JP3611232B2 - ヌクレオチド - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は遺伝子工学の分野で有用なヌクレオチド及び該ヌクレオチドの利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ゲノム解析プロジェクトの進展により急速に遺伝情報の蓄積がなされてきたが、個々の遺伝子の機能を知る上で遺伝子の発現様式（ｐｒｏｆｉｌｅ ）を調べる研究がますます求められている。
例えば癌遺伝子であるＣ−ｅｒＢ２遺伝子の過剰発現が乳癌、卵巣癌、胃癌、子宮癌等において確認されている［ライトＣ．（Ｗｒｉｇｈｔ，Ｃ．）ら、キャンサー リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第４９巻、第２０８７〜２０９０頁（１９８９）、サファリＢ．（Ｓａｆｆａｒｉ，Ｂ．）ら、キャンサー リサーチ、第５５巻、第５６９３〜５６９８頁（１９９５）］。このような場合、ｍＲＮＡを指標とした解析が有用である。例えば、病変細胞とそれに対応する正常細胞よりそれぞれｍＲＮＡを調製し細胞当り存在量の異なるｍＲＮＡ分子が病因となる遺伝子より転写されたｍＲＮＡ分子であると推定できる。この際様々なＲＮＡ解析手法が用いられる。
遺伝子あるいはｍＲＮＡに相補的なＤＮＡ（以下、ｃＤＮＡと称する）の塩基配列が既知で、疾患との因果関係が指摘されている場合、該ｍＲＮＡに特異的なプローブあるいはプライマーを作成し、ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション、ノーザンブロット、ドットあるいはスロットブロット、及びヌクレアーゼプロテクションアッセイや目的ｃＤＮＡのみを特異的に増幅させることが可能なプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ法等を利用できる。
しかし病因遺伝子の塩基配列情報が得られていない場合、あるいは発現量の異なる遺伝子から病因遺伝子を同定する場合については上記方法を利用することができない。このような場合サブトラクティブ ハイブリダイゼーション（Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ）法［ツィムメルマンＣ．Ｒ．（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ， Ｃ．Ｒ．）ら、セル（Ｃｅｌｌ）、第２１巻、第７０９〜７１５頁（１９８９）］、リプレゼンテーショナル ディファレンス アナリシス（Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎａｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＲＤＡ）法［リシツィンＮ．（Ｌｉｓｉｔｓｙｎ， Ｎ．）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ ）、第２５９巻、第９４６〜９５１頁（１９９３）］、分子インデックス法［特開平８−３２２５９８号公報］、ＲＡＰ−ＰＣＲ（ＲＮＡ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ ｂｙ Ａｒｂｉｔｒａｒｉｌｙ ｐｒｉｍｅｄＰＣＲ）法［ウェルシュＪ．（Ｗｅｌｓｈ， Ｊ． ）ら、ヌクレイック アシッズ リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第２０巻、第４９６５〜４９７０頁（１９９２）］及びディファレンシャル ディスプレイ ＲＴ−ＰＣＲ（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｄｉｓｐｌａｙ ＲＴ−ＰＣＲ ：ＤＤＲＴ−ＰＣＲ）法［ライアンＰ．（Ｌｉａｎｇ， Ｐ． ）、及びパーディＡ．Ｂ．（Ｐａｒｄｅｅ， Ａ．Ｂ．）、サイエンス、第２５７巻、第９６７〜９７１頁（１９９２）］等が好適に使用できる。このうち逆転写反応及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）からなるＲＴ−ＰＣＲ法を利用した方法は▲１▼操作的に極めて簡便、▲２▼少量のＲＮＡさえ入手できれば実行することができる、▲３▼多サンプル間の遺伝子発現の差異を同時に比較することが可能である、等の長所を有し、また様々な改良法も提案されている。
すなわち遺伝子発現を比較したい組織の細胞から調製したｍＲＮＡを各々鋳型としたＲＴ−ＰＣＲにより得られる各組織由来細胞のフィンガープリントのバンドを比較し、異なるシグナル強度を示すバンドを与えるＰＣＲ産物がディファレンシャルな発現をする遺伝子に由来するＰＣＲ産物であると推定される。一般的なＲＴ−ＰＣＲのプライミング（ｐｒｉｍｉｎｇ）法には（Ｔ）_ｎ で表される構造（Ｔはチミン、ｎはＴの繰り返し数を意味し、通常１２〜１８に設定される）のヌクレオチドをプライマー（以下、オリゴＴプライマーと称する）として使用するが、オリゴＴプライマーを用いた場合すべてのｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡが得られるためゲル電気泳動などを利用して得られたフィンガープリント解析することは困難である。更にｍＲＮＡのポリＡ配列（Ａはアデニンを意味する）にオリゴＴプライマーがハイブリダイズする位置が一定しておらず、同一ｍＲＮＡ由来でも様々なサイズのＰＣＲ産物が生じるためフィンガープリントによる解析が更に困難になる。したがってフィンガープリントで解析可能な程度にｍＲＮＡ由来のＰＣＲ産物をグループ化する必要がある。
【０００３】
この問題を解決するためにＤＤＲＴ−ＰＣＲ法ではｍＲＮＡのポリＡ配列の第１Ａすぐ上流の塩基配列を利用しｍＲＮＡ由来のＰＣＲ産物を分類できるように、（Ｔ）_ｎ の３’端にＴ以外の塩基を付加したヌクレオチドを第１プライマーとして利用する。この付加したヌクレオチドよりなる塩基配列はアンカー配列と呼ばれる。
なお本明細書における第１プライマーとは、ＲＴ−ＰＣＲにおいてｍＲＮＡを鋳型とし逆転写反応によるｃＤＮＡの第１鎖の合成及びＰＣＲによるｃＤＮＡの増幅に使用するプライマーを意味する。また本明細書における第２プライマーとはＲＴ−ＰＣＲにおいて第１プライマーと共にｃＤＮＡの増幅に使用するプライマーを意味する。
