KR102343373B1 - miRNA 동시 다중 검출 방법 및 이를 이용한 miRNA 검출용 키트 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 miRNA 동시 다중 검출 방법 및 이를 이용한 miRNA 검출용 키트에 관한 것으로, 보다 상세하게는 복수 개의 표적 miRNA 각각의 3' 말단 일부분과 혼성화 하는 역전사 프라이머를 이용하여 복수 개의 cDNA를 합성하는 단계; 복수 개의 역전사된 cDNA 각각의 3' 말단 일부분과 혼성화하는 복수 개의 연장 프라이머로 양방향 연장하여 복수 개의 PCR 주형을 합성하는 단계; 상기 복수 개의 PCR 주형에 특이적인 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 이용하여 증폭시키고, 복수 개의 이중표지된 프로브로 miRNA를 검출하는 단계;를 포함하는 miRNA 동시 다중 검출 방법에 관한 것이다.
본 발명의 miRNA 동시 다중 검출 방법은 상업적 miRNA 검출 키트에 비해 짧은 역전사 프라이머를 사용하므로, 역전사 단계에서 반응성이 높으며, 이로 인해 정확한 cDNA 합성이 가능할 뿐만 아니라, 복수의 miRNA 검출을 위한 각각의 역전사프라이머, 연장프라이머, PCR 증폭용 프라이머세트 및 miRNA 검출용 이중표지된 프로브의 설계가 용이하므로, 복수의 miRNA를 동시에 검출할 수 있는 멀티플렉스 분석이 가능하다.
본 발명의 miRNA 동시 다중 검출 방법은 상업적 miRNA 검출 키트에 비해 짧은 역전사 프라이머를 사용하므로, 역전사 단계에서 반응성이 높으며, 이로 인해 정확한 cDNA 합성이 가능할 뿐만 아니라, 복수의 miRNA 검출을 위한 각각의 역전사프라이머, 연장프라이머, PCR 증폭용 프라이머세트 및 miRNA 검출용 이중표지된 프로브의 설계가 용이하므로, 복수의 miRNA를 동시에 검출할 수 있는 멀티플렉스 분석이 가능하다.
Description
본 발명은 miRNA 동시 다중 검출 방법 및 이를 이용한 miRNA 검출용 키트에 관한 것으로, 보다 상세하게는 복수 개의 표적 miRNA 각각의 3' 말단 일부분과 혼성화 하는 역전사 프라이머를 이용하여 복수 개의 cDNA를 합성하는 단계; 복수 개의 역전사된 cDNA 각각의 3' 말단 일부분과 혼성화하는 복수 개의 연장 프라이머로 양방향 연장하여 복수 개의 PCR 주형을 합성하는 단계; 상기 복수 개의 PCR 주형에 특이적인 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 이용하여 증폭시키고, 복수 개의 이중표지된 프로브로 miRNA를 검출하는 단계;를 포함하는 miRNA 동시 다중 검출 방법에 관한 것이다.
마이크로 RNA(microRNA 또는 miRNA, 이하, 'miRNA'로 약칭함)는 22개 정도의 리보뉴클레오티드로 구성된 비번역 RNA로, 그 크기가 매우 작기(~22 nt) 때문에, 이를 분리하거나 검출하는데 큰 어려움이 있다. 이를 검출하기 위한 통상적인 방법으로는 노던 블랏 분석과 마이크로어레이를 이용한 교잡에 기반한 검출, RT-qPCR기반을 이용한 검출 방법 등이 알려져 있다.
현재 RT-qPCR기반의 miRNA검출 기술은 퀴아젠(Qiagen)과 어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems)의 기술이 존재하며, 상기의 기술은 각각 상이한 역전사(reverse transcription사) 기술을 사용하고 있다.
먼저, 퀴아젠의 miRNA 검출 기술은 폴리-A-폴리머레이즈(Poly-A-Polymerase)를 이용한 폴리-A-테일링(Poly-A-Tailing) 기술을 사용하여 모든 miRNA의 3' 말단에 Poly-A 테일을 합성한 후, 3' 말단에 Poly T가 있는 일반적인 RT-프라이머(Universal RT-Primer)들을 miRNA의 3' 말단의 Poly-A Tail에 혼성화(Hybridization)하여 miRNA에서 cDNA(정확히는 ssDNA PCR Template) 라이브러리를 합성한다. 이렇게 합성된 라이브러리를 PCR 스텝에서 표적 miRNA와 동일한 DNA서열을 갖는 올리고머(Oligomer)를 프라이머로 사용하여 증폭하는 기술로서, 그 증폭된 PCR 산물을 SYBR Green을 이용하여 정량적으로 검출하는 기술이다.
하지만, 상기 퀴아젠의 miRNA 검출 기술은 RT단계에서 동일한 RT-프라이머를 이용하여 cDNA를 합성하기에 miRNA의 종류에 상관없이 miRNA의 염기서열을 제외한 cDNA의 서열이 동일한 문제점이 있으며, 또한 PCR 단계에서 표적 miRNA의 서열을 PCR 프라이머로 이용하여 증폭이 이루어지기에 표적 miRNA에 유래하여 합성되어지는 PCR 주형와 높은 특이도로 혼성화할 수 있는 이중-표지된 프로브(Dual-Labeled Probe) 또는 택맨 프로브(TaqMan Probe)의 디자인이 어려운 문제점이 있어, 정확한 miRNA의 동시 다중 검출이 불가능하다.
ABI(Applied Biosystems)사의 miRNA 검출기술은 Stem-Loop 구조를 갖는 RT-프라이머를 사용하며, RT-프라이머의 3' 말단에 표적 miRNA 3' 말단의 6~8개 정도의 서열과 혼성화하는 상보적 서열을 디자인하여, 표적 miRNA를 cDNA(정확히는 ssDNA PCR Template)로 합성한다. 이렇게 합성된 cDNA는 PCR 스텝에서 표적 miRNA와 동일한 DNA서열을 갖는 올리고머를 프라이머로 사용하여 증폭한 다음, 증폭된 PCR 산물을 TaqMan Probe를 이용하여 정량적으로 검출하는 기술이다.
상기 방법에서 TaqMan Probe는 표적하는 miRNA의 말단 뉴클레오타이드 서열 몇 개 그리고 Stem-Loop 말단의 뉴클레오타이드 서열 몇 개와 상보적으로 결합하여 한 개의 표적 miRNA에서 유래된 cDNA에 의해 증폭된 PCR산물을 특이적으로 검출할 수 있으나, Stem-Loop 구조의 RT-프라이머는 길이가 길어 반응속도가 느리며, Stem-Loop 구조를 유지하기 위한 서열의 수정 또는 조정의 한계를 가지고 있어, 동시 다중 분석에는 적합하지 않다.
이에, 본 발명에서는 보다 효과적으로 복수의 표적 miRNA를 동시 다중 검출하는 방법을 확립하기 위해, 예의 노력한 결과, 복수의 표적 miRNA 각각의 3' 말단 일부분과 혼성화 하는 역전사 프라이머를 이용하여 cDNA를 합성하는 단계; 복수의 역전사된 cDNA 각각의 3' 말단 일부분과 혼성화하는 연장 프라이머로 cDNA를 연장하는 단계; 및 상기 복수의 연장된 cDNA를 각각의 cDNA에 특이적인 프라이머 세트를 이용하여 증폭 시키고, 이중표지된 프로브로 miRNA를 검출하는 단계;를 포함하는 miRNA 동시 다중 검출 방법을 확립하였다.
본 발명의 방법은 타사의 기술과 달리 짧은 선형 RT-프라이머를 사용하며, 또한 표적 miRNA에 따라 각기 다른 서열을 갖는 RT-프라이머를 사용하여 cDNA를 합성하며, PCR 스텝에서도 복수의 표적 miRNA으로부터 합성된 cDNA와 상보적으로 결합하는 연장 프라이머를 각기 다른 염기서열로 디자인이 가능하다. 또한, 각각 합성된 cDNA들에 의해서 증폭된 PCR 산물들과 높은 특이도로 상보적으로 결합하는 이중표지된 프로브의 디자인이 가능하므로, 높은 정확도로 miRNA를 동시 다중 검출할 수 있는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 복수 개의 miRNA 동시 다중 검출 방법 및 이를 이용한 miRNA 검출용 키트를 제공하는 데 있다.
상술한 목적을 달성하기 위해,
본 발명은 다음의 단계를 포함하는 miRNA 동시 다중 검출 방법을 제공한다.
