JP2003508024A

JP2003508024A - 核酸断片の特定方法

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Publication number: JP2003508024A
Application number: JP2001513629A
Authority: JP
Inventors: ベルリン，クルト
Original assignee: エピゲノミクスアーゲー
Priority date: 1999-07-28
Filing date: 2000-07-27
Publication date: 2003-03-04
Also published as: AU771491B2; DE19935749C2; EP1204763B1; DE50008148D1; ATE278808T1; WO2001009374A3; WO2001009374A2; CA2379163A1; DE19935749A1; AU6819500A; EP1204763A2; DE10082230D2

Abstract

(57)【要約】本発明は核酸断片の特定方法に関する。【解決手段】下記a）〜f）からなることを特徴とする核酸断片の特定方法。a）特定しようとする核酸断片を表面上に固定する。b）他の第２の表面上でオリゴマーの一つの配列を製造し、その際、オリゴマーに標識を付加する。c）予め決められた表面の範囲を残すことなく、合成されたオリゴマーを表面から剥がす。d）特定しようとする核酸を固定した表面に接触し、その際、オリゴマー配列の表面で、相補的なオリゴマー配列を特定しようとするＤＮＡにハイブリッド形成する。e）相補的ではないオリゴマーを除去する。f）相補的オリゴマーをその標識により検出する。その際、表面の位置により配列の情報を確認する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は核酸断片の特定方法に関する。

【０００２】ドイツ公開公報９９／２９８９７号には核酸の同定用キット及び同定方法が記
載されている。

【０００３】米国特許第５，９２９，２０８号には、特定しようとする核酸が、オリゴマー
配列の表面と接触し、相補的なオリゴマー配列が特定しようとするＤＮＡとハイ
ブリット形成し、ハイブリット形成されない核酸が除去されることが記載されて
いる。ここでは配列の中の特定の位置に荷電されているので、オリゴマーが特定
の位置に結合するように制御される。

【０００４】今日ではオリゴヌクレオチッド配列を形成できる種々の方法が公知である。

【０００５】１）全てのオリゴマーは各々従来の方法で、比較的大量の反応用ガラス中また
は特殊な自動合成で製造され、次いで、これが各担体上にピペットされる。その
他の方法としては、自動の高精度のマイクロピペットロボットが使用されている
。これらの方法の利点は広範囲の、殆ど最善の標準的方法であり、装置であるこ
とである。この方法により高品質のＤＮＡ配列を高純度のオリゴマーで製造でき
る。このことは、極めて良い影響を配列の検出感度及びその信頼性に与える。ま
たこの方法の大きな問題点は、著しく費用がかかり、従って高コストであること
である。このことは個々のオリゴマーの合成に特によく当てはまる。

【０００６】商業的に合成されたオリゴヌクレオチッドは特に高価で、モノマーの合成には
比較的費用がかかり、いくつかの特別な特許の実施許諾料がコストに加算され、
その他に、使用する溶剤は高純度であることが要求されるから、購入した市販の
オリゴマーでは、問題は解決しない。

【０００７】２）オリゴマーは極少量を基質上に直接ピペットで供給して合成される。どの
ラスター点でも、ヌクレオ塩基の連続するオリゴマー鎖が合成される。ピペット
による供給は方法１）に類似する方法で、特殊なマイクロピペットロボットまた
は、例えば、個々の合成原料を配列位置にまで供給する導管を備えた装置を使用
する。化学合成法は原理的には従来の自動合成器によるオリゴマー合成と同じで
あるが、その間の差異は、全てのオリゴマーがその数に依ることなく、同時に一
つの自動装置によって、直接、予め、決められた位置で合成されることである。
方法１）で区別されたオリゴマー合成及びマイクロピペット法は一つの過程に合
体する。装置及び手作業に要する経費は方法１）に比較して大幅に減少する。

【０００８】オリゴマーは方法２）のように基質上で直接合成される。完全に平行な、半導
体技術に由来するホトグラフ技術が、目的に合致した正確な配列を与えるピペッ
ト法の代わりに、正しいヌクレオ塩基が正しいラスター点に結合される。この方
法は一定の波長の光を５’−ＯＨ保護基に照射して、これを除去することができ
る。好適な位置に照射できる器具により、オリゴヌクレオチッド末端で正確にラ
スター点に反応させることができ、その位置に、次の段階で新しいヌクレオチッ
ドの構成成分を結合させることができる。ヌクレオチッド構成成分の溶液で配列
表面を完全に濡らすことで、これまで光照射された位置にクレオチッド塩基が結
合される。そして光が照射されない位置のものは全て変化しないままである。光
照射サンプルはマイクロホトグラフの白黒マスクを基質と光源の間に設け、この
マスクで全てのラスター点を蔽い、反応させないようにする。ヌクレオ塩基の周
囲の全てのラスター点でオリゴマー鎖長を伸ばすには、最初のマスクにより正確
に、最初の４種類の可能なヌクレオ塩基（例えばＣ）の周囲に拡大されるところ
の、ラスター点が光照射される。その後に、これらの塩基の光照射された位置の
みが伸長するように、配列は対応するヌクレオチッドの溶液で濡らされる。新た
に結合したヌクレオチッド構成成分は、全て保護基に付加されるので、これら保
護基が更に照射され、分解されるまでは、次の反応段階に進むことができない。
この反応段階の後、配列は洗浄される。次に、第２のマスクにより正確にラスタ
ー点が照射され、４種類の可能なヌクレオ塩基（例えば、Ｔ）の周囲に拡大され
る。更に、この配列は、対応するヌクレオチッド構成成分の溶液によって、濡ら
され、光照射された位置はそれにより塩基の周囲に伸張する。正確には、そのま
まの二つのヌクレオ塩基（Ｇ及びＡ）、ヌクレオ塩基の周囲にある全てのオリゴ
マーの伸長には、４つの照射段階と４つのホトマスクが必要である。

