JP2008541705A - 非標準塩基を含むプライマーを使用する等温鎖置換増幅 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、温度サイクル無しで核酸分子を増幅するための方法に関する。
核酸配列の集団から特定の配列を増幅するために最も広く使用されている方法は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による方法である(ディーフェンバハ C(Dieffenbach C)およびドベクスラー G(Dveksler G)編。PCR Primer:A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Press,Plainview、ニューヨーク州)。この増幅方法では、オリゴヌクレオチド(一般に、増幅される領域のどちらかの末端における相補鎖上の15〜30ヌクレオチド長)を使用して、変性された一本鎖DNA鋳型上でDNA合成を開始する。変性とプライマーハイブリダイゼーションと耐熱性DNAポリメラーゼを使用したDNA鎖合成との連続サイクルによって、プライマー間の配列を指数関数的に増幅することが可能となる。RNA配列は、初めに逆転写酵素を使用して複製することによって増幅することができ、その結果、cDNAコピーが生成される。増幅されたDNAフラグメントは、種々の手段によって検出することができる。その手段としては、ゲル電気泳動、標識プローブとのハイブリダイゼーション、その後の同定を可能にする(例えば、酵素結合アッセイによって)タグ付きプライマーの使用、標的DNAとのハイブリダイゼーション時にシグナルを生じる蛍光タグ化プライマーの使用(例えば、BeaconおよびTaqManシステム)が挙げられる。
第1の態様において、本発明は、等温DNA増幅のための方法を提供し、本方法は、
増幅されるDNAに、
DNAのある領域に少なくとも部分的に相補的であり、非標準塩基を含む第1のプライマーと、
DNAのある領域に少なくとも部分的に相補的であり、非標準塩基を含む第2のプライマーと、
DNAポリメラーゼと、
鎖置換が可能な酵素と、
二本鎖DNA中の非標準塩基を認識し、一方のDNA鎖において、非標準塩基においてもしくはその付近でニックを生じるか、または塩基を切除する酵素と
を含む増幅混合物を提供する工程;および
上記DNAを実質的に温度サイクル無しで増幅する工程
を含む。
DNAポリメラーゼ;
鎖置換が可能な酵素;および
二本鎖DNA中の非標準塩基を認識し、一方のDNA鎖において、非標準塩基の部位で、もしくはその付近でニックを生じるか、または塩基を切除する酵素
を備える。
材料および方法
非標準塩基
非標準塩基は、本明細書中で、アデニン(A)、チミン(T)、グアニン(G)およびシトシン(C)以外の、DNA骨格中に挿入され得る化学物質と定義される。非標準塩基の例としては、デオキシイノシン、8デオキシグアニンまたはヒドロキシウラシル、5−メチル−dC、Cを有する5ブロモ−dUイノシン、リボヌクレオチド、およびウラシルが挙げられるが、これらに限定されない。
プライマーは、任意の市販のDNA合成サービスまたは社内(研究室内)のDNA合成装置を使用して合成することができる。標準的なホスホアミダイト合成技術を使用して、非標準塩基を任意の位置でプライマーに組み込むことができる。
いくつかの様式が、本発明を実施するために利用することができる。
I.酵素エンドヌクレアーゼVによって認識される非標準塩基であるデオキシイノシンを含むオリゴヌクレオチド
II.酵素Fpgによって認識される非標準塩基である、8デオキシグアニンまたはヒドロキシウラシルを含むオリゴヌクレオチド
III.酵素hOGG1によって認識される非標準塩基である、8デオキシグアニンまたはヒドロキシウラシルを含むオリゴヌクレオチド
IV.酵素RNase Hによって認識される非標準塩基であるリボヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド
V.酵素ウラシルDNAグリコシラーゼまたはUSER酵素によって認識される非標準塩基であるウラシルを含むオリゴヌクレオチド
VI.酵素McrBCによって認識される非標準塩基である5−メチルシトシンを含むオリゴヌクレオチド
プライマー中の非標準塩基は、N=デオキシイノシンとした。
50ngのプライマー
500μM dNTP、
1mM MgCl2、
9μlの×1Stoffel緩衝液(Perkin Elmer−Applied Biosystems,Foster City、米国)。
本発明による増幅は、以下の様式で起こる(図1を参照のこと)。
第1のプライマーが、DNAの一方の鎖に結合し(A)、
DNAポリメラーゼが第1のプライマーを伸長して、非標準塩基を含む第1の新しく合成された鎖を有する二本鎖分子を形成し(B)、
ニッキング酵素が、伸長したDNAの非標準塩基においてまたはその付近でニックまたは塩基切除を生じ(C)、
鎖置換酵素または鎖置換が可能なDNAポリメラーゼが、第1の新しく合成された鎖を置換し(D)、
第2のプライマーが、置換された第1の新たに合成された鎖に結合し(E)、
DNAポリメラーゼが、第2のプライマーを伸長して、非標準塩基を含む第2の新たに合成された鎖を有する二本鎖分子を形成し(F)、
ニッキング酵素が、伸長したDNAの非標準塩基においてまたはその付近でニックまたは塩基切除を生じ(G)、