(a) 검출하고자 하는 복수 개의 표적 miRNA를 복수 개의 표적 miRNA 각각에 특이적인 직선형태의 역전사 프라이머(reverse transcription primer; RT primer)로 역전사시켜 복수 개의 cDNA를 합성하는 단계;
여기서, 상기 역전사 프라이머는 각각의 표적 miRNA 3' 말단과 혼성화하는 부분 및 임의의 핵산 서열로 구성된 프로빙 사이트(probing site), 및 임의의 핵산 서열인 정방향 프라이머 사이트(forward primer site)로 구성되며,
상기 역전사 프라이머의 정방향 프라이머 사이트 서열은 표적 miRNA 종류에 상관없이 동일한 임의의 서열로 표시되거나, 또는 표적 miRNA 종류 각각에 대해 다른 임의의 서열로 표시된다.
(b) 상기 복수 개의 cDNA를 복수 개의 cDNA 각각에 특이적인 연장 프라이머(extension primer)로 양방향 연장하여, 복수 개의 이중가닥 PCR 주형을 합성하는 단계;
여기서, 상기 연장 프라이머는 각각의 표적 miRNA 3' 말단과 역전사 프라이머가 혼성화하는 부분을 제외한, miRNA 나머지 부분이 역전사된 cDNA 부분과 혼성화하는 핵산서열인 연장 혼성화 사이트(extension annealing site) 및 임의의 핵산 서열인 역방향 프라이머 사이트(reverse primer site)로 구성되며,
상기 연장 프라이머의 역방향 프라이머 사이트 서열은 표적 miRNA 종류에 상관없이 동일한 임의의 서열로 표시되거나, 또는 표적 miRNA 종류 각각에 대해 다른 임의의 서열로 표시된다.
(c) 상기 연장된 복수 개의 이중가닥 PCR 주형을 각각의 PCR 주형에 특이적인 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 이용하여 증폭시킨 다음, 복수 개의 이중표지된 프로브로 miRNA를 검출하는 단계;를 포함하며,
여기서, 상기 정방향 프라이머는 역전사 프라이머의 정방향 프라이머 사이트와 동일한 서열을 가지며, 정방향 프라이머 사이트가 표적 miRNA 종류에 상관없이 동일한 임의의 서열로 표시되는 경우 단일의 정방향 프라이머를, 정방향 프라이머 사이트가 표적 miRNA 종류 각각에 대해 서로 다른 임의의 서열로 표시되는 경우 복수 개 이중가닥 PCR 주형 각각 특이적인 복수 개의 정방향 프라이머를 사용한다.
여기서, 상기 역방향 프라이머는 연장 프라이머의 역방향 프라이머 사이트와 동일한 서열을 가지고, 역방향 프라이머 사이트가 표적 miRNA 종류에 상관없이 동일한 임의의 서열로 표시되는 경우 단일의 역방향 프라이머를, 역방향 프라이머 사이트가 표적 miRNA 종류 각각에 대해 서로 다른 임의의 서열로 표시되는 경우 복수 개 이중가닥 PCR 주형 각각 특이적인 복수 개의 역방향 프라이머를 사용한다.
여기서, 상기 이중표지된 프로브는 역전사 프라이머의 프로빙 사이트와 동일한 핵산서열을 가진다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 역전사 프라이머의 길이는 40 nt 이상 내지 60 nt 이하, 바람직하게는 40 nt 이상 내지 50 nt 이하, 더 바람직하게는 42 내지 49 nt일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 있어서, 상기 역전사 프라이머의 프로빙 사이트(probing site) 길이는 19 내지 24 nt일 수 있으며, 정방향 프라이머 사이트의 길이는 22 내지 25 nt일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 있어서, 상기 프로빙 사이트에서 표적 miRNA 3' 말단과 혼성화하는 부분의 길이는 5 내지 8 nt일 수 있으며, 임의의 핵산 서열 길이는 14 내지 16nt 일수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 연장 프라이머의 길이는 30 nt 이상 내지 60 nt 이하, 바람직하게는 30 nt 이상 내지 50 nt 이하, 더 바람직하게는 34 내지 43 nt일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 연장 프라이머의 연장 혼성화 사이트의 길이는 12 내지 18 nt일 수 있으며, 역방향 프라이머 사이트의 길이는 바람직하게는 22 내지 25 nt일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 정방향 프라이머 또는 역방향 프라이머의 길이는 20 내지 25 nt일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 이중표지된 프로브의 길이는 20 내지 24nt일 수 있으며, miRNA 3' 말단 5 내지 8 nt 부분 및 역전사 프라이머에 의해 연장된 14 내지 16 nt 부분을 동시에 인식할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 이중표지된 프로브는 소광물질 및 형광물질이 결합된 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 소광물질은 답실(Dabcyl), TAMRA, Eclipse, DDQ, QSY, 블랙베리 퀸처(Blackberry Quencher), 블랙홀 퀸처(Black Hole Quencher), Qxl, 아이오와 블랙(Iowa black) FQ, 아이오와 블랙 RQ 또는 IRDye QC-1일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 형광물질은 플루오레신(fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지 닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC, 오레곤 그린(Oregon green), 알렉사 플루오로(Alexa Fluor), FAM, JOE, ROX, HEX, 텍사스 레드(Texas Red), TET, TRITC, TAMRA, 시아닌(Cyanine) 계열 염료 또는 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine) 염료일 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 miRNA 동시 다중 검출방법으로 수행되며,
검출하고자 하는 복수의 표적 miRNA 각각에 특이적이며, 각각의 표적 miRNA 3' 말단과 혼성화하는 부분 및 임의의 핵산 서열로 구성된 프로빙 사이트(probing site), 및 임의의 핵산 서열인 정방향 프라이머 사이트(Forward primer site)로 구성된 복수 개의 역전사 프라이머;
각각의 표적 miRNA 3' 말단과 역전사 프라이머가 혼성화하는 부분을 제외한, miRNA 나머지 부분이 역전사된 cDNA 부분과 혼성화하는 핵산서열인 연장 혼성화 사이트(extension annealing site) 및 임의의 핵산 서열인 역방향 프라이머 사이트(reverse primer site)로 구성된 복수 개의 연장 프라이머;
역전사된 cDNA를 증폭시킬 수 있으며, 역전사 프라이머의 정방향 프라이머 사이트와 동일한 서열을 가지는 복수 또는 단일의 정방향 프라이머, 및 연장 프라이머의 역방향 프라이머 사이트와 동일한 서열을 가지는 복수 또는 단일의 역방향 프라이머; 및
역전사 프라이머의 프로빙 사이트와 동일한 핵산서열을 가지는 복수 개의 이중표지된 프로브;를 포함하는 miRNA 동시 다중 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 키트는 DNA 중합효소, dNTP(dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP) 혼합물, 완충액(buffer solution) 및 증류수를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 miRNA 동시 다중 검출 방법은 상업적 miRNA 검출 키트에 비해 짧은 역전사 프라이머를 사용하므로, 역전사 단계에서 반응성이 높으며, 이로 인해 정확한 cDNA 합성이 가능할 뿐만 아니라, 복수의 miRNA 검출을 위한 각각의 역전사프라이머, 연장프라이머, PCR 증폭용 정방향 프라이머/역방향 프라이머, 및 miRNA 검출용 이중표지된 프로브의 설계가 용이하므로, 복수의 miRNA를 동시에 검출할 수 있는 멀티플렉스 분석이 가능하다.
도 1은 본 발명에 따른 miRNA 동시 다중 검출 방법을 개략적으로 나타낸 모식도이다.
도 2는 miRNA 동시 다중 검출을 위한 역전사프라이머, 연장프라이머, 정방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 이중표지된 프로브의 혼성화 위치 및 길이를 나타낸 모식도이다.
도 3은 hsa-miR-21-5p 검출을 위한 역전사프라이머, 연장프라이머, 정방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 이중표지된 프로브의 혼성화 위치 및 길이를 나타낸 모식도이다.
도 4는 본 발명에 따른 miRNA 동시 다중 검출 방법을 이용하여 hsa-miR-21-5p를 증폭한 결과를 나타낸 데이터이다. 왼쪽 상단은 순차적으로 희석된 hsa-miR-21-5p의 농도 및 증폭 사이클 수에 따른 형광 값의 변화를 나타낸 그래프이고, 왼쪽 하단은 실시간 PCR을 수행한 결과 주형의 copy 수와 검출한계(Cq) 사이클 사이의 상관관계를 나타내는 그래프이다. 오른쪽의 표는 hsa-miR-21-5p 농도에 따른 Ct 값을 나타낸 데이터이다.