【０００９】この方法は処理時の高い平行性のために非常に速く、且つ効率的で、それは高
精度のフォトリソグラフで達成できる精度が好適であり、非常に高いラスター点
密度によって達成できる。

【００１０】オリゴマー配列の従来技術の概観としては、Ｎature Ｇeneticsの別冊（Ｎatu
re Ｇenetics Ｓupplement、Ｖolume ２１、Ｊanuary １９９９）及びそこで引
用されている文献がある。

【００１１】一般にオリゴマー配列及びホトマスクの設計に関する特許としては、例えば、
米国特許第５８３７８３２号、米国特許第５８５６１７４号、米国特許第５８５
６１０１号、ドイツ公開公報９８／２７４３０号がある。それらの特許の中で光
分解性のヌクレオシッドの保護基の使用に関するものに、例えば、ドイツ公開公
報９８／３９３４８号、米国特許第第５７６３５９９号がある。

【００１２】ＤＮＡを固定するには、多くの方法があるが最も知られた方法は、ＤＮＡをビ
オチンで官能化して、ストレプトアビジンの皮膜で被覆した表面に固定するもの
である。このシステムの結合の強さは単独で存在するのではなく、化学的共有結
合に対応するものである。一つの目的−ＤＮＡを化学処理済みの表面に共有結合
させるためには、目的−ＤＮＡが対応する官能基を必要とする。ＤＮＡ自体は好
適な官能化能力を有しない。一つの目的−ＤＮＡの異なる変形には好適な官能化
機能に通じるものがある。二つの、容易に手作業で出来る、官能化機能を与える
基は、まず第一に脂肪族アミン及びチオールである。この脂肪族アミンはＮ−ヒ
ドロキシ−サクシンイミドエステルと定量的に反応する。また、チオールは好適
な条件下で沃化アルキルと反応する。このＤＮＡの官能化機能の実施には一つの
困難が存在する。最も簡明な変形は一つのＰＣＲのプライマーにより実行される
。示される変形には５’位置が反応したプライマー（ＮＨ₂、ＳＨ）及び２官能
性リンカーを使用する。表面への固定の本質的な構成要素はその性状による。今日まで報告されたシス
テムは主として、シリコンまたは金属（磁性粒子）である。目的−ＤＮＡの結合
に関するその他の方法は、目的−ＤＮＡにおける短い配列長さ（例えば、２０個
の塩基）をハイブリッド形成のために表面固定されるオリゴヌクレオチッドに使
用する方法である。酵素反応による変化では目的−ＤＮＡの化学的に活性化され
た位置に書き込みが行われる。ここでは、目的−ＤＮＡにおいて、５’−ＮＨ₂
−官能化が酵素反応で行われる。

【００１３】５−メチルシトシンはしばしば真核生物の細胞の共有結合した塩基である。こ
れは、例えば、転写、ゲノム書き込み及び腫瘍遺伝子の制御において一定の役割
を演じる。遺伝情報の構成要素としての５−メチルシトシンの同定はそれ故非情
に興味のあるものとなる。５−メチルシトシンの位置は、５−メチルシトシンが
シトシンと同じ塩基対の挙動を示すので、配列決定よっては同定できない。更に
、ＰＣＲ−増幅においては、５−メチルシトシンが有する新生の情報は全く失わ
れることになる。

【００１４】これらの問題点を解決する方法は多数ある。最も多いのは、ゲノムＤＮＡを化
学反応させるか、または、酵素で処理することであり、それによってシトシンが
メチルシトシン塩基から区別される。従来の方法はゲノムＤＮＡを重亜硫酸塩溶
液で化学変化させるもので、これはアルカリ加水分解で、２段階でシトシン塩基
をウラシルに変換する方法である[Ｓhapiro、Ｒ．、Ｃohen、B．、Ｓervis、Ｒ
．、Ｎature ２２７、１０４７（１９７０）]。５−メチルシトシンはこの条件
下では変化しない。ＣからＵヘの変換は塩基配列を変化させる。その結果から配
列決定により、最初の５−メチルシトシンが調べられる（Ｃシュプール帯を提供
する）。

【００１５】更に、５−メチルシトシンを証明する公知の方法についての概説は、それに引
用されている文献なども含めて、下記の文献から得られる。[Ｒein、Ｔ．、Ｄe
Ｐamphilis、Ｍ．Ｌ．、Ｚorbas、Ｈ．、Ｎucleic Ａcids Ｒes．２６、２２５
５（１９９８）。]

【００１６】マトリックス補助レーザー脱離／イオン化−質量分析法（ＭＡＬＤＩ）は分子
生物学的な分析のために、新しく、非常に性能の良い方法である（Ｋaras、Ｍ．
and Ｈillenkamp、Ｆ．１９８８．１０，０００ダルトンを超える分子量の蛋白
質のレーザー脱離、イオン化。Ａnal．Ｃhem．６０、２２９９〜２３０１）。分
析される分子はＵＶ吸収マトリックス中に埋め込まれる。短いレーザーパルスに
より、マトリックスは真空中に蒸発し、分析分子は断片化しないで、気相中へ送
り出される。設定電圧によりイオンは加速されて自由電場の飛行導管に入る。異
なる質量毎に、イオンは個々の大きさに加速される。小さい質量のイオンは大き
いイオンよりも早く検出器に到達する。飛行時間はイオン質量に加算される。ハ
ードウエアの技術革新は方法を著しく改善した。遅延抽出（ＤＥ）は言及に値す
る技術である。ＤＥは加速された電場がレーザーパルスの遅延によって挿入され
、衝撃数が減少するので信号の解明が改善される。

