌクレオチドの、固定支持体に繋げ
られたオリゴヌクレオチドに対するハイブリダイゼーシ
ョン 実施例16bは、タグを付けたオリゴヌクレオチドがラ
イゲーション反応に関与しうることを示す。ライゲーシ
ョンはデュープレックス形成工程に依存するため、この
ことは、これらのオリゴヌクレオチドが溶液中における
デュープレックス形成にも関与しうることを意味する。
以下の実験は、これらが固体支持体に繋げられたオリゴ
ヌクレオチドともデュープレックスを形成しうることを
示す。製造元の指示にしたがって、アミン化されたポリ
プロピレンのシートの表面上でT10を合成した。このプ
ロセスは1mm2あたり約10pmolのオリゴヌクレオチドを生
成することが知られている。3.5M塩化テトラメチルアン
モニウム中の、5'末端において33Pで標識され、かつ3'
においてR10でタグを付けたA10の溶液（１μｌあたり65
pmol）を誘導化ポリプロピレンの表面上に置き、４℃で
一夜放置した。ハイブリダイゼーション溶媒中で洗浄し
た後、約1/3のプローブが繋がれたオリゴ−dTにハイブ
リダイズしたことが観察された。これは、ハイブリダイ
ゼーションの理論的限界に近く、タグを付けたオリゴヌ
クレオチドが高い効率でハイブリダイゼーション反応に
関与しうることが示された。 実施例18 タグの光分解 光分解によりタグを除去する可能性は、これらの有用
性を非常に増強する。これは、質量分析器においてレー
ザー脱離による直接分析を可能にする。これは、タグの
簡単な除去方法を提供し、他の生化学的または化学的プ
ロセスを可能とするであろう。 18a.バルク光分解 ニトロベンジル基は、305nmの照射に対して反応活性
であることが知られている。R10A10およびR10T5の水溶
液を、核酸に検出可能な損傷を与えないことが知られて
いる条件下で、トランスイルミネータから2cmの距離で2
0分間照射した。HPLCによる分析は、予期された光分解
生成物を示し、元の化合物の残渣は検出できなかった。 18b.質量分析器におけるレーザー誘導光分解 R10T5およびT5R10の試料を、追加のマトリックスを有
しない飛行時間質量分析器（Finnigan Lasermat）の金
属標的の上に置いた。スペクトルは、ポジティブモード
で他の試料中には存在しない質量約243の単一の飽和ピ
ークを示した。 実施例19 異なる被検体に結合した異なるタグの質量分析法による
同定 3'末端へのタグとして結合したジメトキシトリチル基
を有する一連の５つのチミジン残基を、慣用的な固相法
により、但し「逆シントン」を用いて合成した。質量分
析器において、この化合物は、ポジティブイオンモード
で質量304に大きな区別しうるピークを与えた。これに
対し、上記にR10と称されるタグを有する一連の10個の
アデノシン残基は、ポジティブイオンモードで質量243
に大きな区別しうるピークを与えた。いずれの場合にお
いても、レーザー脱離は、マトリックスの不在下におい
て実施した。いずれの場合においても、タグを有しない
オリゴヌクレオチドのピークは存在しなかった。これら
の実施例は、質量分析のトレース中の、被検体の合成の
間に取り込まれたタグに由来するピークの存在から被検
体配列を同定することは容易に可能であること、および
特有のタグはこれらの異なる質量により容易に同定しう
ることを示す。 図面の説明 図1.特定のタグを有する分子の合成の一般的スキーム 合成は、被検体合成用の基を付加するための少なくと
も１つの部位およびタグの合成用の部位を有する連結基
（Ｌ）から開始する。（連結基はまた、合成の間、固体
支持体に可逆的に結合させることもでき、また、分析に
おいて補助となる荷電基等の基を生成するための部位を
有していてもよい）。PaおよびPrはそれぞれ、被検体前
駆体およびレポーターの一時的保護基である。これら
は、異なる処理により除去することができる。例えば、
Paは酸または塩基に対して反応活性な基、例えばトリチ
ル、Ｆ−MOCまたはｔ−BOCであり、Prはフッ化物で処理
することにより除去可能な基、例えばシリル残基であ
る。基Ｕ−Ｚは保護基を有していてもよいが、これらは
PaおよびPrを除去するために用いられる試薬に対して安
定でなければならない。カップリング化学は、異なるタ
イプの被検体について異なるであろう。オリゴヌクレオ
チドおよびペプチド合成については標準的方法を用いる
ことができる。 図２には３つの異なるタイプのタグが示されている。
第１のスキームについては、タグのそれぞれの伸長は、
被検体に加えられる残基の位置およびタイプの両方に特
異的なレポーターを用いて実施する。このスキームでは
カップリングは重要ではない。 第２および第３のスキームにおいては、位置は、残基
を被検体に加えるときの合成の段階で達成されるレポー
ターの総質量により規定される。この場合、分子の部分
をキャップすることによりタグの伸長の一部を終結させ
ることが重要である。第２および第３のスキームは、レ
ポーターを加える方法において互いに異なる。第２のス
キームにおいては、レポーターは伸長剤の中にあり、第
３のスキームにおいてはレポーターはキャップ中にあ
る。 図2.3つのタイプの分子特異的タグ Ａは、被検体（Ｕ−Ｚ）中の基の位置（下つき）およ
び同一性（上つき）の両方を特定するレポーター（Ｅ）
から作成されたタグを示す。このような組は、位置を特
定するために、増加する式量の一連の脂肪鎖を含み得
る。例えば、１位にメチレン、２位にエチレン、３位に
プロピレン等。これらは、炭素および水素の異なる同位
体組成により基特異的タイプに区別を生じさせることが
できる。例えば、上述の表１に示されるように、CH2に
は６個の異なる同位体組成がある。これらのうち４個は
１質量単位ずつ異なり、質量分析法によって容易に区別
することができる。差異標識の別の方法を考察すること
もできる。例えば、位置または基を異なる電荷を有する
レポーター基で印づけすることができる。このような基
は、質量分析法を含む多くの方法により分離し認識する
ことができる。 Ｂは、例えば被検体の任意の構造を一連のタグに結合
させるような部分合成により作成されたタグを示す。こ
のシリーズの第１のものは、被検体の第１の基に特異的
なレポーター基を有し、第２のものは、第１のレポータ
ー基および、被検体の第２の基に特異的なレポーター基
を有し、そしてその他も同様である。このようなシリー
ズは、タグを伸長するために２種類の前駆体を用いるこ
とにより容易に作成することができる。１つは、可逆的
保護基により保護されたものであり、１つはそれ以上の
伸長を回避するものである。例えば、RXとＰ−（CH2）n
X（ここでＲは、メチルまたはエチル等の非反応性脂肪
族基であり、Ｐは可逆性保護基であり、ＸはＰにより保
護された基と反応しうる活性化残基である）との混合物
である。非反応性脂肪族基により「キャップ」された分
子は、次回の脱保護および伸長には関与しないであろ
う。 Ｂにおいては、基特異的情報は、合成を伸長させるた
めに用いられる残基に含まれる。Ａと同様に、情報は質
量同位体を用いて与えられることができる。例えば、Ｃ
およびＨの同位体で標識したCH2残基をＰ−（CH2）nXに
付加するたびに、レポーターに異なる質量を与え得る追
加の部位が付加される。（CH2）ｎの質量は14nから17n
の範囲にわたり、この範囲には４＋３（ｎ−１）個の異
なる質量がある。したがって、エチレン基については、
28から34の範囲に７個の区別しうる質量があり、プロピ
レン基については、42から51の範囲に10個の区別しうる
質量がある。 Ｃは、いかにして基特異的情報を異なる方法で付加し
うるかを示す。この場合、これは鎖停止剤、すなわち例
Ｂにおける「キャップ」中に含まれている。ここでもま
た、脂肪族残基を認識することにより異なる質量を与え
ることができる。位置情報は、停止剤が付加された伸長
の長さにより与えられる。例えば、Ｅが（CH2）２−Ｏ
の場合、鎖停止剤は同位体により標識された式量15から
19のメチル基である。それぞれの伸長は、レポーターに
44質量単位を付加するであろう。最も短いレポーターの
質量範囲は、44＋15＝59 から 44＋19＝63 の範囲で
ある。第２の位置の範囲は、88＋15＝103 から 88＋1
9＝107の範囲である。他のものも同様であり、第６の位
置の範囲は、284＋15＝299 から 284＋19＝303 であ
る。この範囲には重複はなく、停止剤および追加の原子
による伸長を用いることにより、レポーターの数および
範囲を拡張しうることがわかる。 参考文献： 1. Brenner,S.and Lerner,R.A.（1992）.Encoded comb
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標識された被検体分子の使用は日常のことである。本発
明は一つまたはそれ以上のレーポーター基に連結された
少なくとも二つの被検基を持つ試薬を提供する考えを提
出している。以下に記載する方法においてそのような試
薬は、一つのもので標識された被検体よりもはるかに多
くの分析的情報を発生させるために使用できる。多被検
基および多レポーター基を運ぶ試薬が一緒に合成でき、
同時に使用できかつレポーター分子が分析段階で分解で
きるようにレポーター基を設計することは可能である。 WO93/06121（Affymax）は多数の異なるメンバーを含
む合成オリゴマーライブラリーを記載しており、各々の
メンバーはオリゴマー中のモノマーの配列を同定する一
つまたはそれ以上の同定タグに連結されたモノマーの配
列からなるオリゴマーを含んでいる。オリゴマーと同定
タグ間の結合は好適には固形粒子を含む。同定タグは好
適にはオリゴヌクレオチドである。 本発明の一つの態様では ａ） 少なくとも二つの被検基を含み、およびｂ）に連
結された被検部分、 ｂ） 質量分析法による検出に適応した一つまたはそれ
以上のレポーター基を含むタグ部分 を含む試薬が提供され、 ここでレポーター基は被検残基を示し、かつタグ部分の
各々の位置のレポーター基は被検部分の決められた位置
の被検残基を示すように選択される。 好適には被検部分は切断可能な（例えば、光切断可能
な）結合でタグ部分に連結されている。被検部分および
タグ部分が両方結合される連結基が提供されるであろ
う。好適には、被検部分はｎ個の被検残基の鎖であり、
およびタグ部分はｎ個までのレポーター基の鎖であり、
タグ鎖の各々の位置のレポーター基は被検鎖の対応する
位置の被検残基を示すように選択される。ｎは２以上の
整数であり、好適には３から20である。 本発明は興味あるすべての被検体の検出に使用される
であろう。これらには蛋白質／ペプチド鎖、したがって
被検残基はアミノ酸残基；核酸／オリゴヌクレオチド
鎖、したがって被検残基はヌクレオチド残基；炭化水素
鎖、したがって被検残基は糖残基；が含まれるが、これ
らに制限されるわけではない。さらに、被検体は生物学
的、薬学的または治療的活性を持つ小さな分子の類でも
よい。例えば、質量分析タグと組合わさった様式で種々
の置換基（例えば、アルキル、エステル、アミン、エー
テルなど）を変化させる能力を持つコア分子であっても
よい。 タグ部分および／またはその中の各々のレポーター基
は被検部分および／またはその中の被検残基の性質につ
いての情報を提供するように観察可能／検出可能／分析
可能である。 一つの実施態様において、試薬は式Ａ−Ｌ−Ｒを持っ
ており、式中Ａは被検部分を構成するｎ個の被検残基の
鎖であり、およびＬは連結基であり、Ｒはタグ部分を構
成するｎ個までのレポーター基の鎖であり、ｎは２−20
であり、ここでタグ部分は被検部分の被検残基の位置を
規定する情報を含んでいる。 タグ部分は質量により区別可能な一つまたはそれ以上
のレポーター基から成っており、従って質量分析法によ
り分析可能である。レポーター基は化学的に異なってい
てもよく、従ってお互いに分子量により区別される。ま
たは、レポーター基は化学的には同じであるがお互いに
異なった同位元素（例えば、以下に説明されるように12
C/13Cおよび1H/2H）を含むことにより区別されてもよ
い。タグ部分（および／またはレポーター基）は、例え
ば光化学的にまたは他の手段で試薬から切断された後、