도 5는 본 발명에 따른 miRNA 동시 다중 검출 방법을 이용하여 hsa-miR-16-5p를 증폭한 결과를 나타낸 데이터이다. 왼쪽 상단은 순차적으로 희석된 hsa-miR-16-5p의 농도 및 증폭 사이클 수에 따른 형광 값의 변화를 나타낸 그래프이고, 왼쪽 하단은 실시간 PCR을 수행한 결과 주형의 copy 수와 검출한계(Cq) 사이클 사이의 상관관계를 나타내는 그래프이다. 오른쪽의 표는 hsa-miR-16-5p 농도에 따른 Ct 값을 나타낸 데이터이다.
도 6은 hsa-miR-26a-5p, hsa-miR-193a-5p 및 hsa-miR-30b-5p이 혼합된 miRNA 시료에서 본 발명에 따른 miRNA 동시 다중 검출 방법을 수행한 결과를 나타낸 데이터이다.
왼쪽은 각각의 miRNA 농도 및 증폭 사이클 수에 따른 형광 값의 변화를 나타낸 그래프이고, 가운데는 주형의 copy 수와 검출한계(Cq) 사이클 사이의 상관관계를 나타내는 그래프이며, 오른쪽은 각각의 miRNA 농도 따른 Ct 값을 나타낸 데이터이다.
도 7은 hsa-miR-30c-5p, hsa-miR-29c-3p, hsa-miR-331-3p 및 hsa-miR-320a-3p이 혼합된 miRNA 시료에서 본 발명에 따른 miRNA 동시 다중 검출 방법을 수행한 결과를 나타낸 데이터이다.
왼쪽은 각각의 miRNA 농도 및 증폭 사이클 수에 따른 형광 값의 변화를 나타낸 그래프이고, 가운데는 주형의 copy 수와 검출한계(Cq) 사이클 사이의 상관관계를 나타내는 그래프이며, 오른쪽은 각각의 miRNA 농도 따른 Ct 값을 나타낸 데이터이다.
도 2는 miRNA 동시 다중 검출을 위한 역전사프라이머, 연장프라이머, 정방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 이중표지된 프로브의 혼성화 위치 및 길이를 나타낸 모식도이다.
도 3은 hsa-miR-21-5p 검출을 위한 역전사프라이머, 연장프라이머, 정방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 이중표지된 프로브의 혼성화 위치 및 길이를 나타낸 모식도이다.
도 4는 본 발명에 따른 miRNA 동시 다중 검출 방법을 이용하여 hsa-miR-21-5p를 증폭한 결과를 나타낸 데이터이다. 왼쪽 상단은 순차적으로 희석된 hsa-miR-21-5p의 농도 및 증폭 사이클 수에 따른 형광 값의 변화를 나타낸 그래프이고, 왼쪽 하단은 실시간 PCR을 수행한 결과 주형의 copy 수와 검출한계(Cq) 사이클 사이의 상관관계를 나타내는 그래프이다. 오른쪽의 표는 hsa-miR-21-5p 농도에 따른 Ct 값을 나타낸 데이터이다.
도 5는 본 발명에 따른 miRNA 동시 다중 검출 방법을 이용하여 hsa-miR-16-5p를 증폭한 결과를 나타낸 데이터이다. 왼쪽 상단은 순차적으로 희석된 hsa-miR-16-5p의 농도 및 증폭 사이클 수에 따른 형광 값의 변화를 나타낸 그래프이고, 왼쪽 하단은 실시간 PCR을 수행한 결과 주형의 copy 수와 검출한계(Cq) 사이클 사이의 상관관계를 나타내는 그래프이다. 오른쪽의 표는 hsa-miR-16-5p 농도에 따른 Ct 값을 나타낸 데이터이다.
도 6은 hsa-miR-26a-5p, hsa-miR-193a-5p 및 hsa-miR-30b-5p이 혼합된 miRNA 시료에서 본 발명에 따른 miRNA 동시 다중 검출 방법을 수행한 결과를 나타낸 데이터이다.
왼쪽은 각각의 miRNA 농도 및 증폭 사이클 수에 따른 형광 값의 변화를 나타낸 그래프이고, 가운데는 주형의 copy 수와 검출한계(Cq) 사이클 사이의 상관관계를 나타내는 그래프이며, 오른쪽은 각각의 miRNA 농도 따른 Ct 값을 나타낸 데이터이다.
도 7은 hsa-miR-30c-5p, hsa-miR-29c-3p, hsa-miR-331-3p 및 hsa-miR-320a-3p이 혼합된 miRNA 시료에서 본 발명에 따른 miRNA 동시 다중 검출 방법을 수행한 결과를 나타낸 데이터이다.
왼쪽은 각각의 miRNA 농도 및 증폭 사이클 수에 따른 형광 값의 변화를 나타낸 그래프이고, 가운데는 주형의 copy 수와 검출한계(Cq) 사이클 사이의 상관관계를 나타내는 그래프이며, 오른쪽은 각각의 miRNA 농도 따른 Ct 값을 나타낸 데이터이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 일관점에서, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 miRNA 동시 다중 검출 방법에 관한 것이다.
(a) 검출하고자 하는 복수 개의 표적 miRNA를 복수 개의 표적 miRNA 각각에 특이적인 직선형태의 역전사 프라이머(reverse transcription primer; RT primer)로 역전사시켜 복수 개의 cDNA를 합성하는 단계;
여기서, 상기 역전사 프라이머는 각각의 표적 miRNA 3' 말단과 혼성화하는 부분 및 임의의 핵산 서열로 구성된 프로빙 사이트(probing site), 및 임의의 핵산 서열인 정방향 프라이머 사이트(forward primer site)로 구성되며,
상기 역전사 프라이머의 정방향 프라이머 사이트 서열은 표적 miRNA 종류에 상관없이 동일한 임의의 서열로 표시되거나, 또는 표적 miRNA 종류 각각에 대해 다른 임의의 서열로 표시된다.
(b) 상기 복수 개의 cDNA를 복수 개의 cDNA 각각에 특이적인 연장 프라이머(extension primer)로 양방향 연장하여, 복수 개의 이중가닥 PCR 주형을 합성하는 단계;
여기서, 상기 연장 프라이머는 각각의 표적 miRNA 3' 말단과 역전사 프라이머가 혼성화하는 부분을 제외한, miRNA 나머지 부분이 역전사된 cDNA 부분과 혼성화하는 핵산서열인 연장 혼성화 사이트(extension annealing site) 및 임의의 핵산 서열인 역방향 프라이머 사이트(reverse primer site)로 구성되며,
상기 연장 프라이머의 역방향 프라이머 사이트 서열은 표적 miRNA 종류에 상관없이 동일한 임의의 서열로 표시되거나, 또는 표적 miRNA 종류 각각에 대해 다른 임의의 서열로 표시된다.
(c) 상기 연장된 복수 개의 이중가닥 PCR 주형을 각각의 PCR 주형에 특이적인 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 이용하여 증폭시킨 다음, 복수 개의 이중표지된 프로브로 miRNA를 검출하는 단계;를 포함하며,
여기서, 상기 정방향 프라이머는 역전사 프라이머의 정방향 프라이머 사이트와 동일한 서열을 가지며, 정방향 프라이머 사이트가 표적 miRNA 종류에 상관없이 동일한 임의의 서열로 표시되는 경우 단일의 정방향 프라이머를, 정방향 프라이머 사이트가 표적 miRNA 종류 각각에 대해 서로 다른 임의의 서열로 표시되는 경우 복수 개 이중가닥 PCR 주형 각각 특이적인 복수 개의 정방향 프라이머를 사용한다.
여기서, 상기 역방향 프라이머는 연장 프라이머의 역방향 프라이머 사이트와 동일한 서열을 가지고, 역방향 프라이머 사이트가 표적 miRNA 종류에 상관없이 동일한 임의의 서열로 표시되는 경우 단일의 역방향 프라이머를, 역방향 프라이머 사이트가 표적 miRNA 종류 각각에 대해 서로 다른 임의의 서열로 표시되는 경우 복수 개 이중가닥 PCR 주형 각각 특이적인 복수 개의 역방향 프라이머를 사용한다.
여기서, 상기 이중표지된 프로브는 역전사 프라이머의 프로빙 사이트와 동일한 핵산서열을 가진다.
종래의 기술에서 miRNA 검출을 위해 기존에 사용하던 poly-A-taling 방법은 miRNA의 염기서열을 제외한 cDNA의 서열이 동일한 문제점 및 특이도가 높은 이중표지된 프로브의 디자인이 어려운 문제점있다. 또한, Stem-Loop 구조의 RT-프라이머를 이용한 miRNA 검출방법은 RT-프라이머의 길이가 길어 반응속도가 느리며, Stem-Loop 구조를 유지하기 위한 서열의 수정 또는 조정의 한계를 가지고 있어, 동시 다중 분석에는 적합하지 않다.