【００１７】ＭＡＬＤＩはペプチッド及び蛋白質の分析に特に優れている。核酸の分析に使
用した場合は、感度が約１００malではペプチッドに対してよりも結果は劣り、
断片の大きさが増加するに従がって、比率が低下する。その理由は、ペプチッド
及び蛋白質のイオン化には、単に唯一のプロトンが捕捉されねばならぬというこ
とである。数倍の負電荷のバックボーンを有する核酸には、マトリックスによる
イオン化プロセスは本質的に効率的ではない。ＭＡＬＤＩにとってはマトリック
スの選択が極めて重要である。ペプチッドの脱離にはいくつかの高性能のマトリ
ックスが発見され、これは微細に結晶化する。ＤＮＡに対しては２、３の請求さ
れているマトリックスが発見されており、これにより感度の差が減少した。感度
の差はＤＮＡが化学的に変化し、ペプチッドに類似するようになって、減少する
。ホスホロチオ核酸はバックボーンの通常のリン酸がチオリン酸で置換されたも
のであるが、これは簡単なアルキル化合物により、荷電していないＤＮＡに変化
する。

【００１８】一つのcharge tagsをこれら変化したＤＮＡに結合させると、ペプチッドの場
合のように、同じ範囲内で感度が上昇する。この変化により、ペプチッドの脱離
に使用されたのと類似のマトリックスを使用できる可能性が開けた。更に、もう
一つのcharge taggingの利点は、変化していない基質を証明するのを著しく困難
にする不純物の分析の安定性が高められることである。ＰＮＡs及びメチルホス
ホナートオリゴヌクレオチッドはＭＡＬＤＩで調べられ、分析される。

【００１９】数千の目的−ＤＮＡsの配列は固相に固定され、次いで、全ての目的−ＤＮＡs
は一般的に一つの配列の存在で、一つのＳonde（相補的配列の核酸）により調べ
られる。

【００２０】目的−ＤＮＡsのＳondeとの一致は、相互の二つの部分のハイブリッド形成に
よって、はじめて成就する。Ｓondeは任意の長さの任意の核酸配列である。最小
限度重複するＳonde配列の最適のものを選択する方法が多数ある。

【００２１】一定のＳonde配列を見出すために、Ｓonde配列の組合わせによって、それが達
成される。Ｏligofinger印刷はこの技術が使用される発端になった。目的−ＤＮ
Ａsの蓄積は、短い核酸Ｓondeで探索される。概して、Ｓondeの塩基長は８〜１
２塩基である。ナイロン膜上に固定された目的−ＤＮＡにＳondeがハイブリッド
形成される、Ｓondeには放射性標識が施され、ハイブリッド形成され、ハイブリ
ッド形成は放射能の所在位置によって判定される。

【００２２】固定された核酸の同定を質量分析で行うためのオリゴマーのＳondeの利用につ
いて特許に記載されている（英国特許９７１２１４７１．３号及び英国特許９７
１２１４７０．５号）。この方法では勿論オリゴマー配列は使用されていない。

【００２３】固定されたＤＮＡ配列の探索には、複数回、フルオレスセンスで標識されたＳ
ondeが使用される。特にフルオレスセンス標識にはＣy3及びＣy５色素をＳonde
の５’−ＯＨに使用することが好ましい。ハイブリッド形成されたＳondeのフル
オレスセンスの検出には、例えば、Ｋonfokal顕微鏡が使用され得る。Ｃy3及び
Ｃy５色素及びその類似品は市販されている。

【００２４】本発明の課題は従来技術の問題点を解決することにある。

【００２５】本発明は核酸断片の特定方法を創作したものであり、詳しくは下記の各段階か
らなる方法である。 a）特定しようとする核酸断片を表面に固定し、b）第２の表面上にオリゴマーを
形成し、このオリゴマーに標識を施し、c）合成したオリゴマーを、予め、決め
られた範囲の表面を残さないようにして、表面から分離し、d）特定しようとす
る核酸が固定されている表面とオリゴマー配列の表面、−このとき、相補的オリ
ゴマー配列を特定しようとするＤＮＡにハイブリッド形成するが、−とを接触さ
せる、e）相補的でないオリゴマーを除去し、f）相補的オリゴマーをその標識に
よって検出する（その際、表面上の場所によって配列の情報を確認する）。

【００２６】本発明において特定しようとするＤＮＡ断片はゲノムＤＮＡの増幅産物である
。

【００２７】本発明の主要な形態はゲノムＤＮＡをその増幅に先だって、重亜硫酸塩、酸性
亜硫酸塩、亜硫酸水素塩の中の１種の溶液で処理することである。

【００２８】本発明においては、更に、特定しようとする核酸断片が表面に共有結合してい
る。特定しようとする核酸断片にアミノ官能基を付加し、シリル化ガラス表面に
結合させる。

【００２９】本発明においては、更に、オリゴマー配列を第２の表面に共有結合させる。こ
のとき、オリゴマー配列にアミノ官能基を導入し、このオリゴマー配列はシリル
化したガラス表面に結合する。更に、本発明においてはオリゴマー配列を第２の
表面上でのオリゴマーの固相合成により形成する。

【００３０】本発明においては、特に、第２の表面におけるオリゴヌクレオチッドの固相合
成を閉鎖系の反応器で行い、この合成器に選択的に、特に、この場合、オリゴマ
ーの合成が合成原料を選択的に反応器に供給することにより行われる。

