JP2003517303A - 複合ｐｃｒ増幅の制御可能な実施方法 - Google Patents

複合ｐｃｒ増幅の制御可能な実施方法

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JP2003517303A JP2001538547A JP2001538547A JP2003517303A JP 2003517303 A JP2003517303 A JP 2003517303A JP 2001538547 A JP2001538547 A JP 2001538547A JP 2001538547 A JP2001538547 A JP 2001538547A JP 2003517303 A JP2003517303 A JP 2003517303A
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ベルリン，クルト
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エピゲノミクス アーゲー
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Abstract

(57)【要約】 少なくとも下記a）〜d）段階からなる、複合ＰＣＲ増幅の制御可能な実施方法。a） 異なる配列の第１のタイプ（Ｔyp１）の少なくとも５０のプライマーのＰＣＲ増幅であって、この配列は任意のＤＮＡ試料の鎖に相補的であり、第２のタイプ（Ｔyp２）のプライマーの中の一つのプライマーまたは一つのBibliothekを含有し、この鎖は使用されるＤＮＡ試料の他の鎖に相補的で、Ｔyp２のプライマーが第１の標識（標識１）を含有する。b） ＰＣＲ反応に組み込まれているプライマーまたはこの相補的オリゴヌクレオチッドにハイブリッド形成されるか、またはＰＣＲ反応に組み込まれているプライマーに相補的なオリゴマーを含む、オリゴヌクレオチッドを含有する、一つのオリゴマー配列への増幅産物のハイブリッド形成、c） Arrayに結合する増幅産物の鎖長の決定が、その都度、ＤＮＡ断片の長さで、補正可能な、段階aの）第１の標識（標識１）と異なる、第２の標識（標識２）によって行われ、及びd）標識１及び標識２から発せられる分析に重要な各オリゴヌクレオチッド配列の部分の信号の限量化。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は複合ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅の制御可能な実施方法に関
する。
【０００２】 複合ＰＣＲ増幅、例えば、全ゲノム増幅はＤＮＡ試料からの多数の断片の同時
複写に利用される。得られた種々雑多な断片は遺伝子型化、突然変異解析及び類
縁の論題に使用される。
【０００３】 この方法は勿論、有効性確認の可能性及び補正可能性が難しく、同様に、複雑
さと、増幅された配列の大部分は殆ど未知のものであるという事実に基づいてい
る。本発明は複合ポリメラーゼ連鎖反応増幅に係わり、適合するオリゴマーArra
y を使用して、完全な解析に使用される。
【０００４】 ＰＣＲ反応（ポリメラーゼ連鎖反応）は通常、二つの、特殊な結合したプライ
マーに適用され、そこでは、一方のプライマーは（＋）鎖に相補的であり、他方
のプライマーは増幅される鋳型の（−）鎖に相補的である。このような増幅の目
的は、正確に規定され、その塩基配列が大部分または完全に知られている鋳型Ｄ
ＮＡの一定の断片を複写することである。
【０００５】 また、ＰＣＲ反応については二つ以上の異なるプライマーが組込まれることが
知られている。これらは多くの、少なくとも、それの、公知の断片の塩基配列の
大部分の増幅に、一つの反応器中で同時に使用される。この場合、反応に使用さ
れるプライマーは特異的に鋳型ＤＮＡの一定の部分に結合する。このケースを多
重ＰＣＲと言い、この方法により、多数の断片を同時に増幅することができ、資
材及び実験費用が節約できる。
【０００６】 これまで知られていなかった断片を増幅するＰＣＲ反応は、結合するプライマ
ーの一定領域に非特異的に実施できる。鋳型ＤＮＡの相補的結合位置が幾度も統
計的に観察されるということが着想される。この場合、我々は複合的ＰＣＲ増幅
について述べる。この増幅は、一定部分、例えば、ゲノムの一定部分を統計的に
配分して増幅するために使用することができる。ゲノム中のプライマーの可能な
結合位置の数によって、増幅産物の複合性が制御され得る。プライマーは非常に
短くて、全ての塩基対に自由に処理できるか、または、配列の総合的Bibliothek
として合成される。全ゲノム増幅は例えば、以下の刊行物に記載されている。Ｌ
．Zhang、et al．；単細胞からの全ゲノム増幅：Implications for genetic ana