도 1 및 도 2에 나타난 바와 같이, 본 발명에서는 보다 효과적으로 복수의 표적 miRNA를 동시 다중 검출하는 방법을 확립하기 위해, (a) 검출하고자 하는 복수 개의 표적 miRNA를 복수 개의 표적 miRNA 각각에 특이적인 직선 형태의 역전사 프라이머로 역전사시켜 복수 개의 cDNA를 합성하는 단계; (b) 상기 복수 개의 cDNA를 복수 개의 cDNA 각각에 특이적인 연장 프라이머로 양방향 연장하여 PCR 반응을 위한 복수 개의 이중가닥 주형을 합성하는 단계; (c) 상기 복수 개의 PCR 주형에 특이적인 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 이용하여 증폭시키고, 복수 개의 이중표지된 프로브로 miRNA를 검출하는 단계;를 포함하는 miRNA 동시 다중 검출 방법을 확립하였다.
본 발명의 miRNA 검출 방법은 종래의 기술과 달리 역전사 프라이머 길이가 짧아 반응속도가 빠르며, 서열의 수정에 제약이 없으므로, 보다 용이하게 다양한 miRNA를 동시에 검출할 수 있다.
본 발명의 miRNA 동시 다중 검출 방법은 miRNA 프라이머 갯수에 상관없이 적용 가능하나, 역전사 반응 및 PCR 반응의 효율성을 위해 1 내지 6개, 바람직하게는 1 내지 5개의 miRNA를 동시에 검출할 수 있다.
상기 역전사 프라이머는 각각의 표적 miRNA 3' 말단과 혼성화하는 부분 및 임의의 핵산 서열로 구성된 프로빙 사이트(probing site), 및 임의의 핵산 서열인 정방향 프라이머 사이트(forward primer site)로 구성되며, 상기 역전사 프라이머의 정방향 프라이머 사이트 서열은 표적 miRNA 종류에 상관없이 동일한 임의의 서열로 표시되거나, 또는 표적 miRNA 종류 각각에 대해 다른 임의의 서열로 표시될 수 있다.
상기 역전사 프라이머의 길이는 40 nt 이상 내지 60nt 이하, 바람직하게는 40 nt 이상 내지 50nt 이하, 더 바람직하게는 42 내지 49 nt일 수 있다. 또한, 상기 역전사 프라이머의 프로빙 사이트(probing site) 길이는 19 내지 24 nt일 수 있으며, 정방향 프라이머 사이트의 길이는 22 내지 25 nt일 수 있다.
상기 프로빙 사이트에서 표적 miRNA 3' 말단과 혼성화하는 부분의 길이는 5 내지 8 nt일 수 있으며, 임의의 핵산 서열 길이는 14 내지 16nt 일수 있다.
상기 연장 프라이머는 각각의 표적 miRNA 3' 말단과 역전사 프라이머가 혼성화하는 부분을 제외한, miRNA 나머지 부분이 역전사된 cDNA 부분과 혼성화하는 핵산서열인 연장 혼성화 사이트(extension annealing site) 및 임의의 핵산 서열인 역방향 프라이머 사이트(reverse primer site)로 구성되며, 상기 연장 프라이머의 역방향 프라이머 사이트 서열은 표적 miRNA 종류에 상관없이 동일한 임의의 서열로 표시되거나, 또는 표적 miRNA 종류 각각에 대해 다른 임의의 서열로 표시될 수 있다.
상기 연장 프라이머의 길이는 30 nt 이상 내지 60 nt 이하, 바람직하게는 30 nt 이상 내지 50 nt 이하, 더 바람직하게는 34 내지 43 nt일 수 있다. 또한, 상기 연장 프라이머의 연장 혼성화 사이트의 길이는 12 내지 18 nt일 수 있으며, 역방향 프라이머 사이트의 길이는 바람직하게는 22 내지 25 nt일 수 있다.
상기 정방향 프라이머는 역전사 프라이머의 정방향 프라이머 사이트와 동일한 서열을 가지며, 정방향 프라이머 사이트가 표적 miRNA 종류에 상관없이 동일한 임의의 서열로 표시되는 경우 단일의 정방향 프라이머(universal forward primer site)를 사용할 수 있고, 정방향 프라이머 사이트가 표적 miRNA 종류 각각에 대해 서로 다른 임의의 서열로 표시되는 경우 복수 개 이중가닥 PCR 주형 각각 특이적인 복수 개의 정방향 프라이머를 사용할 수 있다.
상기 역방향 프라이머는 연장 프라이머의 역방향 프라이머 사이트와 동일한 서열을 가지고, 역방향 프라이머 사이트가 표적 miRNA 종류에 상관없이 동일한 임의의 서열로 표시되는 경우 단일의 역방향 프라이머(universal reverse primer site)를 사용할 수 있고, 역방향 프라이머 사이트가 표적 miRNA 종류 각각에 대해 서로 다른 임의의 서열로 표시되는 경우 복수 개 이중가닥 PCR 주형 각각 특이적인 복수 개의 역방향 프라이머를 사용할 수 있다.
상기 정방향 프라이머 또는 역방향 프라이머의 길이는 20 내지 25 nt일 수 있다.
상기 이중표지된 프로브는 역전사 프라이머의 프로빙 사이트와 동일한 핵산서열을 가질 수 있으며, 이중표지된 프로브의 길이는 20 내지 24nt일 수 있으며, miRNA 3' 말단 5 내지 8 nt 부분 및 역전사 프라이머에 의해 연장된 14 내지 16 nt 부분을 동시에 인식할 수 있다.
상기 이중표지된 프로브는 소광물질(Quencher) 및 형광 물질(Fluorescence)이 결합된 것으로, 상기 소광물질은 답실(Dabcyl), TAMRA, Eclipse, DDQ, QSY, 블랙베리 퀸처(Blackberry Quencher), 블랙홀 퀸처(Black Hole Quencher), Qxl, 아이오와 블랙(Iowa black) FQ, 아이오와 블랙 RQ 또는 IRDye QC-1일 수 있으며, 상기 형광물질은 플루오레신(fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지 닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC, 오레곤 그린(Oregon green), 알렉사 플루오로(Alexa Fluor), FAM, JOE, ROX, HEX, 텍사스 레드(Texas Red), TET, TRITC, TAMRA, 시아닌(Cyanine) 계열 염료 또는 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine) 염료일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 방법은 종래 기술과 달리 표적 miRNA에 따라 각기 다른 서열을 갖는 역전사 프라이머를 사용하여 cDNA를 합성하며, PCR 스텝에서도 복수 개의 표적 miRNA으로부터 합성된 cDNA와 상보적으로 결합하는 연장 프라이머를 각기 다른 염기서열로 디자인이 가능하다. 또한, 각각 합성된 cDNA들에 의해서 증폭된 PCR 산물들과 높은 특이도로 상보적으로 결합하는 이중표지된 프로브의 디자인이 가능하므로, 높은 정확도로 miRNA를 동시 다중 검출할 수 있다.
또한, miRNA는 길이가 짧고, 종류에 따라서는 1 내지 2개의 염기서열만 상이하고 나머지 염기서열이 동일하기 때문에, miRNA 일부분에만 특이적인 역전사 프라이머 또는 연장 프라이머를 사용하게 되면, 비특이적 증폭 반응이 일어나, 서열이 유사한 miRNA의 동시 다중 검출이 불가능한 문제점이 있다. 따라서, 본 발명에서는 비특이적 증폭 반응이 일어나지 않게 하기 위해, miRNA 모든 부분을 인식할 수 있도록 역전사 프라이머 및 연장 프라이머를 디자인하였다.
역전사 프라이머 서열은 PCR 증폭 과정에서 이중표지된 프로브 및 정방향 프라이머의 혼성화 부분이 겹치지 않고, 비특이적 반응 없이 충분히 증폭시킬 수 있는 길이가 확보되어야 하므로, 최소 40 nt 이상의 길이가 되도록 디자인하여야 한다.
연장 프라이머 역시 miRNA 3' 말단과 역전사 프라이머가 혼성화하는 부분을 제외한, miRNA 나머지 부분이 역전사된 cDNA 부분 모두 혼성화 되어야 하고, PCR 증폭 과정에서 역방향 프라이머에 의해 비특이적 반응 없이 충분히 증폭시킬 수 있는 길이가 확보되어야 하므로, 최소 30 nt 이상의 길이가 되도록 디자인하여야 한다.