【００３１】本発明においては、更に、フォトリソグラフ法及び光分解性保護基がオリゴマ
ーの合成に使用される。

【００３２】本発明においては、更に、フォトリソグラフ法に電子的制御及び電子的変換が
可能なマスクが使用される。特に、この場合、フォトリソグラフ法は、選択的に
、切替え可能な鏡像配列を露光見本の作製のために使用される。

【００３３】本発明においては、更に、オリゴマー合成を窩洞配列で行うが、この窩洞は場
合によっては、更に、ハイブリッド形成のための合成器として使用される。

【００３４】更に、本発明の他の形態は、特定しようとする核酸断片を、場合によっては、
ハイブリッド形成のための合成器として使用されるところの、窩洞配列に固定す
る。その際、質量変化をもたらすか及び／またはフルオレスセンスとして作用す
る化合物を標識として使用する。特に、本発明においては、ハイブリッド形成さ
れたオリゴマーの検出を質量分析、とりわけ、マトリックス補助レーザー脱離及
び／またはイオン化−質量分析（ＭＡＬＤＩ）により行う。

【００３５】更に、本発明の対象となるキットは、本発明の各請求項に記載の方法を実施す
るためのキットであり、これは合成原料及び／または調べる核酸断片及び／また
は調べるＤＮＡ及び／または処理済み表面及び／またはフォトリソグラフマスク
及び／またはオリゴマーを包含する。

【００３６】本発明においては、また、核酸の特定法についても記載されている。特に本発
明の他の形態は、ゲノムＤＮＡの増幅時のシトシンメチル化サンプルの同定に使
用することができる。

【００３７】本発明は核酸の特定方法に関する。その際、核酸は表面に固定される。第２の
表面上で標識されたオリゴマーの配列、とりわけ、オリゴヌクレオチッドが固相
合成され、次いで、オリゴマーが予め決められた範囲を残すことなく表面から分
離される。両者の表面に僅少量のバッファー液が添加され、オリゴマー合成が行
われる場所で、第１の表面に固定された核酸にハイブリッド形成される。次いで
、ハイブリッド形成される場所に、オリゴマーがそれらの標識で記録される。そ
の際含有するハイブリッド形成されたオリゴマーの見本は特定しようとする核酸
の配列情報を調べるために使用される。本発明の他の特別な形態において、ゲノ
ムＤＮＡにおける、シトシンのメチル化見本の同定方法が使用される。そのため
に、第１の表面上にもたらされる前に、亜硫酸塩溶液による処理及び増幅がなさ
れる。

【００３８】増幅されたゲノムＤＮＡの特定のために、ＤＮＡサンプルがフルオレスセンス
で標識され、固定されたオリゴマーの配列に、ハイブリッド形成することにより
（従来技術）、オリゴマー配列が組み込まれる。同様に、増幅産物の配列を形成
し、それにＳondeをハイブリッド形成することは可能である。しかし、ほんの僅
かの量のＳondeが、例えば、フルオレスセンスによって限定的に区別されるので
、同時に使用できる。この問題をマススペクトル法で処理することは従来技術と
して、特許に記載されている。

【００３９】本発明の他の形態は同定すべきＤＮＡを表面上に固定し、オリゴマー配列の技
術を利用することである。これは多くの利点を提供する。その一つとして、ハイ
ブリッド形成が本質的に速く行われ、ここで述べられる形態では、他の利点は高
価な固定された目的−ＤＮＡのチップが、しばしば、完全に特定化によって必須
であるかのごとく、オリゴマーの除去後に再使用できることである。しばしば、
少量の増幅されたＤＮＡとして、オリゴマーに標識が付加される。この場合、オ
リゴマーが直接検出されるので、特に、一般的にマススペクトル法による検出が
行われる。この形態ではオリゴマーＢibliothekが使用され、その構成要素は各
質量で区別される得る。

【００４０】更に、本発明の本質的利点は、オリゴマーが固定されているオリゴマーの配列
では必然的に起こるように、無条件に、直接表面付近で、目的−ＤＮＡにハイブ
リッド形成することである。これは、しばしば、ハイブリッド形成の効率に関す
る問題を引起こしている。本発明において、オリゴマー配列形成の一般的利点は
、従来技術として述べられている。

【００４１】本発明の核酸の特定方法は以下の各段階に要約される。１．特定しようとする核酸が表面に固定される。２．第２の表面上にオリゴマー配列が形成され、これが検出可能な標識を含んで
いる。３．予め、決められた表面の範囲を残さずに、合成したオリゴマーを表面から分
離する。４．特定しようとする核酸が固定された表面はオリゴマーでコンタクトされる。５．相補的なオリゴマー配列が特定しようとするＤＮＡにハイブリッド形成され
、６．相補的なオリゴマーはその標識によって検出可能で、その表面上の場所によ
り配列情報が調査される。

【００４２】特定しようとする核酸はゲノムＤＮＡであり、特に、ゲノムＤＮＡ試料または
ＲＮＡであり得る。本発明の特別な形態は、ゲノムＤＮＡ試料の処理前に、重亜
硫酸塩溶液で処理してシトシンをウラシルに変換させることである。一方メチル
シトシンはこの条件下では変化しない。これまで先行した段階で、ゲノムＤＮＡ
中のメチル化サンプルの同定のために使用され得る。ゲノムＤＮＡ試料はこの方
法の感度を改良するために増幅される。これは特にＰＣＲにより達成される。