例えば適当な第２プライマーと共に、^５’（Ｔ）_１１Ｖ^３’（ＶはＡ、Ｇ、Ｃのいずれか、Ｇはグアニン、Ｃはシトシンを意味する）で表される構造の３種類のヌクレオチドを個別に第１プライマーとしたＲＴ−ＰＣＲを実施することによりｍＲＮＡ由来のＰＣＲ産物を３種にグループ化することができる。あるいは第１プライマーとして、ＶＮ配列（ＮはＡ，Ｇ，Ｃ，Ｔのいずれか）を配置した^５’（Ｔ）_１１ＶＮ^３’で表される構造の１２種類のヌクレオチドを個別に使用したＲＴ−ＰＣＲにより、ｍＲＮＡ由来のＰＣＲ産物を１２種類にグループ化することができる。このようなｍＲＮＡをグループ化するために、このＰＣＲの際、例えば基質として［α−^３２Ｐ］ｄＣＴＰ又は［α−^３５Ｓ］ｄＡＴＰを用いるとＲＩ標識されたＰＣＲ産物を得ることができる。次いで得られたＲＩ標識ＰＣＲ産物を熱変性した後、ポリアクリルアミド変性ゲル電気泳動後オートラジオグラフィーによるフィンガープリントが得られる。
【０００４】
一方、ＤＤＲＴ−ＰＣＲ法の短所は、フィンガープリント上で擬陽性のバンドが多いなど再現性が低いことにある。これはＰＣＲに採用されている反応条件が至適条件より外れていることが挙げられる。上記問題は、例えば^５’（Ｔ）_１２ＶＮ^３’の５’側にＧＣＧＣＡＡＧＣを付加した２２ｍｅｒの１２種類のＤＮＡ［米国特許第５５８０７２６号］や、^５’（Ｔ）_１５ＶＮ^３’の５’側に５’リン酸基をフルオレセイン標識したデオキシグアノシン−５’−３リン酸（５’−ＧＴＰ）を付加した１８ｍｅｒの１２種類の蛍光標識したＤＮＡ［イトウＴ．（Ｉｔｏ，Ｔ．）、ＦＥＢＳレターズ（ＦＥＢＥＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ）、第３５１巻、第２３１〜２３６頁（１９９４）］を、第１プライマーとして使用することにより改善されつつある。
一方、ＰＣＲでは２種類のヌクレオチドを増幅用プライマー対として用いるが、使用するヌクレオチドのプライミング効率が同等でないと目的のＰＣＲ産物の合成効率が低下するだけでなく、増幅用プライマー対のいずれかのプライマーに偏ったＤＮＡ合成が起こり目的物以外のＰＣＲ産物が生じることが報告されている［グラフ Ｄ．（Ｇｒａｆ，Ｄ．）ら、ヌクレイック アシッズ リサーチ、第２５巻、第２２３９〜２２４０頁（１９９７）］。なお本明細書におけるプライミング効率とは、プライマーと鋳型核酸の複合体形成の安定性に基づく核酸伸長反応開始効率を意味する。ＤＤＲＴ−ＰＣＲ法及びその改良法にプライマーとして使用されるヌクレオチドにおいて、第２プライマーはＧＣ含量５０％程度の１０ｍｅｒ程度の長さであるランダムな塩基配列を有するヌクレオチドで、各々のプライミング効率が近似しているヌクレオチドが用いられる。しかしながら第１プライマーとして用いるヌクレオチドは同一構造のヌクレオチドにアンカー配列を付加した構造のヌクレオチドであり、各ヌクレオチドのプライミング効率が同等であるとは言えない。したがってＤＤＲＴ−ＰＣＲ法の上記改良方法は、ディファレンシャルな発現を行う遺伝子のｍＲＮＡ由来のＰＣＲ産物を効率的に得ているとは言い難かった。
【０００５】
一方、ディファレンシャルな発現をする遺伝子のｍＲＮＡ由来のＰＣＲ産物が得られれば、更に詳細に解析するために塩基配列を決定する場合が多い。塩基配列決定法にはＤＮＡポリメラーゼ反応を利用したダイデオキシ法［サンガーＦ．（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．）ら、プロシーディングズ オブ ザ ナショナル アカデミー オブ ザ サイエンシーズ オブ ザ ＵＳＡ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）、第７４巻、第５４６３〜５４６７頁（１９７７）］を基本としたシークエンス方法が繁用されている。しかしＤＮＡポリメラーゼ反応は、同一塩基が連続した領域が存在するとその配列の繰り返し数を間違い、その部分で２〜３塩基長さの異なったＤＮＡを生じることが知られている。鋳型ＤＮＡを大量に使用したシークエンス方法の場合、ＤＮＡポリメラーゼによる反応は１回で済み、上記配列の繰り返し数が異なったＤＮＡはバックグラウンドとして現れるが比較的問題となりにくい。
一方、少量のＰＣＲ産物を鋳型に用い、ＤＮＡポリメラーゼによる反応を繰り返すサイクルシークエンス方法［キャロザース Ａ．Ｍ．（Ｃａｒｏｔｈｅｒｓ，Ａ．Ｍ．）ら、バイオテクニクス（Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、第７巻、第４９４〜４９９頁（１９８９）］等は配列の繰り返し数が異なったＤＮＡが蓄積され塩基配列の解読が不可能になることが報告されている［斉藤ら、蛋白質核酸酵素、第４１巻、第５２２〜５３０頁（１９９６）］。したがって例えばＤＤＲＴ−ＰＣＲ法で得られたＰＣＲ産物の３’末端の様にＡが連続した領域に隣接した領域の塩基配列をＤＮＡポリメラーゼを用いた方法で解析する場合、サブクローン等を行い十分な鋳型ＤＮＡを調製する段階が必須であった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的はディファレンシャルな発現をする遺伝子をＲＴ−ＰＣＲを用いて解析する方法において、ディファレンシャルな発現を行う遺伝子のｍＲＮＡ由来のＰＣＲ産物を効率的に得ることができるヌクレオチドを提供することにある。また本発明の目的はＤＮＡポリメラーゼを用いた塩基配列決定方法において、Ａが連続した領域周辺の塩基配列を少量の鋳型ＤＮＡで決定するために使用するヌクレオチドを提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は、下記から選択されるヌクレオチドに関する。
【０００８】
（１）５’端がＲＯＸ（カルボキシ−Ｘ−ローダミン）、ＴｅｘａｓＲｅｄ［９−〔４（若しくは２）−スルホフェニル−２，３，６，７，１２，１３，１６，１７−オクタヒドロ−１Ｈ，５Ｈ，１１Ｈ，１５Ｈ−キサンテノ〔２，３，４−ｉｊ：５，６，７−ｉ’ｊ’〕ジキノリジン］、又はＣｙ３．５［３−（ｅ−カルボキシペンテニル）−１’−エチル−３，３，３’，３’−テトラメチル−（１，３−ジスルホネート）ジベンゾ−カルボキシシアニン］のいずれか１種により標識された配列番号１〜１０のいずれかに示す塩基配列で表されるヌクレオチド、
