JP5870030B2 - 改良型核酸定量法 - Google Patents
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Description
本発明は核酸を定量する方法に関し、特に、データをハウスキーピング遺伝子または注目している合成遺伝子に対して規格化する必要がない、遺伝子発現研究に用いる核酸を定量する改良された普遍的な方法に関する。この方法は、診断用途、法医学的用途、および、研究用途に適用可能であるが、本発明は、これらの特定の分野の用途に限定されるものではないことは理解されよう。
本明細書全体を通じて、先行技術に関するいかなる議論も、当該先行技術が広く公知であると見なすべきではなく、当該分野の通常の一般的な知識の一部を構成すると容認するものであると見なすべきでもない。
本発明は、一般的な広い意味では、核酸の発現データを規格化するためにハウスキーピング遺伝子または合成参照遺伝子を使用する必要がない、核酸を定量する方法に関する。換言すれば、本発明の方法は、普遍的な参照オリゴヌクレオチド(または、1つ以上のこのようなオリゴヌクレオチド)を適切な色素と組み合わせて使用する方法であって、この方法を用いて検量線が作成可能であり、さらに、この検量線からは、試料中の増幅済みの標的核酸の絶対レベルが算出可能である。したがって、本発明の方法は、注目している互いに異なる核酸を、同じ参照オリゴヌクレオチドを用いて、個別に、または、このような注目している核酸の混合物中において定量することができる。
a)所定の長さを有する参照オリゴヌクレオチドを、検出可能なマーカーで標識する工程、
b)該標識された参照オリゴヌクレオチドの連続希釈物(serial dilutions)を用いて、該検出可能なマーカーの強度を標識された参照オリゴヌクレオチドの濃度に対してプロットすることによって検量線を作成する工程、
c)増幅される標的核酸を標識する検出可能なマーカーの存在下で、標的核酸を増幅する工程、
d)該標識が付された増幅された標的核酸に付随する該検出可能なマーカーの強度と該検量線とを比較して、該増幅された標的核酸の量を求める工程であって、該検量線は、増幅されず、該標的核酸との共増幅もされない工程。
a)所定の長さを有する参照オリゴヌクレオチドを、検出可能なマーカーで標識する工程、
b)該標識された参照オリゴヌクレオチドの連続希釈物を用いて、該検出可能なマーカーの強度を標識された参照オリゴヌクレオチドの濃度に対してプロットすることによって検量線を作成する工程、
c)標的核酸を増幅する工程、
d)該増幅された標的核酸を、検出可能なマーカーで標識する工程、
e)該標識が付された増幅された標的核酸に付随する該検出可能なマーカーの強度と該検量線とを比較して、該増幅された標的核酸の量を求める工程であって、該検量線は、増幅されず、該標的核酸との共増幅もされない工程。
図1は、15サイクルにわたる、複数の濃度における、標準とする参照オリゴヌクレオチドの蛍光を示している。各水平線が1つの濃度を表わしている。反応混合物において酵素が欠如していることによって、蛍光が多数のサイクルにわたって変化しないことが保証される。さらに、グラフは、変性およびアニーリングのサイクルを繰り返すことによって、参照オリゴヌクレオチド色素複合体の安定性および再現性が得られることを示唆している。
本明細書中で使用される場合、「遺伝子」または「標的核酸」または「標的遺伝子」または「注目している遺伝子」または「注目している標的配列」または「注目している標的」または「注目している核酸」という用語/表現は、互換的に使用し、同一概念を指すものである。
本発明は、動物/ヒトのコントロール群および処理群において核酸の発現を定量するための高精度かつ効率的な手段が存在しないことが開発の動機となっている。本発明は、さらに、遺伝子発現研究に使用される既知のハウスキーピング遺伝子は、大部分が実験条件または処理に応じて変動し、したがって、結果に狂いが生じることも動機となって開発された。
〔実施例1〕
<計算>
rt−PCRでは、複製効率が100%であり、各サイクルにおいて遺伝子の全ての複製物が複製されると仮定すれば、所定のサイクル数(c)の後に存在する注目している遺伝子の量(R)は、PCR増幅の開始時に存在する該遺伝子の量(n)に再現可能な形式で関連している。
R=n×2c
n=時刻0において存在する複製物の個数
c=所定の蛍光でのサイクル数 R=cサイクル後に存在する複製物の個数