質量分析法による分析に適しまたは適応している。 検出系としての質量分析法の利点は：その高い感度−
良好な信号を与えるのに数百の分子しか必要とされな
い；その広いダイナミックレンジおよび高い分解能−10
0から200,000ダルトンの質量範囲の分子が0.01より小さ
い分解能で分析できる；その融通性−多くの異なった化
学構造の分子が容易に分析される；質量分析法と例えば
走査レーザー脱離法を組み合わせることによる画像分析
の可能性；単に定性的測定ではなく定量的測定ができる
能力がある。 質量標識は放射能および蛍光の利点をあわせたもので
あり、新規の応用を示唆するさらなる特質を持ってい
る。 別の態様において、本発明は上記試薬のライブラリー
を提供し、ここでライブラリーは各々ｎ個の被検残基の
異なった被検部分を含む多数の試薬から構成されてい
る。例えば、ライブラリーは各々ｎ個のヌクレオチド残
基の異なったオリゴヌクレオチドの鎖を含む4nの試薬か
ら成っているであろう。ライブラリーの試薬は溶液中に
一緒に混合されて存在するであろう。 別の態様において、本発明は：標的物質を用意し；少
なくとも一つの試薬の標的物質への結合が生じる条件下
で標的物質と前記試薬のライブラリーをインキュベート
し；非結合試薬を除去し；各々の結合試薬のタグ部分を
回収し；標的物質へ結合された被検部分の性質の指標と
して回収されたタグ部分を分析する、の各工程を含むア
ッセイ法を提供する。 標的物質は、非結合試薬から結合試薬を分離するのに
都合のよい手段を提供するために固定化されているであ
ろう。一つの態様では、標的物質は微生物または組織ま
たは細胞の集団であり、本アッセイは候補薬剤の一群を
スクリーニングするために実施されるであろう。別の態
様において標的物質は核酸であり、この態様は以下に非
常に詳細に説明される。 付随する図を参照されたい： −図１は本発明による試薬合成のための一般的スキーム
である。 −図２はレポーター基を含んでいるタグ鎖の３つの異な
ったシステムを持つ試薬を示している。 −図3aはコードされたオリゴヌクレオチドの合成を示し
ている図であり、および −図3bはタグ鎖のコードの読みとりを示している図であ
る。 −図４は累進的ライゲーションによる配列分析を示して
いる図である。 −図５はオリゴヌクレオチドアッセイでのハイブリッド
形成により読みとられた配列の伸長を示す図である。 図１および２の説明は本明細書の最後に含まれてい
る。 以下の応用の実施例を参照すると、本方法が如何に核
酸配列の分析および候補薬剤のスクリーニングに応用さ
れるかが説明されている。 コードされたタグの合成 同時に多被検体にタグを付けるために使用された方法
の原理は、結合された核酸配列でペプチドをコードする
ためにBrennerおよびLerner（1992）により提案された
ものと同様である。彼らの考えの概念は、ポリメラーゼ
連鎖反応により増幅されおよび産生されたDNA分子の配
列決定により読みとられることができるタグを付加する
ことである。 試薬の構造は如何にしてそれらを作製しうるかを考え
ることにより最もよく示される。一つの方向に被検体へ
残基を付加し、別の方向に残基特異性レポーター基を付
加して段階的に伸長できる二価または多価連結基から合
成が始まる（図１）。もし有機化合物の混合物を作りた
いならば、合成の各々の段階で異なった残基が導入され
る。例えば、混合物は異なったアミノ酸配列を持つペプ
チドまたは異なった塩基配列を持つオリゴヌクレオチ
ド、またはコア構造に結合された異なった基を持つ医薬
活性を持つ可能性のある変異体の組を含むことができ
る；各々の場合において各々の構造変異体を独特のタグ
で標識することが望まれる。このことは異なった残基が
問題とする化合物に加えられる各々の工程において合成
物を分割し、対応する残基をタグに加えることにより達
成される。 例として、各々が独特のタグを持つ4096のヘキサヌク
レオチドの混合物を作りたいと仮定する。二価連結基の
四つの試料が各々の塩基および塩基に対して独特のレポ
ーターと結合されるであろう（図3a）。四つの試料は次
に混合され、四つに分割され、この過程を再度繰り返
す。結果は各々独特のタグを持つジヌクレオチドの組で
ある。この過程を６回の結合工程が完了するまで繰り返
す。 連結基およびレポーター基 連結基は被検体合成と合致する一つの基を持たなけれ
ばならない−ヒドロキシ、アミノまたはスルフヒドリル
基はすべてオリゴヌクレオチド合成の開始に適してお
り、例えばポリペプチド合成などの他の経路の開始には
類似の基を見いだすことができる。ある種の化合物に対
しては、被検体の一部を形成する“コア”化合物から出
発するのが望ましいであろう。レポーターの付加を開始
するための基の選択はレポーター基の性質およびそれら
の結合に使用される化学に依存している。この化学は被
検体の合成に使用される化学と合致されていなければな
らない。オリゴヌクレオチド合成の例では、多くの変法
が存在する。確立された方法は塩基を保護するためにベ
ンゾイルおよびイソプロピル基、カップリング間の5'−
OH基の一時的保護に酸に反応活性なトリチル基、および
リン酸を保護するのにβ−シアノエチル基を使用してい
る。レポーターのカップリングのために使用される方法
はこれらの保護基またはオリゴヌクレオチドのその他の
結合を攻撃してはならず、タグの合成はオリゴヌクレオ
チドの伸長に使用されるカップリング、酸化および脱保
護により影響されるべきではない。 被検体はレポーター構造の組合わさった組へ結合され
るので、レポーターモノマーのカップリングまたは鎖の
キャッピングは各々の工程で不完全であろう（図２、Ｂ
およびＣ）。このことはタグの組成からの被検体の構造
の演繹をより簡単にするであろう（図1;図３）。合成を
より容易にするため、連結基は被検体またはレポーター
基の分解を起こさずに切断できる結合により固形支持体
へ結合されているのが望ましい。もしくは、連結基は試
薬からの中間体および最終生成物の分離を可能にするよ
うな荷電基または親油性基のような基を持っているであ
ろう。 レポーター基は多くの形をとることができるが、質量
分析法によりタグの組成または配列が読み取れるという
要求を主として考慮する。可能性としては、異なった長
さまたは異なった同位元素組成の脂肪族鎖のような異な
った原子または式量の基が挙げられる。同位元素で標識
したメチレン基を用いて、独特の式量の基を四つの異な
ったレポーターの各々に帰属させることが可能である
（表１）。 表１ 水素および炭素の同位元素に基づいたレポーターの例： 同位体組成 式量（−OCH2） 記号 塩基 12CH2 30 γ30 Ａ 12CHD、13CH2 31 γ31 Ｃ 12CD2、13CHD 32 γ32 Ｇ 13CD2 33 γ33 Ｔ オリゴヌクレオチドを例にすると、これらのタグはそ
のシリーズの部分生成物の質量の増加からオリゴヌクレ
オチド中の各々の位置の塩基を読み取ることを可能にす
るセットを作ることができる（表２）。レポーターを加
えることによる最も少ない増加分が最も小さいレポータ
ーと最も大きいレポーターの間の質量相違より大きいな
らば、すべてのオリゴヌクレオチド配列は一連の独特の
タグ断片質量を与えるであろう。 質量分析のためには、被検体からタグ鎖を切断する簡
単な方法があることが望まれるであろう。いくつかの可
能性が存在する。オリゴヌクレオチドおよびペプチド被
検体に合致する方法には：光反応活性連結の光誘導切
断；酵素切断、例えばエステル連結；フリーラジカル誘
導切断がある。 さらに要求されることは、タグは分析に使用される化
学的および生化学的過程に合致可能でなければならない
ことであり：分子ハイブリッド形成に使用されるオリゴ
ヌクレオチドの例または提案された配列決定法の一つに
ついては、それらは溶解可能でなければならず、および
分析で使用されるであろうある種の酵素反応を阻害して
はならない。表１に示されたメチレン類似体と同様なオ
リゴエチレングリコール結合がオリゴヌクレオチドの分
子再会合に合致することが経験から示された。さらに、
そのような結合は、ヘキサエチレングリコール連結基を
通してガラスにつながれたオリゴヌクレオチドがポリヌ
クレオチドキナーゼおよびATP処理により5'−ホスホモ
ノエステルへ変換できることを示したように、少なくと
もいくつかの酵素反応と合致している。 連結基の望まれる性質 考えられる応用のために、連結基分子は以下の性質を
持っていることが望まれる： 中間体の煩わしい精製を必要とせずに、被検体および
対応するタグを産生する合成サイクルを進行させること
を可能にするため、連結基は固形支持体に連結可能でな
ければならない。合成サイクルに続いて、連結基は被検
体およびタグが無傷のまま残される条件下で固形支持体
から除去可能でなければならない。タグ合成のための官
能基は、質量分析によりお互いに区別可能であるタグの
容易な合成を可能にするようなものでなければならな
い。 連結基は、被検体およびタグの別々の伸長を、その一
つための化学が他方の化学を妨害しない条件下で可能に
するような保護された官能基を持っていなければならな
い。 連結基は好適には質量分析をマトリックス非存在下で
実施できるように荷電された基を持っていなければなら
ない。さらにこの目的のために、タグは電気噴霧のよう
な複雑な技術によらずに質量分析器内で十分に蒸発する
ように揮発性である化合物を含むことが望まれる。タグ
は安定なイオンかまたは対応する被検体の同定に使用で
きる特徴的なパターンに断片化するイオンを生じるべき
である。 タグをレーザー照射により質量分析器内で直接切断で
きるように、タグと被検体の間の結合は好適には光で切
断可能でなければならず、ライゲーションなどのような
生化学的工程を可能にするように完全に除去するための
更なる切断はランプに暴露することにより都合良く実施
できる。 連結された生成物は好適には、生化学的反応に使用で
きるように水性溶媒に可溶でなければならない。 ここに記載された実施例はこれらの望まれる性質を持
つ連結基を示している。 光切断可能基 光切断可能基は既知の光反応活性ｏ−ニトロベンジル
基に基づいてきた。この基はオリゴヌクレオチド合成に
おいてリン酸基および2'ヒドロキシ基の両方の保護基と
して使用されてきた［Pillai Synthesis １（1980）
の総説を参照されたい］。それ自身ではｏ−ニトロベン
ジル基は、タグおよび被検体間の連結器の続いての結合
のための更なる官能化が欠けている。商業的に入手可能
なものは化合物５−ヒドロキシ−２−ニトロベンジルア
ルコールである。光反応活性性を有意に減少させること
なく５、４位にOMe基を付加させることができることが
知られている（Pillai総説参照）。従って、５−ヒドロ
キシ−２−ニトロベンジルアルコールがベンジルアルコ
ールからのDNA合成の伸長を目的とする出発点として、
および５−ヒドロキシ基でのエーテルカップリングから
タグへの連結基鎖として使用された。 存在すべき官能基に必要とされることは被検体とタグ
の組合わさった合成を可能にすることである。従って、
光切断可能な基からタグ合成のために必要とされる官能
基への連結基の腕が必要とされる。組み合わせ合成が固
形支持体上で実施されることもまた一層高く評価され
る。このように、連結基の腕は官能基が二価でなければ
ならず、選択的な合成的変換を可能にするため直交する
保護旗を持っている。好適なタグ試薬はグリコール結合
／エーテル結合を含んでいる。合成のため、オリゴヌク
レオチドは通常3'ヒドロキシおよびコハク酸エステル結
合を通して長鎖アミノCPG支持体に結合されている。こ
のように、必要とされる官能基はアルコールであるべき
と思われた。 下記の中間体化合物が合成された。 この中間体は： −被検体合成のためのメトキシトリチル基（−CH2ODM
T）； −光切断のためのｏ−ニトロ基； −タグ合成のためのｏ−ｔ−ブチルジフェニルシリル基
（OTBDPS）； −質量分析法による分析のために正に荷電した基への転
換のための三級アミン基； −および支持体への結合のためのＮ−ヒドロキシスクシ
ンイミジル基を 持つ芳香族連結基を含んでいる。 被検体がペプチドである場合、条件の少しの変更しか
考えなくて良い。２−ニトロベンジル基はペプチド合成
のほとんどの条件下で安定であり、それおよび関連する