【０００９】
（２）５’端がＦＩＴＣ又はＦＡＭのいずれか１種により標識された、配列表の配列番号１〜１０、１３、１４のいずれかに示す塩基配列で表されるヌクレオチド、
【００１０】
本発明の第２の発明は、第１の発明のヌクレオチドをプライマーとして使用することを特徴とする核酸の合成方法に関する。
【００１１】
本発明の第３の発明は、第１の発明のヌクレオチドを構成の必須要件としてなる第２の発明の核酸の合成方法に使用するキットに関する。
【００１２】
本発明者らは鋭意検討した結果、下記一般式（化１）：
（Ｘ）ｍ ^５’ （α）ｎβＮ ^３’ （化１）
で表される構造（Ｘは標識化合物及び／又は任意配列からなるヌクレオチド、ｍはＸの存在の有無を示す０又は１、αはチミン、ｎはαの繰り返し数を示す自然数、βはＶ又はＮのいずれか、Ｖはアデニン、グアニン、シトシンのいずれか、Ｎはアデニン、グアニン、シトシン、チミンのいずれかを示す）の２種類以上のヌクレオチドにおいて、各ヌクレオチドが同等のプライミング効率を示すように一般式（化１）のｎを各ヌクレオチドごとに設定することによりヌクレオチドのプライミング効率を均一化させることが可能であり、ディファレンシャルな発現を行う遺伝子をＲＴ−ＰＣＲを用いて解析する方法において、プライミング効率が均一化されたヌクレオチドを第１プライマーとして用いることによりディファレンシャルな発現を行う遺伝子のｍＲＮＡ由来のＰＣＲ産物を効率的に得ることができることを見出した。
更に本発明者らは塩基配列を決定したいＤＮＡ中に存在する同一塩基繰り返し領域中の任意の塩基を異なる塩基に変異させ、該変異ＤＮＡを用いることにより、同一塩基が連続して存在する領域に隣接する領域の塩基配列をサイクル シークエンス法を用いたＤＮＡ塩基配列決定法で解析できることを見出し、該方法に有用なヌクレオチドを開発した。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について具体的に説明する。
本発明において、プライミング効率の決定は、例えばヌクレオチドをＰＣＲのプライマーとして用いることにより実施することができる。ＰＣＲにおいて、例えば第２プライマーを固定して、該プライマーが一端に結合したＰＣＲ産物数及び量が最大となるよう対となる第１プライマーを設計していけばプライミング効率が同等の第１プライマーとして使用可能なヌクレオチドを得ることができる。なお本発明のヌクレオチドは本発明の塩基配列を有していればデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）に特に限定されず、リボヌクレオチド（ＲＮＡ）等目的に応じ適宜選択すればよい。また本発明のヌクレオチドは５’端が標識されている。標識方法としては蛍光標識、ラジオアイソトープ（ＲＩ）標識、ビオチン標識等が挙げられる。例えば蛍光標識の場合、蛍光標識化合物としてはフルオレセイン系のフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、ローダミン系のカルボキシローダミン（ＲＯＸ）、カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ ）、ＣｙＤｙｅ系のＣｙ３．５，Ｃｙ５等が挙げられる。なおヌクレオチドのプライミング効率への影響は、塩基配列のみに依存するものではなく標識化合物にも依存する。したがって第１の発明のヌクレオチドにおいて、βＮ配列が同一であっても一般式（化１）のｎが異なるヌクレオチドが存在する場合がある。
【００１４】
第１の発明のヌクレオチドは、該ヌクレオチドの塩基配列に相補的な塩基配列を有する核酸を検出するためのプローブのほか、核酸合成反応におけるプライマーとして使用できる。なお本明細書における核酸の合成方法とはプライマーを用いた酵素反応による合成方法を意味し、例えばＤＮＡポリメラーゼによる逆転写反応、ＤＮＡ複製反応等が挙げられる。第１の発明のヌクレオチドは、Ｔの繰り返し配列を有するため、ｍＲＮＡを鋳型とした逆転写反応やｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによる増幅反応のプライマーとして特に有用である。該ヌクレオチドはＲＴ−ＰＣＲの第１プライマーとして使用できるが、ディファレンシャルな発現をする未知遺伝子の解析ではｍＲＮＡの３’末端に存在するポリＡ配列の５’側上流に存在する塩基によりＰＣＲ産物をグループ化することが有利であり、上記目的の場合第１プライマーとして例えば一般式（化１）においてβＮがＴＡ、ＴＧ、ＴＣであるヌクレオチドを用いることができる。
しかしＰＣＲ産物のグループ化の点では、上記のβＮがＴＡ、ＴＧ、ＴＣのいずれかであるヌクレオチドのような１塩基のハイブリダイズより２塩基のハイブリダイズでグループ化する方がより確実である。したがって第１の発明のヌクレオチドをディファレンシャルな発現をする未知遺伝子の解析を目的としたＲＴ−ＰＣＲの第１プライマーとして使用する場合には、一般式（化１）のβＮがＶＮで表される１２種類のヌクレオチドから選択することが更に好ましい。本法においてＧＣ含量５０％前後の１０ｍｅｒの非標識ＤＮＡを第２プライマーとして用いた場合、第１プライマーとして使用できる本発明のヌクレオチドとして５’端がＲＯＸ又はＴｅｘａｓ Ｒｅｄ又はＣｙ３．５のいずれか１種により標識された配列番号１〜１０の塩基配列を有する３０種のＤＮＡ、及び５’端がＦＩＴＣ又はＦＡＭのいずれか１種により標識された配列表の配列番号１〜１０、１３、１４で表される塩基配列を有する２４種のＤＮＡを例示することができる。
【００１５】