効率が100%未満であり、各サイクルにおいて遺伝子の全ての複製物が複製されるわけではないと仮定すれば、この複製効率の減少を考慮して、上式を次のように修正する。
R=n×ec
e=複製効率
c=所定の蛍光でのサイクル数
R=cサイクル後に存在する複製物の個数。
<参照オリゴヌクレオチドの調製>
引用した実施例では、参照オリゴヌクレオチドを生成するために、結合組織増殖因子(CTGF)に対応するRNAを使用しているが、標準規格として使用するための参照オリゴヌクレオチドが、任意の遺伝子またはコードDNAもしくは非コードDNAに対応するRNAから生成可能であることは理解されるべきである。
SHRラットから組織を収集し、フェノールおよびグアニジンイソチオシアネートを利用する方法(Chomczynski and Sacchi 1987)に修正を加えた方法を用いて全RNAを抽出した。液体窒素で凍結させたSHRの心臓を、Mixer Mill MM300(Retsch GmbH社、ドイツ)で均質化した。1.5mLのSafe−Lock型マイクロ試験チューブ(Eppendorf Biopur社、ハンブルグ、ドイツ)に仕込んだ1mLのトリゾール試薬(Invitrogen社)に、Tungsten Carbide Beads 3mm(Qiagen社)とともに、各100mgずつの低温貯蔵試料を添加し、30Hzの振動数で粉砕した。続いて、製造者(Invitrogen社)の推奨にしたがってRNAを抽出した。RNAを得るために試料を破砕(disrupt)した後、200mLのクロロホルム(Lab−Scan Analytical Sciences、Lomb Scientific社、Taren Point、NSW、オーストラリア)を添加して相分離を進めた。試料を15秒間手で激しく振り、室温(23℃〜30℃)で5分間インキュベーションし、その後、Sigma 1−15PK centrifuge (John Morris Scientific社、Chatswood、NSW、オーストラリア)を用いて、12,000rpm(13,201g)、4℃で、20分間(ブレーキはオフ)遠心分離を実施した。上部の水相を300mL収集して新しい1.5mLのエッペンドルフチューブに入れ、事前に冷却しておいた500mLのプロパン−2−オール(イソプロパノール)(Lab−Scan Analytical Sciences、Lomb Scientific社、Taren Point、NSW、オーストラリア)を添加し、試料を手で数回転倒混和した。この混合物を室温で10分間インキュベーションして、RNAを沈殿させた。12,000rpm、4℃で20分間遠心分離(John Morris Scientific社、Chatswood、NSW、オーストラリア)することによって、ペレットを形成した。上清を捨て、そして、ジエチルピロカーボネート(DEPC)で(Sigma−Aldrich社、Castle Hill、NSW、オーストラリア)で希釈した75%(v/v)の絶対分子グレード(absolute molecular grade)のエタノール(Lab−Scan Analytical Sciences、Lomb Scientific社、Taren Point、NSW、オーストラリア)を1mL用いて、ペレットを洗浄し、10,000rpm、4℃で10分間遠心分離にかけた(John Morris Scientific社、Chatswood、NSW、オーストラリア)。ペレットを収集して、ドラフト中で数分間空気乾燥させ、次に、DEPCで処理したMilli−Q水に溶解させ、−80℃で保存した。全RNA濃度を、Nanodrop 1000(Nd−1000、Thermo Scientific社)を260nm(A260)で用いて、分光光度計による吸光度によって決定した。A260:A280の比が約2.0であれば、RNAの純度は十分であるとみなした。
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)に先立って、RNAの試料をDNase−1(Invitrogen社)を用いて処理し、二重鎖DNAおよび一本鎖DNAを取り除いた。DNaseもRNaseも含まない0.5mLのエッペンドルフチューブにおいて、1ユニット/μLのDNase−1および1μLの10X DNase−1の反応バッファを用いて、DEPCで処理した水で10μLの総容積にした中で最大で1μgまでのRNAを消化させた。試料を室温で15分間インキュベーションし、その後、溶液混合物中での25mMのEDTA(1μL)によるカルシウムイオンおよびマグネシウムイオンのキレート化、ならびに65℃での10分間の加熱によってDNase−1を不活性化した。試料を氷の上に載せて冷却し、−80℃で保存した。混合物の全ての成分はDNase−1キット(Invitrogen社)において供給された。