鎖置換酵素または鎖置換が可能なDNAポリメラーゼが、第2の新しく合成された鎖を置換し(H)、
第1のプライマーが、置換された第2の新しく合成された鎖に結合し(I)、そして
このプロセスが、繰り返されることにより、DNA鎖の新たな合成が続いていく(J)。
等温増幅の特異性
本発明の特異性を証明するために、増幅反応を2つの人工DNA分子(標的および非標的)において行った。
9μlの×1Stoffel緩衝液(Perkin Elmer−Applied Biosystems,Foster City、米国)中、50ngの上記各オリゴヌクレオチドプライマー、500μM dNTP、1mM MgCl2、0.5UエンドヌクレアーゼV、2U Klenowエキソ−。
増幅の効率を測定するために、本発明に記載の方法によって連続希釈した標的DNAを増幅した。
9μlの×1Stoffel緩衝液(Perkin Elmer−Applied Biosystems,Foster City、米国)中、50ngの上記各オリゴヌクレオチドプライマー、500μM dNTP、1mM MgCl2、0.5UエンドヌクレアーゼV、2U Klenowエキソ−。
市販の増幅標準と本発明の効率を比較するために、同じプライマーおよび標的DNAを使用してPCRを行った。
図5は、ヒトゲノムDNA由来の12S rDNA遺伝子の増幅を示す。増幅は、以下の条件下で行った。
9μlの×0.5Stoffel緩衝液(Perkin Elmer−Applied Biosystems,Foster City、米国)中、
50ngの各オリゴヌクレオチドプライマー
全長ヒトパピローマウイルス(HPV)のウイルスゲノムHPV1a(45021)、HPV16(45113D)およびHPV18(45152D)を含むプラスミドをATCCから入手した。供給者の推奨によって指摘されているようにプラスミド調製物を調製した。Qiagenプラスミド中型キット(Cat#12143)を使用してプラスミドを精製した後、HPV−1aおよびHPV−16についてはHindIII(NEB Cat#R0104S)で、またはClaI(NEB Cat#R0197S)で、製造者の指示に従ってプラスミドを線状にした。等温増幅のための鋳型となるようにプラスミドの10倍連続希釈物を滅菌水に調製した。
9μlの×1Stoffel緩衝液(Perkin Elmer−Applied Biosystems,Foster City、米国)中、50ngの上記各オリゴヌクレオチドプライマー、500μM dNTP、1mM MgCl2、0.5UエンドヌクレアーゼV、2U Klenowエキソ−。
9μlの×1Stoffel緩衝液(Perkin Elmer−Applied Biosystems,Foster City、米国)中、50ngの上記各オリゴヌクレオチドプライマー、500μM dNTP、1mM MgCl2、0.5UエンドヌクレアーゼV、2U Klenowエキソ−。
9μlの×1Stoffel緩衝液(Perkin Elmer−Applied Biosystems,Foster City、米国)中、50ngの上記各オリゴヌクレオチドプライマー、500μM dNTP、1mM MgCl2、0.5UエンドヌクレアーゼV、2U Klenowエキソ−。
9μlの×10反応緩衝液(NEB緩衝液1、Klenow緩衝液またはStoffel緩衝液のいずれか)中、50ngの上記各オリゴヌクレオチドプライマー、500μM dNTP、1mM MgCl2、0.1U RNaseH、2.5U Klenowエキソ−。
9μlの×10反応緩衝液×1Stoffel緩衝液(Perkin Elmer−Applied Biosystems,Foster City、米国)中、50ngの上記各オリゴヌクレオチドプライマー、500μM dNTP、1mM MgCl2、1U Fpg、2.5U Klenowエキソ−。
Claims (36)
- 等温DNA増幅のための方法であって、
増幅されるDNAに、
DNAのある領域に少なくとも部分的に相補的であり、非標準塩基を含む第1のプライマーと、
DNAのある領域に少なくとも部分的に相補的であり、非標準塩基を含む第2のプライマーと、
DNAポリメラーゼと、
鎖置換が可能な酵素と、
二本鎖DNA中の非標準塩基を認識し、一方のDNA鎖において、該非標準塩基においてもしくはその付近で、ニックを生じるか、または塩基を切除する酵素と
を含む増幅混合物を提供する工程;および
該DNAを実質的に温度サイクル無しで増幅する工程
を含む、方法。 - 前記DNAが、前記増幅混合物を加える前、加えている間、または加えた後に変性される、請求項1に記載の方法。
- 前記第1のプライマーが、DNAの第1の鎖のある領域に少なくとも部分的に相補的であり、前記第2のプライマーが、DNAの第2の鎖のDNAのある領域に少なくとも部分的に相補的である、請求項1または2に記載の方法。
- 前記第1のプライマーおよび前記第2のプライマーが、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド類似体、PNA/オリゴヌクレオチドまたはINA/オリゴヌクレオチドなどのキメラ性のオリゴヌクレオチドである、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記プライマーが、デオキシオリゴヌクレオチドである、請求項4に記載の方法。
