CN102725421B

CN102725421B - 改良的核酸定量法

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Publication number: CN102725421B
Application number: CN201080048692.7A
Authority: CN
Inventors: K.A.杜冈; H.哈; G.霍德格
Original assignee: ACCUGEN PTY Ltd
Current assignee: ACCUGEN PTY Ltd
Priority date: 2009-09-02
Filing date: 2010-09-02
Publication date: 2018-04-10
Anticipated expiration: 2030-09-02
Also published as: KR20160092522A; BR112012004788A2; ES2665763T3; ZA201202210B; BR112012004788B1; US9238831B2; AU2010291867A1; JP2013503608A; RU2012111733A; EP2473632B1; US20120231465A1; JP5870030B2; CA2772770A1; AU2010291867B2; EP2473632A4; MX2012002734A; MY159569A; IL218423A; SG178960A1; CA2772770C

Abstract

本发明涉及用于基因表达研究的定量核酸的方法且特别涉及定量核酸的改良通用方法，而无需针对持家基因或合成目的基因标准化数据。

Description

改良的核酸定量法

发明领域

本发明涉及用于基因表达研究的定量核酸的方法且特别涉及定量核酸的改良通用方法，而无需针对持家基因或合成的目的基因标准化数据。这种方法可应用于诊断、法医学和研究用途，然而，应当理解本发明并不限于这些具体使用领域。

背景技术

贯穿说明书的现有技术的任何讨论决不应视为承认此类现有技术是广泛已知的或构成本领域普通一般知识的一部分。

用于定量基因表达的PCR技术已通过快速热循环仪的开发和在每个循环后引入扩增产物的荧光监控（实时PCR）得到改良。基因表达的定量通过使用染料特别是荧光染料以及检测与反应开始时样品中的核酸量成比例的在PCR扩增的指数期过程中荧光增加而发生。定量基于阈值循环，即具有可检测荧光的第一个循环，并且可以以绝对方式用外部标准（通常为合成基因）或以相对方式用充当内部校准物的比较标准化参考基因（即持家基因）执行。对照基因或持家基因用于标准化在不同样品之间的mRNA水平。

关键的是所选参考基因不会波动，因为即使在基因表达的边缘变动也将改变靶基因的相对定量概况。吸取和稀释误差也改变扩增水平，并且从而改变定量概况。

基因例如3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）、胆色素原脱氨酶（PBGD）、β-2微珠蛋白或β-肌动蛋白通常用作实时PCR中的内部校准物。然而，上述基因已显示响应实验条件或处理而移动。丰富表达的基因例如18S也不是理想的参考基因，因为PCR条件需要进行限制，以便不干扰反应。

因此，合适的持家基因应在目的组织中充分表达，并且最重要的是，显示在样品之间和在使用的实验条件或处理下在表达中的最低限度变化性。

然而，这些对照基因中的许多可以显示在表达中无法接受的变化性。已显示此类基因的表达水平可以在组织或细胞中不同，并且可以在特定环境即不同处理下改变。因此，关键的是在任何新的实验系统中验证持家基因。发现适合于在具体实验系统中使用的持家基因或参考基因通常是耗时和困难的任务。在某些情况下，这是太不可能的。

外部标准（即合成序列）在基因表达研究中的使用一般要求克隆目的基因以提供合成参考基因。在这种方法中，将已知量的合成参考基因序列系列稀释，随后实施扩增以产生标准曲线。用于这种方法的克隆序列的产生一般是耗时的费力的任务，并且稀释误差被指数扩增，这可以导致核酸水平的不准确评估。高度稀释的克隆序列的稳定性和保存也可以造成困难。

因此，存在关于定量核酸的快速和有效通用方法的需要，所述方法可应用于任何实验情况或处理条件，不需要使用持家基因或合成的目的基因以标准化数据。

本发明的目的之一是克服或改善现有技术的至少一个缺点，或提供有用的替代方法。

发明内容

在一个广泛方面，本发明涉及用于定量核酸的方法，其不需要使用持家基因或合成的参考基因以标准化核酸表达数据。相反，本发明的方法利用与合适染料组合的通用参考寡核苷酸（或可以使用一种或多种此类寡核苷酸），这可以用于生成标准曲线，可以由所述标准曲线计算样品中扩增的靶核酸的绝对水平。因此，本发明的方法可以利用相同参考寡核苷酸，以个别地或在此类目的核酸的混合物中定量不同目的核酸。

本发明还涉及用于在本发明的方法中使用的试剂盒。

在第一个方面，提供了用于定量靶核酸的方法，其包含：

a）用可检测标记物来标记具有预定长度的参考寡核苷酸；

b）使用标记的参考寡核苷酸的系列稀释，通过将可检测标记物的强度针对标记的参考寡核苷酸的浓度作图生成标准曲线；

c）在标记扩增的靶核酸的可检测标记物的存在下扩增靶核酸，

d）比较与标记的扩增靶核酸结合的可检测标记物的强度与标准曲线，并且测定扩增的靶核酸的数量，其中所述标准曲线不被扩增或不与靶核酸共扩增。

在第二个方面，提供了用于定量靶核酸的方法，其包含：

a）用可检测标记物来标记具有预定长度的参考寡核苷酸；

c）扩增靶核酸；

d）用可检测标记物来标记扩增的靶核酸；

e）比较与标记的扩增靶核酸结合的可检测标记物的强度与标准曲线，并且测定扩增的靶核酸的数量，其中所述标准曲线不被扩增或不与靶核酸共扩增。

参考寡核苷酸序列无需与靶核酸或任何持家基因序列具有任何同源性。然而，因为其中参考寡核苷酸在本发明的方法中使用的特定方式（即在参考寡核苷酸的系列稀释后制备标准曲线），参考寡核苷酸序列可以与靶核酸序列或持家基因或其较小部分具有一定程度的同源性（homology）或甚至同一性（identity）。本发明的优点之一是该方法可以利用相同单一参考寡核苷酸以定量不同靶核酸。在实践中，参考寡核苷酸可以是通用的寡核苷酸，具有特定固定长度和GC含量，一般为100 bp和50％GC含量的寡核苷酸。