【００４３】本発明の第１段階では、まず、特定しようとするＤＮＡが表面上に固定される
。この表面はガラス、石英ガラスまたは例えば、シリカからなる。本発明の方法の
他の形態では、表面は化学的に活性化され、特定しようとする核酸と官能化され
た表面とが結合することができる。この表面の活性化は、特にシリル化である。
そのとき、エポキシ官能基による活性化が問題となる。特定しようとするＤＮＡ
に、直接、または、特に、ＰＣＲで、プライマーを経由して付加された１級アミ
ノ官能基が結合する。他に、表面はシリル化により、アミノ官能化される。それ
から、特定しようとするＤＮＡは一つのリンカー分子を経由して、アミノ官能基
と結合する。特定しようとするＤＮＡはこの場合、特にＰＣＲ中で付加されるア
ミノまたはメルカプト官能基を有している。２官能性リンカー分子としては、例
えば、ＳＩＡＢ、ＤＭＳまたはＰＩＴＣが使用される。

【００４４】表面の前処理及びリンカー法は、本発明の第２段階である第２の表面上でのオ
リゴマー配列の形成に当てはまる。オリゴマー配列は従来技術のように効率的に
形成されるが、オリゴマー配列が固相から再び分離できる点が従来技術とは異な
る。この分離は光化学的または酸または塩基、好ましくは塩基によって達成され
る。表面はオリゴマー配列のために、第１級アルコールまたはアミノ官能基によ
って処理される。第１級アルコール官能基は従来技術に対応して、表面のエポキ
シ化及びそれに続くオリゴエチレングライコールによる変換、特に、これについ
ては、簡略に、Ｂeier等（Ｎucleic Ａcids Ｒesearch、1999、１９７０〜７７
頁）によって前記のガラス表面のアミノ官能化が行われている。光化学的分離が
実施可能となるためには、アミノまたはＯＨ−官能化の後に、光分離を可能にす
るリンカーが使用される。本発明の他の実施では、合成後のオリゴマーの分離に
投入されるＢeier及びＰfleiderer等によって置換された保護基が使用され、そ
の際、表面からのオリゴマーの分離のために、塩基としてＤＢＵが使用される（
ドイツ特許Ａ１９６２５３９７）。

【００４５】オリゴマー配列の形成は、本発明の他の形態であって、閉鎖系の合成反応基中
で行われ、この反応基には選択的に合成原料が供給される。モノマーがピンによ
るか、または、ピエゾピペットロボットを介して直接導入され、そのとき反応基
は開放されている。他の合成法として、従来のフォトリソグラフ法によっても行
うことができる。その方法はマスクを通して、一定のモノマーの周囲に、オリゴ
マーの鎖延長化が行われる範囲に、光を照射するものである（従来技術参照）。
特に、その際、電子技術で変換できるダイナミックマスクが使用される。このマ
スクはＬＣＤデイスプレー、マイクロコード配列または接続可能なガラス繊維束
からなる。それには、新型のプロジェクターで使用されている傾斜式マイクロ鏡
が配列を通して表面上の点に選択的に照射される。一方、粘性、弾性マイクロ鏡
も使用可能である。フォトリソグラフ法ではモノマーに光分解性保護基を含有さ
せることが必要であり、モノマーの導入には、例えば、ピペットシステムを使用
して、従来の保護基が使用され得る。

【００４６】表面上の１箇所または複数箇所で、多くの異なるオリゴマーまたはオリゴマー
Ｂibliothekは、それらが、ハイブリッド形成後、全ての使用されている検出方
法で区別可能である限り、合成可能である。

【００４７】オリゴマー配列はオリゴヌクレオチッド及び／またはＰＮＡs（Ｐeptide Ｎuc
leic Ａcids）から構成することができる。従来技術に対応する合成方法が使用
されているが、これは従来技術とは若干変わっている。配列の１箇所または複数
箇所でオリゴマーＢibliothekが使用されるならば、ここではオリゴマーＢiblio
thekの構成成分の質量による分別がより容易にできるので、ＰＮＡが使用される
。オリゴマーは配列形成で、フルオレスセンスまたは特定の物質でもよい、標識
を含んでいる。この物質はオリゴマー自体またはオリゴマーに付随する官能基形
体の指標でもよい。

【００４８】本発明の方法の３番目は表面からオリゴマーを分離させることである。この分
離の際は、オリゴマーの配列順が崩れるような、表面上のオリゴマーの横への動
きをさせないように注意すべきである。これを防ぐために、本発明のその他の形
態において、既に、オリゴマー配列の形成が、どのようなタイプのオリゴマー配
列の形成でも、それに対して用意された窩洞において行われている。オリゴマー
は、この表面からの光化学的分離後には、窩洞には残っていない。

【００４９】本発明の方法の４番目は、最初の２次元配列中の標識されたオリゴマーを特定
しようとする核酸にハイブリッド形成することである。本発明の方法の他の形態
において、第２の表面の窩洞に、オリゴマーを結合させ、ハイブリッド形成用バ
ッファーを加え、次いで、特定しようとする核酸を有する表面を第２の表面と接
触させる。他の方法では、第１の表面または両表面は、ハイブリッド形成用バッ
ファーで満たされた窩洞を含む。この方法は、例えば、ピペットロボットまたは
ピンロボットにより行われる。窩洞のＲasterは第２の表面上のオリゴマー配列
のＲasterに対応する。