lysis；Proc．Natl．Acad．Sci．ＵＳＡ（１９９２）、８９、５８４７〜５１；
Ｋ．Kristjansson、et al．；Preimplantation single cell analysis of dytro
phin gene deletion using whole genome amplification ；Nature Genetics（
１９９４）、６、１９〜２３；Ｐ．Ｏ．Ｂrown；Genome scanning methods、Cur
rent Opinion in Genetics and Development（１９９４）、４、３６６〜７３；
Ｍ．Ｔ．Barrett et al．；Genotypic analysis of multiple loci in somatic
cells by whole genome amplification；Nucl．Acids．Res．（１９９５）、２
３、３４８８〜９２；Ｄ．Grothues、et al．ＰＣＲ amplification of megabas
e ＤＮＡ with tagged random primers （Ｔ−ＰＣＲ）；Nucl．Acids．Res．（
１９９３）、２１、１３２１〜２；Ｊ．Welsh．et al．；Fingerprinting genom
es using ＰＣＲ with arbitrary primers；Nucl．Acids．Res（１９９０）、１
８、７２１３〜８；Ｖ．Ｇ．Cheung et al．；Whole genome amplification usi
ng a degenerate oligonucleotide primer allows hundreds of genotypes to b
e performed on less than one nanogram of genomic ＤＮＡ；Proc．Natl．Aca
d．Sci．ＵＳＡ（１９９６）、９３、１４６７６〜９。
【０００７】 ＤＮＡチップの領域では、例えば、米国特許公報第５５９３８３９号、同５９
９９６９５号または同５６３１７３４号に記載されているように、長足の進歩が
遂げられている。また、異なる性質を有し、特殊な用途に用いられる、他の、若
干のＤＮＡチップが知られている（例えば、米国特許公報第５６６７６６７号、
同５５２５４６４号または同５４９２８０６号または例えば、Goffeau、Ａ．、N
ature ３８５、２０２〜２０３；Weiler、Ｊ．and Hoheisel、Ｊ．、Anal．Bioc
hem．２４３、２１８〜２２７；Chee Ｍ．et al．、Science、２７４、６１０〜
６１４）。最新の刊行物は既に商業的に使用できるＨＩＶチップについて発表し
ているが、これは完全なＨＩＶゲノムの研究が可能なものである。４００，００
０個までのオリゴヌクレオチッドに対して、調査試料のフルオレスセンスで標識
されたＰＣＲ産物がハイブリッド形成される。信号の解析はＣＣＤカメラまたは
特殊なフルオレスセンス−スキャナによってなされる。特殊な対立遺伝子のハイ
ブリッド形成のために長年その実績が知られているシステムが使用される。試料
が絶対的に一つの固定されたオリゴヌクレオチッドに相補的である部分だけで、
ハイブリッド形成及び洗浄手順の終期に信号が得られる。突然変異での公知の遺
伝子配列の調査が成功するのは、オリゴヌクレオチッド配列の形の中の全配列の
範囲がマトリックス上に存在することのみならず、これが正規の配列からの各々
の可能な差異に当てはまるからである。チップ手順の効率は、多数の遺伝子また
は遺伝子の位置に関する配列情報を得るところの、二つの簡単な作業段階即ち、
ハイブリッド形成と洗浄を以って、一つの部分へと集約される。
【０００８】 一つの増幅に組み込まれる標識を付された種々のヌクレオチッド類縁体または
５’−末端に標識された一つの（常に形作られているように）ＤＮＡチップ上の
ＤＮＡの検知は種々の方法で実行される。フルオレスセンス信号は登録されてお
り、チップ上にフルオレスセンス標識された任意の配列の施された結合を示すと
ころのＣＣＤカメラで検知が可能になる。
【０００９】 ５−メチルシトシンは真核生物の細胞のＤＮＡに存在するしばしば共有結合変
化する塩基である。この塩基は、例えば、転写、ゲノム刷り込みの制御及び腫瘍
遺伝子において一つの役割を演じている。遺伝子情報の構成成分としての５−メ
チルシトシンの同定はそれ故、非常に興味あるものである。５−メチルシトシン
とシトシンは同じ塩基対挙動を示すので、５−メチルシトシンの位置は配列化に
よっては同定できない。その上、ＰＣＲ増幅では５−メチルシトシンを含む情報
が完全に失われる。
【００１０】 これらの問題点を解決する多くの方法が知られている。そのうちの大部分は化