類似体はペプチド合成においてすでに光反応活性基とし
て使用されている（Pillaiの総説およびそこに含まれて
いる文献を参照されたい）。異なった切断様式によるペ
プチド合成に適したいくつかの樹脂が存在する。被検体
およびタグ合成のための直交保護基はｔ−ブトキシカル
ボニルおよび２−メトキシエトキシメチルに基づいてい
るであろう。ｔ−ブトキシカルボニル基はトリフルオロ
酢酸処理により影響される切断からアミノ酸のアミノ基
を保護するために使用される。２−メトキシエトキシメ
チルはタグ形成基および上記のような１の質量相違のｎ
アルキルジオール誘導体に基づいたタグの保護に使用さ
れるであろう。ｔ−ブトキシカルボニル基の切断は２−
メトキシエトキシメチル保護基と合致することが示され
ている。２−メトキシエトキシメチル保護基はジクロロ
メタン中、臭化亜鉛により選択的に切断できる。本方法
を上に例示してきたが、当業者は直交保護基のこの組は
代表的な例として出されたものであり、それによって制
限されるわけではないことを認識するであろう。 レポーターの検出および分析 光切断は被検体からのタグの放出に好ましい方法であ
る；迅速であり、乾燥状態で実施でき、および非常に小
さい規模での画像化に走査型レーザーが使用でき、すな
わち細胞内の様相を画像化するのに十分に小さいので
（de Vriesら、1992）、提案された方法は細胞の表面
または内部または組織切片中の異なった細胞の“染色”
に使用された特異的被検体（例えば候補薬剤などのよう
なリガンドとそれらの受容体間の相互佐用の画像化に必
要とされるであろうもの）の位置を検出するのに使用で
きる。 光感受性保護基は非常に広い範囲の光学残基に利用可
能であろう（Pillaiの総説、1980）。広い範囲の化合物
に対して保護基として使用できる光反応活性ｏ−ニトロ
ベンジル基は考えられる多くの被検体（中でもペプチド
およびオリゴヌクレオチド）のための連結基の理想的出
発物質である。オリゴヌクレオチドを例にとると、定量
的に分解できてヒドロキシ基を与える光感受性連結基が
提供される。これは以下の配列決定法に記載されるよう
に脱保護オリゴヌクレオチドのライゲーション伸長を起
こすことを可能にするであろう。さらに、この基はオリ
ゴヌクレオチド合成の間は安定であることが知られてい
る。タグ合成を開始するために使用できる基を与えるた
めにベンジル環を修飾する必要があろう；上記のオリゴ
エチレングリコール系列のようなレポーターはｏ−ニト
ロベンゾイル基の光化学切断反応を妨害しない（Pillai
前掲文献中に）。切断を促進する他の基を芳香環に加え
ることができる；そのような基は質量分析計での分析を
簡単にするための荷電基の付加に利用できるであろう。
現在の質量分析計は100分の１ダルトンより高い分離能
で、全質量200kDまでを数百分子で測定できる。好適な
光反応活性連結基は以下のように表現できるであろう；
正に荷電した基Ｒは芳香環に直接結合されているか、ま
たは連結基の腕の一つに存在してもよい。 計測 提案された分子タグは質量分析法のいくつかの型の一
つで分析されるであろう。被検体からタグを切断するの
が望ましいであろうが、多くの目的にはタグを断片化す
る必要はないであろうし、そのことは曖昧さのもとにな
るので実際には望まれないであろう。質量分析計の最近
の進歩は多くの断片化をしくなくても非常に大きな分子
の測定が可能であり；および残りのタグが安定な条件下
で容易に切断できるように連結基を設計することが可能
であるので、測定の間のタグ断片化は避けられるべきで
ある。ほとんどの場合、被検基はタグより揮発性が低い
であろうし、および多くの応用では固形基質に結合され
ているであろうので質量分析法を妨害しない。 上に例示した連結基はほとんど大多数の共有結合の切
断を起こさない条件下、光子照射に対して非常に反応活
性である。適した装置はすでに記載されている（de Vr
iesら、1992）。これは１μｍより小さな点に焦点を合
わすことができるレーザーを使用している。250mmまで
の画像が台を0.1μｍ間隔で動かしてスキャンできる。 この装置はまた脱離レーザーにより持ち上げられた化
学種と相互作用させるように台の表面を横切ってイオン
化レーザーを放つことにより測定されるべき標本のイオ
ン化が可能である。このことは、もしタグ中に荷電残基
を含ませることが不可能であったならば、またはタグの
読みとりに断片化が望まれるならば本方法に有用であり
うる。 別の態様において、本発明は標的核酸の配列決定法を
提供し、その方法は以下の工程を含んでいる： ａ） 支持体上に固定化されたオリゴヌクレオチドを提
供し、 ｂ） 標的核酸と固定化オリゴヌクレオチドをハイブリ
ダイズさせ、 ｃ） ライブラリーの第一の試薬のオリゴヌクレオチド
鎖を固定化オリゴヌクレオチドに隣接する標的核酸にハ
イブリダイズするようにｂ）からのハイブリッドと、定
義したように試薬が溶液中に一緒に混合されているライ
ブラリーをインキュベートし、 ｄ） 隣接するオリゴヌクレオチドをライゲーション
し、このようにライゲーションされた第一の試薬を形成
させ、 ｅ） 他の非結合試薬を除去し、および ｆ） 標的核酸の最初の部分の配列を示すものとして、
ライゲーションされた第一の試薬のタグ部分を回収し分
析する。 応用例 核酸分析においてコードされたオリゴヌクレオチドが
使用できる方法を参照することにより応用の可能性を例
示する。 1.累進的ライゲーションによる核酸配列の決定。（図
４） 決定されるべき配列は最初に工程ｂ）で固形支持体に
結合されたオリゴヌクレオチドとハイブリダイズされ
る。もし配列決定されるべきDNAがバクテリオファージM
13のような一本鎖ベクターにクローン化されていたら、
固形支持体上の“プライマー”オリゴヌクレオチドはベ
クター配列の一部であるように選ぶことができる。工程
ｃ）において、工程ｂ）からのハイブリッドを運ぶ固形
支持体をコードされたオリゴヌクレオチド試薬の溶液と
インキュベートする（例えば、与えられた長さのすべて
の配列、4096のヘキサヌクレオチド（一般には4nのｎ−
mer）の前記のライブラリーと）。工程ｄ）において、
標的DNAの最初の六つの塩基と相補的なヘキサヌクレオ
チドが固定化プライマーオリゴヌクレオチドに連結され
るようにリガーゼが導入される。この工程によりライブ
ラリーからの第１のコードされたオリゴヌクレオチド試
薬が、そのオリゴヌクレオチド鎖の固定化プライマーオ
リゴヌクレオチドへのライゲーションにより連結され、
ここではライゲーションされた第一の試薬と称される。 工程ｅ）において、例えば洗浄によりライゲーション
されていない試薬が除去される。工程ｆ）において、ラ
イゲーションされた第一の試薬の連結基がタグ鎖を離す
ために破壊され、タグ鎖は回収されて標的DNAの第１の
部分の配列の指標として分析される。 好適には、連結基の除去はまた第１のオリゴヌクレオ
チド鎖の末端のヒドロキシまたはリン酸基を露出させ、
第二の試薬のオリゴヌクレオチド鎖との結合に利用可能
にする。光化学的および酵素的および化学的加水分解を
含む連結基分解のためのいくつかの方法はさらなる結合
のために必要とされる3'−ヒドロキシルまたは5'−リン
酸基の発生に使用できる。次に工程ｃ）、ｄ）、ｅ）お
よびｆ）を繰り返す。これらの工程にはライブラリーか
ら第二の試薬のハイブリッド形成、ライゲーション、ラ
イゲーションされた第二の試薬のタグの回収および分
析、およびさらなるライゲーションのために必要とされ
る別の3'−ヒドロキシルまたは5'−リン酸基の発生を含
んでいる。この過程は全DNA配列が読み取られるまで、
または反応の収率が非常に低くなって有効でなくなるま
で繰り返すことができる。 この系列の四つの段階は図式的に図４に示されてい
る。最初の図は一回目の工程ｅ）の最後の状態に対応し
ている。第二の図は工程ｆ）の最後の状態に対応してい
る。第三の図は二回目の工程ｅ）の最後の状態に対応し
ている。第四の図は二回目の工程ｄ）の最後の状態に対
応している。本技術の循環的性質が示されている。 2.連続的ライゲーションによる多数の鋳型の核酸配列決
定 第一の例を拡大して、多くの配列が同時に分析できる
であろうことが考えられる。例えば、配列決定されるべ
きDNAの個々のクローンが固定化できるであろう： ａ） 各々の末端に固定化された同一のベクターオリゴ
ヌクレオチドを持つ針のアレイが使用できる。標的DNA
の個々のクローンを各々の個々の針に固定化されたオリ
ゴヌクレオチドへハイブリダイズさせる。次にこれらの
ハイブリッドを運ぶ針のアレイはコードされたオリゴヌ
クレオチド試薬のライブラリー溶液（ライゲーションの
ための成分も含んでいる）とインキュベートする。この
工程の結果、各々の針は異なったライゲーションされた
試薬を運んでいる。最後に、前記のように各々のライゲ
ーションされた試薬のタグ鎖を回収し分析する。もしア
レイの針が適切に配置されていたら、それらはマイクロ
タイタープレートのウェル内へ浸してもよく、第一のプ
レートは配列決定されるべき鋳型を含んでおり、第二の
プレートは試薬のライブラリーおよびライゲーション溶
液、および第三のプレートは針からタグ鎖を切断するた
めの試薬を含んでいる。 ｂ） もしくは、表面がプライマーオリゴヌクレオチド
で被覆されていてもよく、好適にはその5'末端またはさ
もなくばいくつかの他の場所を通して共有結合で結合さ
れている。配列決定されるべきDNAの個々のクローンを
被覆された支持体上の離れた位置へスポットし、標的DN
Aの各々の個々のクローンが支持体上の個々の離れた位
置で固定化されたオリゴヌクレオチドへハイブリダイズ
するようにする。支持体は次に試薬のライブラリーおよ
びライゲーションのための成分を含んだ溶液とインキュ
ベートする。非結合試薬を除去する。続いて各々離れた
位置のライゲーションされた試薬の連結基を切断し、タ
グを回収し分析する。切断は表面の小さな領域に向ける
ことができるレーザー脱離のような方法により好適に達
成される。この方法の利点は非常に多数のDNA配列が一
緒に分析できることである。 3.オリゴヌクレオチドへのハイブリッド形成による配列
決定のための伸長法 ａ）型Ｉ 膜上に高濃度でDNAをスポッティングする方法はよく
確立されている（Hoheiselら、1992;Rossら、1992）。
フィンガープリンティングおよび配列決定のためには、
ハイブリッド形成パターンが解釈するには複雑すぎない
ようにオリゴヌクレオチドは単一でまたは小さな組で適
用されなければならない；その結果、分析の各々の回で
は鋳型の少しの比率しか信号を与えない。各々のハイブ
リッド形成からの信号が配列の決定を可能にするコード
情報を含んでいたら、より複雑な混合物が使用できハイ
ブリッド形成の各々の回でより多い情報が集められる。
混合物の複雑さはDNA鋳型の長さおよび混合されたオリ
ゴヌクレオチド中の配列を分割する分析法の能力に依存
しているであろう。 これらの質量分析法タグまたはレポーター基でコード
された核酸プローブは多プローブの使用が便利である場
合（例えば、DNAフィンガープリンティングまたは突然
変異分析）に非常に有用であろう。質量分析法タグは多
重送信の利点を提供する。 各々が自身の独特で適切な質量分析法タグで標識され
た多数の異なったプローブは典型的な核酸ハイブリッド
形成アッセイに一緒に使用できる。ハイブリダイズする
各々の個々のプローブの配列は、質量分析におけるタグ
の分離および分割のため他のものの存在下で特異的に決
定できる。 この態様において、本発明は標的核酸の配列決定法を
提供し、この方法は以下の工程を含んでいる； ｉ） 支持体上に固定化された標的核酸を用意する。好
適には、標的核酸の個々のクローンは支持体上離れた位
置に固定化されている。 ii） 異なった試薬のオリゴヌクレオチド鎖が支持体上
の標的核酸にハイブリダイズするようにｉ）からの固定
化された標的核酸と上記の多数のコードされたオリゴヌ
クレオチド試薬をインキュベートし、 iii） ハイブリダイズしていない試薬を除去し、およ
び iv） 標的核酸の一部を配列の指標として各々の試薬の
タグ部分を回収して分析する。 好適にはその後、試薬のライブラリーをハイブリッド
形成に使用し、ライゲーション、切断および分析工程を