例示した上記６０種の第１の発明のヌクレオチドは蛍光標識されているため、該ヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲではＤＮＡ検出のためのインナーラベリングが不要でありｄＮＴＰ濃度を至適条件に設定することができる。例示したヌクレオチドはプライミング効率が同等のため、ＲＴ−ＰＣＲにおいて該ヌクレオチドを第１プライマーとし、第１プライマーとプライミング効率が同等で適当な塩基配列を有するヌクレオチドを第２プライマーとして用いると再現性のある結果を得ることができる。第２プライマーには配列表の配列番号１５〜２４で表される塩基配列を有する非標識ＤＮＡが好適に使用できる。またＲＴ−ＰＣＲ法における逆転写反応やＰＣＲにおいて１反応当り第１プライマーとして使用する第１の発明のヌクレオチドの種類は特に限定されず、必要に応じ数種類を組合せて使用してもよい。上記第１プライマーから選択されるヌクレオチド及び第２プライマーから選択されるヌクレオチドを用いたＲＴ−ＰＣＲにより得られるフィンガープリントはシグナル強度、バンドの多様性及び鮮明度等が増し、ディファレンシャルな発現を行う遺伝子ｍＲＮＡ由来のＰＣＲ産物を得る効率が上がる。
なお第１の発明のヌクレオチドにおいて非標識のヌクレオチドであってもエチジウムブロマイド（Ｅｔｈｉｄｉｕｍ Ｂｒｏｍｉｄｅ）のような核酸染色剤、あるいは化学発光系［ガング Ａ．（Ｇａｎｇ， Ａ．）ら、バイオ テクニクス、第２０巻、第３４２〜３４６頁（１９９６）］等を用いたＤＮＡ検出法を採用すればＰＣＲにおけるｄＮＴＰ濃度を至適条件に設定することが可能である。
【００１６】
本発明の第１の発明のヌクレオチド、例えば例示した上記６０種の蛍光標識ＤＮＡから選択されるヌクレオチドを第１プライマーとし配列表の配列番号１５〜２４で表される塩基配列を有する非標識ＤＮＡから選択されるヌクレオチドを第２プライマーとして使用するＲＴ−ＰＣＲにおいて、ＰＣＲにＬＡ−ＰＣＲ［バーンズ（Ｂａｒｎｅｓ）ら、プロシーディングズ オブ ザ ナショナル アカデミー オブ ザ サイエンシーズ オブ ザ ＵＳＡ 、第９１巻、第２２１６〜２２２０頁（１９９４）］を採用すると更に次のような特徴が付加される。すなわち１種のみの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを使用した通常のＰＣＲに比べ▲１▼増幅産物量の増加、▲２▼耐熱性ポリメラーゼのみでは増幅不能のフラグメントの増幅、▲３▼長鎖のＤＮＡ増幅、▲４▼スメアなバンドの消失、が挙げられる。
上記ＲＴ−ＰＣＲでＰＣＲ産物をベクターへのサブクローニングを介さず単離する際、核酸塩基特異的なリガンドを核酸電気泳動用ゲルに添加することにより分子量の似通ったＰＣＲ産物であっても核酸塩基組成によりゲル電気泳動で分離することができる。このようなリガンドとしてｄＡ及びｄＴに結合するＨ．Ａ．−Ｙｅｌｌｏｗ（ハンス アナリティックＧｍｂＨ社製）あるいはｄＧ及びｄＣに結合するＨ．Ａ．−Ｒｅｄ（ハンス アナリティックＧｍｂＨ社製）が例示される。
【００１８】
本発明の第２の発明のＤＮＡ合成反応にはＰＣＲやサイクルシークエンス法等も包含される。第１の発明のヌクレオチドをプライマーとして用いる核酸合成反応としては逆転写反応又はＰＣＲ等が例示される。
本合成方法に使用する酵素は特に限定されず、目的に応じ選択すればよい。ＤＮＡポリメラーゼではＡＭＶリバース トランスクリプターゼ（ＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）ＸＬ、クレノウフラグメント（Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ）、ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（以上、宝酒造社製）等が例示される。
【００１９】
本発明の第３の発明のキットには第１の発明のヌクレオチドのほか、必要に応じ核酸合成に使用する酵素、緩衝液、基質となるｄＮＴＰ等が組込まれていてもよい。
第１の発明のヌクレオチド及び逆転写反応に必要な試薬から構成されるキットは、ｍＲＮＡを対象とした解析に好適に使用できる。上記のキットに核酸増幅反応に必要な試薬を加えたキットは、ＲＴ−ＰＣＲに好適に使用できる。更に上記のキットにサイクルシークエンス法に必要な試薬を加えたキットは、ディファレンシャルな発現を行う未知遺伝子の解析に特に好適に使用できる。
【００２０】
【実施例】
以下、本発明を実施例をもって更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００２１】
実施例１ ヌクレオチドの調製
配列表の配列番号２５〜３３で表される塩基配列を有する蛍光標識ＤＮＡ、又は非標識ＤＮＡをＤＮＡ合成機（アプライドパイオシステムズ／パーキンエルマー社製）を用いて合成した。ヌクレオチドの標識はＲＯＸ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、Ｃｘ３．５、ＦＩＴＣ、ＦＡＭの蛍光標識化合物５種より選択されるいずれか１種を用いた。
配列表の配列番号１５〜２４で表される塩基配列を有する非標識ＤＮＡはＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｄｉｓｐｌａｙ^ＴＭ ｋｉｔ（ディスプレイシステムス社製）中のＤＮＡを用いた。
【００２２】
参考例１ 同等のプライミング効率を示さないヌクレオチドを用いたＲＴ−ＰＣＲによるディファレンシャルな発現を行う遺伝子の解析
（１）ＲＮＡ試料の調製
ＲＮＡはヒト低分化腺癌の進行胃癌患者より摘出された胃の癌化病変部と対照正常部の組織細胞より個別に抽出した。
まず、ＴＲＩｚｏｌ^ＴＭ試薬（ギブコＢＲＬ社製）を用い、それぞれの摘出組織より個々にＲＮＡを抽出した。次に得られたＲＮＡそれぞれ５０μｇ を、最終５ｍ Ｍ ＭｇＣｌ_２ と２０単位のＲＮａｓｅ阻害剤（宝酒造社製）存在下で１０単位のＤＮａｓｅＩ（宝酒造社製）と３７℃、３０分間反応し、ゲノムＤＮＡを除去した。上記方法により病化病変部組織細胞より調製されたＲＮＡ試料をＲＮＡ試料１、対照正常部組織細胞より調製されたＲＮＡ試料をＲＮＡ試料２とした。
【００２３】
（２）ＲＴ−ＰＣＲの実施
（１）で調製した２種のＲＮＡ及びＴａＫａＲａ ＲＮＡ ＬＡ ＰＣＲ^ＴＭ
Ｋｉｔ（ＡＭＶ）Ｖｅｒ．１．１（宝酒造社製）を用いてＲＴ−ＰＣＲを実施した。但し、第１プライマーとして５’端をＲＯＸ標識した配列表の配列番号２９で表される塩基配列を有する１２種類の蛍光標識ＤＮＡを、第２プライマーとして配列番号１５〜２０で表される塩基配列を有する６種類の非標識ＤＮＡを用いた。