优选地，靶核酸的扩增通过聚合酶链反应（PCR）法执行。一般地，靶核酸经过15个循环扩增，但这对于本发明的方法并不是关键的。还可以执行在一个反应中多种（multiple）目的靶核酸的同时扩增（即多路（multiplex）PCR）。

参考寡核苷酸可以与靶核酸序列具有相同或相似的长度，但这无需如此。参考寡核苷酸可以长于或短于靶核酸。优选地，单一标准曲线用单一参考寡核苷酸进行制备，并且用于多种靶核酸扩增和定量。需要时，多种靶核酸扩增和定量可以各自在不同时间执行。

优选地，可检测标记物是结合dsDNA的染料，并且它可以是嵌入染料。优选地，染料是荧光染料。使用的染料可以选自SYBR绿I、SYBR绿II、 CYBR金、Evagreen、噁唑黄、噻唑橙、picogreen、TOTO或BEBO、Deep Purple ^TM中的任何一种，然而，染料的选择并不是关键的，因为其他合适染料也可以使用且将是本领域技术人员已知的。优选地，染料化学计量学是一对一的，但可以更高。

在第三个方面，提供了用于在第一个或第二个方面的方法中使用的试剂盒，其包含一种或多种参考寡核苷酸和荧光染料。优选地，仅一种参考寡核苷酸存在于试剂盒中。如果存在超过一种寡核苷酸，每种可以具有相同或不同长度。

在第四个方面，提供了用于在第一个或第二个方面的方法中使用的试剂盒，其包含用荧光染料标记的一种或多种参考寡核苷酸。

在第五个方面，提供了用于在第一个或第二个方面的方法中使用的试剂盒，其包含用荧光染料标记的一种或多种参考寡核苷酸的系列稀释。

参考寡核苷酸应优选具有大于60bp的长度，并且一般在约60bp – 约170bp的范围中。最优选地，参考寡核苷酸应具有100bp的长度，可以用于定量靶核酸，其通常在长度约60bp – 约210bp的范围中。参考寡核苷酸的长度上限并不是关键的，并且将受实际考虑控制。

希望参考寡核苷酸的GC含量是45％或以上。一般地，参考寡核苷酸的GC含量可以选择在约45％- 约75％的范围中，并且最优选它是50％。GC含量的上限并不是关键的。

参考寡核苷酸可以使用已知技术得自天然或其他方式的生物学来源，或它可以合成制备。

除非上下文另有明确要求，说明书和权利要求自始至终，单词“包含”（“comprise”，“comprising”）等应以包括在内的（inclusive）含义进行解释，与专有（exclusive）或穷举（exhaustive）的含义相反；即，在“包括但不限于”的含义中。

附图说明

图1：经过15个循环以不同浓度的参考寡核苷酸标准的荧光。每条水平线代表一个浓度。在反应混合物中酶的缺乏确保荧光经过众多循环是不改变的。该图进一步指出参考寡核苷酸染料复合物通过反复变性和退火循环的稳定性和重现性。

图2：由图1中所示的荧光数据生成的标准曲线。

图3：关于6个基因（由括号定义）的循环曲线。关于每种基因获得3个给定荧光水平f1、f2、f3（例如65、60和55）所需的循环得自这个数据。

图4：在SHR大鼠的心脏中5种目的基因的表达。每种目的基因的表达使用参考寡核苷酸（空心条），参考寡核苷酸加上20个碱基对（阴影条）和参考寡核苷酸加上100个碱基对（实心条）进行计算。增加参考寡核苷酸长度不显著影响目的基因表达的计算。对于参考寡核苷酸与参考寡核苷酸加上20和100个碱基对比较：TNFα p=0.3946；TGFβ p=0.7151；Ang0p=0. 6158；CTGF p=0. 4955和AT1a p=0.5589（ANOVA）。

图5：在3个实验组中在以高盐饮食为主的WKY大鼠的心脏中5种目的基因的表达 –零时间对照（14周龄）空心条，在4周对照媒介物输注后（18周龄）阴影条和在用VIP 4周处理后（18周龄）实心条。

图6：经过3周生成的标准曲线。在运行之间将参考寡核苷酸染料反应混合物冷冻且贮存于-20℃，对于每个循环解冻且再冷冻。如可以看出的，生成的标准曲线随着时间过去以及反复冷冻和再解冻是稳定的。

图7A-F：使用长度范围为70 – 170个碱基对且GC含量为50％到74％不等的5种参考寡核苷酸，对于6种目的基因（血管紧张素原、TGFβ、TNFα、CTGF、At1a和NONO）的定量结果。这些例子中所示的参考寡核苷酸是CTGF 70个碱基对、50％GC含量（CTGF 70/50），CTGF 73个碱基对、74％GC含量（CTGF73/74），β肌动蛋白90个碱基对、50％GC含量（肌动蛋白90/50），CTGF 90个碱基对、50％GC含量（CTGF 90/50），和CTGF 170个碱基对、52％GC含量（CTGF170/52）。

图8A-F：显示使用长度范围为50 – 144个碱基对且GC含量为40％到50％不等的4种参考寡核苷酸，对于6种目的基因（血管紧张素原、TGFβ、TNFα、CTGF、At1a和NONO）的定量结果。这些例子中所示的参考寡核苷酸是肌动蛋白144/40（β 肌动蛋白144个碱基对、40％GC含量）、CTGF 50/50（CTGF 50个碱基对、50％GC含量）、肌动蛋白90/50（β 肌动蛋白90个碱基对、50％GC含量）和CTGF 90/50（CTGF 90个碱基对、50％GC含量）。与肌动蛋白90/50比较，* p<0.005、** p<0.0005；与CTGF 90/50比较，# p<0.01、## p<0.005、###p<0.001和#### p<0.0005。