学反応またはゲノムＤＮＡの酵素処理を行うものである。この反応または処理に
よりシトシンがメチルシトシン塩基から分離される。通常行われる方法はゲノム
ＤＮＡを重亜硫酸塩で置きかえるものである。これはアルカリ加水分解により二
段階でシトシン塩基をウラシルに変えるもので、５−メチルシトシンはこの条件
では変化しない。ＣのＵへの変換は塩基配列を変化させ、これから配列化により
最初の５−メチルシトシンが調べられる（これはＣシュプールの帯を提供する）
。
【００１１】 マトリックス補助レーザー吸収／イオン化−マススペクトル分析（ＭＡＬＤＩ
）は新しい、生物分子の解析に非常に力を発揮する分析法である（Karas、Ｍ．a
nd Hillenkamp、Ｆ．１９８８、Laser desorption ionization of proteins wit
h molecular masses exceeding 10，000 daltons．Anal．Chem．６０：２２９９
〜２３０１）．分析分子はＵＶ吸収マトリックス中に埋め込まれ、短いレーザー
パルスによりマトリックスは真空中に蒸発し、分析物は断片化しないで、気相中
に送られる。一定電圧がイオンを加速し、自由領域の飛行管へ送りこむ。それぞ
れの質量によって速度が異なる。質量のより小さいイオンはより大きいイオンよ
りも速く検知器に到達する。飛行時間はイオン質量から計算される。
【００１２】 ハードウエアの技術革新は方法を著しく改善した。遅延抽出（ＤＥ）はここに
記載するに値する。ＤＥにとって、レーザーパルスへの遅延を伴う加速電圧が接
続され、それによって、衝突回数が減少するので、信号の改善された解決法が達
成された。
【００１３】 固定されたＤＮＡ−Arrayの検知のために、複数回のフルオレスセンス標識を
施されたゾンデ（Ｓonde）が使用される。特に、フルオレスセンスによる標識化
にはその都度、ゾンデの５’ＯＨ基にＣy３及びＣy５色素を一回嵌めこむのが好
ましい。ハイブリッド形成されたゾンデのフルオレスセンスの検知は例えば、コ
ンホカール（Ｋonfokal）顕微鏡によって行われる。Ｃy３及びＣy５色素は、他
の多くの類似品と共に市販されている。例えば、Ｃy５色素を含み、ＰＣＲ反応
に組み込まれ得るところの、ヌクレオチッドもまた市販されている（Amersham P
harmacia）。
【００１４】 従来技術である複合増幅はその実績を総合すると、全ての場合において、統計
的に制御可能である。二つの非特異的に結合するプライマーで行われる増幅後、
生産された複数種の断片の数と長さを決定するのは現実的に不可能である。
【００１５】 それ故、本発明の課題は、これら従来技術の問題点を解決することにある。
【００１６】 本発明の課題は、少なくとも下記の段階からなる、複合ＰＣＲ増幅の制御可能
な実施方法によって解決される。
【００１７】 a） 異なる配列の第１のタイプ（Ｔyp１）の少なくとも５０のプライマーの
ＰＣＲ増幅であって、この配列は任意のＤＮＡ試料の鎖に相補的であり、第２の
タイプ（Ｔyp２）のプライマーの中の一つのプライマーまたは一つのBibliothek
を含有し、この鎖は使用されるＤＮＡ試料の他の鎖に相補的で、Ｔyp２のプライ
マーが第１の標識（標識１）を含有する。
【００１８】 b） ＰＣＲ反応に組み込まれているプライマーまたはこの相補的オリゴヌク
レオチッドにハイブリッド形成されるか
【００１９】 またはＰＣＲ反応に組み込まれているプライマーに相補的なオリゴマーを含む
、オリゴヌクレオチッドを含有する、一つのオリゴマー配列への増幅産物のハイ
ブリッド形成、
【００２０】 c） Arrayに結合する増幅産物の鎖長の決定がその都度ＤＮＡ断片の長さで、
補正可能な、段階aの）第１の標識（標識１）と異なる、第２の標識（標識２）
によって行われ、及び
【００２１】 d）標識１及び標識２から発せられる分析に重要な各オリゴヌクレオチッド配
列の部分の信号の限量化。
【００２２】 ハイブリッド形成において、この関係は、第２のＤＮＡ鎖の貯蔵がワトソン−
クリックの塩基対に則って理解され、その際、二重鎖において、任意の８個の塩
基を超えて生成した断片はワトソン−クリックの定律に則っていない２５％以下
の塩基対が生成する。
【００２３】 本発明においては、任意のＤＮＡ試料の（＋）鎖に相補的で、異なる配列のＴ
yp１の少なくとも５０のプライマーのＰＣＲ増幅を行ない、異なる配列は一つの
プライマーまたは（−）鎖に相補的なＴyp２のプライマーの一つのBibliothekを
含有し、Ｔyp２のプライマーは標識１を含む。
【００２４】 同様に本発明においては、（−）鎖に相補的で、異なる配列のＴyp１の少なく
とも５０のプライマーのＰＣＲ増幅を行ない、異なる配列は一つのプライマーま
たは（−）鎖に相補的なＴyp２のプライマーの一つのBibliothekを含有し、Ｔyp