循環的に繰り返し、標的核酸の配列についての追加の情
報が提供される。 ｂ）型II オリゴヌクレオチドのアレイへハイブリダイズした場
合、形成されたデュープレックスのパターンから核酸配
列を決定することが可能である。決定できる配列の長さ
は大体アレイの大きさの平方根であり；もし全部で65,5
36のオクタヌクレオチドのアレイが使用されたならば、
決定されるべき配列は約200bpであろう（Southernら、1
992）。大きさの制限は、決定されるべき配列において
８塩基の並びが２度以上生じてはならない束縛により課
せられている。アレイおよび配列決定におけるその使用
は国際特許出願WO89/10977に記載されており；固定化さ
れた（例えば、表面上にそれらの5'−末端またはそれら
の3'−末端により）オリゴヌクレオチドのアレイを提供
する方法は国際特許出願WO90/03382に記載されている。 本発明の方法によると決定できる配列長を非常に長く
することができる。本発明のこの態様において、本方法
は以下の工程を含んでいる： ａ） 支持体上の間隔をとった位置に固定化されたオリ
ゴヌクレオチドのアレイを提供し、一つの位置のオリゴ
ヌクレオチドは別の位置のオリゴヌクレオチドと異なっ
ている。好適には支持体上の各々間隔をとった位置に共
有結合で固定されているオリゴヌクレオチドの配列が知
られている、 ｂ） 支持体上の一つまたはそれ以上の間隔をとった位
置でハイブリッドを形成するように標的核酸と固定化オ
リゴヌクレオチドのアレイをインキュベートし、 ｃ） ライブラリーの試薬のオリゴヌクレオチド鎖が各
々の固定化されたオリゴヌクレオチドに隣接する標的核
酸にハイブリダイズするようにｂ）からのハイブリッド
とコードされたオリゴヌクレオチド試薬のライブラリー
をインキュベートし、 ｄ） 隣接するオリゴヌクレオチドをライゲーション
し、このことにより支持体上の一つまたはそれ以上の間
隔をとった位置でライゲーションされた試薬を形成し、 ｅ） 他のライゲーションしていない試薬を除去し、お
よび ｆ） 標的核酸の一部の配列の指標として各々のライゲ
ーションされた試薬のタグ部分を回収して分析する。 好適には、各々間隔をとった位置のタグ鎖の切断はレ
ーザーにより光化学的に達成される。好適には、タグ鎖
の分析は質量分析法による。好適には上記のように、標
的核酸の配列についての追加の情報を得るためにハイブ
リッド形成、ライゲーション、切断および分析工程が循
環的に繰り返される。 好適な操作の順番は図５を構築する四つの図に示され
ている。最初の図は工程ｂ）の出発時の状態を示してい
る。第二の図は工程ｂ）の最後の状態を示しており、標
的核酸の一部がアレイの一部を形成している繋がれたオ
リゴヌクレオチドへハイブリダイズしている。第三の図
は工程ｃ）の最後の状態を示しており、第四の図は工程
ｄ）の最後の状態を示しており；ライブラリーからの試
薬が標的核酸にハイブリダイズされ、固定化オリゴヌク
レオチドにライゲーションされた。 既知の方法のこの伸長の結果は劇的である。タグを読
み取るのに用いられる方法が混合物を分離することがで
きれば、アレイ中のオリゴヌクレオチドの長さに等しい
長さ分の一回の伸長は、読みとることができる全部の長
さと一致している。この場合、八つの塩基により伸長さ
れたオクタヌクレオチドの配列から読みとることができ
る長さは約60,000塩基である。 タグを付けたオリゴヌクレオチドを含むハイブリッド分
析と下記の方法の比較： ａ）ゲルに基づく方法 自動化配列分析について最も進歩した装置は一日当た
り約40000塩基を読みとることができる。これはゲルに
加えられる反応液を提供するのに主要な生物学的および
生化学的過程のための時間は含まれていない。もし鋳型
を表面にミリメートル平方当たり１の密度で適用できる
と仮定すると（Hoheiselら、1992;Rossら、1992）、100
x100mmの領域に10000を適用できるであろう。ハイブリ
ッド形成後、各々のセルのタグを付けたオリゴヌクレオ
チドは数ｆモルであろうので、レーザーの一回の２ナノ
秒パルスは読みとりに十分なタグを放出するであろう
が、たとえ100のパルスが必要とされると仮定しても、
読みとられるべきセルに対しての総時間は数ミリ秒であ
り、したがって10000のセルすべてを数分間で読み取る
ことができる。もしオリゴヌクレオチドがヘキサマーで
あったとしても、得られた生のデータは60000塩基であ
ろう。配列決定に対して、このことはゲルからの等しい
生データほど情報が豊かではないであろう、なぜなら、
より長い連続的な長さがゲルから読みとられるからであ
る。ゲルにおけるこの利点は、もちろん、もしアレイか
ら読まれた配列がそれ以上の回数の分析により伸長でき
るならば失われるであろう。しかし、アレイに基づいた
方法の基本的利点は、数千の鋳型を一緒に分析すること
を可能にする平行法であり；ゲル上で分析できる数はゲ
ルの巾により制限され、15未満である。 ｂ）現在のアレイに基づく方法 現存のアレイに基づく方法の主たる欠点は： ａ） 大きさＮのアレイから読むことができる配列は のみであり、アレイのほとんどのセルは空である。タグ
を付けたオリゴヌクレオチドを加えることにより、アレ
イの占拠率はほとんど完全に近くなり、そのためほとん
どのセルから情報が得られるであろう。この理由はタグ
からの付加的な情報が、標的配列中に短い列が多く存在
することによる曖昧さを除く助けとなるからである（表
３）。 ｂ）ハブリッド形成によるオリゴヌクレオチドとの各々
の相互作用から読み取れる配列の長さは必然的にオリゴ
ヌクレオチドの長さに制限される。このことは単一塩基
の並びのような繰り返し配列の読みとりに問題を起こし
ている。ライゲーションによる読みとりの拡大は繰り返
しされたライゲーションにより通過できるかぎり読みと
りを可能にするであろう。 ｃ）現在の検出法のうち、放射能は高い感度を持ってい
るが分解能が悪く、蛍光は低い感度と高い分解能を持っ
ている；両方とも比較的遅い。質量分析法を使用する案
は分解能、速度および感度を改良でき、ならびにタグの
配列を読みとる可能性を加えた。 薬理活性の可能性を持つ被検体 多くの薬剤は組織特異的である。それらの作用はしば
しば細胞表面レセプターとの相互作用に依存している。
コア構造に基づいた薬剤の一群がある；例えば、短いペ
プチドを含むいくつかのもの。候補薬剤を追跡してどの
細胞または組織を標的としているのかを観察できること
は有用である。多くの異なった候補を同時に追跡できる
ことは有用であろう。コードされた質量タグでタグを付
けた被検体のライブラリーを用いると、質量分析計中で
細胞または組織を試験することにより相互作用を追跡す
ることが可能であろう。もしタグに光反応活性保護基が
結合されているとしたら、質量分析計と組み合わされた
走査レーザー切断を用いて動物全体または組織切片を画
像化できるであろう。 以下の実施例は本発明をさらに例示している。 実施例１から６は、被検体合成のためのメチルオキシ
トリチル基（−CH2ODMT）；光切断のためのｏ−ニトロ
基；タグ合成のためのＯ−ｔ−ブチルジフェニルシリル
基（OTBDPS）；質量分析法による分析のための正に荷電
した基への変換のための三級アミノ基；および支持体へ
の結合のためのＮ−ヒドロキシスクシンイミジル基を有
する芳香族連結基を含む化合物（８）の合成における反
応スキーム１に従った工程を示している。 実施例７および８は反応スキーム２に従った続いての
工程を示している。 実施例９および10は反応スキーム３に従った、プロパ
ン−1,3−ジオールに基づいたレポーター基（13）を合
成する工程を示している。 実施例11から13は反応スキーム４に従った、レポータ
ー基としての保護プロパン−1,3−ジオール残基の化合
物（６）への結合に関与する工程を示している。 実施例14から19は本発明に従った種々の試薬の調製、
特徴づけおよび使用を記載している。 一般的項目 ５−ヒドロキシ−２−ニトロベンジルアルコールは、
Aldrich社より購入し、長鎖アルキルアミノ制御孔ガラ
スはSigmaより購入した。無水溶媒は、窒素雰囲気下で
包装したAldrich Sure Seal等級のものである。トリ
エチルアミンは水素化カルシウムから前蒸留し、使用ま
で窒素雰囲気下に保存した。他の溶媒および試薬は、市
販の範囲のものから入手可能である。 1H−NMRは、Jeol 270MHz機器で、指示された溶媒を
用い、テトラメチルシランを参照として得た。 赤外吸収は、Nicolet 5DXC F.T.IR機器で、指示さ
れるように、臭化カリウムディスクまたはクロロホルム
溶液として得た。 融点は、Gallenkamp融点装置を用いて求め、修正しな
かった。 TLCは、指示された溶媒系を用いて、Kieselgel 60F
254アルミニウム裏張TLCプレートで行った。プレート
は、紫外線および／またはモリブドリン酸の３％w/vエ
タノール性溶液に浸漬し次にホットエアガンで加熱する
ことの両方により可視化した。トリチル含有種は明るい
オレンジ色のスポットとして、アルコールは青いスポッ
トとして現れる。 シリカゲルクロマトグラフィーは、粒子サイズ40→63
μｍのフラッシュ等級シリカゲルを用いて実施した。 反応スキームおよび本文中においては、次の略号を使
用する。 DMT 4,4'−ジメトキシトリチル THF テトラヒドロフラン TBDPS tert−ブチルジフェニルシラン DMAD ４−ジメチルアミノピリジン DCCI ジクロロヘキシルジカルボジイミド CH2Cl2 ジクロロメタン CPG 制御孔ガラス MeI ヨードメタン Tresyl 2,2,2−トリフルオロエチルスルホニル 実施例１ ５−ヒドロキシ−Ｏ−（4,4'−ジメトキシトリチル）−
２−ニトロベンジルアルコール（化合物２、スキーム
１）の合成 無水ピリジン（40ml）に溶解した５−ヒドロキシ−２
−ニトロベンジルアルコール（5.11g,30.2mmol）に、塩
化4,4'−ジメトキシトリチル（10.25g,30.2mmol）を加
え、フラスコに栓をした。次に、反応混合物を室温で合
計72時間撹拌した。TLC分析（エーテル／石油エーテル4
0−60℃,65％/35％）は、RF＝0.27の新たなトリチル陽
性含有物質の存在および出発アルコールの消失を示し
た。次に、回転蒸発によりピリジンを除去し、最後の痕
跡量はトルエンとの共蒸発（×２）により除去した。得
られたガムを酢酸エチルに溶解し、溶液を水（×１）お
よびブライン（×１）で洗浄した。次に、酢酸エチル溶
液を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、蒸発させて、赤茶
色ガムを得た。ガムをCH2Cl2（20ml）に溶解し、次にシ
リカゲルカラム（14cm×6.5cm）にかけ、エーテル／石
油エーテル40−60℃,65％/35％で溶出した。生成物分画
を合わせ、回転蒸発により溶媒を除去して、灰白色固体
を得た（13.49g,95％,mp.80−82℃（分解））。分析用
試料は、クロロホルム／石油エーテル40−60℃から再結
晶することにより調製した。mp.134−７℃（分解）。1 H−NMR（270MHz,CDCl3,δ）:3.79（s,6H,DMT−OCH3）,
4.63（s,2H,CH2−ODMT）,6.77−6.85（m,5H,アリー
ル）,7.22−7.49（m,9H,アリール）,7.63（s,1H,アリー
ル）,8.06（d,1H,J＝9.06Hz,アリール）。 IR（KBrディスク）:1610,1509,1447,1334,1248,1090,10
60,1033,828cm-1。 実施例２ Ｏ−（4,4'−ジメトキシトリチル）５−［１−（３−ブ
ロモ−１−オキシプロピル）］−２−ニトロベンジルア
ルコール（化合物３、スキーム１）の合成 アセトン（150ml）に溶解した化合物２（10.18g,21.6
mmol）に、1,3−ジブロモプロパン（11ml,108mmol）お
よび炭酸カリウム（4.47g,32.3mmol）を加えた。次に、
反応混合物を80℃で合計３時間加熱し、次に室温でさら
に16時間撹拌した。TLC分析（エーテル／石油エーテル4
0−60℃,60％/40％）は、出発材料が完全に消失し、RF