【００５０】相補的オリゴマーの特定しようとする核酸へのハイブリッド形成の後、両表面
は互いに分離され、非相補的オリゴマーが最初の表面から洗浄で除去される。

【００５１】本発明の方法の４番目で、相補的オリゴマーはその標識によって検出される。
配列形成から、第１の表面のどの点で、どのオリゴマーがハイブリッド形成され
るかが解る。本発明のその他の形態において、標識は、特に、Ｃy３またはＣy５
が好ましい。フルオレスセンススキャナで表面上のどの位置のフルオレスセンス
も検出されることができ、存在する位置についての情報でハイブリッド形成され
たオリゴマーが決められる。それから、特定しようとするＤＮＡについての部分
的または完全な情報が得られる。本発明のその他の形態において、ハイブリッド
形成されたオリゴマーの同一性は、この方法の第１段階に先だって、重亜硫酸塩
溶液で処理される場合は、特定しようとするＤＮＡのシトシンメチル化について
の情報による。

【００５２】本発明のその他の形態において、ハイブリッド形成されたオリゴマーの検出は
質量分析、特に、好ましくはマトリックス補助レーザー脱離／イオン化−質量分
析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）により行われる。そのためには、先ず、ハイブリッド形
成されたオリゴマーを有する第１の表面を１つのマトリックスで被覆し、次いで
、質量分析計の点を目指す。質量分析計のソフトウエアは表面の点についての得
られたスペクトルを整理する。ハイブリッド形成されたオリゴマーはその質量に
よって一義的に同定される。本発明のその他の形態において、配列形成によるオ
リゴマーは質量ラベルを備えている。もし、それらのオリゴマーの質量による区
別の可能性が少なくとも配列の１点で確実ならば、第２の表面上の１点で、最初
から、多数の異なるオリゴマーまたはオリゴマーＢibliothekが合成され得る。
本発明のその他の形態において、ハイブリッド形成されたオリゴマーの同一性は
、この方法の段階１に先だって、重亜硫酸塩溶液で処理される場合は、特定しよ
うとするＤＮＡのシトシンメチル化についての情報による。本発明のその他の形
態において、これらの情報はデータバンクの預けられ、特定しようとするＤＮＡ
に属する表現型と相関する。

【００５３】以下の実施例によって本発明を詳細に説明する。

【００５４】実施例１５’−ＤＭＴ及び光分解性保護基によるＤＮＡの合成ＤＮＡオリゴマーの合成は公知の、処理済みガラス表面でのリン酸アミド法に
よる。５’−保護基としては、酸非耐性のＤＭＴ基または光分解性基として知ら
れているものが使用される。これらの基の分解にはＤＭＴ基の場合はジクロロメ
タンにトリクロロ酢酸を添加した溶液が、光分解性基の場合には、波長３２０〜
３６５nmの光が使用される。環外アミン及びリン酸塩の保護基の分解は濃アンモ
ニア水による標準法が使用される。

【００５５】実施例２ＰＮＡオリゴマー配列の形成ＰＮＡオリゴマー（オリゴマー配列として）の形成は各構成成分のＳpottenに
よってチップ上で行われる。モノマーまたは原料のＳpottenの後、チップはジメ
チルホルムアミドによって未反応の化合物を除去するために洗浄される。そのと
き、例えば、ＰＮＡ配列の５’−ＡＧＣＣＡＧＣＴＣＡＣＴＡＣＣＴＡＧ
−３’、Ｃ末端（３’）からＮ末端（５’）までが形成される。これは処理済み
のガラス表面上で、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）溶液中のＮ−保護モノマー
Ｇ（Ｆmoc、５当量）の酸官能基の結合によって行われ、その際、ＤＭＦ溶液中
には、５当量のＤＩＰＥＡ、７．５当量のルチジン酸及び４．５当量のＨＡＴＵ
が同時に添加される。モノマーＡ、Ｃ、Ｇ及びＴの５’アミノ基はＦmoc基で、
モノマーＡ、Ｃ及びＧ上の環外アミノ基はＢhoc基で保護される。ＰＮＡモノマ
ー及び各化合物は市販されている（例えば、Ｐerkin Ｅlmer社）ので入手可能で
ある。

【００５６】次いで、ＤＭＦで洗浄され、未反応のアミノ基は無水酢酸／ルチジン酸−混液
と共にＤＭＦ中に残っているが、ＤＭＦで洗浄され、保護されている５’アミノ
官能基は２０％ピペリジン含有ＤＭＦで洗浄され、保護が解かれる。ＤＭＦによ
る洗浄後、結合しているＧモノマー上のＡモノマーがＳpottenされる。それに続
く合成サイクルによって完全なＰＮＡ配列が形成される。塩基Ａ、Ｃ及びＧの素
環外アミノ基を保護しているＢhoc基は合成が終わった段階で、m−クレゾールの
不存在下、トリフルオロ酢酸で洗浄し除去される。

【００５７】実施例３チップ上での、光分解性リンカーを含むＤＮＡの合成最初の段階で、目的とするオリゴヌクレオチッド構成物の結合が従来技術と同
様にできるように、ガラス基質を化学的に処理する。多種類のオリゴヌクレオチ
ッドを基質上に加えて、通常の方法でオリゴヌクレオチッド配列が形成される。
ガラス基質はシリル化されるが、これに使用されるシランは、例えば、ＯＨ、Ｎ
Ｈ₂基などの官能基を含むアルキル基を有している。次いで、表面には光分解性
リンカー、例えば、４[１，４−（Ｆmoc−アミノメチル）−２−メトキシ−５−
ニトロフェノキシ]ブタン酸（Ｎovabiochem社）が導入される。このリンカーは
波長３６５nmの光の照射で分解する。オリゴヌクレオチッドの合成、例えば、配
列５’−ＡＧＣＣＡＧＣＴＣＡＣＴＡＣＣＴＡＧ−３’の形成は、実施例
１でＤＭＴについて記載されたように、保護を解かれたリンカーのアミノ官能基
上で行われる。環外アミンの保護基、例えば、ベンゾイル基またはイソブチル基
は濃アンモニア水により除去される。ＤＮＡのチップ全体からの分離は光化学的
に行われ、最終的には表面の洗浄による。