２のプライマーは（＋）鎖に相補的で、Ｔyp２のプライマーは標識１を含む。
【００２５】 本発明においては、Ｔyp１の組み込まれた、少なくとも５０のプライマーを、
これが増幅されるＤＮＡに対して特異的にハイブリッド形成されるように選択し
、他方、対向する鎖に相補的なＴyp２のプライマーを、これが増幅されるＤＮＡ
に対して非特異的にハイブリッド形成されるように選択される。
【００２６】 本発明においては、対向する鎖のプライマーが１５個未満の塩基を含有し、特
にここで、対向する鎖のプライマーが１２個未満の塩基を含有する。
【００２７】 更に本発明においては、対向する鎖のプライマーの位置が一般的塩基または変
化した位置を含む。
【００２８】 更に本発明においては、対向する鎖のプライマーが組み合わせ式合成法で製造
される。
【００２９】 更に本発明においては、標識１及び標識２が蛍光標識である。
【００３０】 更に本発明においては、標識１及び標識２の蛍光標識及び／または分離可能で
、質量分析計で実証可能な質量ラベルである。
【００３１】 そこで、特に、標識１及び標識２の比率から発せられる信号が各分析にとって
重要な配列（Array）位置を決める。
【００３２】 本発明においては特に、使用されたＴyp１のプライマーが塩基Ｔ、Ａ及びＣの
みか、または塩基Ｔ、Ａ及びＧを含有する。
【００３３】 更に、本発明においては、ＤＮＡを増幅前に、５−メチルシトシン及びシトシ
ンが異なった化学反応をし、処理によってこれら塩基の塩基対の状態が変化する
ように処理する。
【００３４】 その際、特に、増幅前のＤＮＡの処理が重亜硫酸塩（＝酸性亜硫酸塩、亜硫酸
水素塩、）溶液によって行われる。
【００３５】 本発明においては複合的増幅について記載され、従来技術の問題点について記
載されている。
【００３６】 本発明の対象は、複合ＰＣＲ増幅の制御可能な実施方法である。そのためには
、先ず第一に、Ｔyp１の少なくとも５０のプライマーのＰＣＲ増幅及びＴyp２の
プライマーまたはプライマーBibliothekでもって、ＰＣＲ増幅を行ない、その際
、 Ｔyp１の少なくとも５０のプライマーが全てその配列が異なり、且つ、全てが、
任意の、本発明の方法を使用して研究された、ＤＮＡ試料の（＋）鎖に相補的で
ある。このＴyp１のプライマーまたはＴyp２のプライマーのBibliothekが本発明
の方法を使用して研究された、ＤＮＡ試料の（−）鎖に相補的である。二者択一
的に、Ｔyp１のプライマーが（−）鎖に相補的で、Ｔyp２のプライマーが（＋）
鎖に相補的である。Ｔyp２のプライマーがＴyp１の標識を含有する。
【００３７】 本発明の方法の特に好ましい変形において、少なくとも５０が組込まれたＴyp
１のプライマーが増幅されるＤＮＡに特異的にハイブリッド形成し、一方、対向
する鎖に相補的なＴyp２のプライマーは非特異的にハイブリッド形成する。即ち
、 選択された反応条件下で、研究されるＤＮＡ試料が多くの位置に結合することが
できる。本発明の方法の特に好ましい変形において、Ｔyp２のプライマーは１２
未満の塩基を有する。
【００３８】 Ｔyp２のプライマーは、好ましくは、変化した塩基位置を有する。この位置で
対向する鎖の異なる塩基に比較可能な方法で結合できる。例えば、Ａ、Ｇまたは
Ｔへである。その際、所謂一般的塩基が使用され、これは相補的なＴ、Ｃ、Ｇ及
びＡ−核塩基に結合できる。本発明の方法の特に好ましい変形において、Ｔyp２
のプライマーは組合わせ合成法で生産される。それで、プライマーのBibliothek
は同じ長さのものが得られる。それによって、与えられた配列の一定の位置に異
なる塩基を含んでいるプライマーのBibliothekが使用される。
【００３９】 本発明の方法の特に好ましい変形において、Ｔyp２のプライマーの標識１はフ
ルオレスッセンス標識である。更に他の、本発明の方法の特に好ましい変形にお
いて、Ｔyp２のプライマーの標識１は質量分析計を使用するプライマーの実証に
使用できる。特に好ましい実施において、ＭＡＬＤＩ質量分析計によって、実証
され、その際質量標識の分離が質量分析計のレーザー照射によるか、または、Ｍ
ＡＬＤＩ−マトリックスとの接触によって行われる。
【００４０】 本発明の方法の更に他の特に好ましい変形において、使用されたＴyp１のプラ
イマー塩基はＴ、Ａ及びＣのみを含有するか、または塩基Ｔ、Ａ及びＧを含有す
る。
【００４１】 本発明の方法の第二段階において、ＰＣＲ反応に組み込まれているプライマー
またはこの相補的オリゴヌクレオチッドにハイブリッド形成される、一つのオリ
ゴマー配列への増幅産物のハイブリッド形成が実行される。オリゴマー配列は好
ましくはオリゴヌクレオチッドまたはＰＮＡオリゴマーである。これらは通常の
方法で増幅産物の一本の鎖にのみハイブリッド形成される。好ましくは、標識１
を含み、それに従って、Ｔyp２のプライマーの一つを含有する。