图9A：VIP或依那普利处理对SHR中的血管紧张素原（AGT）、TGFβ和CTGF表达的作用：零时间对照（空心条）、媒介物对照（阴影条）、VIP输注（实心条）和依那普利处理（交叉阴影条）。对于VIP或依那普利与媒介物对照比较，* p<0.05、** p<0.025、***p<0.0005。对于VIP或依那普利与零时间对照比较，# p<0.001 ## p<0.0005。

图9B：用VIP或依那普利处理对SHR中的NFκB、TNFα和AT1a受体表达的作用。对于VIP或依那普利与媒介物对照比较，* p<0.01 ** p<0.0005；对于VIP或依那普利与零时间对照比较，# p<0.05、## p<0.0005。

图9C：用VIP或依那普利处理对SHR中的金属蛋白酶和TIMP表达的作用。对于VIP或依那普利与媒介物对照比较，*p<0.025、** p<0.0005；VIP或依那普利与零时间对照比较，#p<0.01、## p<0.001、### p<0.0005 VIP。值是对于n=6只大鼠的平均值+ 标准误。

定义

如本文使用的，术语/短语“基因”或“靶核酸”或“靶基因”或“目的基因”或“目的靶序列”或“目的靶”或“目的核酸”已可互换使用且指相同概念。

术语“核酸”指由单体核苷酸的链组成的分子。如本文使用的，该术语意图包含DNA、RNA及其变体和衍生物。

如本文使用的，术语“基因”可以是包含转录和/或翻译调节序列和/或编码区和/或非翻译序列（例如内含子、5'和3'非翻译序列）的天然（例如基因组）或合成基因。基因的编码区可以是编码氨基酸序列或功能RNA例如tRNA、rRNA、催化RNA、siRNA、miRNA或反义RNA的核苷酸序列。术语“基因”还可以包含对应于编码序列（例如外显子）的cDNA，任选包含与之连接的5'或3'非翻译序列。基因还可以是在体外产生的扩增的核酸分子，包含编码区和/或与之连接的5'或3'非翻译序列的全部或部分。

核酸序列的“扩增”可以常规地通过聚合酶链反应（PCR）完成，但还可以通过另一种合适方法例如连接酶链反应完成。在本说明书的上下文中，术语“聚合酶链反应”及其首字母缩写词“PCR”根据其如本领域技术人员理解的普通含义使用。PCR法的例子可以在本领域使用的普通分子生物学教材和参考手册中发现。例如，PCR Technology：Principles andApplications for DNA Amplification（1989）Ed H A Erlich. Stockton Press，NewYork。为了最佳化PCR扩增，引物可以以不同浓度和比例使用。这些及其他变量的选择将是本领域技术人员理解和可获得的。

在本发明的上下文中的“扩增子”指通过扩增反应形成的DNA或核酸产物的片段，例如通过PCR或连接酶链反应进行的那些。在一种情况中，扩增子可以是“靶核酸”或“目的基因”或“目的核酸”等的产物。

“引物”可以与“寡核苷酸”互换使用，并且可以是天然、合成的或其修饰，并且与在模板分子上的特异性核苷酸序列充分互补能够充当核苷酸合成的起始点。

如在本发明的上下文中使用的，“参考寡核苷酸”或“参考核酸序列”或“通用参考寡核苷酸”是核酸，优选双链DNA，且涵盖在标准曲线的制备中有用的或以其他方式适合于目的靶核酸的定量的任何有适当大小的核酸，。因此，参考寡核苷酸可以是多核苷酸，但还可以是更短序列。合适的参考寡核苷酸特征在本文中描述。

参考寡核苷酸可以是完全合成的，或可以使用合适的限制性酶从天然来源的DNA获得，以获得合适大小的核酸作为参考寡核苷酸。

为了获得适当地较大数量，参考寡核苷酸可以使用扩增反应（例如PCR或连接酶链反应）进行扩增，或可以在微生物中重组表达且在使用前纯化。如果参考寡核苷酸的大小允许，那么它还可以通过合成方法大量制备。

“持家基因”一般是组成基因，这是基本细胞功能的维持所需的。此类基因在所有细胞中发现。某些持家基因以相对恒定的水平表达，然而，其他持家基因可以在表达上不同，这取决于使用的实验条件。

“标准曲线”是定量研究工具，标绘测定数据的方法，所述测定数据用于测定物质例如DNA和蛋白质的绝对浓度。

如本发明背景中使用的“定量”意指检测物质的绝对量，在本文情况下“目的靶核酸”。

“系列稀释”指制备标准曲线所需的任何形式的稀释，涵盖由其可以定量“靶核酸”的量的一系列物质（例如核酸）浓度。

在本发明的上下文中，“dsDNA”指双链DNA，“bp”指碱基对，“dNTP”指脱氧核苷三磷酸，“RNA”指核糖核酸，“tRNA”指转移RNA，“rRNA”指核糖体RNA，“siRNA”指小干扰RNA，“miRNA”指微小RNA，“mRNA”指信使RNA，并且“cDNA”指互补DNA。

核酸序列例如引物的“GC含量”对引物的多种性质包括其解链温度（Tm）具有作用。

发明优选实施方案

本发明已通过缺乏用于在对照和处理动物/人组中定量核酸表达的准确和有效方法而被推动。它还通过下述事实被推动：在基因表达研究中使用的大多数已知持家基因响应实验条件或处理移动，从而使结果有偏差。

本发明的优点之一是所述方法去除对用于标准化数据和定量基因表达的持家基因或合成参考基因的需要。本发明的另一个优点是通常通过PCR但可以使用其他方法的靶核酸扩增可以经过减少数目的循环（例如15个循环）执行，而不是用于基因表达研究的通常30个循环左右，从而提供足够量的靶核酸用于在定量测定中使用，同时显著减少测定的时间和成本。

在本文描述的新方法中，与预定长度的参考寡核苷酸组合的染料用于生成标准曲线，所述参考寡核苷酸有利地可以与目的靶核酸无关，但也可以与目的基因相似或等同。通过系列稀释根据本发明的荧光标记的参考寡核苷酸，且将荧光染料的强度水平针对标记的参考寡核苷酸浓度作图，生成标准曲线。不需要参考寡核苷酸的扩增以产生标准曲线。这与用于评估基因表达的目前方法形成对比，在目前的方法中，测试样品和持家基因/合成参考基因并排（side by side）进行扩增或在一个反应混合物中组合。