【００５８】実施例４チップ上での、光分解性リンカーを含むＰＮＡの合成ガラス基質表面の処理は実施例３記載の様に、spottenされた光分解性リンカ
ーにより行われる。ＰＮＡ配列は、例えば、配列５’−ＡＧＣＣＡＧＣＴＣ
ＡＣＴＡＣＣＴＡＧ−３’の形成は、実施例２で記載されたように、構成成分
のＳpottenにより、保護を解かれたリンカーのアミノ官能基上で行われる。Ｂho
c保護基はトリフルオロ酢酸で洗浄し、除去され、合成されたＰＮＡ鎖は波長３
６５nmの光照射で分解される。

【００５９】ＰＮＡの合成は光分解性リンカー上で、極めて平坦なチップ上で行われる。そ
のとき、チップ上の構成成分は洗浄される。保護基の解放は前記の如くである。

【００６０】実施例５チップ上での、非光分解性リンカーを含むＤＮＡの合成最初の段階で、目的とするオリゴヌクレオチッド構成物の結合ができるように
、ガラス基質を化学的に処理する。それには、ガラス基質がシリル化される。こ
れに使用されるシランは、例えば、ＯＨまたはＮＨ₂基などの官能基を含むアル
キル基を有している。非光分解性リンカーの合成は５’を保護されたＴ、Ａ、Ｃ
またはＧモノマーと無水クエン酸及びジメチルアミノピリジンのカップリングに
より行われる。モノマーに含まれる保護基としては、例えば、従来使用のＤＮＡ
合成用のＤＭＴ基またはＤＮＡ配列に使用される光分解性基が使用される。予め
処理されたモノマーは基質と結合し、例えば、配列５’−ＡＧＣＣＡＧＣＴＣ
ＡＣＴＡＣＣＴＡＧ−３’の形成が実施例１に記載されているように行われ
る。５’保護基の分離はトリクロロ酢酸または波長３６５nm光照射により達成される
。アンモニア蒸気によりＤＮＡは基質から分離され、配列はＢlottingによって
ニトロセルロース膜へ吸収される。

【００６１】実施例６ＤＮＡオリゴマー配列のＢlotting 実施例５の処理済みガラス表面から分離したオリゴマー配列をＤＮＡ試料にハ
イブリッド形成するために、オリゴマー配列がニトロセルロース（Ａmersham Ｐ
harmacia Ｂiotech、Ｈybond Ｓerie、Ｎitrocellulose auf Ｎylon oder ＰＶ
ＤＦ）へ、ブロットされる。これは創案された、Ｓouthern Ｂlots、に類似して
いる。そのとき、オリゴマー配列の順序は、配列内の点の距離が十分である限り
、本質的に変化しない。そのために、ガラス基質は搭載サイトで、予めハイブリ
ッド形成用バッファー（ＳＳＣ＋ＳＤＳ、Ｄenhardtの試薬）で湿らされたニト
ロセルロース膜上に置かれる。加圧によってオリゴマーはニトロセルロース上に
吸収される。ニトロセルロース上にはＤＮＡ試料が固定され、これとオリゴマー
がハイブリッド形成する。ハイブリッド形成されないオリゴマーは洗い流される
。オリゴマーに導入されているフルオレスセンス標識によって検出が行われる（
実施例９参照）。

【００６２】実施例７チップ上での、非光分解性リンカーを含むＰＮＡの合成基質表面がシリル化される。これに使用されるシランは、例えば、ＯＨ、ＮＨ ₂ 基などの官能基を含むアルキル基を有している。次いで、アミンと非光分離性
リンカーであるカルボン酸、例えば、ヒドロキシアルキルカルボン酸またはエポ
キシ化合物を酸性条件下で、区別可能な鎖長のエチレングライコールとカップリ
ングさせる。ＰＮＡの合成は例えば、実施例２記載のように、配列５’−ＡＧＣ
ＣＡＧＣＴＣＡＣＴＡＣＣＴＡＧ−３’が形成される。モノマーＧと末端
にあるアルコールとのカップリングでエステルが形成される。ＰＮＡの合成は光
分解性保護基とともにアミノ基上で行われる。そのとき、分解は２０％ピペリジ
ン含有ＤＭＦを使用する代わりに、波長３６５nmの光で行われる。アンモニア蒸
気の作用でＰＮＡが基質から分離され、Ｂlottingによりニトロセルロース上で
ＤＮＡ試料と接触する。

【００６３】実施例８ＰＮＡオリゴマー配列のＢlotting ＰＮＡオリゴマーの同定方法はＤＮＡの同定方法に類似しており、ＰＮＡバッ
ファーが使用される。この方法は蛋白質同定用のＷestern Ｂlots法に似ている
。

【００６４】実施例９フルオレスセンス色素のＰＮＡオリゴマーヘのカップリングフルオレスセンス色素、好ましくは、Ｃy３またはＣy５をＰＮＡオリゴマーヘ
カップリングさせるために、Ｎ末端（５’アミノ基）を色素のＮ−ヒドロキシ−
サクシンイミド誘導体とアミドの形成下反応させる。そのとき、色素誘導体はＤ
ＭＦまたはＤＭＳＯに溶け、トリエチルアンモニウムハイドロジェンカルボナー
ト−バッファーの存在で固定されているオリゴマーと接触する。２時間後反応が
終了し、過剰になったか、または、加水分解した色素が水及びメタノールで洗浄
、除去される。