【００４２】 本発明の方法の第二段階において、ＰＣＲ反応に組込まれるプライマーに相補
的なオリゴマーを含有する一つのオリゴマー配列への増幅産物のハイブリッド形
成が実行される。
【００４３】 本発明の方法の第三段階において、各解析のために重要な配列の場所に結合す
る増幅産物の鎖長がＤＮＡ断片の長さと相関可能な、第１段階の標識１とは異な
る、標識２により決定される。本発明の方法の好ましい変形において、標識２は
フルオレスセンス標識である。本発明の方法の更に特に好ましい変形は、Ｔyp２
のプライマーの標識が質量標識であり、これはこのプライマーの実証のために質
量分析計で使用することができる。これについての特に好ましい実施法は、ＭＡ
ＬＤＩ質量分析計によって実証され、その際、質量標識の分離が質量分析計のレ
ーザー照射によるかまたはＭＡＬＤＩ−マトリックスとの接触によって行われる
。 標識２はその都度の増幅産物の鎖長に依存してこれに結合するか、または、増幅
時に、増幅産物に統合される。これはフルオレスセンス−または質量標識された
三リン酸塩によって増幅過程で行うことができる。本発明の方法の更に特に好ま
しい変形において、鎖長の決定は非特異的に結合している、フルオレスセンス標
識及び／または質量標識を含む、オリゴヌクレオチッドまたはペプチッド核酸の
ハイブリッド形成により行われる。このフルオレスセンス標識及び質量標識はＴ
yp２のプライマーの標識とは異なるものである。
【００４４】 本発明の方法の第四段階において、標識１及び標識２から発せられる、分析に
重要な各オリゴヌクレオチッドArrayの部分の信号の限量化が行われる。本発明
の方法の更に特に好ましい変形において、標識１及び標識２からその都度発せら
れる、分析に重要な各オリゴヌクレオチッドArrayの部分の信号の強度の関係が
決定される。本発明の方法の好ましい変形において、どのＴyp１のプライマー
が事実上、増幅に寄与しているか、増幅産物由来の一つのプライマーの平均的鎖
長はどのくらいかなどが調査される。
【００４５】 本発明の方法の好ましい変形において、ＤＮＡ試料は増幅前に化学処理されて
、５−メチルシトシン及びシトシンが異なる反応を示し、その処理により、その
塩基の一つの塩基対挙動が変化することを示す。本発明の方法の特に好ましい変
形において、これは増幅前のＤＮＡの重亜硫酸塩（＝酸性亜硫酸塩、亜硫酸水素
塩）溶液による処理により達成される。この変法を使用することにより、その都
度のＤＮＡ試料におけるシトシンのメチル化標準の研究に使用される、複合ＤＮ
Ａ増幅産物の生産の制御が可能になる。
【００４６】 以下の実施例で本発明を説明する。
【００４７】 実施例１ ５０ホワード(Foward)プライマー及び一つのリバース（Reverse）プライマー
及びそれらの制御を伴う複合増幅。 制御可能な複合増幅を実施するという課題は、方法の二つの構成部によって実
現される。
【００４８】 １．増幅は、二種類のプライマーがあり、主請求項に記載されている、最も簡
明な方法の場合、異なる配列の５０のプライマーが使用され、このプライマーは
鋳型の一本鎖に結合し、且つ、一つのプライマーは対応する対向鎖に結合する。
それに従って、増幅産物が生産される。そこでは常に、Ｔyp１の５０プライマー
の中の一つ及びＴyp２のプライマーが二重鎖生産物の構成部である。これを可能
にするために、Ｔyp２のプライマーがＴyp１のプライマーよりも、統計的にも、
本質的にも、頻繁に鋳型にハイブリッド形成されねばならぬ。例えば、Ｔyp１の
プライマーは特異的に、Ｔyp２のプライマーは非特異的に結合する。それは非常
に短いか、または、好ましくは、所謂、Wobble−ポジション（即ち、異なる塩基
が存在し得る位置）または変性した塩基を含有し得る。その際、後者はＤＮＡ中
で自然に生成する塩基ではない。それは、Ａ、Ｃ、Ｔ及びＧを有する非特異的塩
基対または、これらの塩基の大部分であり得る。
【００４９】 特にこの種の増幅は、二重鎖鋳型の（＋）及び（−）鎖からなる塩基構成が本
質的に異なり、そこでＴyp２のプライマーのみが一本鎖にハイブリッド形成し、
それに従って、Ｔyp１のプライマー及びそれ以上頻繁にハイブリッド形成される
Ｔyp２のプライマーのみによって、増幅産物が形成され得る。
【００５０】 この塩基構成の差異は、例えば、もし、ゲノムＤＮＡが重亜硫酸ナトリウムで
処理された場合である。この場合処理される鎖は相補的鎖の塩基のＡ、Ｔ及びＧ
のみからなり、それでも、殆ど、Ａ、Ｔ及びＣのみからなる。これはプライマー
配列の設計の際、非常に好都合である。
【００５１】 （２）このような方法は増幅後に、複合ＰＣＲが各々の組込まれたプライマーの
ために一つの産物を生成させることを制御できるという利点を有する。そのため
には増幅産物は一つのオリゴマーArrayにハイブリッド形成され、そのArrayはＴ