- 前記プライマーが、2つ以上の非標準塩基を含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記プライマーがDNAに結合するとき、該プライマーが、前記酵素によって認識される部位を形成する、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記非標準塩基が、アデニン(A)、チミン(T)、グアニン(G)およびシトシン(C)以外の、DNA骨格内に挿入され得る化学物質である、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記非標準塩基が、デオキシイノシン、8デオキシグアニン、ヒドロキシウラシル、リボヌクレオチド、5−メチルシトシンおよびウラシルからなる群から選択される、請求項8に記載の方法。
- 前記非標準塩基が、デオキシイノシンである、請求項9に記載の方法。
- 前記鎖置換酵素が、ヘリカーゼ、APエンドヌクレアーゼ、および任意の鎖置換が可能な酵素のうちのミスマッチ修復酵素からなる群から選択される、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記DNAポリメラーゼが、鎖置換能力も有する、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記DNAポリメラーゼが、エキソヌクレアーゼ欠損である、請求項12に記載の方法。
- 二本鎖DNA中の非標準塩基を認識することができる前記酵素が、エンドヌクレアーゼV(デオキシイノシン3’エンドヌクレアーゼ)、Fpg、hOGG1、RNase H、McrBCおよびウラシルDNAグリコシラーゼからなる群から選択される、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 前記酵素が、エンドヌクレアーゼVである、請求項14に記載の方法。
- DNA増幅に必要な添加物をさらに含む、請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法。
- 前記添加物が、ヌクレオチド、マグネシウムイオンまたはマンガンイオンなどの緩衝液または希釈剤、補助因子、およびT4gp32などの一本鎖結合タンパク質を含む、請求項16に記載の方法。
- 増幅が、前記酵素が所望の活性を有する任意の適した温度で行われる、請求項1〜17のいずれか1項に記載の方法。
- 前記温度が、約20℃〜約75℃である、請求項18に記載の方法。
- 前記温度が、約42℃である、請求項19に記載の方法。
- 前記DNAが、一本鎖改変DNAを形成するための条件下で、シトシン塩基を改変するが、5’−メチル−シトシン塩基を改変しない改変剤で前処理される、請求項1〜20のいずれか1項に記載の方法。
- 前記改変剤が、亜硫酸水素塩、酢酸塩またはクエン酸塩から選択され、処理が、実質的なDNA断片化を生じない、請求項21に記載の方法。
- 前記改変剤が、亜硫酸水素ナトリウムである、請求項22に記載の方法。
- 等温DNA増幅のためのキットであって、
DNAポリメラーゼ;
鎖置換が可能な酵素;および
二本鎖DNA中の非標準塩基を認識し、一方のDNA鎖において、該非標準塩基の部位で、もしくはその付近でニックを生じるか、または塩基を切除する酵素
を備える、キット。 - DNA増幅に必要な添加物をさらに備える、請求項24に記載のキット。
- 前記キットを使用するための指示書をさらに備える、請求項24に記載のキット。
- 前記DNAポリメラーゼと鎖置換が可能な酵素が、同じ酵素である、請求項24〜26のいずれか1項に記載のキット。
- 少なくとも1つの内部非標準塩基を含み、DNAのある領域に結合したとき、一方のDNA鎖において、前記非標準塩基の部位でもしくはその付近で、ニックを生じることができるかまたは塩基を切除することができる酵素によって認識される部位を形成する、等温DNA増幅のためのプライマー。
- 前記非標準塩基が、アデニン(A)、チミン(T)、グアニン(G)およびシトシン(C)以外の、DNA骨格中に挿入され得る化学物質である、請求項28に記載のプライマー。
- 前記非標準塩基が、デオキシイノシン、8デオキシグアニン、ヒドロキシウラシル、リボヌクレオチド、5−メチルシトシンおよびウラシルからなる群から選択される、請求項29に記載のプライマー。
- 前記非標準塩基が、デオキシイノシンである、請求項30に記載のプライマー。
- 実質的に温度サイクル無しでDNA増幅を行うための、請求項24〜27のいずれか1項に記載のキットの使用。
- 実質的に温度サイクル無しでDNA増幅を行うための、請求項28〜31のいずれか1項に記載のプライマーの使用。
- 実質的に温度サイクル無しでDNA増幅を行うための、鎖置換能力を有するDNAポリメラーゼの使用。
- 実質的に温度サイクル無しでDNA増幅を行うための、二本鎖DNA中の非標準塩基を認識し、一方のDNA鎖において、前記非標準塩基の部位でもしくはその付近で、ニックを生じるかまたは塩基を切除する酵素の使用。
- 実質的に温度サイクル無しでDNA増幅を行うための、二本鎖DNA中の非標準塩基を認識し、一方のDNA鎖において、前記非標準塩基の部位でもしくはその付近で、ニックを生じるかまたは塩基を切除する酵素、および鎖置換能力を有するDNAポリメラーゼの使用。
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