一旦制备，如果需要定量超过一种目的靶核酸，同一标准曲线就可以使用多次。用于制备标准曲线的稀释的参考寡核苷酸溶液随着时间过去例如经过约一个月的时期以及溶液的反复冷冻和解冻是稳定的。这使得能够在任何实验需求前制备和贮存参考寡核苷酸溶液。

参考寡核苷酸可以是完全合成的序列，扩增的序列（例如PCR生成的），或从天然来源中分离的较大核酸的适当大小的限制性片段。在本发明的方法中使用的参考寡核苷酸不是描述为“持家基因”或“合成参考基因”的那种，即它不需要连同目的基因进行扩增。

可能希望设计不同长度的参考寡核苷酸，以制备用于定量不同长度的靶核酸的标准曲线，但这对于本发明的方法不是关键的。然而，本发明的一个特定优点是特定固定长度的单一参考寡核苷酸可以用于标准曲线中，以定量长于或短于参考寡核苷酸以及具有不同核酸序列的靶核酸。

参考寡核苷酸将希望地具有大于60bp的长度，且一般将在60bp - 约170bp的范围中（即约60、70、80、90 100、110、120、130、140、150、160或约170 bp），这可以用于定量长度在约80 – 约210 bp的范围中的靶核酸，更通常在长度约80 - 约150bp的范围中。进一步地，具有上述范围中的长度的任何参考寡核苷酸可以用于定量长度在上述范围中的任何一种或多种靶核酸产物。应当理解靶序列的长度对于本发明的方法是不重要的，因为它通过使用该方法的那些人选择为目的核酸（或多种目的核酸）。

参考寡核苷酸的长度上限并不是关键的，并且将受实际考虑控制。因此，需要时，在本发明的方法中可以使用大于170bp的参考寡核苷酸，而对靶核酸的定量没有有害作用（例如约170-180、180- 200、200-220、220-240、240-260、260-280、280-300、300-320、320-340、340-360、360-380、380-400 bp等的长度）。

希望参考寡核苷酸的GC含量是45％或以上。GC含量的上限并不是关键的。因此，具有75％GC含量的参考寡核苷酸获得与具有较低GC含量的参考寡核苷酸相似的结果。一般地，参考寡核苷酸的GC含量可以选择在约45％- 约75％的范围中（例如约45％、50％、55％、55％、60％、65％、70％或约75％）。

参考寡核苷酸序列无需与靶核酸或任何持家基因序列具有任何同源性。然而，因为其中参考寡核苷酸在本发明的方法中使用的特定方式（即在参考寡核苷酸的连续稀释后建立标准曲线），参考寡核苷酸序列可以与靶核酸序列或持家基因或其较小部分具有一定程度的同源性或甚至同一性。本发明的优点之一是该方法可以利用相同参考寡核苷酸，以定量不同靶核酸。在实践中，参考寡核苷酸将是通用的寡核苷酸，具有特定固定长度和GC含量，一般为100 bp和50％GC含量的寡核苷酸。设想在上述范围中的至少3种不同参考寡核苷酸包括在试剂盒中，以便能够定量通常测量的基因（核酸）大小的完全范围。

如果参考寡核苷酸使用限制性酶得自天然或其他方式的生物学来源，以获得合适大小的片段，那么GC含量可以使用本领域技术人员众所周知的标准分子生物学技术进行测定，并且将不需要超过简单分析程序，以选择且测定适当大小的片段（Sambrook等人Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版（1989）Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.）。合成参考寡核苷酸还可以是方便地使用的，并且可以通过已知技术进行简单制备，例如下述中描述的那些：Sambrook等人Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版（1989）Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.和Roe等人DNA Isolation andSequencing"（Essential Techniques Series）（1996）John Wiley & Sons，Inc.，N.Y。合成参考寡核苷酸的所需长度和GC含量可以在合成过程中容易地选择。

本发明的方法适合于与嵌入染料以及荧光探针（染料）一起使用。对于嵌入染料，参考寡核苷酸的长度不影响对于给定浓度的参考寡核苷酸的荧光强度，只要参考寡核苷酸的长度是60bp或更长。看起来对影响荧光强度的参考寡核苷酸长度不存在上限。因此，一个参考寡核苷酸适合于用作参考标准用于任何数目的目的核酸靶序列，所述核酸靶序列可以具有不同长度、GC含量和/或核苷酸序列。对于荧光探针，相同参考寡核苷酸可以用于系列研究的许多核酸靶，条件是使用相同荧光团。可替代地，多重标准曲线可以使用一种参考寡核苷酸但不同荧光团生成，以提供用于多路rt-PCR产物的定量框架。

因此，本发明的方法是有利的，因为它去除扩增持家基因且不断地运行关于持家基因或合成持家基因的测定以在每个实验内标准化核酸表达数据的需要。一个标准曲线可以制备且使用一段时间，以定量可以在大小和序列方面不同的超过一种目的靶核酸，从而当与常规基因表达测定比较时，削减成本和时间。

本发明的方法适合于自动化以及实时监控靶核酸扩增和定量，其通过在扩增目的靶核酸开始前将参考寡核苷酸标准曲线信息存储于基于计算机的系统中，且在特定时间段获得扩增反应的样品或监控随着时间过去（实时）荧光的增加且使信息与存储的标准曲线信息关联来进行。当以这样的模式操作方法时，标准曲线可以定期例如每周或每月生成，并且这种信息存储且用于一段时间定量目的靶核酸，而无需制备新标准曲线。