yp１（少なくとも５０の異なる）プライマーに相補的であるか、または、特に好
ましくは配列類似体のゾンデを含有する。最も簡単なケースは５０の組み込みプ
ライマーを表面に固定し、複合増幅産物をそこにハイブリッド形成することであ
る。Ｔyp２のプライマーのみが、一つの標識を有するので、表面にはハイブリッ
ド形成によって標識された位置のみが存在する。それによって複合増幅のどの部
分が有効なのかが容易に解り、また、品質の制御が容易にできる。
【００５２】 その都度、合成増幅産物の正しい長さを決めるために、増幅において他の標識
が組み込まれ得る。最も簡明な場合、産物の長さ自体が、例えば質量分析によっ
て、実証できるところの分子量の型に入る場合である。特に好ましくは、ＰＣＲ
の間に、標識を施されたヌクレオチッドの構造によって採用することである。例
えば、Ｃy３ラベルのdＣＴＰがこれである。何個のシトシン塩基が増幅産物中に
あるか、及び、何個のラベルされたdＣＴＰが、同様に存在するラベルされてい
ないdＣＴＰに比較して、組み込まれているかが把握されているので、増幅産物
の鎖長が計算でき、少なくとも、増幅の複製の可能性が実証できる。計算には、
結合している増幅産物の計算のための種々の量を含む、標準化が必要である。Ｔ
yp２のプライマー上の標識の測定可能な数が、結合している増幅産物量と一次的
関係にあるので、これは非常に容易である。
【００５３】 実施例２ 複合ＰＣＲの実施 ゲノムＤＮＡが亜硫酸処理されたＤＮＡに変化する（Olek et al．、Nucl．Ac
ids． Res．１９９６、２４、５０６４〜５０６６；従来技術）。この実施例で
は、複合増幅がＴyp１の６４個のプライマーオリゴヌクレオチッドとＴyp２の４
個のプライマーオリゴヌクレオチッドによる複合増幅が行われる。Ｔyp２のプラ
イマーオリゴヌクレオチッドがフルオレスセンス色素Ｃy５で標識される。その
際下記のプライマー配列が使用され、特異的部分のみが、核酸分子をハイブリダ
イズさせる温度（Annealingtempetatur）の比較のために非特異的に結合する位
置（Wobbles）が満たされる。
【００５４】 Ｔyp１： ＴＡＧＴＴＡＧＴＧＴＴＴＡＧＧ ＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴＴＴ ＡＴＴＴＡＧＡＴＴＴＴＡＴＴＧ ＧＴＴＴＴＴＧＴＡＴＴＴＡＡＧ ＡＧＴＡＧＡＧＴＴＧＡＧＡＡＧ ＧＴＴＴＡＧＡＧＴＡＧＧＧＴＡ ＴＴＴＡＴＴＡＴＧＡＴＴＴＴＧ ＧＴＡＴＴＡＴＴＧＴＧＴＴＴＧ ＴＧＧＴＴＡＡＴＡＧＴＡＡＴＧ ＴＡＧＴＡＡＴＴＧＴＡＴＴＧＧ ＴＴＴＡＧＴＡＴＴＴＴＧＴＴＧ ＴＡＡＧＴＴＴＴＡＴＧＡＧＧＴ ＧＡＴＴＴＧＴＴＴＴＡＧＧＴＡ ＴＧＡＴＴＡＡＴＡＴＧＧＴＧＡ ＧＡＡＴＡＧＡＡＡＴＴＡＧＧＧ ＴＡＴＡＡＧＧＴＴＡＧＧＡＧＡ ＴＴＡＧＡＧＧＴＴＴＴＴＧＡＧ ＡＴＴＴＴＴＧＴＴＴＧＴＡＧＡ ＧＴＴＧＧＡＴＡＧＡＡＧＡＧＴ ＴＡＡＡＡＡＡＴＴＡＧＴＴＧＧ ＧＴＡＴＧＧＴＧＧＴＴＡＧＡＴ ＴＡＡＴＧＴＡＧＧＴＴＡＧＧＡ ＡＡＧＴＧＧＴＴＡＧＧＴＡＴＧ ＧＡＡＴＴＧＡＧＧＴＡＡＴＧＴ ＴＡＡＴＴＴＧＡＧＧＴＴＡＧＧ ＴＡＡＡＧＧＡＡＡＧＴＡＧＧＴ ＴＴＴＧＧＡＡＡＡＡＴＡＴＡＧ ＡＡＴＴＡＡＴＡＴＧＧＡＡＡＧ ＧＡＧＴＡＡＴＧＧＡＡＡＧＡＧ ＴＡＴＴＴＡＡＧＡＧＧＴＴＧＡ ＧＡＧＴＴＧＧＧＴＡＴＴＡＧＴ ＴＴＴＡＧＡＧＡＧＧＴＧＡＡＧ ＧＴＴＴＴＡＧＡＴＴＴＧＴＴＧ ＧＴＴＴＴＡＴＧＡＧＡＧＧＴＴ ＴＴＧＴＡＴＴＴＧＧＡＴＡＧＡ ＧＡＡＡＧＴＴＧＴＴＧＴＴＧＴ ＴＧＡＡＴＴＴＧＴＴＴＴＴＧ ＧＧＴＴＡＧＴＡＧＧＧＴＴＡＴ ＧＴＴＴＴＡＧＧＴＡＧＡＧＧＡ ＴＴＡＧＧＧＡＡＧＴＡＴＴＡＴ ＧＴＴＴＧＧＴＧＧＴＴＡ ＧＡＧＡＧＧＴＴＡＴＡＴＴＴＧ ＧＧＴＴＡＧＴＴＡＧＧＴＴＡＴ ＡＧＴＡＡＡＴＡＴＴＧＡＡＡＧ ＴＴＧＡＧＴＴＴＴＴＴＡＴＡＧ ＴＴＧＡＡＴＴＴＴＴＡＴＴＴＡ ＴＧＡＴＡＴＴＡＡＴＴＴＧＴＴ ＴＴＴＧＧＴＴＡＴＴＡＧＡＧＴ ＡＴＴＴＡＧＴＴＴＡＴＴＴＧＴ ＴＡＧＧＴＴＡＴＴＴＴＴＧＴＡ ＴＡＴＡＧＡＧＴＡＴＴＧＧＴＧ ＴＴＡＧＡＴＴＴＴＡＡＴＡＧＧ ＧＧＴＴＡＧＴＴＡＴＧＴＡＴＴ ＴＡＧＴＡＧＧＴＴＧＴＴＴＡＧ ＡＡＴＴＴＴＡＧＧＴＴＧＴＴ ＧＴＧＡＧＧＡＴＡＴＴＴＡＴＴ ＧＴＴＡＴＡＡＧＴＴＡＡＧＧＡ ＴＴＴＡＴＴＡＴＡＧＡＧＧＡＧ ＴＴＧＴＧＧＴＴＴＧＧＡ ＴＧＡＴＴＴＴＡＧＡＴＧＴＡＧ ＧＡＧＧＴＴＡＡＡＡＧＧＴ ＴＴＡＡＧＧＴＡＴＡＴＴＡＧＧ ＴＴＴＧＡＡＧＴＡＡＴＴＧＴＡ ＧＴＴＧＴＡＴＴＧＧＡＴＡＧＴ
【００５５】 Ｔyp２： ＡＣＡＣＴＣＣＡＡＣＣＴ ＡＣＣＴＣＡＡＣＣＴＣＣ ＡＡＡＡＣＡＡＡＡＣＣＣ ＡＡＡＡＣＡＡＡＡＣＣＡ