逆転写反応は以下のように実施した。まずＰＣＲチューブ（宝酒造社製）にＲＮＡ試料２００ｎｇ、第１プライマーから選択された１種の蛍光標識ＤＮＡ５０ｐｍｏｌを分注し、更にＲＮａｓｅ非含水を加え合計１０μｌとした。該混合液を７０℃で１０分間加熱処理後、氷中で５分間急冷した。次に該混合液に１×ＲＮＡ ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ，５ｍＭ ＭｇＣｌ_２ ，１ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰの等量混合物、２０単位のＲＮａｓｅ阻害剤、５単位のＡＭＶ逆転写酵素から成るＲＴ反応液を加え２０μｌとし５５℃、３０分間の酵素反応後、９５℃、５分間加熱により酵素を失活させた。
反応終了後ＴＥ緩衝液８０μｌを加え希釈し、１本鎖ｃＤＮＡ試料を作製した。第１プライマーとして用いる蛍光標識ＤＮＡを他種に変更した同様の逆転写反応を実施し、ＲＮＡ試料１種当たり１２種類の１本鎖ｃＤＮＡ試料を得た。
続くＰＣＲによる核酸増幅反応は、個々の１本鎖ｃＤＮＡを鋳型とし、逆転写反応時にプライマーとして用いたヌクレオチドと第２プライマーから選択された非標識ＤＮＡ１種をプライマー対として実施した。
ＰＣＲ時の反応液２０μｌ中の組成は１×ＬＡ ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩ（Ｍｇ^２＋Ｆｒｅｅ）、１．３５ｍＭ ＭｇＣｌ_２ 、１００μＭ ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰの等量混合物、０．５単位ＬＡ Ｔａｑポリメラーゼ、０．３μＭ 第１プライマー、０．５μＭ第２プライマー及び２μｌ一本鎖ｃＤＮＡ試料溶液から成る。増幅は９４℃で２分，４０℃で５分，７２℃で５分からなる工程を１サイクル，次に９４℃で３０秒，４０℃で２分，７２℃で１分からなる工程を３４サイクル行った後最終的に７２℃で５分間反応させた。
反応終了後、等量の９５％ホルムアミドを添加し、ゲル電気泳動用試料とした。
第２プライマーとして用いるヌクレオチドを変更した同様のＰＣＲを実施し、ｃＤＮＡ試料１種当り６種類の電気泳動用試料を得た。
【００２４】
（３）フィンガープリントの比較
第１プライマー及び第２プライマーとして使用したヌクレオチドの組合せが同一のＲＮＡ試料１及びＲＮＡ試料２由来電気泳動用試料を対とし、更に第１プライマーとして使用したヌクレオチドが同一の６対の電気泳動用試料を１群として、以下の方法によりフィンガープリント画像を得た。
まず電気泳動用試料は熱変性にて一本鎖に解離させ、各検体につき３μｌを７Ｍ尿素変性４％ポリアクリルアミドゲルに通した。４０Ｗ定電圧で約３時間泳動後、ゲル板を泳動槽からはずし、ガラス面を洗浄し蛍光バイオイメージアナライザーＦＭＢＩＯ ＩＩ Ｍｕｌｔｉ Ｖｉｅｗ（宝酒造社販売）にセットしスキャニングを行った。
図１〜図３に第１プライマーとして各々ＶＮがＧＧ、ＡＧ、ＡＡである蛍光標識ＤＮＡを用いた場合のフィンガープリント画像を写真として示す。図中Ｎ、Ｔはそれぞれ対照正常部、癌病変部を、１５〜２０の数字は第２プライマーに使用した非標識ＤＮＡの塩基配列を示した配列表の配列番号を示し、またＭはＤＮＡ分子量マーカーを示す。図１、図２共第２プライマーとして使用した非標識ＤＮＡの組合せを変えているにもかかわらず得られるフィンガープリントのパターンはわずかにしか変化していない。一方図３のフィンガープリントのパターンは多様性に富みディファレンシャルな発現を示唆するバンドが多数見られる。
これは第１プライマーとして使用したＶＮがＡＡである蛍光標識ＤＮＡは第２プライマーとして使用した非標識ＤＮＡとプライミング効率が近似しているため蛍光標識ＤＮＡと非標識ＤＮＡがが増幅用プライマー対として機能した結果と考えられた。一方、第１プライマーとして使用したＶＮがＧＧ又はＡＧである蛍光標識ＤＮＡは第２プライマーとして使用した非標識ＤＮＡとプライミング効率がかけ離れているため、主として蛍光標識ＤＮＡのみが増幅用プライマー対として機能した結果であると考えられた。この結果得られたＰＣＲ産物は両端に蛍光を有するためシグナル強度が高くフィンガープリント画像上強調されてみえる。
【００２５】
一方、第１プライマーとしてＴの繰り返し数が１４である配列表の配列番号２８で表される塩基配列を有する１２種類のＲＯＸ標識したＤＮＡ、第２プライマーとして配列番号１５〜２０に示す配列を有する６種類の非標識ＤＮＡを用いた上記ＲＴ−ＰＣＲによるフィンガープリントも得た。図には示さないが、ＶＮ配列がＡＡ、ＡＴの蛍光標識ＤＮＡを第１プライマーとして用いるとフィンガープリントのシグナル強度が弱く好ましくなかった。また標識を他の蛍光物質すなわちＴｅｘａｓ Ｒｅｄ、ＦＡＭ、ＦＩＴＣ、Ｃｙ３． ５に変えても同様の結果を示した。
【００２６】
実施例２ プライミング効率が同等なヌクレオチドを第１プライマーとして用いたＲＴ−ＰＣＲとプライミング効率が同等でないヌリレオチドを第１プライマーとして用いたＲＴ−ＰＣＲの比較
（１）プライミング効率が同等なヌクレオチドの選択
配列表の配列番号２６〜３１で表される塩基配列を有する蛍光標識ＤＮＡ７２種よりプライミング効率が同等なヌクレオチドの選択を行った。なお標識に用いた蛍光標識化合物はＲＯＸ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、ＦＡＭ、ＦＩＴＣ、Ｃｙ３． ５の５種である。プライミング効率の決定は、参考例１で実施したＲＴ−ＰＣＲにおける第１プライマーを７２種の蛍光標識ＤＮＡから選択された１種、及び第２プライマーを配列番号１５〜２４に示す塩基配列を有する非標識ＤＮＡから選択された１種に変更したＲＴ−ＰＣＲにより得られるフィンガープリントを用い実施した。また参考のため非標識ＤＮＡを加えずに反応し蛍光標識ＤＮＡ１種のみをプライマーとして機能させたフィンガープリントも得た。フィンガープリントのシグナル強度、バンドの多様性、及び鮮明度、差のあるバンドの見付けやすさ等の観点からプライマー効率が同等のヌクレオチドを選択した。図４〜図６に膨大な実験結果のうちの一例を示す。なお図中ｎは該フィンガープリントを得るために使用した蛍光標識ＤＮＡの塩基配列におけるＴの繰り返し数を示し、１５〜１７の数字は配列表の該配列番号の塩基配列を有する非標識ＤＮＡを用いて得られたフィンガープリントであることを示す。また−は非標識ＤＮＡ無添加により得られたフィンガープリント、Ｍは分子量マーカーにより得られたバンドパターンであることを示す。またＮ，Ｔはそれぞれ対照正常部と癌病変部のバンドであることを示す。