本发明的方法和试剂盒可以使用单一参考寡核苷酸有利地用于定量具有基因（核酸）产物的目的基因（核酸），其通常在分析和研究实验室中遇到，且通常在长度80 - 150bp的范围中且具有30％- 60％GC含量。更具体而言，本发明的方法和试剂盒使用优选长度是100bp且具有50％GC含量的单一参考寡核苷酸用于定量长度超过60bp和35％GC含量的核酸产物。试剂盒的优选形式从而由此类参考寡核苷酸或其系列稀释和用于目的核酸的反应的染料或其他合适可检测标记物组成。可替代地，试剂盒包括用染料或其他合适标记物来标记的参考寡核苷酸，或此类标记的参考寡核苷酸的系列稀释，和待用于标记目的核酸的染料或标记物。

作为用于制备在本发明的方法中使用的标准曲线的一般指导，使用与用于目的基因的反应缓冲液相同的反应缓冲液一式两份地系列稀释参考寡核苷酸，以给出例如在约0.01 – 约10pmol参考寡核苷酸/反应管范围中（可以是更窄或更宽的范围）的最终量，以使得如本文描述的标准（参考）曲线的构建成为可能。参考核苷酸的浓度范围通过简单尝试和误差进行测定，取决于需求。可检测标记物例如荧光染料（与用于目的基因的那种相同且以与用于目的基因反应的那种相同的量）随后加入每个反应管中。一般地，反应管在实时rt-PCR机器中经历15个循环（或需要时，可以是更多循环），循环条件反映用于目的基因的那些。因此，如果关于目的基因的起始变性条件是例如94℃和2分钟，那么含有参考寡核苷酸的系列稀释（待用于构建标准曲线）的管经历在94℃2分钟的起始变性。接下来的15个循环随后与目的基因的条件平行，从而使得如果目的基因循环条件包括例如在95℃30秒的变性，随后为在60℃30秒的退火，含有参考寡核苷酸的系列稀释的管也在95℃30秒（变性）和60℃30秒（退火）进行循环。如果荧光染料用作标记或标记物，那么荧光可以在每个退火期获得，如图1和2中证实的。随后如本文描述的构建荧光相对于核酸（例如DNA）的量的标准（参考）曲线。

尽管本发明已通过例子进行描述，但应当理解可以做出变化和修饰，而不背离本发明的范围。此外，当对于特定特征存在已知等效特征（equivalent）时，此类等效特征可被并入，如同本说明书中具体提及。

实施例

实施例1

计算

在rt-PCR中，在预定循环数目（c）后，存在的目的基因的量（R）以可重复方式与PCR扩增开始时存在的那种基因的量（n）相关，条件是复制效率是100％，并且在每个循环时基因的每个拷贝都被复制。

R = n x 2^c

n = 在时间0时存在的复制数

c= 在预定荧光时的循环数目

R= 在c个循环后存在的复制数

当效率小于100％，并且并非基因的所有拷贝都在每个循环时复制时，等式修改为考虑在复制效率中的这种减少，那么

R = n x e^c

e = 复制效率

c= 在预定荧光时的循环数目

R= 在c个循环后存在的复制数

实施例2

参考寡核苷酸的制备

尽管引用的实施例使用结缔组织生长因子（CTGF）的RNA以生成参考寡核苷酸，但应当理解用作标准的参考寡核苷酸可以由任何基因的RNA或编码或非编码DNA生成。

如下通过扩增来自自发性高血压大鼠（SHR）的心脏组织的CTGF基因的片段制备长度70、90和170个碱基对的参考寡核苷酸：

1）RNA提取

从SHR动物中收集组织用于总RNA提取，所述总RNA提取通过具有修改的苯酚和异硫氰酸胍（Chomczynski和Sacchi 1987）进行。通过Mixer Mill MM300（Retsch GmbH，德国）均质化液氮冷冻的SHR心脏。将各100mg的冷冻样品加入在具有Tungsten Carbide Beads3mm（Qiagen）的1.5mL安全锁（Safe-Lock）微量试管（Eppendorf Biopur，Hamburg，德国）中的1mL Trizol试剂（Invitrogen），且以30Hz的频率磨碎。随后根据制造商的建议（Invitrogen）进行RNA提取。在破裂样品用于RNA提取后，进行相分离，由此加入200mL氯仿（Lab-Scan Analytical Sciences，Lomb Scientific，Taren Point，NSW，Australia），并且将样品手工剧烈振荡15秒，并且随后在使用Sigma 1-15PK离心机（John MorrisScientific，Chatswood，NSW，Australia）以12,000rpm（13,201g）在4℃离心20分钟（制动脱开（brake off））前，在室温（23-30℃）温育5分钟。将300mL上层水相收集到新的1.5mLeppendorf管，并且加入500mL预冷的2-丙醇（异丙醇）（Lab-Scan Analytical Sciences，Lomb Scientific，Taren Point，NSW，Australia），并且通过手工倒置样品数次以混合。混合物在室温温育10分钟，以沉淀RNA。通过以12,000rpm在4℃离心20分钟形成沉淀（JohnMorris Scientific，Chatswood，NSW，Australia）。弃去上清液，并且随后用在焦碳酸二乙酯（DEPC）（Sigma-Aldrich，Castle Hill，NSW，Australia）中稀释的1mL 75％（v/v）绝对分子级别乙醇（Lab-Scan Analytical Sciences，Lomb Scientific，Taren Point，NSW，Australia）洗涤沉淀，并且以10,000rpm在4℃旋转10分钟（John Morris Scientific，Chatswood，NSW，Australia）。收集沉淀，并且在通风橱中风干数分钟，随后溶解于DEPC处理的Milli-Q水且贮存于-80℃。通过分光光度计吸光度测定总RNA浓度，使用在260nm（A₂₆₀）的Nanodrop 1000（Nd-1000，Thermo Scientific）进行；并且如果A₂₆₀:A₂₈₀的比是约2.0，那么RNA的纯度视为令人满意的。

2）脱氧核糖核酸酶1（DNA酶-1）处理

在逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）前，用DNA酶-1（Invitrogen）处理RNA样品，以消除双链和单链DNA。在0.5mL无DNA酶和RNA酶的eppendorf管中，用在含DEPC处理的水的10µL总体积中的1单位/µL DNA酶-1和1µL 10X DNA酶-1反应缓冲液消化高达1µg RNA。在溶液混合物中通过用1µL 25mM EDTA螯合钙和镁离子且在65℃加热10分钟灭活DNA酶-1前，将样品在室温温育15分钟。将样品在冰上冷却且贮存于-80℃。混合物的所有组分在DNA酶-1试剂盒（Invitrogen）中供应。