특히, 이중표지된 프로브는 복수 개의 miRNA에서 표적 miRNA를 특이적으로 검출할 수 있도록, miRNA 3' 말단 부분 및 역전사 프라이머에 의해 연장된 임의의 서열 부분을 동시에 인식할 수 있도록 디자인되어야 하기 때문에, 또한, 정방향 프라이머 및 이중표지된 프로브가 혼성화되는 부분이 서로 겹치지 않게 적절한 길이가 되도록 디자인되어야 한다.
즉, 본 발명의 miRNA 동시 다중 검출 방법에 사용되는 역전사 프라이머, 연장프라이며, 정방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 이중표지된 프로브는 비특이적 증폭 및 검출 반응이 일어나지 않게 하기 위해, miRNA 서열을 모두 특이적을 인식할 수 있고, 서로 혼성화 되는 부분이 중첩되지 않으며, PCR 과정에서 적절한 증폭 반응을 수행하기 위한 프라이머 길이의 확보가 가능하므로, 한 튜브 내에서 복수 개의 표적 miRNA의 동시 다중 검출이 가능하다.
본 발명에서 사용되는 용어 "뉴클레오티드(nucleotide)"는 핵산을 구성하는 단위체 분자로 염기, 오탄당 및 인산으로 구성되어 있으며, 상기 염기는 DNA의 경우 아데닌(adenine), 구아닌(guanine), 시토신(cytosine), 및 티민(thymine)의 네 가지가 존재하고, RNA의 경우에는 상기 티민 대신 우라실(uracil)이 사용된다. 상기 오탄당은 DNA의 경우 2'-디옥시리보스(2'-deoxyribose), RNA의 경우 리보스(ribose)가 사용된다.
본 발명에서 사용되는 용어 "올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)"는 상기 뉴클레오티드 단위체 분자의 중합체로서 일반적으로 13 내지 25개까지의 뉴클레오티드로 구성된 짧은 단일쇄 핵산 사슬을 의미하는데, 경우에 따라서는 6-mer, 7-mer, 8-mer, 9-mer, 10-mer, 11-mer 및 12-mer 등 13개 미만의 뉴클레오티드로 구성되거나 25개초과의 뉴클레오티드로 구성된 핵산 사슬을 지칭할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "PCR(polymerase chain reaction)" 또는 "핵산증폭반응"은 열안정성 DNA 중합효소를 이용하여 특정 표적 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. PCR에는 DNA 중합효소 외에 표적 핵산 특이적으로 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드인 프라이머(포워드 프라이머, 리버스 프라이머), 디옥시뉴클레오티드혼합물(dNTP mixture), Mg2 + 등의 2가 이온을 포함하는 반응 완충액 등이 사용된다. 상기 PCR 반응에 의해 생성된 DNA 분자를 본 문서에서는 "증폭산물"이라고 지칭하였다.
본 발명에서 사용되는 용어 "프라이머(primer)"는 PCR 반응 또는 프라이머 연장반응(primer extension) 반응의개시를 위해 사용되는, 주형 핵산분자에 상보적으로 혼성화는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. PCR 반응을 위한 프라이머는 증폭되는 핵산분자의 유전자 코드 진행방향과 동일한 센스 가닥으로부터 선택되는 포워드 프라이머(또는 센스 프라이머) 및 상기 센스 가닥에 상보적인 안티센스 가닥으로부터 선택되는 리버스 프라이머(또는 안티센스 프라이머)의 쌍이 사용되고, 프라이머 연장반응의 경우 통상적으로 단일한 연장용 프라이머가 사용된다.
상기 "센스 가닥"은 이중가닥 DNA 분자 중 유전자의 코드의 진행방향과 동일한 방향의 단일가닥 핵산분자를 의미하고, "안티센스 가닥"은 상기 센스 가닥과 상보결합을 하는 다른 단일가닥 핵산분자를 의미하나, 유전자의 코드 진행방향과 무관하게, 최초로 핵산서열이 규명된 가닥을 "센스 가닥"으로 정의하고 그의 상보가닥을 "안티센스 가닥"으로 정의하는 것도 무방하다.
상기 "프라이머 연장반응(primer extension)"은 DNA 중합효소가 제한된 길이의 주형 핵산에 상보적으로 혼성화된 프라이머를 연장시켜 상기 주형 핵산의 5'-말단에서 종료가 되는 비연쇄반응을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "혼성화 올리고뉴클레오티드"는 증폭대상 miRNA 분자 또는 상기 증폭대상 miRNA 분자로부터 역전사된 cDNA와 상보결합에 의해 혼성화가능한 핵산분자를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "포워드 프라이머"는 해당 프라이머의 방향(5' -> 3')이 유전자의 방향과 일치하는 경우의 프라이머를 의미한다. 반대로 "리버스 프라이머"는 해당 프라이머의 방향이 유전자의 방향과 반대로 되는 프라이머를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "검출하고자 하는 복수 개의 표적 miRNA"는 검출 대상으로부터 수득된 시료 내에 존재하는 다양한 miRNA 분자를 의미한다.
상기 "시료(sample)"는 예를 들어 배양된 세포, 단백질, 핵산, 또는 이를 포함하는 생물학적 의약제, 동물 또는 인간의 뇌(brain), 눈(eye), 심장(heart), 장(intestine), 신장(kidney), 간(liver), 허파(lung), 근육(muscle), 비장(spleen), 또는 정소(testis)로부터 얻은 조직(tissue), 혈액(blood), 혈장(plasma), 혈청(serum), 뇨액(urine), 타액(saliva), 땀(sweat), 정액(semen) 또는 점액(mucus) 등의 체액(body fluid)일 수 있으며, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 miRNA 동시 다중 검출방법으로 수행되며,
검출하고자 하는 복수의 표적 miRNA 각각에 특이적이며, 각각의 표적 miRNA 3' 말단과 혼성화하는 부분 및 임의의 핵산 서열로 구성된 프로빙 사이트(probing site), 및 임의의 핵산 서열인 정방향 프라이머 사이트(Forward primer site)로 구성된 복수 개의 역전사 프라이머;
각각의 표적 miRNA 3' 말단과 역전사 프라이머가 혼성화하는 부분을 제외한, miRNA 나머지 부분이 역전사된 cDNA 부분과 혼성화하는 핵산서열인 연장 혼성화 사이트(extension annealing site) 및 임의의 핵산 서열인 역방향 프라이머 사이트(reverse primer site)로 구성된 복수 개의 연장 프라이머;
역전사된 cDNA를 증폭시킬 수 있으며, 역전사 프라이머의 정방향 프라이머 사이트와 동일한 서열을 가지는 복수 또는 단일의 정방향 프라이머, 및 연장 프라이머의 역방향 프라이머 사이트와 동일한 서열을 가지는 복수 또는 단일의 역방향 프라이머; 및
역전사 프라이머의 프로빙 사이트와 동일한 핵산서열을 가지는 복수 개의 이중표지된 프로브;를 포함하는 miRNA 동시 다중 검출용 키트에 관한 것이다.
상기 키트는 DNA 중합효소, dNTP(dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP) 혼합물, 완충액(buffer solution) 및 증류수를 더 포함할 수 있다.
상기 키트는 샘플을 담는 구획된 캐리어 수단, MVM 검출용 프라이머 세트 및 프로브를 포함하는 용기, PCR 반응용 버퍼 및 DNA 중합효소를 함유하는 용기를 포함한 하나 이상의 용기를 포함할 수 있으며, 상기 프라이머 세트는 서열번호 1 및 서열번호 2에 기재된 염기서열, 기능적 조합 및 그 단편을 포함할 수 있고, 상기 프로브는 서열번호 9에 기재된 염기서열, 기능적 조합 및 그 단편을 포함할 수 있다. 상기 캐리어 수단은 병, 튜브와 같은 하나 이상의 용기를 함유하기에 적합하고, 각 용기는 본 발명의 방법에 사용되는 독립적 구성요소들을 포함하며, 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자는 용기 중의 필요한 제제를 손쉽게 분배할 수 있다.
또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함할 수 있다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일구현예에서, 도 3에 나타난 바와 같이, hsa-miR-21-5p 검출을 위해 역전사프라이머, 연장프라이머, 정방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 이중표지된 프로브의 혼성화 위치 및 서열을 본 발명의 검출 방법에 따라 디자인하여 miRNA 동시 다중 검출용 키트를 제조하였다.