【００２７】
図４は、蛍光標識ＤＮＡとしてＶＮがＧＣであるＲＯＸ標識された配列表の配列番号２７〜２９で表される塩基配列を有するＲＯＸ標識されたＤＮＡを用い得られたフィンガープリントを示す写真である。ｎが１５では４００ｂｐ以上のバンドの多くは蛍光標識ＤＮＡのみがプライマーとして機能した結果得られたバンドであり、ｎが１３の場合でも蛍光標識ＤＮＡのみがプライマーとして機能した結果得られたバンドが強いシグナルを示した。よってＶＮがＧＣであるＲＯＸ標識されたＤＮＡを第１プライマーとして用いる場合、ｎが１４であるＤＮＡを選択した。
図５は、蛍光標識ＤＮＡとしてＶＮがＡＡであるＲＯＸ標識された配列表の配列番号２９〜３１で表される塩基配列を有するＲＯＸ標識されたＤＮＡを用い得られたフィンガープリントを示す写真である。ｎが１６、１７と増すとフィンガープリント全体のシグナル強度は増すが蛍光標識ＤＮＡのみがプライマーとして機能したバンドが目立ち、またバンドがスメアーになった。よってＶＮがＡＡであるＲＯＸ標識されたＤＮＡを第１プライマーとして用いる場合、ｎが１５であるＤＮＡを選択した。
図６は、蛍光標識ＤＮＡとしてＶＮがＧＧであるＣｙ３．５標識された配列表の配列番号２７〜２９で表される塩基配列を有するＲＯＸ標識されたＤＮＡを用い得られたフィンガープリントを示す写真である。この図６においてもｎが１４、１５に設定するとフィンガープリント全体のシグナル強度は増すが蛍光標識ＤＮＡのみがプライマーとして機能したバンドが目立ち、またバンドがスメアーになった。よってＶＮがＧＧであるＣｙ３．５標識されたＤＮＡを第１プライマーとして用いる場合、最もバンドの多様性が高いｎが１３であるＤＮＡを選択した。
【００２８】
このようにして選択されたプライミング効率が同等なヌクレオチドは、５’端に有する蛍光標識化合物がＲＯＸ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、Ｃｙ３．５、ＦＩＴＣ、ＦＡＭのいずれかである配列表の配列番号１〜１０に示した塩基配列を有する蛍光標識ＤＮＡ、及び５’端に有する蛍光色素がＦＩＴＣ、ＦＡＭのいずれかである配列表の配列番号１３又は１４に示した塩基配列を有する蛍光標識ＤＮＡであった。
【００２９】
（２）再現性の実証
第１プライマーとして配列表の配列番号６で表される塩基配列を有し５’端がＲＯＸ標識されたＤＮＡを、第２プライマーとして配列表の配列番号１５〜１７に示す塩基配列を有する非標識ＤＮＡから選択される１種を用いた。参考例１と同様のＲＴ−ＰＣＲを各々同一試薬，同一サーマルサイクラーを用い３回繰り返し行った。これら３回の反応液を同一ゲル上に通し、電気泳動して得られたフィンガープリントの写真を図７中１〜３の数字は実験の実施順序回数、１５〜１７は第２プライマーとして用いたヌクレオチドの塩基配列を示す配列表の配列番号を示し、ＭはＤＮＡ分子量マーカーであることを示す。
いずれのヌクレオチドの組み合わせにおいても非常によく反応が再現されていた。
【００３０】
（３）ＬＡ ＰＣＲテクノロジー導入効果
（１）及び（２）ではＬＡ ＰＣＲテクノロジーを導入して反応を行っているが、ＰＣＲにおいて１種のみの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用い得られた結果との比較を行った。すなわち参考例１記載の方法に従って一本鎖ｃＤＮＡサンプルを作製し、ＰＣＲを１種のみの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼで増幅した場合とＬＡＴａｑポリメラーゼで増幅した場合とでそれぞれ得られるフィンガープリントを比較した。１種のみの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼで増幅する場合はＴａＫａＲａ ＲＮＡ ＰＣＲ^ＴＭ Ｋｉｔ（ＡＭＶ）Ｖｅｒ．２．１中のＴａｑポリメラーゼと緩衝液を使用し、参考例１と同様にＲＴ−ＰＣＲを行った。図８及び図９にその結果を写真として示す。
図８の（ａ）及び（ｂ）はＴａｑポリメラーゼを用いて得られたフィンガープリントを、図９の（ｃ）及び（ｄ）はＬＡ−Ｔａｑポリメラーゼを用いて得られたフィンガープリントを示す。なお、図８（ａ）、図９（ｃ）は第１プライマーとしてＶＮがＧＡである配列表の配列番号２９記載の塩基配列を有し５’末端がＲＯＸ標識されたＤＮＡ、及び第２プライマーとして配列番号１５〜１７に示す配列の非標識のＤＮＡの１種を用い、図８（ｂ）、図９（ｄ）に第１プライマーとして配列表の配列番号７記載の塩基配列を有し５’末端がＲＯＸ標識されたＤＮＡ、及び第２プライマーとして配列番号１５〜１７に示す配列の非標識ＤＮＡから選択された１種を用いた。各図中１５〜１７の数字は第２プライマーとして用いたヌクレオチドの塩基配列を示す配列表の配列番号を示し、またＭはＤＮＡ分子量マーカーであることを示す。Ｎ、Ｔはそれぞれ対照正常部、癌病変部のフィンガープリントであることを示す。
図８の（ａ）と図９（ｃ）並びに図８の（ｂ）と図９の（ｄ）のフィンガープリントを比較すれば、ＬＡ ＰＣＲテクノロジーを導入により▲１▼通常のＴａｑポリメラーゼによる反応より得られるフラグメントのシグナル強度が全体的に強い。▲２▼Ｔａｑポリメラーゼでは合成されなかったフラグメントが合成される。▲３▼長鎖のフラグメントの合成が可能。 ▲４▼明りょうなフィンガープリントが得られることが判明した。
【００３１】
実施例３ ディファレンシャルな発現を行う遺伝子の解析