＝0.48（メジャー）およびRF＝0.23（マイナー）の２つ
の新たなトリチル含有物質の形成を示した。次に、回転
蒸発によりアセトンを除去し、得られた残渣を水とジク
ロロメタンとの間に分配した。ジクロロメタン溶液を分
離し、ブライン（×１）で洗浄した。次に、ジクロロメ
タン溶液を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、蒸発させて
ガムを得た。ガムをジクロロメタン（20ml）に溶解し、
次にシリカゲルカラム（6.5cm×14cm）にかけ、エーテ
ル／石油エーテル40−60℃,60％/40％で溶出した。純粋
生成物分画を合わせ、回転蒸発により溶媒を除去して、
化合物３を白色固体として得た（8.18g,64％,mp.132→
４℃,RF＝0.48 エーテル／石油エーテル40−60℃,60％
/40％。分析のために、少量の試料を酢酸エチル／石油
エーテルから再結晶した。mp.132−４℃。1 H−NMR（270MHz,CDCl3,δ）:2.40（m,2H,−CH2−CH2−
CH2）,3.64（t,2H,J＝6.32Hz,CH2Br）,3.79（s,6H,OC
H3）,4.27（t,2H,J＝6.04Hz,−OCH2CH2）,4.66（s,2H,A
rCH2ODMT）,6.84（d,4H,J＝8.79Hz,DMTアリール）,7.20
−7.50（m,10H,9DMTアリール、１アリール）,7.68（s,1
H,アリール）,8.1（d,1H,J＝9.06Hz,アリール）。 IR（KBrディスク）:1608,1577,1511,1289,1253,1230,11
74,1065,1030cm-1。 実施例３ Ｎ−［Ｏ−（tert−ブチルジフェニルシリル）−２−オ
キシエチル）］−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）アミン
（化合物５、スキーム１）の合成 水素化ナトリウム（油中60％分散液0.76g,19mmol）
に、N2雰囲気下で無水THF（15ml）を加え、次に、水素
を発生させるような速度でTHF（30ml）中のジエタノー
ルアミンのスラリー（2g,19mmol）を加えた。次に、反
応混合物をN2雰囲気下で室温で30分間撹拌し、この間に
灰色の析出物が形成した。tert−ブチルクロロジフェニ
ルシラン（4.95ml,19mmol）を加えることにより生成し
たアルコキシドを急冷し、次に反応液をN2雰囲気下で室
温で撹拌した。TLC分析（酢酸エチル）は、出発物質に
対して２つの新たなUV陽性スポットの生成を示した。RF
＝0.05（メジャー）、RF＝0.60（マイナー）。回転蒸発
によりTHFを除去し、残渣を0.1M炭酸水素ナトリウム溶
液に溶解した。次に生成物を酢酸エチル（×２）で抽出
した。次に酢酸エチル抽出物を合わせ、ブライン（×
１）で洗浄した。次に酢酸エチル溶液を無水硫酸マグネ
シウムで乾燥し、蒸発させて油状物を得た。この油状物
をシリカゲルカラムにかけ、クロロホルム／メタノー
ル、90％/10％で溶出した。RF＝0.33の分画を合わせ、
回転蒸発させて、化合物５を白色結晶質固体として得た
（3.93g,60％）。mp.73→75℃。分析のために、少量の
試料を酢酸エチル／石油エーテル40−60℃から再結晶し
た。mp.76→77℃。1 H−NMR（270MHz,CDCl3,δ）:1.06（9H,tBu）,2.13（br
s,1H,OH,D2O交換可能）,2.78（m,4H,CH2NHCH2−）,3.63
（t,2H,J＝5.22Hz,−CH2OSi−）,3.78（t,2H,J＝5.22H
z,CH2OH）,7.40（m,6H,アリール）,7.66（m,4H,アリー
ル）。 IR（KBrディスク）:3100,1430,1114,1080,969,749,738,
707cm-1。 実施例４ Ｎ−［Ｏ−（tert−ブチルジフェニルシリル）−２−オ
キシエチル］−Ｎ−［Ｏ−（３（Ｏ−（4,4'−ジメトキ
シトリチル）−１−オキシメチル）−４−ニトロフェニ
ル）−３−オキシプロピル］−Ｎ−（２−ヒドロキシエ
チル）アミン（化合物６、スキーム１）の合成 １−メチル−２−ピロリジノン（65ml）中に溶解した
化合物３（7.46g,12.6mmol）に、化合物５（8.63g,25.2
mmol）を加えた。次に、反応混合物を80℃で合計５時間
加熱し、放置して冷却させ、室温でさらに16時間撹拌し
た。TLC分析（酢酸エチル）は、RF＝0.51の新たなトリ
チル含有種の形成および残余量の２つの出発物質を示し
た。反応混合物を水（600ml）とブライン（100ml）との
混合物中に注ぎ、生成物を酢酸エチル（３×200ml）で
抽出した。次に、酢酸エチル抽出物を合わせ、無水硫酸
マグネシウムで乾燥した。次に、回転蒸発により酢酸エ
チルを除去して、茶色ガムを得た。このガムから、結晶
質生成物がゆっくり形成した。結晶質生成物（化合物５
の臭化水素塩）を濾過しうるように、最少量の酢酸エチ
ルを加えて残渣ガスを溶解した。次に、酢酸エチル溶液
をシリカゲルカラム（13cm×6.5cm）にかけ、酢酸エチ
ルで溶出した。このカラムでは、残余の化合物３と所望
の生成物との分離が不十分であったため、生成物分画を
合わせ、蒸発させてガムを得た。このガムを必要最少量
の酢酸エチルに溶解し、別のシリカゲルカラム（14cm×
6.5cm）にかけ、最初に酢酸エチル／石油エーテル40−6
0℃,50％/50％で、次に酢酸エチルで、勾配溶出を用い
て溶出した。生成物分画を合わせ、回転蒸発により溶媒
を除去して、化合物６をガムとして得た。最後の痕跡量
の溶媒は、ガムを高真空下に１時間置くことにより除去
した。生成物の収量は7.64g,71％であった。1 H−NMR（270MHz,CDCl3,δ）:1.04（s,9H,tBu）,1.97
（m,2H,−CH2CH2CH2−）,2.7（m,6H,NCH2）,3.56（m,2
H,CH2OH）,3.75（m,2H,CH2OSi）,3.78（s,6H,DMT−OC
H3）,4.12（m,2H,ArOCH2CH2）,4.64（s,2H,ArCH2ODM
T）,6.74−6.85（m,5H,アリール）,7.2−7.65（m,20H,
アリール）,8.05（d,1H,アリール）。 IR（KBrディスク）:1608,1579,1509,1287,1251,1232,11
12,1092,1064,1035,826,754,730,613cm-1。 実施例５ Ｎ−［Ｏ−（tert−ブチルジフェニルシリル）−２−オ
キシエチル］−Ｎ−［Ｏ−（３（Ｏ−（4,4'−ジメトキ
シトリチル）−１−オキシメチル）−４−ニトロフェニ
ル）−３−オキシプロピル］−Ｎ−［Ｏ−（３−カルボ
キシラートプロピオニル）−２−オキシエチル］アミン
（化合物７、スキーム１）の合成 無水ジクロロメタン（40ml）および無水ピリジン（50
ml）に溶解した化合物６（5.64g,6.59mmol）に、コハク
酸無水物（2.06g,20.6mmol）およびジメチルアミノピリ
ジン（210mg,1.72mmol）を加え、フラスコに栓をした。
次に、反応混合物を室温で合計72時間撹拌した。TLC分
析（メタノール／酢酸エチル、10％/90％）は、RF＝0.4
5の新たなトリチル含有種の形成および出発物質の消失
を示した。回転蒸発により溶媒を除去し、トルエンとの
共蒸発（×２）により最後の痕跡量のピリジンを除去し
た。次に、得られたガムをクロロホルムと水との間に分
配した。有機相を分離し、水相をさらにクロロホルム
（×１）で抽出した。次に、有機相を合わせ、ブライン
（×１）で洗浄した。次に、クロロホルム溶液を無水硫
酸マグネシウムで乾燥し、蒸発させてガムを得た。次
に、ガムを高真空下に１時間置くことにより最後の痕跡
量の溶媒を除去し、化合物７を得た。6.75g。この生成
物を、さらに精製することなく次の段階で用いた。1 H−NMR（270MHz,CDCl3,δ）:1.0（s,9H,tBu）,1.9（m,
2H,CH2CH2CH2）,2.5（m,4H,COCH2CH2COOH）,2.7（m,6H,
N−CH2）,3.7（m,2H,CH2OSi）,3.75（s,6H,DMT−OC
H3）,4.1（m,4H,CH2OCOおよびAr−OCH2CH2）,5.6（s,2
H,ArCH2ODMT）,6.7（d,1H,アリール）,6.8（d,4H,アリ
ール）,7.2→7.7（m,20H,アリール）,8.02（d,1H,アリ
ール）。 IR（CHCl3溶液）:1736,1608,1579,1509,1288,1251,123
2,1175,1158,1112,1093,1065,1035,755,703cm-1。 実施例６ Ｎ−［Ｏ−（tert−ブチリジフェニルシリル）−２−オ
キシエチル］−Ｎ−［Ｏ−（３（Ｏ−（4,4'−ジメトキ
シトリチル）−１−オキシメチル）−４−ニトロフェニ
ル）−３−オキシプロピル］−Ｎ−［（Ｏ−（スクシニ
ル（３−カルボキシラートプロピオニル）））−２−オ
キシエチル］アミン（化合物８、スキーム１）の合成 無水ジクロロメタン（30ml）に溶解した化合物７（2.
99g,3.13mmol）に、ジシクロヘキシルカルボジイミド
（0.710g,3.45mmol）およびＮ−ヒドロキシスクシンイ
ミド（0.396g,3.44mmol）を加え、フラスコに栓をし
た。次に、反応混合物を室温で18時間撹拌し、この間に
白色析出物が形成した。白色析出物を濾別し、ジクロロ
メタン溶液を水（×１）およびブライン（×１）で洗浄
した。次に、ジクロロメタン溶液を無水硫酸マグネシウ
ムで乾燥し、溶媒を回転蒸発させて、泡状物3.26g（99
％）を得た。TLC分析（酢酸エチル）は、RF＝0.74の唯
一のトリチル含有種を示し、有意の混入物はなかった。
少量の物質をシリカゲルカラムに通すことにより、分析
用試料を得ようと試みたが、活性エステルが分解して酸
に戻った（化合物７）。したがって、この物質をさらに
精製することなく、以下のすべての実験において用い
た。1 H−NMR（270MHz,CDCl3,δ）:1.04（s,9H,tBu）,1.97
（m,2H,CH2CH2CH2）,2.50→2.75（m,6H,スクシニルCH2
＋−OCCH2）,2.76−2.86（m,6H,NCH2）,3.08（m,2H,CH2
CO2スクシニル）,3.77（s,6H,DMTOCH3）,3.86（m,2H,CH
2OSi）,4.1→4.2（m,4H,ArOCH2＋CH2O2C）,4.63（s,2H,
ArCH2ODMT）,6.7→6.9（m,5H,アリール）,7.01→7.7
（m,20H,アリール）,8.05（d,1H,アリール）。 IR（KBrディスク）:1742,1713,1509,1288,1251,1211,11
75,1090,1067cm-1。 実施例７ 誘導化長鎖アルキルアミノ制御孔ガラス（化合物９、ス
キーム２） 長鎖アルキルアミノ制御孔ガラス（Sigma Chemical
Co.3.5g）を、ジクロロメタン（50ml）に溶解したト
リクロロ酢酸（1.5g）で2.5時間前処理し、ジクロロメ
タン（総量100ml）および無水エーテル（総量100ml）の
アリコートで洗浄し、真空下に乾燥した。次に、CPG支
持体に、無水ピリジン（35ml）、ジメチルアミノピリジ
ン（42mg,344μmol）、トリエチルアミン（280μl,201m
mol）および化合物８（スキーム１を参照のこと）（736
mg,700μmol）を加えた。次に、混合物を合計18時間穏
やかに撹拌し、その後、ビーズをピリジン（７×10m
l）、メタノール（５×15ml）およびクロロホルム（５
×15ml）で多数回洗浄し、次に真空下に乾燥した。 実施例８ CPG支持体に結合した第３アミノ基のメチル化（化合物1
0、スキーム２） 誘導化長鎖アルキルアミノ制御孔ガラス（化合物９、ス
キーム２）（1.01g）に、無水THF（10ml）およびヨード
メタン（0.5ml,8mmol）を加えた。次に、混合物を合計1
8時間穏やかに撹拌し、その後、ビーズを無水THF（５×
10ml）で多数回洗浄し、次に真空下に乾燥した。 実施例９ モノ保護1,3−プロパンジオール誘導体の合成（化合物1
2aおよび12b、スキーム３）−一般的方法 N2雰囲気下で、水素化ナトリウム（油中60％分散物1.