【００５６】 ＰＣＲは下記の反応用原材料を使用して行われる。 複合ＰＣＲの反応用原材料（２５μl） １μlの亜硫酸水素塩で処理されたＤＮＡ、 ２．５μlのＰＣＲ緩衝液（１０倍、Qiagen）、 １μlのＴyp１のプライマー混合物（６４個のプライマーオリゴヌクレオチッ
ド、各々０．７８pmol／μl）、 １μlのＴyp２のプライマー混合物（４個のプライマーオリゴヌクレオチッド
、Ｃy５標識、各々１２．４８pmol／μl）、 ０．８μlのdＮＴＰs（２５mＭ pro dＮＴＰ、Gibco−ＢＲＬ）、 ３μlのＭgＣl2（１５mＭ）、 １５．５μlの水（分子生物学用、Fluka）、 ０．２μlのポリメラーゼ（１ユニット）（HotstarTaq、Qiagen）、
【００５７】 ＰＣＲ反応はＭaster Cycler Ｇradient（Eppendorf Hamburg）で下記のプロ
グラムで行われる。 １５分、９５℃；６０秒、９５℃；４５秒、３５℃；１２０秒、６５℃；１０分
、６５℃；４℃に保持する。
【００５８】 得られたＰＣＲ増幅産物はアガロースゲル電気泳動で分析する（０．５倍ＴＢ
Ｅ緩衝液中１．５％アガロース、Sambrook et al．）。ここでは４μlのＰＣＲ
原材料が電気泳動にかけられる。所定の条件下、６４個のＤＮＡ断片が与えられ
たプライマー対で同時に、良好に増幅される。
【００５９】 実施例３ 多段ＰＣＲによる未知のメチル化ＤＮＡ試料の生産 この実施例は未知のメチル化ＤＮＡ試料の生産に関し、これと実施例２のメチ
ル化された対照ＤＮＡが比較される。ゲノムＤＮＡ試料が組込まれる。これはこ
の場合制限酵素ＭssＩで分解される。この試料は続いて亜硫酸水素塩（＝重亜硫
酸塩、酸性亜硫酸塩）と反応する。その際、二種類の方法を取ることができる。
第一の方法（Olek et al．、Nucl．Acids．Res． １９９６、２４、５０６４〜
５０６６）は亜硫酸水素塩（＝重亜硫酸塩、酸性亜硫酸塩）とラジカル捕捉剤に
よる変換であり、その際、ＤＮＡはアガロース中に組込まれる。ＤＮＡの脱スル
ホンは同様にアガロース中で行われる。この場合ＤＮＡは引き続いて予備増幅（
ＰＥＰ：primer extension preamplification）によって清浄化処理される。二
者択一的に、ＤＮＡはアガロースマトリックスなしで、亜硫酸水素塩（＝重亜硫
酸塩、酸性亜硫酸塩）とラジカル捕捉剤で、高温で化学反応させられる。変性を
防ぐ有機原料が添加され、原料が高温で培養される。亜硫酸水素塩による処理で
、二つの方法とも、シトシン塩基がウラシルに変化するが、メチルシトシンは変
化しない。清浄化のためにアガロースマトリックスなしで、亜硫酸水素塩で処理
されたＤＮＡは逆相のＣ１８の固相上で結合し好ましい緩衝液で洗浄され、化学
薬品から解放される。最終的にはＤＮＡは極性有機溶媒、例えば、アセトニトリ
ル及び水で溶出され、容積減少で濃縮される。亜硫酸水素塩で処理されたＤＮＡ
の予備増殖は、非常に短鎖長のプライマーオリゴヌクレオチッド（５’−ＴＴＡ
ＴＡＡＴＧＴＴＴＴ及び５’−ＴＡＡＴＡＴＡＣＴＡＡＴ）で行われる。
【００６０】 反応用原料（２０μl） １μlの重亜硫酸塩処理ＤＮＡ（０．２〜１ng） ２μlの反応緩衝液（１０倍、Qiagen） ２μlのdＮＴＰ’s（１０mＭ pro dＮＴＰ、Fermentas） １μlのプライマー（ＴＴＡＴＡＡＴＧＴＴＴＴ）２５pmol １μlのプライマー（ＴＡＡＴＡＴＡＣＴＡＡＴ）２５pmol ０．２μlのポリメラーゼ（１ユニット）（HotstarTaq、Qiagen）、 １２．８μlの水（分子生物学用、Fluka）、
【００６１】 下記のＣy５ラベルプライマーオリゴヌクレオチッドによる増幅は実施例２に
記載されたプライマーオリゴヌクレオチッドを使用して行われる。その際、同じ
プライマーオリゴヌクレオチッドはＣy５でラベルされる。増幅産物はアガロー
スゲル電気泳動法により分析される。
【００６２】 実施例４ 未知のメチル化ＤＮＡ試料と対照メチル化試料との比較 未知のメチル化ＤＮＡ試料と対照メチル化試料との比較はオリゴヌクレオチッ
ドarrayへのハイブリッド形成により行われる。Array上の位置に対応してフルオ
レスセンス標識される点が明らかになる。個々の研究対象の試料の増幅産物が対
比可能な濃度範囲にある限り、Array上の一定の点が他に対して相対的であり、
対照ＤＮＡに対して明確に増加するか、または、減少したフルオレスセンスを示
すことが明らかである。フルオレスセンス色素Ｃy５（６３５nm）の強度は個々
の増幅産物で測定される。フルオレスセンスの測定の解析の種類及び方法は専門
家が知っている。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ

Claims (14)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 少なくとも下記a）〜d）段階からなる、複合ＰＣＲ増幅の制御可