（１）ディファレンシャルな発現を行う遺伝子のｍＲＮＡ由来ＰＣＲ産物の取得参考例１で調製された２種のＲＮＡ試料を各々鋳型とし、第１プライマーとして配列表の配列番号６に示す塩基配列を有し５’端がＲＯＸ標識されたＤＮＡ、第２プライマーとして配列表の配列番号２１で表される塩基配列を有する非標識のＤＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲを参考例と同様の方法で実施し、フィンガープリントを得た。フィンガープリントの比較より癌病変部と対照正常部で差を示すバンドとしておよそ６２０ｂｐ付近に癌部に特異的に見られるバンドを選択した。次いでポリアクリルアミドゲル上癌部由来ＰＣＲ産物を流したレーン（Ｔ）及び対照正常部由来ＰＣＲ産物を流したレーン（Ｎ）よりフィンガープリント上およそ６２０ｂｐに相当する位置のゲルを各々切り出した。各ゲル切片をそれぞれ５０μｌの水に浸し、１００℃１０分間加熱し含有するＰＣＲ産物を抽出した。それぞれの抽出液２μｌを個々にＰＣＲチューブに加えＲＴ−ＰＣＲの増幅時と同一反応組成でＰＣＲにて再増幅した。増幅は９４℃で２分，４０℃で５分，７２℃で５分からなる行程を１サイクルの後、９４℃で３０秒，４０℃で２分，７２℃で１分からなる行程を９サイクル行った。各々反応液１０μｌを、Ｈ． Ａ．−Ｙｅｌｌｏｗ（ハンスアナリティックＧｍｂＨ社製）を１ｍｌに１単位含む３％ＮｕＳｉｅｖｅ３：１アガロース（ＦＭＣ社製）ゲルに隣り合って流しミニゲル電気泳動システム、ミューピッド−２（コスモバイオ社製）にて５０Ｖで電気泳動を行った。泳動終了後ゲルを蛍光イメージアナライザーにてスキャニングした結果正常部由来増幅産物を流したレーン（Ｎ）は、うすいバンドが一本見えるのに対し、癌部由来増幅産物を流したレーン（Ｔ）は３本のバンドが見られた。癌部由来増幅産物を流したレーン（Ｔ）からレーン（Ｎ）より強いシグナルを有するバンドを再び切り出し、１００μｌ水に加え熱抽出した。
【００３２】
（２）塩基配列決定用ＤＮＡの調製
実施例３の（１）で得られたディファレンシャルな発現をする遺伝子由来のＰＣＲ産物を含む抽出液を配列表の配列番号２１で表される塩基配列を有する非標識ＤＮＡを上流プライマーとし、配列表の配列番号２５で表される非標識ＤＮＡを下流プライマーとしたＰＣＲを行った。１００μｌの反応液中にＨ． Ａ．−Ｙｅｌｌｏｗ含有アガロースゲルよりの抽出液１μｌと１×ＲＮＡ ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２ 、１００μＭ ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰの等量混合物、０．５単位Ｔａｑポリメラーゼ、０．４μＭ上流プライマー、０．２μＭ下流プライマーを含み、増幅は９４℃、２分加熱後９４℃で３０秒、４１℃で３０秒、２分間かけて７２℃にまで温度上昇、７２℃で３０秒からなる行程を４０サイクル、さらに最終的に７２℃，５分間反応して行った。
本反応液全量をＨ．Ａ．− Ｒｅｄ（ハンスアナリティックＧｍｂＨ社製）を１ｍｌにつき１単位含む３％ＮｕＳｉｅｖｅ３：１アガロースゲルに流し、電気泳動した。泳動終了後エチジウムブロマイドにて染色し紫外線照射すると約６４０ｂｐの位置に目的のフラグメントが見られ本バンドを切り出した。切り出したゲルに含まれるｃＤＮＡフラグメントは、フィルター付き遠心チューブＳｕｐｒｅｃ−０１（宝酒造社製）を用い溶出し、エタノール沈殿により回収した。
回収されたＰＣＲ産物をプローブとして用いたノーザンブロット解析によりこのフラグメントは胃の癌部に高く発現するｍＲＮＡに由来することが確かめられた。この回収されたＰＣＲ産物を塩基配列決定用ＤＮＡとした。
【００３３】
（３）塩基配列の決定
塩基配列決定用ＤＮＡの塩基配列を得る為サイクルシークエンス法により解析した。
ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ／パーキンエルマー社製）を用いたが、５’端側からの塩基配列決定は塩基配列決定用ＤＮＡを得るために実施例３の（２）で用いた上流プライマーが１０ｍｅｒと短いためキット記載の方法と一部変更して行った。すなわち２０μｌの反応液中に約２０ｎｇの塩基配列決定用ＤＮＡ、３０μＭ上記上流プライマー、９．５μｌターミネーションミックスを含み９６℃で２０秒、３５℃で３０秒、６０℃で４分からなる行程を２５サイクル反応を行った。反応生成物はダイデオキシンターミネータープロトコール（アプライドバイオシステムズ／パーキンエルマー社製）に述べられたフェノール／クロロホルム法にて精製後、３７３Ａ自動シークエンサー（アプライドバイオシステムズ／パーキンエルマー社製）にて解析した。一方３’端側からの塩基配列解析は、配列表の配列番号３２で表される塩基配列を有する非標識ＤＮＡをプライマーとしたキット記載の方法で行った。図１０には５’側からの解析結果を、図１１には３’側からの解析結果を示す。一方、実施例３の（２）において下流プライマーに１５のＴ連続領域を有する配列表の配列番号３３で表される塩基配列を有する非標識ＤＮＡを用いても塩基配列決定用ＤＮＡは得られ、該ＤＮＡを用い実施例３の（３）と同様の方法で塩基配列の解析を試みた。図１２に該ＤＮＡの３’側からの解析結果を示す。図１０及び図１１は共に明りょうな波形パターンが得られており塩基配列を決定することが可能であった。しかし図１２は波形パターンが乱れており塩基配列決定は不可能であった。
【００３４】
実施例４ キット構築例
以下に示す構成成分を有する、ＲＴ−ＰＣＲを利用した遺伝子発現様式解析キットを構築した。
すなわち第１プライマー用試薬として５’端がＲＯＸで標識された配列表の配列番号１〜３、５〜７、９〜１１で表される塩基配列を有するＤＮＡから選択されるいずれか１種のヌクレオチドをＴＥ緩衝液に２０ ｐｍｏｌ／μｌとなるよう溶解した９種類の溶液、及び第２プライマー用試薬として配列表の配列番号１５〜２４で表される塩基配列を有する非標識のＤＮＡから選択されるいずれか１種のヌクレオチドをＴＥ緩衝液に５０ｐｍｏｌ／ μｌとなるように溶解した１０種類の溶液を含む。その他の試薬として、ＴａＫａＲａ ＲＮＡ ＬＡ ＰＣＲ^ＴＭＫｉｔ（ＡＭＶ） Ｖｅｒ１．１（宝酒造社製）に含有される、ＡＭＶ逆転写酵素、ＲＮａｓｅ阻害剤、１０×ＲＴ−ＰＣＲ緩衝液、２５ｍＭ ＭｇＣｌ_２ 、各々２． ５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰからなる混合物、ＬＡ Ｔａｑポリメラーゼ、ＬＡ Ｔａｑポリメラーゼ添付緩衝液を含む。
【００３５】
【発明の効果】
本発明のヌクレオチドをＲＴ−ＰＣＲ及び塩基配列決定に用いることにより、ディファレンシャルな発現を行う未知遺伝子の解析を再現性よく高効率に実施することができる。
【００３６】
【配列表】
【００３７】
配列番号：１
配列の長さ：１６
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：