05g,26.3mmol）に、無水THF（10ml）を加え、続いて無
水THF（20ml）に溶解した1,3−プロパンジオール誘導体
（26.3mmol）を滴加した。さらにN2雰囲気下で30分間撹
拌して、灰色析出物の形成により示されるアルコキシド
形成を確実にした。無水THF（20ml）に溶解したtert−
ブチルクロロジフェニルシラン（7.24g,26.3mmol）を滴
加することにより生成したアルコキシドを急冷し、反応
混合物をN2雰囲気下でさらに40分間撹拌した。次に、回
転蒸発によりTHFを除去し、残渣をジクロロメタンと0.1
M炭酸水素ナトリウム溶液との間に分配した。ジクロロ
メタン溶液を分離し、ブライン（×１）で洗浄した。次
に、ジクロロメタン溶液を硫酸マグネシウムで乾燥し、
蒸発させて油状物を得た。この油状物をシリカゲルカラ
ム（16cm×5cm）にかけ、エーテル／石油エーテル40−6
0℃、30％/70％混合物で溶出した。生成物分画を合わ
せ、回転蒸発させて、所望の1,3−プロパンジオール誘
導体を得た。 化合物の個別の詳細は以下のとおりである。 12a １−Ｏ−tert−ブチルジフェニルシリル−1,3−プ
ロパンジオール，白色結晶質固体,RF＝0.21 エーテル
／石油エーテル40−60℃,30％/70％,7.61g,92％,mp.40
→42℃。 IR（KBrディスク）:3400,1448,1112,822,734,702,689,5
06,488cm-1 1 H−NMR（270MHz,CDCl3,δ）:1.06（s,9H,tBu）,1.80
（m,2H,CH2CH2CH2）,2.45（t,1H,OH）,3.84（m,4H,OCH2
CH2CH2O−）,7.40（m,6H,アリール）,7.68（m,4H,アリ
ール）。 12b ２−メチル−１−Ｏ−tert−ブチルジフェニルシ
リル−1,3−プロパンジオール，無色油状物,RF＝0.21
エーテル／石油エーテル40−60℃,30％/70％,6.60g,77
％。 IR（薄膜）:3400,1472,1428,1087,1040,823,740,702cm
-1 1 H−NMR（270MHz,CDCl3,δ）:0.82（d,3H,J＝6.87Hz,CH
3）,1.06（s,9H,tBu）,2.0（m,1H,CH−CH3）,2.68（t,1
H,OH）,3.64（m,4H,CH2CH（CH3）CH2）,7.40（m,6H,ア
リール）,7.68（m,4H,アリール）。 対称1,n−ジオールのモノシリル化の一般的方法につ
いては、P.G.McDougal et al.,JOC,51,3388（1986）
を参照のこと。 実施例10 トレスレート（treslate）誘導体（化合物13aおよび13
b、スキーム３）の合成−一般的方法 無水ジクロロメタン（10ml）に溶解したアルコール誘
導体（4.94mmol）および乾燥トリエチルアミン（0.84m
l,6.03mmol）に、N2雰囲気下で、−15℃から−30℃に冷
却して、無水ジクロロメタン（5ml）中の塩化トレシル
（1g,5.48mmol）を、20−40分間かけて滴加した。N2雰
囲気下で−15℃から−30℃においてさらに30分間撹拌し
て反応を完了させた。次に、反応混合物を分離フラスコ
に移し、氷冷1.0M塩酸（×１）、氷冷水（×１）および
氷冷ブライン（×１）で洗浄した。次に、ジクロロメタ
ン溶液を硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を回転蒸発さ
せて、トレスレートを得た。このトレスレートは、必要
となるまでN2下で−20℃で保存した。 化合物の個別の詳細は以下のとおりである。 13a １−Ｏ−tert−ブチルジフェニルシリル３−Ｏ−
トレシル−1,3−プロパンジオール，白色結晶質固体,1.
74g,77％,mp.34→35℃。他の反応に加えるために、反応
の後処理の前にこの反応混合物3mlを除去した。1 H−NMR（270MHz,CDCl3,δ）:1.06（s,9H,tBu）,1.97
（m,2H,CH2CH2CH2）,3.77（t,2H,J＝5.49Hz,CH2−Ｏ−S
i）,3.84（q,2H,J＝8.79Hz,CF3−CH2−Ｏ）,4.54（t,2
H,J＝6.05Hz,トレシルＯ−CH2）,7.42（m,6H,アリー
ル）,7.64（m,4H,アリール）。 IR（KBrディスク）:1386,1329,1274,1258,1185,1164,11
37,1094,941,763,506cm-1 13b ２−メチル−Ｏ−tert−ブチルジフェニルシリル
−３−Ｏ−トレシル−1,3−プロパンジオール，無色油
状物,2.57g,99％。1 H−NMR（270MHz,CDCl3,δ）:0.97（d,3H,J＝6.87Hz,CH
3）,1.06（s,9H,tBu）,2.10（m,1H,CHCCH3）,3.6（m,2
H,CH2OSi）,3.8（q,2H,J＝8.79Hz,CF3CH2）,4.40（t,2
H,トレシルＯ−CH2）,7.40（m,6H,アリール）,7.64（m,
4H,アリール）。 トレスレートの一般的詳細については、R.K.Crosslan
d et al.,JACS,93,4217（1971）を参照のこと。 実施例11 Ｎ−［アセトキシ−２−オキシエチル］−Ｎ−［Ｏ−
（３（Ｏ−（4,4'−ジメトキシトリチル）−１−オキシ
メチル）−４−ニトロフェニル）−３−オキシプロピ
ル］−Ｎ−２−ヒドロキシエチル］アミン（化合物15、
スキーム４）の合成 無水THF（20ml）に溶解した化合物11（1.72g,1.92mmo
l）に、フッ化テトラブチルアンモニウム（THF中1M溶液
0.55ml,1.92mmol）を加えた。次に、反応混合物を室温
で合計２時間撹拌した。次に、反応混合物を水（50ml）
で希釈し、回転蒸発によりTHFを除去した。次に、水性
溶液をクロロホルム（×１）で抽出した。有機溶液を無
水硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発させてガムを得た。生
成物をシリカゲルクロマトグラフィーで精製し、カラム
を酢酸エチルで溶出した。生成物分画を合わせ、回転蒸
発させて、化合物12を無色ガムとして得た。これは放置
するとゆっくり結晶化した。0.73g,58％,mp.95→97℃,R
F＝0.26 酢酸エチル。1 H−NMR（270MHz,CDCl3,δ）:1.75（brs,1H,OH）,2.0→
2.1（m,5H,O2CCH3＋CH2CH2CH2）,2.70→2.81（m,6H,CH2
N）,3.58（m,2H,CH2OSi）,3.79（s,6H,DMT−OCH3）,4.1
7（m,4H,CH2O）,4.46（s,2H,ArCH2ODMT）,6.83（d,4H,D
MT−アリール）,7.2→7.5（m,10H,アリール）,7.69（s,
1H,アリール）,8.10（d,1H,アリール） IR（KBrディスク）:3459,1738,1608,1577,1506,1444,13
13,1288,1250,1230,1175,1154,1070,1035,984cm-1 実施例12 Ｎ−［Ｏ−（tert−ブチルジフェニルシリル）−２−オ
キシエチル］−Ｎ−［Ｏ−（３（Ｏ−（4,4'−ジメトキ
シトリチル）−１−オキシメチル）−４−ニトロフェニ
ル）−３−オキシプロピル］−Ｎ−［アセトキシ−２−
オキシエチル］アミン（化合物14、スキーム４）の合成 無水ピリジン（10ml）に溶解した化合物６（1.73g,2.
02mmol）に、無水酢酸（0.5ml,4.54mmol）および４−ジ
メチルアミノピリジン（55mg,0.45mmol）を加え、フラ
スコに栓をした。次に、反応混合物を室温で合計16時間
撹拌した。この後、TLC分析（メタノール／酢酸エチル,
5％/95％）は、出発物質の完全な消失および新たなトリ
チル含有スポット,RF＝0.80の形成を示した。回転蒸発
によりピリジンを除去し、最後の痕跡量はトルエン（×
２）との共蒸発により除去した。得られたガムをクロロ
ホルムと水との間に分配した。クロロホルム溶液を分離
し、ブライン（×１）で洗浄した。次に、クロロホルム
溶液を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を回転蒸発
させて、無色ガムを得た。1.94g。この物質は、さらに
精製することなく次の段階で用いるのに十分純粋であっ
た。1 H−NMR（270MHz,CDCl3,δ）:1.04（s,9H,tBu）,1.9
（m,2H,CH2CH2CH2）,2.01（s,3H,−O2CCH3）,2.74（m,6
H,CH2N）,3.7（m,2H,CH2OSi）,3.8（s,6H,DMT−OCH3）,
4.1（m,4,CH2O）,4.63（s,2H,ArCH2ODMT）,6.78（d,1H,
アリール）,6.83（d,4H,DMTアリール）,7.2→7.8（m,20
H,アリール）,8.05（d,2H,アリール）。 実施例13 Ｎ−［アセトキシ−２−オキシエチル］−Ｎ−［Ｏ−
（３（Ｏ−（4,4'−ジメトキシトリチル）−１−オキシ
メチル）−４−ニトロフェニル）−３−オキシプロピ
ル］−Ｎ−［Ｏ−（tert−ブチルジフェニルシリル）−
３−オキソ−６−オキシヘキシル］アミン（化合物16、
スキーム４）の合成 無水アセトニトリル（5ml）に溶解した化合物12（66m
g,0.10mmol）に、炭酸カリウム（55mg,0.4mmol）および
化合物13a（反応混合物1ml,約0.30mmol）を加え、次に
フラスコに塩化カルシウム乾燥チューブで栓をした。次
に、反応混合物を室温で合計22時間撹拌し、その後、炭
酸カリウムを濾別し、回転蒸発により溶媒を除去した。
次に、得られた油状物をシリカゲルカラム（14cm×1c
m）にかけ、生成物をエーテル／石油エーテル40−60℃,
75％/25％混合物で溶出した。純粋生成物分画を合わ
せ、蒸発させて透明ガムを得た。6mg,6％,RF＝0.47 エ
ーテル／石油エーテル40−60℃,80％/20％。1 H−NMR（270MHz,CDCl3,δ）:1.05（s,9H,tBu）,1.8
（m,2H,CH2CHCH2OSi）,1.9（m,5H,O2CCH3＋ArOCH2−）,
2.76−2.92（m,6H,CH2N）,3.51（t,2H,J＝6.6Hz,OCH2CH
2CH2OSi）,3.79（s,6H,DMT−OCH3）,3.85（m,2H,CH2OS
i）,4.12→4.23（m,4H,ArOCH2CH2＋NCH2CH2OCOCH3）,4.
64（s,2H,ArCH2ODMT）,6.84（m,5H,1アリール＋DMT−ア
リール）,7.23→7.50（m,16H,アリール）,7.68（m,4H,
アリール）,8.10（d,1H,J＝9.06Hz,アリール）。 上述と類似の反応条件により、トレスレート13bを用
いて以下の化合物も合成した。 Ｎ−［アセトキシ−２−オキシエチル］−Ｎ−［Ｏ−
（３（Ｏ−（4,4'−ジメトキシトリチル）−１−オキシ
メチル）−４−ニトロフェニル）−３−オキシプロピ
ル］−Ｎ−［Ｏ−（tert−ブチルジフェニルシリル）−
５−メチル−３−オキソ−６−オキシヘキシル］アミ
ン。この化合物は、透明ガムである。RF＝0.53 エーテ
ル／石油エーテル40−60℃,80％/20％。1 H−NMR（270MHz,CDCl3,δ）:0.88（d,3H,CH−CH3）,1.