3）RNA质量和浓度的评估

在MCE-202 MultiNA微芯片自动化电泳仪器（Shimadzu Biotech，Rydalmere，NSW，Australia）上，就核糖体RNA（rRNA）18S和28S亚单位的纯度、大小和浓度分析DNA酶-1处理的DNA样品。所有步骤根据制造商的建议执行，伴随微小修饰。简言之，将3µL每种样品与等体积的内部RNA标记物（Shimadzu Biotech，Rydalmere，NSW，Australia）在96孔板中混合，并且用粘性PCR铝箔（Thermo Scientific，Integrated Sciences，NSW，Australia）密封。RNA连同已知浓度和大小的内部标准标记物（更低和更高的分子大小标记物）自动地校正电泳结果用于RNA样品的自动化大小预测和定量。用DEPC处理的水以1:5（v/v）的比例稀释RNA-6000梯带（Applied Biosystems，Victoria，Australia）；随后将溶液混合物与RNA标记物溶液以1:1（v/v）混合。样品和梯带混合物两者在65℃热变性5分钟，并且立即在冰上冷却5分钟。这些大小范围分离在MultiNA的微芯片（Shimadzu Biotech，Rydalmere，NSW，Australia）上在RNA分离缓冲液（Shimadzu Biotech，Rydalmere，NSW，Australia）中执行，所述RNA分离缓冲液含有10,000X荧光嵌入染料SYBR绿II（Invitrogen），用TE（10mM Tris-HCl，1mM EDTA二钠，pH8.0）（Sigma-Aldrich）和20％（v/v）甲酰胺（Invitrogen）稀释1:99。

4）逆转录

根据制造商的说明书，使用SuperScript III First-Strand SynthesisSuperMix试剂盒（Invitrogen）的莫洛尼-鼠白血病病毒逆转录酶（M-MLV RT），由单链RNA模板合成第一链互补DNA（cDNA）。所有反应在0.2mL薄壁的eppendorf管中执行；并且所有温育步骤在Rotor-Gene 6000（Corbett Research，Sydney，Australia；Qiagen）上执行。高达5µg总RNA在65℃热变性5分钟，用在含DEPC处理的水的8µL总体积中的1µL 50µM寡核苷酸（dT）₂₀和1µL退火缓冲液进行。在加入10µL 2X第一链反应混合物和2µL SuperScript III/RNaseOUT酶混合物前，样品在冰上冷却至少1分钟。将样品短暂涡旋以混合，并且随后通过脉冲旋转收集，随后在50℃温育50分钟用于cDNA合成。将RT酶在85℃变性5分钟以终止反应，并且将样品立即在冰上冷却且贮存于-20℃。包括不含RT酶或RNA的阴性对照样品，以验证DNA污染的不存在。

5）引物

基于由NCBI GenBank公开的结缔组织生长因子（CTGF）的大鼠mRNA序列（登记号AB023068），设计生成70bp、90bp和170bp的PCR产物长度的引物对。将引物序列（引物序列自身是长度21-24个碱基）寄出用于合成为脱盐的冻干产物（Invitrogen）。用TE（10mM Tris-HCl，pH8.0，1mM EDTA）（Invitrogen）将引物重建为50µM的浓度，并且贮存于-20℃。

表1：用于大鼠CTGF的引物序列。

有义序列（5’-3’）	反义序列（5’-3’）	mRNA范围	产物大小（bp）
				AAAGATGGTGCACCCTGTGTCTTC	TGCAACTGCTTTGGAAGGACTC	499-568	70
AAAGATGGTGCACCCTGTGTCTT	CAGGCAAGTGCACTGGTATTTG	499-588	90
				AATGCTGTGAGGAGTGGGTGT	CATCCCACAGGTCTTAGAACAGG	683-852	170

6）PCR

用每个引物组对SHR心脏执行PCR 以测定与固定量的EvaGreen结合的不同浓度的dsDNA。在该PCR中使用的所有试剂购自Invitrogen，以试剂盒或单品供应。将1微升cDNA在总共50µL反应混合物中扩增，所述反应混合物含有5µL 10X PCR缓冲液、1µL 10mM dNTP混合物、1.5µL 50mM MgCl₂、2µL每种引物对混合物（各10µM）、0.2µL Platinum Taq DNA聚合酶和39.3µL DEPC处理的水。通过Rotor-Gene 6000（Corbett Research，Sydney，Australia；Qiagen）执行PCR。用于扩增的条件最初在94℃变性2分钟；在95℃、10秒的变性；在60℃20秒的退火和在72℃20秒的合成的30-35个循环。在所有运行中包括不含cDNA的阴性对照。

7）PCR产物的浓度

将高达4µL的合并PCR产物加入30K Amicon Ultra-4过滤装置（Millipore，NorthRyde，NSW，Australia）（用于浓缩DNA的纤维素膜），且在Sigma 2-16PK浮桶式转头（JohnMorris Scientific，Chatswood，NSW，Australia）上在22℃、5000rpm（4025g）旋转10分钟。在过滤装置底部收集浓缩的溶质，并且贮存于-20℃用于后续PCR。

8）DNA大小证实和定量

在MCE-202 MultiNA微芯片自动化电泳仪器（Shimadzu Biotech，Rydalmere，NSW，Australia）上，就条带大小证实和浓度分析浓缩的PCR产物。根据制造商的说明书伴随微小修改进行所有步骤。简言之，将6µL浓缩PCR产物的1/10稀释物（v/v）（在DEPC处理的水中稀释的）加入96孔板的每个孔中，并且用粘性PCR铝箔（Thermo Scientific，IntegratedSciences，NSW，Australia）密封。由在TE（10mM Tris-HCl，1mM EDTA二钠，pH8.0）（Sigma-Aldrich）中以1/100稀释度稀释的10,000X SYBR Gold（Invitrogen）组成的DNA-500分离缓冲液（Shimadzu Biotech，Rydalmere，NSW，Australia）随后用于通过微芯片（ShimadzuBiotech，Rydalmere，NSW，Australia）分离DNA样品。DNA条带大小和浓度分别地沿着在TE（10mM Tris-HCl，1mM二钠EDTA，pH8.0）（Sigma-Aldrich）中1:49稀释的25bp DNA梯（Invitrogen）和DNA-500内部标记物（Shimadzu Biotech，Rydalmere，NSW，Australia）分析。