    能な実施方法。 a）異なる配列の第１のタイプ（Ｔyp１）の少なくとも５０のプライマーのＰＣ
    Ｒ増幅であって、この配列は任意のＤＮＡ試料の鎖に相補的であり、第２のタイ
    プ（Ｔyp２）のプライマーの中の一つのプライマーまたは一つのビブリオテーク
    （Bibliothek）を含有し、この鎖は使用されるＤＮＡ試料の他の鎖に相補的で、
    Ｔyp２のプライマーが第１の標識（標識１）を含有する。 b）ＰＣＲ反応に組み込まれているプライマーまたはこの相補的オリゴヌクレオ
    チッドにハイブリッド形成されるか、またはＰＣＲ反応に組み込まれているプラ
    イマーに相補的なオリゴマーを含む、オリゴヌクレオチッドを含有する、一つの
    オリゴマー配列への増幅産物のハイブリッド形成、 c）Arrayに結合する増幅産物の鎖長の決定がその都度ＤＮＡ断片の長さで、補正
    可能な、段階aの）第１の標識（標識１）と異なる、第２の標識（標識２）によ
    って行われ、及びd）標識１及び標識２から発せられる分析に重要な各オリゴヌ
    クレオチッド配列の部分の信号の限量化。
  2. 【請求項２】 任意のＤＮＡ試料の（＋）鎖に相補的で、異なる配列のＴyp１の
    少なくとも５０のプライマーのＰＣＲ増幅を行ない、異なる配列は一つのプライ
    マーまたは（−）鎖に相補的なＴyp２のプライマーの一つのBibliothekを含有し
    、Ｔyp２のプライマーは標識１を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 （−）鎖に相補的で、異なる配列のＴyp１の少なくとも５０のプ
    ライマーのＰＣＲ増幅を行ない、異なる配列は一つのプライマーまたは（−）鎖
    に相補的なＴyp２のプライマーの一つのBibliothekを含有し、Ｔyp２のプライマ
    ーは（＋）鎖に相補的で、Ｔyp２のプライマーは標識１を含むことを特徴とする
    請求項１に記載の方法。
  4. 【請求項４】 Ｔyp１の組み込まれた、少なくとも５０のプライマーを、これが
    増幅されるＤＮＡに対して特異的にハイブリッド形成されるように選択し、他方
    、対向する鎖に相補的なＴyp２のプライマーを、これが増幅されるＤＮＡに対し
    て非特異的にハイブリッド形成されるように選択されることを特徴とする請求項
    １〜３の何れか１項に記載の方法。
  5. 【請求項５】 対向する鎖のプライマーが１５個未満の塩基を含有することを特
    徴とする請求項４に記載の方法。
  6. 【請求項６】 対向する鎖のプライマーが１２個未満の塩基を含有することを特
    徴とする請求項４に記載の方法。
  7. 【請求項７】 対向する鎖のプライマーの位置が一般的塩基または変化した位置
    を含むことを特徴とする請求項４に記載の方法。
  8. 【請求項８】 対向する鎖のプライマーが組み合わせ式合成法で製造されること
    を特徴とする請求項４に記載の方法。
  9. 【請求項９】 標識１及び標識２が蛍光標識であることを特徴とする請求項１〜
    ８の何れか１項に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 標識１及び標識２の蛍光標識及び／または分離可能で、質量分
    析計で実証可能な質量ラベルであることを特徴とする請求項１〜９の何れか１項
    に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 標識１及び標識２の比率から発せられる信号が各分析にとって
    重要な配列（Array）位置を決めることを特徴とする請求項９または１０に記載
    の方法。
  12. 【請求項１２】 使用されたＴyp１のプライマーが塩基Ｔ、Ａ及びＣのみか、ま
    たは塩基Ｔ、Ａ及びＧを含有することを特徴とする請求項１〜１１の何れか１項
    に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 ＤＮＡを増幅前に、５−メチルシトシン及びシトシンが異なる
    反応をし、化学処理によってこれら塩基の塩基対の状態が変化するように、処理
    することを特徴とする請求項１〜１２の何れか１項に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 増幅前のＤＮＡの処理が重亜硫酸塩（＝酸性亜硫酸塩、亜硫酸
    水素塩、）溶液によって行われることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
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