【００３８】
配列番号：２
配列の長さ：１５
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：

【００３９】
配列番号：３
配列の長さ：１６
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：

【００４０】
配列番号：４
配列の長さ：１６
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：

【００４１】
配列番号：５
配列の長さ：１５
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：

【００４２】
配列番号：６
配列の長さ：１６
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：

【００４３】
配列番号：７
配列の長さ：１６
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：

【００４４】
配列番号：８
配列の長さ：１６
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：

【００４５】
配列番号：９
配列の長さ：１６
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：

【００４６】
配列番号：１０
配列の長さ：１６
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：

【００４７】
配列番号：１１
配列の長さ：１７
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：

【００４８】
配列番号：１２
配列の長さ：１７
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：

【００４９】
配列番号：１３
配列の長さ：１８
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：

【００５０】
配列番号：１４
配列の長さ：１８
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：

【００５１】
配列番号：１５
配列の長さ：１０
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：

【００５２】
配列番号：１６
配列の長さ：１０
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：

【００５３】
配列番号：１７
配列の長さ：１０
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：

【００５４】
配列番号：１８
配列の長さ：１０
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：

【００５５】
配列番号：１９
配列の長さ：１０
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：

【００５６】
配列番号：２０
配列の長さ：１０
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：

【００５７】
配列番号：２１
配列の長さ：１０
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：

【００５８】
配列番号：２２
配列の長さ：１０
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：

【００５９】
配列番号：２３
配列の長さ：１０
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：

【００６０】
配列番号：２４
配列の長さ：１０
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：

【００６１】
配列番号：２５
配列の長さ：４１
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：

【００６２】
配列番号：２６
配列の長さ：１４
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：

【００６３】
配列番号：２７
配列の長さ：１５
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：

【００６４】
配列番号：２８
配列の長さ：１６
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：

【００６５】
配列番号：２９
配列の長さ：１７
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：

【００６６】
配列番号：３０
配列の長さ：１８
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：

【００６７】
配列番号：３１
配列の長さ：１９
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：

【００６８】
配列番号：３２
配列の長さ：２４
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：

【００６９】
配列番号：３３
配列の長さ：４１
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：

【図面の簡単な説明】
【図１】プライマー効率が同等でないヌクレオチドをプライマーとして用いたＲＴ−ＰＣＲにより得られたフィンガープリントのパターンの１例を示す写真である。
【図２】プライマー効率が同等でないヌクレオチドをプライマーとして用いたＲＴ−ＰＣＲにより得られたフィンガープリントのパターンの１例を示す写真である。
【図３】プライマー効率が同等でないヌクレオチドをプライマーとして用いたＲＴ−ＰＣＲにより得られたフィンガープリントのパターンの１例を示す写真である。
【図４】プライマー効率が同等であるヌクレオチドをプライマーとして用いたＲＴ−ＰＣＲにより得られたフィンガープリントのパターンの１例を示す写真である。
【図５】プライマー効率が同等であるヌクレオチドをプライマーとして用いたＲＴ−ＰＣＲにより得られたフィンガープリントのパターンの１例を示す写真である。
【図６】プライマー効率が同等であるヌクレオチドをプライマーとして用いたＲＴ−ＰＣＲにより得られたフィンガープリントのパターンの１例を示す写真である。
【図７】同一条件のＲＴ−ＰＣＲを３回実施して得られたフィンガープリントのパターンを示す写真である。
【図８】ＲＴ−ＰＣＲにおいてＴａｑポリメラーゼを使用して得られたフィンガープリントのパターンを示す写真である。
【図９】ＲＴ−ＰＣＲにおいてＬＡ−Ｔａｑポリメラーゼを使用して得られたフィンガープリントのパターンを示す写真である。
【図１０】ＤＮＡポリメラーゼを用いた塩基配列決定法による解析結果の１例を示す図である。
【図１１】ＤＮＡポリメラーゼを用いた塩基配列決定法による解析結果の１例を示す図である。
【図１２】ＤＮＡポリメラーゼを用いた塩基配列決定法による解析結果の１例を示す図である。

Claims (3)

1. 下記から選択されるヌクレオチド。
   （１）５’端がＲＯＸ（カルボキシ−Ｘ−ローダミン）、ＴｅｘａｓＲｅｄ［９−〔４（若しくは２）−スルホフェニル−２，３，６，７，１２，１３，１６，１７−オクタヒドロ−１Ｈ，５Ｈ，１１Ｈ，１５Ｈ−キサンテノ〔２，３，４−ｉｊ：５，６，７−ｉ’ｊ’〕ジキノリジン］、又はＣｙ３．５［３−（ｅ−カルボキシペンテニル）−１’−エチル−３，３，３’，３’−テトラメチル−（１，３−ジスルホネート）ジベンゾ−カルボキシシアニン］のいずれか１種により標識された配列番号１〜１０のいずれかに示す塩基配列で表されるヌクレオチド、
   （２）５’端がＦＩＴＣ又はＦＡＭのいずれか１種により標識された、配列番号１〜１０、１３、１４のいずれかに示す塩基配列で表されるヌクレオチド。
2. 請求項１記載のヌクレオチドをプライマーとして使用することを特徴とする核酸の合成方法。
3. 請求項１記載のヌクレオチドを構成の必須要件としてなる請求項２記載の方法に使用するキット。

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