본 발명에 따른 miRNA 동시 다중 검출용 키트를 이용하여 hsa-miR-21-5p 및 hsa-miR-16-5p를 증폭한 결과, hsa-miR-21-5p 농도 의존적으로 Ct 값이 감소하는 것을 확인하였으며, 시료 내에 포함된 miRNA의 수준을 정확하게 정량할 수 있는지 확인하기 위해 순차 희석한 미리 결정된 농도의 miRNA 샘플을 대상으로 실시간 PCR 반응을 수행한후, 검출 한계 사이클(Cq)를 측정한 결과, 매우 낮은 농도부터 Cq 값이 정확한 지수관계를 나타내는 것으로 확인되었으며, miRNA의 카피수의 로그값과 Cq와의 상관관계는 R2값이 0.99 이상에 이를 정도로 매우 높게 나타났다 (도 4 및 도 5). 따라서, 상기 결과로부터 본원발명의 방법은 miRNA의 검출은 물론 정확한 정량을 위해서도 사용할 수 있음을 확인할 수 있었다.
본 발명의 다른 구체적인 일구현예에서, 본 발명에 따른 miRNA 동시 다중 검출용 키트를 이용하여 여러 종류의 miRNA가 혼합된 시료의 분석을 수행한 결과, 도 6 및 도 7에 나타난 바와 같이, 복수 개의 miRNA가 혼합된 시료에서도 각각의 miRNA를 특이적으로 검출 및 정량할 수 있는 것을 확인하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.
이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
본 발명의 키트에 의한 단일 miRNA 검출
본 발명에서는 도 1 및 도 2에 나타난 miRNA 동시 다중 검출 방법에 따라, hsa-miR-21-5p 및 hsa-miR-16-5p를 검출하고자 하였으며, 도 3에 나타난 바와 같이, hsa-miR-21-5p 검출을 위해 역전사 프라이머, 연장 프라이머, 정방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 이중표지된 프로브의 혼성화 위치 및 서열을 본 발명의 검출 방법에 따라 디자인하여 miRNA 동시 다중 검출용 키트를 제조하였다.
hsa-miR-21-5p 및 hsa-miR-16-5p 검출을 위한 프라이머 및 프로브 서열은 하기 표 1 및 표 2에 나타내었다. 또한, 이중표지된 프보르는 소광물질(Quencher) 및 형광 물질(Fluorescence)이 표지되어 있으며, 소광물질은 듀얼퀸칭 시스템(double quanching) 및 단일퀸칭 시스템(single quanching)을 사용하였다.
| 서열정보(5' -> 3') | 서열번호 | |
| hsa-miR-21-5p | UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA | 1 |
| 역전사 프라이머 | TCTCAATCCCCGCCAGATGAGTTGAGGTGGATATGGTCAACA | 2 |
| 연장 프라이머 | GCGTCCTCTGTCTGTTCAGGCATTTAGCTTATCAGACTGA | 3 |
| 정방향 프라이머 | TCTCAATCCCCGCCAGATGA | 4 |
| 역방향 프라이머 | GCGTCCTCTGTCTGTTCAGGCA | 5 |
| 이중표지 프로브 | TGAGGTGGATATGGTCAACA <듀얼퀸칭 시스템> 56-FAM- TGAGGTGGA-ZEN-TATGGTCAACA-3IABkFQ <단일퀸칭 시스템> 56-FAM-TGAGGTGGATATGGTCAACA-3BHQ_1 |
6 |
| 서열정보(5' -> 3') | 서열번호 | |
| hsa-miR-16-5p | UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG | 7 |
| 역전사 프라이머 | TCTCAATCCCCGCCAGATGAGTTGAGGTGGATATGGCGCCAA | 8 |
| 연장 프라이머 | GCGTCCTCTGTCTGTTCAGGCATTTAGCAGCACGTAAATA | 9 |
| 정방향 프라이머 | TCTCAATCCCCGCCAGATGA | 10 |
| 역방향 프라이머 | GCGTCCTCTGTCTGTTCAGGCA | 11 |
| 이중표지 프로브 | TGAGGTGGATATGGCGCCAA <듀얼퀸칭 시스템> 56-FAM-TGAGGTGGA-ZEN-TATGGCGCCAA-3IABkFQ <단일퀸칭 시스템> 56-FAM-TGAGGTGGATATGGCGCCAA-3BHQ_1 |
12 |
| 시료 | 부피 (ul) | 최종 농도 |
| 2X 반응 완충액 | 10 | 1X |
| 역전사 효소(RTase) | 1 | 0.5 U |
| dNTP mix (10 mM) | 2 | 1 mM |
| 역전사용 프라이머 (100 μM) | 1 | 5 uM |
| 주형 | 1 | - |
| 증류수 | 5 | - |
| 총 부피 | 20 | - |
| 시료 | 부피 (ul) | 최종 농도 |
| 2X q PCR Master Mix | 10 | 1X |
| 연장용 프라이머 (10 μM) | 1 | 0.5 μM |
| 포워드 프라이머 (10 μM) | 1 | 0.5 μM |
| 이중표지 프로브 (5 μM) | 1 | 0.25 μM |
| 역전사 반응물 | 1 | - |
| 증류수 | 6 | - |
| 총 부피 | 20 | - |
hsa-miR-21-5p 농도는 1 ㎍ 내지 1 pg이 되도록 순차 희석하여 사용하였으며, 상기 표 3 및 표 4 조건과 같이 역전사 반응 및 실시간 PCR 반응을 Bio-Rad CFX96™를 이용하여 수행하였다.
역전사 반응은 37℃에서 60분 동안 수행한 다음, 95℃에서 5분 동안 반응시켜 역전사 효소를 불활성화 시켰다. 프라이머 연장반응 및 PCR은 95℃에서 10분 동안 반응시킨 후, 95℃에서 15초 및 60℃에서 60초를 40 사이클 돌린 후, Ct 값을 측정하였다.
hsa-miR-21-5p 및 hsa-miR-16-5p를 증폭한 결과, hsa-miR-21-5p 농도 의존적으로 Ct 값이 감소하는 것을 확인하였으며, 시료 내에 포함된 miRNA의 수준을 정확하게 정량할 수 있는지 확인하기 위해 순차 희석한 미리 결정된 농도의 miRNA 샘플을 대상으로 실시간 PCR 반응을 수행한후, 검출 한계 사이클(Cq)를 측정한 결과, 매우 낮은 농도부터 Cq 값이 정확한 지수관계를 나타내는 것으로 확인되었으며, miRNA의 카피수의 로그값과 Cq와의 상관관계는 R2값이 099 이상에 이를 정도로 매우 높게 나타났다 (도 4 및 도 5). 따라서, 상기 결과로부터 본원발명의 방법은 miRNA의 검출은 물론 정확한 정량을 위해서도 사용할 수 있음을 확인할 수 있었다.
본 발명의 키트에 의한 복수 개의 miRNA 검출
본 발명의 miRNA 동시 다중 검출용 키트가 복수 개의 miRNA가 혼합된 시료 속에서 각각의 miRNA를 특이적으로 검출할 수 있는지 확인하고자 하였다.
세트 A 및 세트 B로 나누어서 실험을 수행하였으며, 실험에 사용된 miRNA 종류 및 서열정보는 하기 표 5 및 표 6과 같다.