【００６５】実施例１０処理済みガラス表面へのＰＣＲ産物の固定ＰＣＲ産物を処理済みガラス表面へ固定するには、ＰＣＲ産物をガラス表面に
処理する。ＰＣＲ産物の３’末端に、フリーのアミノ基を備えたアミノプロピル
誘導体をカップリングする。ガラス表面は、３’−グリシドキシアルキルトリメ
トキシシラン及び触媒量のジイソプロピルエチルアミンで反応処理され、表面に
エポキシ化合物を形成する。固定の操作はＰＣＲ産物の０．１モル水酸化カリウ
ム溶液でspottenし、次いで、６時間、３７℃、湿度１００％の空気で培養する
。次いで、結合していないＰＣＲ産物を水洗除去する。

【００６６】実施例１１ＤＮＡ試料のニトロセルロースまたはＰＶＤＦ膜への固定ＤＮＡ試料のニトロセルロースまたはＰＶＤＦ膜への固定法は実験者のレポー
トによる。特に、膜はガラス表面上に顕微鏡フォーマット（例えば、Ｓchleiche
r及びＳchuell）で付着させ、ハイブリッド形成後、従来のフルオレスセンスス
キャナで簡単に分析できるので、好ましい。固定後、膜はハイブリッド形成用バ
ッファーで湿らされる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記a）〜f）からなることを特徴とする核酸断片の特定方法。 a）特定しようとする核酸断片を表面上に固定する。 b）第２の表面上でオリゴマーの一つの配列を形成し、その際、オリゴマーに
標識を付加する。 c）予め、決められた表面の範囲を残すことなく、合成されたオリゴマーを表
面から分離する。 d）特定しようとする核酸を固定した表面に接触し、その際、オリゴマー配列
の表面で、相補的なオリゴマー配列を特定しようとするＤＮＡにハイブリッド形
成する。 e）相補的ではないオリゴマーを除去する。 f）相補的なオリゴマーをその標識により検出する。その際、表面の位置によ
り配列の情報を確認する。
【請求項２】特定しようとする核酸断片がゲノムＤＮＡの増幅産物であること
を特徴とする請求項１に記載の核酸断片の特定方法。
【請求項３】増幅に先立ち、ゲノムＤＮＡを重亜硫酸塩、亜硫酸水素塩または
酸性亜硫酸塩の中の１種の溶液で処理することを特徴とする請求項２に記載の核
酸断片の特定方法。
【請求項４】特定しようとする核酸断片を表面に共有結合させることを特徴と
する請求項１〜３の何れか１項に記載の核酸断片の特定方法。
【請求項５】特定しようとする核酸断片にアミノ官能基を導入し、シリル化ガ
ラス表面に結合させることを特徴とする請求項４に記載の核酸断片の特定方法。
【請求項６】オリゴマー配列を第２の表面に共有結合させることを特徴とする
請求項１〜５の何れか１項に記載の核酸断片の特定方法。
【請求項７】オリゴマー配列にアミノ官能基を導入し、シリル化ガラス表面に
結合させることを特徴とする請求項１〜６の何れか１項に記載の核酸断片の特定
方法。
【請求項８】オリゴマー配列を第２の表面上で、オリゴマーの固相合成で製造
することを特徴とする請求項１〜７の何れか１項に記載の核酸断片の特定方法。
【請求項９】オリゴヌクレオチッドの固相合成を、閉鎖系反応器中で、これに
選択的に合成原料を供給し、且つ、反応器中の第２の表面上で行うことを特徴と
する請求項８に記載の核酸断片の特定方法。
【請求項１０】オリゴマーの合成を、合成原料をオリゴマーが合成される場所
に選択的に供給することにより行うことを特徴とする請求項９に記載の核酸断片
の特定方法。
【請求項１１】フォトリソグラフ法及び光分解性の保護基を使用することを特
徴とする請求項１〜１０の何れか１項に記載の核酸断片の特定方法。
【請求項１２】フォトリソグラフ法を、電子的制御及び変換可能なマスクを使
用して行うことを特徴とする請求項１１に記載の核酸断片の特定方法。
【請求項１３】フォトリソグラフ法において、選択的に切り替え可能な鏡像配
列を露光見本の作製のために使用することを特徴とする請求項１１に記載の核酸
断片の特定方法。
【請求項１４】オリゴマーの合成を窩洞のある配列で行い、場合によってはこ
れをハイブリッド形成に使用することを特徴とする請求項１〜１３の何れか１項
に記載の核酸断片の特定方法。
【請求項１５】窩洞のある配列に特定しようとする核酸断片を固定し、場合に
よってはこれをハイブリッド形成に使用することを特徴とする請求項１〜１３の
何れか１項に記載の核酸断片の特定方法。
【請求項１６】オリゴマーの標識として、変化及び／またはフルオレスセンス
として作用する化学基を使用することを特徴とする請求項１〜１５の何れか１項
に記載の核酸断片の特定方法。
【請求項１７】ハイブリッド形成されたオリゴマーの検出を質量分析、とりわ
け、マトリックス補助レーザー脱離／イオン化−質量分析（ＭＡＬＤＩ）を使用
して行うことを特徴とする請求項１〜１６の何れか１項に記載の核酸断片の特定
方法。
【請求項１８】ゲノムＤＮＡ試料中のシトシンのメチル化の情報を確認するこ
とを特徴とする請求項１〜１７の何れか１項に記載の核酸断片の特定方法。
【請求項１９】合成原料及び／または調べる核酸断片及び／または調べるＤＮ
Ａ及び／または処理された表面及び／またはフォトリソグラフマスク及び／また
はオリゴマーを含む請求項１〜１８の何れか１項に記載の核酸断片の特定方法を
実施するためのキット。