00（s,9H,tBu）,1.9→2.1（m,6H,O2CCH3＋CH−CH3＋CH2
CH22CH2）,2.7→3.0（m,6H,CH2N）,3.4→3.7（m,4H,CH2
O−）,3.79（s,6H,DMT−OCH3）,4.0→4.4（m,6H,CH2O
−）,4.64（s,2H,ArCH2ODMT）,6.83（m,5H,アリー
ル）、7.2→7.7（m,20H,アリール）,8.01（d,1H,アリー
ル）。 実施例14 固体支持体上でのオリゴヌクレオチドの合成 連結基９および10（スキーム２の化合物９および10）
を有する制御孔ガラスを自動オリゴヌクレオチド合成器
（ABI381A）において用いられるカラム中に装填した。
用いた量は0.2または１μmolスケールの合成用の量であ
る。カラムを自動合成器中に挿入し、次にこれを適当な
サイクル用にプログラムした。２つの異なるタイプのヌ
クレオチド前駆体を用いた:5'ヒドロキシル上にジメト
キシトリチル保護基を有する通常のホスホルアミダイ
ト;5'ホスホルアミダイトおよび3'ヒドロキシル上にジ
メトキシトリチル保護基を有する「逆シントン」。これ
らの支持体上で合成したオリゴヌクレオチドの一覧は表
４に示される。ここでR9およびR10はそれぞれ化合物９
および10に由来するものである。収量は、それぞれのカ
ップリングにおいて放出されたジメトキシトリチル基の
量から監視した。これらの収量は、通常のオリゴヌクレ
オチド合成について用いられるCPG支持体上で得られる
ものに対応した。 実施例15 被検体を無傷のまま残す条件下におけるタグの合成 支持体９上で5'R9T5を合成した後、固体支持体を分割
し、一部をTHF中の5mMフッ化テトラブチルアンモニウム
で室温で10分間処理して、ｔ−ブチルジフェニルシリル
保護基を除去した。両方の試料を29％アンモニアで室温
で一夜処理して、固体支持体から生成物を除去した。真
空下にアンモニアを除去し、固体残渣を水に溶解した。
HPLCは、上首尾にシリル保護基が除去されDMT基が残っ
ていたことを示した。この実施例は、他方をその場に残
す条件下で２つの保護基を除去しうることを示し、さら
に、保護基の除去によりオリゴヌクレオチド鎖が無傷で
残ることを示す。 実施例16 タグを付けた被検体の生化学反応 16a.タグを付けたオリゴヌクレオチドの酵素的リン酸化 5'末端にホスフェート基を有するオリゴヌクレオチド
を得ることは、多くの目的のために有用であろう。その
ような基は、ライゲーション反応においてオリゴヌクレ
オチドを供与体として用いようとする場合に必要であ
り、生化学的特性を試験するために放射性基を導入する
有用な方法である。 3'末端に結合したタグR9およびR10を有するオリゴヌ
クレオチドA5、A10およびT5を、シリル保護基を除去す
るかまたは除去せずに製造した（これは、まだ固体支持
体上にあるオリゴヌクレオチドを、アセトニトリル中の
5mMフッ化テトラブチルアンモニウム溶液で、室温で15
分間処理することにより実施した）。これらのオリゴヌ
クレオチドを、供給元により推奨される標準的なプロト
コールにしたがって、T4ポリヌクレオチドキナーゼおよ
びガンマー33P−ATPを用いてリン酸化した。0.5炭酸水
素アンモニウムで発色させたポリエチレンイミン（PE
I）充満セルロース上の生成物の薄層クロマトグラフィ
ーは、それぞれの場合において、標識されたリンがほぼ
完全にオリゴヌクレオチドに移動したことを示した。 16b.タグを付けたオリゴヌクレオチドの酵素的ライゲー
ション タグを付けたオリゴヌクレオチドのいくつかの応用の
ためには、これらをレセプターにライゲーションするこ
とが有用であろう。我々は、以下の試験により、タグを
付けたオリゴヌクレオチドが酵素的ライゲーションを行
い得ることを示した 。 （１） 5'末端にタグを付けたオリゴヌクレオチド この試験においては、鋳型は であった。これを、放射性リンを用いて5'−末端でリン
酸化した供与体 にハイブリダイズさせた。それぞれ、鋳型中の５つのＡ
の並びにハイブリダイズさせた後に供与体の5'リン酸化
末端にライゲーションしうる配列T5の修飾を用いて、４
つのライゲーション反応を実施した。反応において用い
られた４つのオリゴＴは、その5'−末端の性質において
異なっていた。１つはヒドロキシルを介して結合したジ
メトキシトリチル基を有していた。第２および第３のも
のは、ホスホジエステル結合を介して5'−末端に結合し
たタグR9およびR10を有していた。第４のものは、正常
な5'OHを有する正の対照であった。負の対照は、オリゴ
Ｔを欠失したものであった。ライゲーション反応は、T4
リガーゼを用いて、供給元の指示にしたがって実施し
た。反応は、0.75M炭酸水素アンモニウム溶液で発色さ
せたPEI−セルロース上のTLCにより分析した。４つのす
べての反応は、クロマトグラム上に、供与体より移動度
の低い追加のスポットを示した。予期されたように、負
の対照は追加のスポットを示さなかった。このことは、
異なるタグを有するオリゴヌクレオチドがいかに配列特
異的ライゲーション反応に関与しうるかを示す。 Cozzarelliら（1967）は、相補的鋳型の存在下におい
て、固体支持体に結合したポリヌクレオチドを受容体に
ライゲーションしうることを示した。 実施例17 タグを付けたオリゴヌクレオチドの、固定支持体に繋げ
られたオリゴヌクレオチドに対するハイブリダイゼーシ
ョン 実施例16bは、タグを付けたオリゴヌクレオチドがラ
イゲーション反応に関与しうることを示す。ライゲーシ
ョンはデュープレックス形成工程に依存するため、この
ことは、これらのオリゴヌクレオチドが溶液中における
デュープレックス形成にも関与しうることを意味する。
以下の実験は、これらが固体支持体に繋げられたオリゴ
ヌクレオチドともデュープレックスを形成しうることを
示す。製造元の指示にしたがって、アミン化されたポリ
プロピレンのシートの表面上でT10を合成した。このプ
ロセスは1mm2あたり約10pmolのオリゴヌクレオチドを生
成することが知られている。3.5M塩化テトラメチルアン
モニウム中の、5'末端において33Pで標識され、かつ3'
においてR10でタグを付けたA10の溶液（１μｌあたり65
pmol）を誘導化ポリプロピレンの表面上に置き、４℃で
一夜放置した。ハイブリダイゼーション溶媒中で洗浄し
た後、約1/3のプローブが繋がれたオリゴ−dTにハイブ
リダイズしたことが観察された。これは、ハイブリダイ
ゼーションの理論的限界に近く、タグを付けたオリゴヌ
クレオチドが高い効率でハイブリダイゼーション反応に
関与しうることが示された。 実施例18 タグの光分解 光分解によりタグを除去する可能性は、これらの有用
性を非常に増強する。これは、質量分析器においてレー
ザー脱離による直接分析を可能にする。これは、タグの
簡単な除去方法を提供し、他の生化学的または化学的プ
ロセスを可能とするであろう。 18a.バルク光分解 ニトロベンジル基は、305nmの照射に対して反応活性
であることが知られている。R10A10およびR10T5の水溶
液を、核酸に検出可能な損傷を与えないことが知られて
いる条件下で、トランスイルミネータから2cmの距離で2
0分間照射した。HPLCによる分析は、予期された光分解
生成物を示し、元の化合物の残渣は検出できなかった。 18b.質量分析器におけるレーザー誘導光分解 R10T5およびT5R10の試料を、追加のマトリックスを有
しない飛行時間質量分析器（Finnigan Lasermat）の金
属標的の上に置いた。スペクトルは、ポジティブモード
で他の試料中には存在しない質量約243の単一の飽和ピ
ークを示した。 実施例19 異なる被検体に結合した異なるタグの質量分析法による
同定 3'末端へのタグとして結合したジメトキシトリチル基
を有する一連の５つのチミジン残基を、慣用的な固相法
により、但し「逆シントン」を用いて合成した。質量分
析器において、この化合物は、ポジティブイオンモード
で質量304に大きな区別しうるピークを与えた。これに
対し、上記にR10と称されるタグを有する一連の10個の
アデノシン残基は、ポジティブイオンモードで質量243
に大きな区別しうるピークを与えた。いずれの場合にお
いても、レーザー脱離は、マトリックスの不在下におい
て実施した。いずれの場合においても、タグを有しない
オリゴヌクレオチドのピークは存在しなかった。これら
の実施例は、質量分析のトレース中の、被検体の合成の
間に取り込まれたタグに由来するピークの存在から被検
体配列を同定することは容易に可能であること、および
特有のタグはこれらの異なる質量により容易に同定しう
ることを示す。 図面の説明 図1.特定のタグを有する分子の合成の一般的スキーム 合成は、被検体合成用の基を付加するための少なくと
も１つの部位およびタグの合成用の部位を有する連結基
（Ｌ）から開始する。（連結基はまた、合成の間、固体
支持体に可逆的に結合させることもでき、また、分析に
おいて補助となる荷電基等の基を生成するための部位を
有していてもよい）。PaおよびPrはそれぞれ、被検体前
駆体およびレポーターの一時的保護基である。これら
は、異なる処理により除去することができる。例えば、
Paは酸または塩基に対して反応活性な基、例えばトリチ
ル、Ｆ−MOCまたはｔ−BOCであり、Prはフッ化物で処理
することにより除去可能な基、例えばシリル残基であ
る。基Ｕ−Ｚは保護基を有していてもよいが、これらは
PaおよびPrを除去するために用いられる試薬に対して安
定でなければならない。カップリング化学は、異なるタ
イプの被検体について異なるであろう。オリゴヌクレオ
チドおよびペプチド合成については標準的方法を用いる
ことができる。 図２には３つの異なるタイプのタグが示されている。
第１のスキームについては、タグのそれぞれの伸長は、
被検体に加えられる残基の位置およびタイプの両方に特
異的なレポーターを用いて実施する。このスキームでは
カップリングは重要ではない。 第２および第３のスキームにおいては、位置は、残基
を被検体に加えるときの合成の段階で達成されるレポー
ターの総質量により規定される。この場合、分子の部分
をキャップすることによりタグの伸長の一部を終結させ
ることが重要である。第２および第３のスキームは、レ
ポーターを加える方法において互いに異なる。第２のス
キームにおいては、レポーターは伸長剤の中にあり、第
３のスキームにおいてはレポーターはキャップ中にあ
る。 図2.3つのタイプの分子特異的タグ Ａは、被検体（Ｕ−Ｚ）中の基の位置（下つき）およ
び同一性（上つき）の両方を特定するレポーター（Ｅ）
から作成されたタグを示す。このような組は、位置を特
定するために、増加する式量の一連の脂肪鎖を含み得
る。例えば、１位にメチレン、２位にエチレン、３位に
プロピレン等。これらは、炭素および水素の異なる同位
体組成により基特異的タイプに区別を生じさせることが
できる。例えば、上述の表１に示されるように、CH2に
は６個の異なる同位体組成がある。これらのうち４個は
１質量単位ずつ異なり、質量分析法によって容易に区別
することができる。差異標識の別の方法を考察すること
もできる。例えば、位置または基を異なる電荷を有する
レポーター基で印づけすることができる。このような基
は、質量分析法を含む多くの方法により分離し認識する
ことができる。 Ｂは、例えば被検体の任意の構造を一連のタグに結合
させるような部分合成により作成されたタグを示す。こ
のシリーズの第１のものは、被検体の第１の基に特異的
なレポーター基を有し、第２のものは、第１のレポータ
ー基および、被検体の第２の基に特異的なレポーター基
を有し、そしてその他も同様である。このようなシリー
ズは、タグを伸長するために２種類の前駆体を用いるこ
とにより容易に作成することができる。１つは、可逆的
保護基により保護されたものであり、１つはそれ以上の
伸長を回避するものである。例えば、RXとＰ−（CH2）n
X（ここでＲは、メチルまたはエチル等の非反応性脂肪
族基であり、Ｐは可逆性保護基であり、ＸはＰにより保
護された基と反応しうる活性化残基である）との混合物