| 서열정보(5' -> 3') | 서열번호 | ||
| target A | hsa-miR-26a-5p | UUCAAGUAAUCCAGGAUAGGCU | 13 |
| 역전사 프라이머 | TCTCAATCCCCGCCAGATGAGTTGAGGTGGATATGGAGCCTA | 14 | |
| 연장 프라이머 | GCGTCCTCTGTCTGTTCAGGCATTTTCAAGTAATCCAGGA | 15 | |
| 정방향 프라이머 | TCTCAATCCCCGCCAGATGA | 16 | |
| 역방향 프라이머 | GCGTCCTCTGTCTGTTCAGGCA | 17 | |
| 이중표지 프로브 | TGAGGTGGATATGGCGCCAA <듀얼퀸칭 시스템> 56-FAM-TGAGGTGGA-ZEN-TATGGCGCCAA-3IABkFQ <단일퀸칭 시스템> 56-FAM-TGAGGTGGATATGGCGCCAA-3BHQ_1 |
18 | |
| target B | hsa-miR-193a-5p | UGGGUCUUUGCGGGCGAGAUGA | 19 |
| 역전사 프라이머 | TCTCAATCCCCGCCAGATGAGTTGAGGTGGATATGGTCATCT | 20 | |
| 연장 프라이머 | GCGTCCTCTGTCTGTTCAGGCATTTGGGTCTTTGCGGGCG | 21 | |
| 정방향 프라이머 | TCTCAATCCCCGCCAGATGA | 22 | |
| 역방향 프라이머 | GCGTCCTCTGTCTGTTCAGGCA | 23 | |
| 이중표지 프로브 | TGAGGTGGATATGGCGCCAA <듀얼퀸칭 시스템> 5HEX-TGAGGTGGA-ZEN-TATGGCGCCAA-3IABkFQ <단일퀸칭 시스템> 5HEX-TGAGGTGGATATGGCGCCAA-3BHQ_1 |
24 | |
| target C | hsa-miR-30b-5p | UGUAAACAUCCUACACUCAGCU | 25 |
| 역전사 프라이머 | TCTCAATCCCCGCCAGATGAGTTGAGGTGGATATGGAGCTGA | 26 | |
| 연장 프라이머 | GCGTCCTCTGTCTGTTCAGGCATTTGTAAACATCCTACAC | 27 | |
| 정방향 프라이머 | TCTCAATCCCCGCCAGATGA | 28 | |
| 역방향 프라이머 | GCGTCCTCTGTCTGTTCAGGCA | 29 | |
| 이중표지 프로브 | TGAGGTGGATATGGCGCCAA <듀얼퀸칭 시스템> 5Cy5-TGAGGTGGAT-TAO-ATGGCGCCAA-3IAbRQSp <단일퀸칭 시스템> 5Cy5-TGAGGTGGATATGGCGCCAA-3BHQ_2 |
30 |
| 서열정보(5' -> 3') | 서열번호 | ||
| target D | hsa-miR-30c-5p | UGUAAACAUCCUACACUCUCAGC | 25 |
| 역전사 프라이머 | TCTCAATCCCCGCCAGATGAGTTGAGGTGGATATGGGCTGAG | 26 | |
| 연장 프라이머 | GCGTCCTCTGTCTGTTCAGGCATTUGUAAACAUCCUACACU | 27 | |
| 정방향 프라이머 | TCTCAATCCCCGCCAGATGA | 28 | |
| 역방향 프라이머 | GCGTCCTCTGTCTGTTCAGGCA | 29 | |
| 이중표지 프로브 | TGAGGTGGATATGGCGCCAA <듀얼퀸칭 시스템> 56-FAM-TGAGGTGGA-ZEN-TATGGCGCCAA-3IABkFQ <단일퀸칭 시스템> 56-FAM-TGAGGTGGATATGGCGCCAA-3BHQ_1 |
30 | |
| target E | hsa-miR-29c-3p | UAGCACCAUUUGAAAUCGGUUA | 31 |
| 역전사 프라이머 | TCTCAATCCCCGCCAGATGAGTTGAGGTGGATATGGTAACCG | 32 | |
| 연장 프라이머 | GCGTCCTCTGTCTGTTCAGGCATTTAGCACCATTTGAAAT | 33 | |
| 정방향 프라이머 | TCTCAATCCCCGCCAGATGA | 34 | |
| 역방향 프라이머 | GCGTCCTCTGTCTGTTCAGGCA | 35 | |
| 이중표지 프로브 | TGAGGTGGATATGGCGCCAA <듀얼퀸칭 시스템> 5HEX-TGAGGTGGA-ZEN-TATGGCGCCAA-3IABkFQ <단일퀸칭 시스템> 5HEX-TGAGGTGGATATGGCGCCAA-3BHQ_1 |
36 | |
| target F | hsa-miR-331-3p | GCCCCUGGGCCUAUCCUAGAA | 37 |
| 역전사 프라이머 | TCTCAATCCCCGCCAGATGAGTTGAGGTGGATATGGTTCTAG | 38 | |
| 연장 프라이머 | GCGTCCTCTGTCTGTTCAGGCATTGCCCCTGGGCCTATC | 39 | |
| 정방향 프라이머 | TCTCAATCCCCGCCAGATGA | 40 | |
| 역방향 프라이머 | GCGTCCTCTGTCTGTTCAGGCA | 41 | |
| 이중표지 프로브 | TGAGGTGGATATGGCGCCAA <듀얼퀸칭 시스템> 5Cy5-TGAGGTGGATATGGCGCCAA-TAO-3IAbRQSp <단일퀸칭 시스템> 5Cy5-TGAGGTGGATATGGCGCCAA-3BHQ_2 |
42 | |
| target G | hsa-miR-320a-3p | AAAAGCUGGGUUGAGAGGGCGA | 43 |
| 역전사 프라이머 | TCTCAATCCCCGCCAGATGAGTTGAGGTGGATATGGTCGCCC | 44 | |
| 연장 프라이머 | GCGTCCTCTGTCTGTTCAGGCATTAAAAGCUGGGUUGAGA | 45 | |
| 정방향 프라이머 | TCTCAATCCCCGCCAGATGA | 46 | |
| 역방향 프라이머 | GCGTCCTCTGTCTGTTCAGGCA | 47 | |
| 이중표지 프로브 | TGAGGTGGATATGGCGCCAA <듀얼퀸칭 시스템> 5TexRd-XN-TGAGGTGGATATGGCGCCAA-3IAbRQSp <단일퀸칭 시스템> 5TexRd-XN-TGAGGTGGATATGGCGCCAA-3BHQ_2 |
48 |
시료가 혼합된 mimic miRNA는 107 ~ 109 ㎍가 되도록 순차 희석하여 사용하였으며, 상기 실시예 1과 동일하게 상기 표 3 및 표 4 조건으로 역전사 반응 및 실시간 PCR 반응을 Bio-Rad CFX96™를 이용하여 수행하였다.
역전사 반응은 37℃에서 60분 동안 수행한 다음, 95℃에서 5분 동안 반응시켜 역전사 효소를 불활성화 시켰다. 프라이머 연장반응 및 PCR은 95℃에서 10분 동안 반응시킨 후, 95℃에서 15초 및 60℃에서 60초를 40 사이클 돌린 후, Ct 값을 측정하였다.
본 발명에 따른 miRNA 동시 다중 검출용 키트를 이용하여 여러 종류의 miRNA가 혼합된 시료의 분석을 수행한 결과, 도 6 및 도 7에 나타난 바와 같이, 복수 개의 miRNA가 혼합된 시료에서도 각각의 miRNA를 특이적으로 검출 및 정량할 수 있는 것을 확인하였다.
<110> HeimBiotek Inc.
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using the same
<130> 1067181
<160> 48
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hsa-miR-21-5p
<400> 1
uagcuuauca gacugauguu ga 22
<210> 2
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RT primer
<400> 2
tctcaatccc cgccagatga gttgaggtgg atatggcgcc aa 42
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Extension primer
<400> 3
gcgtcctctg tctgttcagg catttagcag cacgtaaata 40
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer
<400> 4
tctcaatccc cgccagatga 20
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer
<400> 5
gcgtcctctg tctgttcagg ca 22
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Dual Labeled Probe
<400> 6
tgaggtggat atggtcaaca 20
<210> 7
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hsa-miR-16-5p
<400> 7
uagcagcacg uaaauauugg cg 22
<210> 8
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RT primer
<400> 8
tctcaatccc cgccagatga gttgaggtgg atatggcgcc aa 42
<210> 9
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Extension primer
<400> 9
gcgtcctctg tctgttcagg catttagcag cacgtaaata 40
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer
<400> 10
tctcaatccc cgccagatga 20
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer
<400> 11
gcgtcctctg tctgttcagg ca 22
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Dual Labeled Probe
<400> 12
tgaggtggat atggcgccaa 20
<210> 13
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hsa-miR-26a-5p
<400> 13
uucaaguaau ccaggauagg cu 22
<210> 14
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RT primer
<400> 14
tctcaatccc cgccagatga gttgaggtgg atatggagcc ta 42
<210> 15
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Extension primer
<400> 15
gcgtcctctg tctgttcagg cattttcaag taatccagga 40
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer
<400> 16
tctcaatccc cgccagatga 20
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer
<400> 17
gcgtcctctg tctgttcagg ca 22
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Dual Labeled Probe
<400> 18
tgaggtggat atggcgccaa 20
<210> 19
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hsa-miR-193a-5p
<400> 19
ugggucuuug cgggcgagau ga 22
<210> 20
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RT primer
<400> 20
tctcaatccc cgccagatga gttgaggtgg atatggtcat ct 42
<210> 21
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Extension primer
<400> 21
gcgtcctctg tctgttcagg catttgggtc tttgcgggcg 40
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer
<400> 22
tctcaatccc cgccagatga 20
<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer
<400> 23
gcgtcctctg tctgttcagg ca 22
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Dual Labeled Probe
<400> 24
tgaggtggat atggcgccaa 20
<210> 25
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hsa-miR-30b-5p
<400> 25
uguaaacauc cuacacucag cu 22
<210> 26
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RT primer
<400> 26
tctcaatccc cgccagatga gttgaggtgg atatggagct ga 42
<210> 27
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Extension primer
<400> 27
gcgtcctctg tctgttcagg catttgtaaa catcctacac 40
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer
<400> 28
tctcaatccc cgccagatga 20
<210> 29
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer
<400> 29
gcgtcctctg tctgttcagg ca 22
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Dual Labeled Probe
<400> 30
tgaggtggat atggcgccaa 20
<210> 31
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hsa-miR-29c-3p
<400> 31
uagcaccauu ugaaaucggu ua 22
<210> 32
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RT primer
<400> 32
tctcaatccc cgccagatga gttgaggtgg atatggtaac cg 42
<210> 33
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Extension primer
<400> 33
gcgtcctctg tctgttcagg catttagcac catttgaaat 40
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer
<400> 34
tctcaatccc cgccagatga 20
<210> 35
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer
<400> 35
gcgtcctctg tctgttcagg ca 22
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Dual Labeled Probe
<400> 36
tgaggtggat atggcgccaa 20
<210> 37
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hsa-miR-331-3p
<400> 37
gccccugggc cuauccuaga a 21
<210> 38
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RT primer
<400> 38
tctcaatccc cgccagatga gttgaggtgg atatggttct ag 42
<210> 39
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Extension primer
<400> 39
gcgtcctctg tctgttcagg cattgcccct gggcctatc 39
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer
<400> 40
tctcaatccc cgccagatga 20
<210> 41
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer
<400> 41
gcgtcctctg tctgttcagg ca 22
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Dual Labeled Probe
<400> 42
tgaggtggat atggcgccaa 20
<210> 43
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hsa-miR-320a-3p
<400> 43
aaaagcuggg uugagagggc ga 22
<210> 44
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RT primer
<400> 44
tctcaatccc cgccagatga gttgaggtgg atatggtcgc cc 42
<210> 45
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Extension primer
<400> 45
gcgtcctctg tctgttcagg cattaaaagc uggguugaga 40
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer
<400> 46
tctcaatccc cgccagatga 20
<210> 47
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer
<400> 47
gcgtcctctg tctgttcagg ca 22
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Dual Labeled Probe
<400> 48
tgaggtggat atggcgccaa 20
Claims (10)
- 다음의 단계를 포함하는 miRNA 동시 다중 검출 방법:
(a) 검출하고자 하는 복수 개의 표적 miRNA를 복수 개의 표적 miRNA 각각에 특이적인 직선형태의 역전사 프라이머(reverse transcription primer; RT primer)로 역전사시켜 복수 개의 cDNA를 합성하는 단계;
여기서, 상기 역전사 프라이머는 각각의 표적 miRNA 3' 말단과 혼성화하는 부분 및 임의의 핵산 서열로 구성된 프로빙 사이트(probing site), 및 임의의 핵산 서열인 정방향 프라이머 사이트(forward primer site)로 구성되며,
상기 역전사 프라이머의 정방향 프라이머 사이트 서열은 표적 miRNA 종류에 상관없이 동일한 임의의 서열로 표시되거나, 또는 표적 miRNA 종류 각각에 대해 다른 임의의 서열로 표시된다.
(b) 상기 복수 개의 cDNA를 복수 개의 cDNA 각각에 특이적인 연장 프라이머(extension primer)로 양방향 연장하여, 복수 개의 이중가닥 PCR 주형을 합성하는 단계;
여기서, 상기 연장 프라이머는 각각의 표적 miRNA 3' 말단과 역전사 프라이머가 혼성화하는 부분을 제외한, miRNA 나머지 부분이 역전사된 cDNA 부분과 혼성화하는 핵산서열인 연장 혼성화 사이트(extension annealing site) 및 임의의 핵산 서열인 역방향 프라이머 사이트(reverse primer site)로 구성되며,
상기 연장 프라이머의 역방향 프라이머 사이트 서열은 표적 miRNA 종류에 상관없이 동일한 임의의 서열로 표시되거나, 또는 표적 miRNA 종류 각각에 대해 다른 임의의 서열로 표시된다.
(c) 상기 연장된 복수 개의 이중가닥 PCR 주형을 각각의 PCR 주형에 특이적인 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 이용하여 증폭시킨 다음, 복수 개의 이중표지된 프로브로 miRNA를 검출하는 단계;를 포함하며,
여기서, 상기 정방향 프라이머는 역전사 프라이머의 정방향 프라이머 사이트와 동일한 서열을 가지며, 정방향 프라이머 사이트가 표적 miRNA 종류에 상관없이 동일한 임의의 서열로 표시되는 경우 단일의 정방향 프라이머를, 정방향 프라이머 사이트가 표적 miRNA 종류 각각에 대해 서로 다른 임의의 서열로 표시되는 경우 복수 개 이중가닥 PCR 주형 각각 특이적인 복수 개의 정방향 프라이머를 사용한다.
여기서, 상기 역방향 프라이머는 연장 프라이머의 역방향 프라이머 사이트와 동일한 서열을 가지고, 역방향 프라이머 사이트가 표적 miRNA 종류에 상관없이 동일한 임의의 서열로 표시되는 경우 단일의 역방향 프라이머를, 역방향 프라이머 사이트가 표적 miRNA 종류 각각에 대해 서로 다른 임의의 서열로 표시되는 경우 복수 개 이중가닥 PCR 주형 각각 특이적인 복수 개의 역방향 프라이머를 사용한다.
여기서, 상기 이중표지된 프로브는 역전사 프라이머의 프로빙 사이트와 동일한 핵산서열을 가진다.
- 제1항에 있어서, 상기 역전사 프라이머의 길이는 42 내지 49 nt인 것을 특징으로 하는 miRNA 동시 다중 검출방법.
- 제1항에 있어서, 상기 역전사 프라이머의 프로빙 사이트(probing site) 길이는 19 내지 24 nt이며, 정방향 프라이머 사이트의 길이는 22 내지 25 nt인 것을 특징으로 하는 miRNA 동시 다중 검출방법.
- 제3항에 있어서, 상기 프로빙 사이트에서 표적 miRNA 3' 말단과 혼성화하는 부분의 길이는 5 내지 8 nt 이며, 임의의 핵산 서열 길이는 14 내지 16 nt인 것을 특징으로 하는 miRNA 동시 다중 검출방법.
- 제1항에 있어서, 상기 연장 프라이머의 길이는 34 내지 43 nt인 것을 특징으로 하는 miRNA 동시 다중 검출방법.
- 제1항에 있어서, 상기 연장 프라이머의 연장 혼성화 사이트의 길이는 12 내지 18 nt인 것을 특징으로 하는 miRNA 동시 다중 검출방법.
- 제1항에 있어서, 상기 연장 프라이머의 역방향 프라이머 사이트의 길이는 바람직하게는 22 내지 25 nt인 것을 특징으로 하는 miRNA 동시 다중 검출방법.
- 제1항에 있어서, 상기 정방향 프라이머 또는 역방향 프라이머의 길이는 20 내지 25 nt인 것을 특징으로 하는 miRNA 동시 다중 검출방법.
- 제1항에 있어서, 상기 이중표지된 프로브의 길이는 19 내지 24 nt 이며, miRNA 3' 말단 5 내지 8 nt 부분 및 역전사 프라이머에 의해 연장된 14 내지 16 nt 부분에 특이적인 것을 특징으로 하는 miRNA 동시 다중 검출방법.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 miRNA 동시 다중 검출방법으로 수행되며,
검출하고자 하는 복수의 표적 miRNA 각각에 특이적이며, 각각의 표적 miRNA 3' 말단과 혼성화하는 부분 및 임의의 핵산 서열로 구성된 프로빙 사이트(probing site), 및 임의의 핵산 서열인 정방향 프라이머 사이트(Forward primer site)로 구성된 복수 개의 역전사 프라이머;
각각의 표적 miRNA 3' 말단과 역전사 프라이머가 혼성화하는 부분을 제외한, miRNA 나머지 부분이 역전사된 cDNA 부분과 혼성화하는 핵산서열인 연장 혼성화 사이트(extension annealing site) 및 임의의 핵산 서열인 역방향 프라이머 사이트(reverse primer site)로 구성된 복수 개의 연장 프라이머;
역전사된 cDNA를 증폭시킬 수 있으며, 역전사 프라이머의 정방향 프라이머 사이트와 동일한 서열을 가지는 복수 또는 단일의 정방향 프라이머, 및 연장 프라이머의 역방향 프라이머 사이트와 동일한 서열을 가지는 복수 또는 단일의 역방향 프라이머; 및
역전사 프라이머의 프로빙 사이트와 동일한 핵산서열을 가지는 복수 개의 이중표지된 프로브;를 포함하는 miRNA 동시 다중 검출용 키트.
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