参考文献：

Chomczynski，P.和Sacchi，N.（1987）Anal. Biochem. 162，156。

实施例3

i）标准曲线制备

在含有50µL TE（10mM Tris-HCl、pH8.0、1mM EDTA）（Invitrogen）的反应体积的0.2mL PCR管中，将7微升浓缩的DNA样品（即70、90或170bp产物）一式两份地在1:1（v/v）TE（10mM Tris-HCl、pH8.0、1mM EDTA）（Invitrogen）和1.25µM Eva Green染料中系列稀释，范围从纯的到1/32稀释度。在Rotor-Gene 6000（Corbett Research，Sydney，Australia；Qiagen）中执行滴定。关于循环的条件是在94℃2分钟的起始变性；在95℃30秒变性的15个循环；并且在每个60℃30秒的退火步骤过程中获得荧光信号。在每个标准曲线运行中包括2个阴性对照– 无模板对照和不含Evagreen染料以最高浓度的寡核苷酸。DNA混合物贮存于-20℃用于后续荧光重复测量。

获得关于参考寡核苷酸的每个浓度的荧光（参见图1）。数据随后以荧光（Y轴）相对于以皮摩尔存在的参考寡核苷酸（X轴）作图（参见图2），通过最小二乘法线性回归生成最佳拟合的曲线，并且生成标准曲线等式。

ii）计算

根据标准曲线等式，计算关于3个荧光水平f1,f2 f3的皮摩尔当量（即，选择3个阈值），参见图3。

根据测试/靶样品的RT-PCR，获得：

- 关于目的基因的效率（e）

- 对于3个荧光水平（f1,f2,f3）各自的循环（c1、c2、c3）

- 使用标准曲线等式，生成对应于f1,f2,f3在样品中存在的目的基因的皮摩尔数[DNA（pmol）i]。

由下述计算n（在反应起始时存在的目的基因的皮摩尔数）

- DNA（pmol）_i = n_i x e^ci

- 即 n_i = DNA_i / e^ci

求n_i的平均值，以获得在样品中存在的目的基因的摩尔数。

就每个反应中存在的总RNA校正，并且将n_i表示为皮摩尔数/100 ng总RNA。乘以Avagadro’s数允许它可替代地表示为复制数/100ng RNA（参见图4）。

实施例4

因此，图1显示对于一式两份执行的参考寡核苷酸的每个浓度的荧光。在图2中将数据以荧光（y轴）对于以皮摩尔表示的存在的参考寡核苷酸（x轴）作图，允许通过最小二乘法计算等式限定这个关系。将f1,f2,f3（得自每种目的基因的荧光对于循环数目的图，参见图3）代入标准曲线等式内，得到在循环c1,c2,c3存在的目的基因的计算皮摩尔数（DNA_i）。随后可以如上计算在时间零时存在的目的基因的皮摩尔，并且就总RNA校正且表示为乘以Avagadro’s数后的复制数。

不同长度的参考寡核苷酸作为用于计算n的标准的比较

如在i）标准曲线制备方法下描述的，长度相差20和100个碱基对的3种寡核苷酸用于生成3个标准曲线。随后依次如在ii）计算下所述，使用每个标准曲线独立地定量5种目的基因。通过ANOVA比较通过3个曲线对于每种基因获得的结果，显著差异设为0.05水平（参见图4）。目的基因的表达在3个组之间并无显著不同。因此，参考寡核苷酸的长度中高达100个碱基对的变化不影响目的基因的计算。

应用于实验情况（参见图5）

使用上述方法，在3个实验组中在WKY大鼠的心脏中测量5种目的基因 – 零时间对照（空心条）、媒介物对照（阴影条）和在用VIP处理后（实心条）。

标准曲线的稳定性和重现性

在经过3周时期在反复冻融后测量含有多种浓度的参考寡核苷酸和EvaGreen染料的管具有的荧光。荧光水平对于每个浓度是稳定的。因此，一个标准可以用作定量标准用于大量rt-PCR运行，条件是已采用相同批的染料，并且染料浓度在运行之间并无改变（参见图6）。

实施例5

由不同部分（section）的CTGF、α肌动蛋白和β肌动蛋白制备长度为50到170个碱基对不等且GC含量为40到75％不等的参考寡核苷酸。如在实施例2下所述制备参考寡核苷酸，并且如在实施例3下所述制备标准曲线。基于由NCBI GenBank公开的CTGF的大鼠mRNA（登记号AB023068）以及α肌动蛋白和β肌动蛋白的大鼠mRNA（分别地登记号NM_019183和BC063166）序列，设计生成参考寡核苷酸（50 - 170bp）的引物，参见表2。

依次如在ii）计算下所述，使用每个标准曲线独立地定量6种目的基因（AT1a、血管紧张素、TGFβ、TNFa、NONO和CTGF）。通过ANOVA比较通过3个曲线对于每种基因获得的结果。

表2：用于PCR和标准曲线构建的引物序列

结果显示于图7A-F和图8A-F中。在这些实验中，目的基因的定量仅受具有50bp的长度和40％的GC含量的参考寡核苷酸影响（导致目的基因的复制数的显著更高的值）。较大长度和较高GC含量的参考寡核苷酸（都不具有关于任一参数上限的明显限制）都提供目的基因的精确定量。根据这些实验，可以得出结论在本发明的方法中有用的参考寡核苷酸的长度下限是60bp和45％的GC含量。这些值可以代表这些值的有用范围的下限。上限可以取决于需求进行设置。如果将使用单一通用参考寡核苷酸，那么为了方便起见，长度可以设为100bp，并且GC含量设为50％。根据本文提供的数据，还可以选择用于参考寡核苷酸的任何可替代的合适长度和GC含量。