である。非反応性脂肪族基により「キャップ」された分
子は、次回の脱保護および伸長には関与しないであろ
う。 Ｂにおいては、基特異的情報は、合成を伸長させるた
めに用いられる残基に含まれる。Ａと同様に、情報は質
量同位体を用いて与えられることができる。例えば、Ｃ
およびＨの同位体で標識したCH2残基をＰ−（CH2）nXに
付加するたびに、レポーターに異なる質量を与え得る追
加の部位が付加される。（CH2）ｎの質量は14nから17n
の範囲にわたり、この範囲には４＋３（ｎ−１）個の異
なる質量がある。したがって、エチレン基については、
28から34の範囲に７個の区別しうる質量があり、プロピ
レン基については、42から51の範囲に10個の区別しうる
質量がある。 Ｃは、いかにして基特異的情報を異なる方法で付加し
うるかを示す。この場合、これは鎖停止剤、すなわち例
Ｂにおける「キャップ」中に含まれている。ここでもま
た、脂肪族残基を認識することにより異なる質量を与え
ることができる。位置情報は、停止剤が付加された伸長
の長さにより与えられる。例えば、Ｅが（CH2）２−Ｏ
の場合、鎖停止剤は同位体により標識された式量15から
19のメチル基である。それぞれの伸長は、レポーターに
44質量単位を付加するであろう。最も短いレポーターの
質量範囲は、44＋15＝59 から 44＋19＝63 の範囲で
ある。第２の位置の範囲は、88＋15＝103 から 88＋1
9＝107の範囲である。他のものも同様であり、第６の位
置の範囲は、284＋15＝299 から 284＋19＝303 であ
る。この範囲には重複はなく、停止剤および追加の原子
による伸長を用いることにより、レポーターの数および
範囲を拡張しうることがわかる。 参考文献： 1. Brenner,S.and Lerner,R.A.（1992）.Encoded comb
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配列番号:1 （ｉ） 配列の特性： （Ａ） 配列の長さ:21 （Ｂ） 型：核酸 （Ｃ） 鎖の数：一本鎖 （Ｄ） トポロジー：直線状 （iii） 配列： 配列番号:2 （ｉ） 配列の特性： （Ａ） 配列の長さ:10 （Ｂ） 型：核酸 （Ｃ） 鎖の数：一本鎖 （Ｄ） トポロジー：直線状 （iii） 配列：
フロントページの続き (72)発明者 カミンズ，ウィリアム・ジョナサン イギリス国ハートフォードシャー エイ チピー23・４ジェイイー，トリング，ソ ーンツリー・ドライブ ５ (56)参考文献 国際公開93／6121（ＷＯ，Ａ１) Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ．，Ｖｏｌ．89，Ｎｏ．12, ｐ．5381−5383（1992) Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，Ｖ ｏｌ．21，Ｎｏ．15，ｐ．3347−3357 （1993) ＲＡＰＩＤ ＣＯＭＭＵＮＩＣＡＴＩ ＯＮ ＩＮ ＭＡＳＳ ＳＰＥＣＴＲＯ ＭＥＴＲＹ，Ｖｏｌ．６，Ｎｏ．６, ｐ．369−372（1992) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/48 - 33/98 C12N 15/00 C12Q 1/68
Claims (26)
- 【請求項１】ａ）少なくとも二つの被検残基を含み、か
つｂ）に連結基を介して連結された被検部分、 ｂ）質量分析法による検出に適した一つまたはそれ以上
のレポーター基を含む、オリゴヌクレオチドではないタ
グ部分 を含む試薬であって、但し、レポーター基は被検残基を
示し、そしてタグ部分の各々の位置のレポーターは被検
部分の決められた位置の被検残基を示すように選ばれる
ことを特徴とする試薬。 - 【請求項２】被検部分がｎ個の被検残基の鎖であり、お
よびタグ部分がｎ個までのレポーター基の鎖であり、タ
グ鎖の各々の位置のレポーター基が被検鎖の対応する位
置の被検残基を示すように選ばれる、請求項１に記載の
試薬。 - 【請求項３】被検部分が光切断可能結合によりタグ部分
に連結されている請求項１または２に記載の試薬。 - 【請求項４】式Ａ−Ｌ−Ｒ（式中Ａは被検部分を構成す
るｎ個の被検残基の鎖であり、Ｌは連結基であり、Ｒは
タグ部分を構成するｎ個までのレポーター基の鎖であ
り、およびｎは２−20である）を有するが、但しタグ部
分は被検部分における被検残基の位置を決定する情報を
含む、請求項１から３のいずれかに記載の試薬。 - 【請求項５】連結基が被検部分合成のためのヒドロキ
シ、アミノまたはスルフヒドリル基およびタグ部分合成
のための反応性基を有する芳香族基を含む、請求項２か
ら４のいずれかに記載の試薬。 - 【請求項６】被検部分合成のためのヒドロキシ、アミノ
またはスルフヒドリル基を有する芳香族基がまた、光切
断のためのｏ−ニトロ基も有する、請求項５に記載の試
薬。 - 【請求項７】質量分析法による分析のために荷電基が存
在する、請求項１から６のいずれかに記載の試薬。 - 【請求項８】被検部分がペプチド鎖である請求項１から
７のいずれかに記載の試薬。 - 【請求項９】被検部分がオリゴヌクレオチド鎖である請
求項１から７のいずれかに記載の試薬。 - 【請求項１０】請求項１から９のいずれかに記載の試薬
のライブラリーであって、各々が異なる被検部分を含む
多数の試薬から構成されることを特徴とするライブラリ
ー。 - 【請求項１１】ライブラリーがｎ個のヌクレオチドの異
なるオリゴヌクレオチド鎖である異なる被検部分を各々
が含む4nの試薬から構成される、請求項10に記載のライ
ブラリー。 - 【請求項１２】試薬が溶液中に一緒に混合されている請
求項11に記載のライブラリー。 - 【請求項１３】以下の工程：標的物質を用意し；標的物
質と請求項10から12のいずれかに記載の試薬のライブラ
リーを、少なくとも一つの試薬が標的物質との結合を起
こす条件下でインキュベートし；非結合試薬を除去し；
各々の結合した試薬のタグ部分を回収し；そして標的物
質に結合された被検部分の性質の指標として回収された
タグ部分を分析することを含むアッセイ法。 - 【請求項１４】標的物質が生物体または組織または細胞
群である請求項13に記載のアッセイ法。 - 【請求項１５】標的核酸の配列決定法であって、 ａ）支持体上に固定化されたオリゴヌクレオチドを用意
し、 ｂ）標的核酸と固定化オリゴヌクレオチドをハイブリダ
イズさせ、 ｃ）ｂ）からのハイブリッドと請求項12に記載のライブ
ラリーをインキュベートして、ライブラリーの第一の試
薬のオリゴヌクレオチド鎖を固定化オリゴヌクレオチド
に隣接する標的核酸にハイブリダイズさせ、 ｄ）隣接するオリゴヌクレオチドをライゲーションし、
このことによりライゲーションされた第一の試薬を形成
し、 ｅ）他のライゲーションされなかった試薬を除去し；そ
して ｆ）標的核酸の第一の部分の配列の指標として、ライゲ
ーションされた第一の試薬のタグ部分を回収して分析す
ること の各工程を含む方法。 - 【請求項１６】下記の追加の工程： ci）ｆ）からのハイブリッドと請求項12に記載のライブ
ラリーをインキュベートして、ライブラリーの第二の試
薬のオリゴヌクレオチド鎖を第一の試薬のオリゴヌクレ
オチド鎖に隣接する標的核酸にハイブリダイズさせ、 di）隣接するオリゴヌクレオチドをライゲーションし、
このことによりライゲーションされた第二の試薬を形成
し、 ei）他のライゲーションされなかった試薬を除去し；そ
して fi）標的核酸の第二の部分の配列の指標として、ライゲ
ーションされた第二の試薬のタグ部分を回収して分析す
ること、 を含む請求項15に記載の方法。 - 【請求項１７】工程ａ）においてオリゴヌクレオチドは
支持体としての一連の針の末端に固定化されており；工
程ｂ）において標的DNAの個々のクローンを各々の個々
の針に固定化されているオリゴヌクレオチドにハイブリ
ダイズさせ；工程ｃ）およびｄ）において、異なるライ
ゲーションされた試薬を有する異なる針を有する一連の
ライゲーションされた試薬が形成され；および工程ｆ）
において各々のライゲーションされた試薬のタグ部分が
回収されおよび標的DNAの一部の配列の指標として分析
される、請求項15または16に記載の方法。 - 【請求項１８】工程ｂ）において標的DNAの各々の個々
のクローンを支持体の個々の間隔をとった位置に固定化
されたオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせ；工程
ｃ）およびｄ）において異なるライゲーションされた試
薬を有する支持体の、異なる、間隔をとった位置を有す
る一連のライゲーションされた試薬が提供され；および
工程ｆ）において各々のライゲーションされた試薬のタ
グ部分が回収されおよび標的DNAの一部の配列の指標と
して分析される、請求項15または16に記載の方法。 - 【請求項１９】以下の工程： ａ）支持体上の間隔をとった位置に固定化されたオリゴ
ヌクレオチドのアレイを用意し、一つの位置のオリゴヌ
クレオチドは他の位置のオリゴヌクレオチドとは異なっ
ており、 ｂ）支持体上で一つまたはそれ以上の間隔をとった位置
でハイブリッドを形成させるように標的核酸を固定化さ
れたオリゴヌクレオチドのアレイとインキュベートし、 ｃ）ｂ）からのハイブリッドと請求項12に記載のライブ
ラリーをインキュベートして、ライブラリーの試薬のオ
リゴヌクレオチド鎖を各々の固定化オリゴヌクレオチド
に隣接する標的核酸にハイブリダイズさせ、 ｄ）隣接するオリゴヌクレオチドをライゲーションし、
このことにより支持体上の一つまたはそれ以上の間隔を
とった位置でライゲーションされた試薬を形成し、 ｅ）他のライゲーションされなかった試薬を除去し；そ
して ｆ）標的核酸の一部の配列の指標として各々のライゲー
ションされた試薬のタグ部分を回収して分析すること、 を含む請求項15または16に記載の方法： - 【請求項２０】支持体上の各々間隔をとった位置に共有
結合で固定化されているオリゴヌクレオチドの配列が知
られている請求項19に記載の方法。 - 【請求項２１】標的DNAの分析法であって、 ｉ）支持体上に固定化された標的DNAを用意し、 ii）異なる試薬のオリゴヌクレオチド鎖が支持体上の標
的DNAにハイブリダイズするように、ｉ）からの固定化
された標的DNAを請求項９に記載の多数の試薬とともに
インキュベートし、 iii）ハイブリダイズしていない試薬を除去し、そして iv）標的DNAの一部の配列の指標として各々の試薬のタ
グ部分を回収して分析すること、 の各工程を含む方法。 - 【請求項２２】追加の工程： ii a）異なる試薬のオリゴヌクレオチド鎖が標的DNAに
ハイブリダイズするように、iv）からのハイブリッドを
請求項12に記載のライブラリーとともにインキュベート
し、 iii a）標的DNAにハイブリダイズした隣接するオリゴヌ
クレオチドをライゲーションさせ、およびライゲーショ
ンされていない試薬を除去し、そして iv a）標的DNAの一部の配列の指標として各々のライゲ
ーションされた試薬のタグ部分を回収して分析するこ
と、 を含む請求項21に記載の方法。 - 【請求項２３】標的核酸の個々のクローンが支持体上の
間隔をとった位置に固定化され、このことにより工程i
i）において異なる試薬のオリゴヌクレオチド鎖が支持
体上の異なる、間隔をとった位置で標的核酸にハイブリ
ダイズする、請求項21または22に記載の方法。 - 【請求項２４】各々のタグ部分がその付随する試薬から
光切断により回収される、請求項13から23のいずれかに
記載の方法。 - 【請求項２５】タグ部分が質量分析法により分析され
る、請求項13から24のいずれかに記載の方法。 - 【請求項２６】その上に二つまたはそれ以上の間隔をと
った位置を持つ支持体；支持体上の間隔をとった位置に
固定化された標的核酸の個々のクローン；および支持体
上の間隔をとった位置で標的核酸の個々のクローンにハ
イブリダイズする請求項９の異なる試薬；を含むアッセ
イ器具。
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