实施例6

这些参考寡核苷酸各自用于依次定量9种目的基因（血管紧张素原、TNFα、TGFβ、CTGF、NONO MMP2、MMP9和TIMP1），其基因产物从80到120个碱基对不等（关于扩增子序列参见表3）。

表3：关于目的基因的扩增子序列。

目的基因	扩增子	大小（bp）
			血管紧张素原（AGT）	TCTTCCCTCGCTCTCTGGACTTATCCACTGACCCAGTTCTTGCTGCCCAGAAAATCAACAGGTTTGTGCAGGCTGTGACAGG	82
TNF-α	TGTCTGAGACCAACTCAACCCAGAAAAACAAAATGGCCCTTAACTCTTCTGCTGAAGATGGTATCAAAAGAATCCAAGATGACTGCCCCA	82
			TGF-β1	CTACTGCTTCAGCTCCACAGAGAAGAACTGCTGTGTACGGCAGCTGTACATTGACTTTAGGAAGGACCTGGGTTGGAAGT	80
CTGF	CTGTTGGCGAACAAATGGCCTTTATTAAGAAATGGCTTGCTCAGGGTAACTGGTCAGATTTCCACGAGGAAGTGTTTGCTGCTTCTTTGACTATGACT	98
			NFκB	TCTGATGAACATACACCAGTAGAGGATGAAGAACCAAAGAAAAGCACTACTTCAGCATCTAGTTCGGAAGATGATAAGAAGAAGAAAAGGAAATCTAGTCGTTCAAAAGAAAGAGCCAAG	120
AT1a	TGTCTGAGACCAACTCAACCCAGAAAAACAAAATGGCCCTTAACTCTTCTGCTGAAGATGGTATCAAAAGAATCCAAGATGACTGCCCCA	90
			NONO	AAGCAGGCGAAGTTTTCATTCATAAGGATAAAGGCTTTATTCGCTTGGAAACACGAACCCTAGCGGAAATTGCCAAAGTGGAGCTGGAC	95
MMP2	CTGGCACTTTTACTACTTTAGCTGTTTGCTTTGTTTGCCCTTTGCTGTTTGGTTCAACCTTTTCAGTTTTCCACCACACTGCATTTTTCTCACCG	95
			MMP9	CCCCCAACCTTTACCAGCTACTCGAACCAATCAGCTTGTCTGTAGTTGTATACACATCCAAGCCTGTGGTTGGTCAGAAGACAACTTTGTAGG	93
TIMP1	GGGTGTGCACAGTGTTTCCCTGTTCAGCCATCCCTTGCAAACTGGAGAGTGACAGTCATTGCTTGTGGACAGATCAGATCCTCATGGGCT	90

使用上述方法，在4个实验组中在SHR大鼠（n=6）的心脏中测量9种目的基因 – 零时间对照（空心条）、媒介物对照（阴影条）和在用VIP处理（实心条）和依那普利处理（交叉阴影条）后。

结果显示于图9A-C。这些结果证实参考寡核苷酸法精确定量核酸产物的量且从而精确地阐明通过用化合物例如VIP和依那普利处理高血压大鼠所致的基因表达变化的能力。该方法提供描绘在处理和对照动物之间统计上显著差异的灵敏度，以及就通过不同处理的基因表达调节而言不同处理的效率。虽然特定动物研究用作该方法在特定实验情况下如何进行的方便实施例，但相同定量原则和方法可应用于任何此类情况，其中需要不受持家基因中的任何不希望改变等影响的核酸产物的精确定量。

使用染料SYBR绿I、SYBR绿II、 CYBR金、Evagreen、噁唑黄、噻唑橙、picogreen、TOTO和BEBO和上述方案进行的相似实验获得相似结果。

应当理解举例说明的方法提供定量基因表达产物的改良方法，而无需针对持家基因或合成基因的标准化，或无需共扩增持家/合成参考基因与靶序列。

虽然本发明已参考具体实施例描述，但本领域普通技术人员应当理解本发明可以以许多其他形式体现。

Claims

1.一种用于定量核酸的方法，其包括：

a）用可检测标记物来标记具有60bp至170bp的长度和45%至75%的GC含量的参考寡核苷酸；

d）实时比较与标记的扩增的靶核酸结合的可检测标记物的强度与标准曲线，并且测定扩增的靶核酸的数量，其中在步骤c）中所述参考寡核苷酸不被扩增或不与靶核酸共扩增，并且其中相同的标记的参考寡核苷酸用于定量不同的靶核酸。

2.根据权利要求1的方法，其中所述可检测标记物是染料。

3.根据权利要求2的方法，其中所述染料与双链DNA(dsDNA)结合。

4.根据权利要求3的方法，其中所述染料是嵌入染料。

5.根据权利要求2-4中任一项的方法，其中所述染料是荧光染料。

6.根据权利要求5的方法，其中所述荧光染料选自SYBR绿I、SYBR绿II、 SYBR金、Evagreen、噁唑黄、噻唑橙、picogreen、TOTO、BEBO或Deep Purple中的任何一种。

7.根据权利要求1的方法，其中所述参考寡核苷酸具有100bp的长度和50％的GC含量。

8.根据权利要求1的方法，其中所述参考寡核苷酸长于或短于所述靶核酸。

9.根据权利要求1的方法，其中所述靶核酸的扩增通过聚合酶链反应（PCR）法执行。

10.根据权利要求1的方法，其中单一标准曲线用于多种靶核酸扩增和定量。

11.根据权利要求10的方法，其中所述多种靶核酸扩增和定量各自在不同时间执行。

12.根据权利要求1的方法，其中所述靶核酸经过15个循环的扩增。

13.根据权利要求1的方法，其中所述相同的标记的参考寡核苷酸用于多种不同的靶核酸的同时定量。