DNase−1で処理したRNAの試料を、マイクロチップ自動電気泳動器MCE−202 MultiNA(Shimadzu Biotech社、Rydalmere、NSW、オーストラリア)で、リボソームRNA(rRNA)の18Sサブユニットおよび28Sサブユニットの純度、サイズ、および、濃度について分析した。なお、全てのステップを製造者の推奨にしたがいながら、わずかな修正を加えて実施した。簡潔に記すと、各試料(3μL)を、96ウェルを有するプレートにおいて等しい体積の内部RNAマーカー(internal RNA marker)(Shimadzu Biotech社、Rydalmere、NSW、オーストラリア)と混合し、粘着性PCRアルミニウム箔(Thermo Scientific社、Integrated Sciences、NSW、オーストラリア)で封止した。上記RNAを濃度およびサイズが既知の内部標準マーカー(より低分子のサイズマーカーおよびより高分子のサイズマーカー(lower and upper molecular size markers))とともに用いることで、電気泳動の結果を自動的に補正し、RNAの試料について自動的にサイズの予測および定量を行う。RNA−6000ラダー(Applied Biosystems社、Victoria、オーストラリア)を、DEPCで処理した水で1:5の比(v/v)に希釈し、次に、この混合溶液をRNAマーカー溶液と1:1(v/v)で混合した。試料およびラダーの混合物をどちらも65℃で5分間熱変性させ、すぐに氷の上に載せて5分間冷却した。このサイズ範囲の分離は、MultiNAのマイクロチップ(Shimadzu Biotech社、Rydalmere、NSW、オーストラリア)において、TE(10mMのTris−HCl、1mMのEDTA二ナトリウム、pH値8.0)(Sigma−Aldrich社)および20%(v/v)のホルムアミド(Invitrogen社)で1:99に希釈した蛍光性挿入色素10,000X SYBRグリーンII(Invitrogen社)を含有するRNA Separating Buffer(Shimadzu Biotech社、Rydalmere、NSW、オーストラリア)中で実施した。
SuperScript III First−Strand Synthesis SuperMixキット(Invitrogen社)のMoloney−Murine Leukaemia Virus Reverse Transcriptase(M−MLV RT)を製造業者の指示にしたがって用いて、第1鎖相補DNA(cDNA)を一本鎖RNA鋳型から合成した。全ての反応を0.2mLの薄壁型エッペンドルフチューブの中で実施した。また、全てのインキュベーションステップをRotor−Gene6000(Corbett Research社、Sydney、オーストラリア; Qiagen社)を用いて実施した。最大で5μgまでの全RNAを、1μLの50μMのオリゴ(dT)20および1μLのアニーリングバッファを用いて、総容積が8μLのDEPCで処理した水中で65℃で5分間熱変性させた。試料を氷の上に載せて少なくとも1分間冷却し、その後、10μLの2X First−Strand Reaction Mixおよび2μLのSuperScript III/RNaseOUT Enzyme Mixに添加した。試料を短時間ボルテックスして混合し、そして、パルス回転によって収集し、次に、50℃で50分間インキュベーションして、cDNAを合成した。RT酵素を85℃で5分間変性させて反応を終了させ、試料をすぐに氷の上に載せて冷却し、−20℃で保存した。DNAの混入がないことを検証するために、RT酵素もRNAも用いないネガティブコントロール用試料を一緒に用いた。
長さが70bp、90bp、および、170bpのPCR生成物を生成するプライマー対を、結合組織増殖因子(CTGF)に対応するラットのmRNA(受託番号AB023068)についてNCBI GenBankによって報告されている配列に基づいて設計した。このプライマー配列(プライマーの配列自身が21〜24個の塩基の長さである)を委託して(Invitrogen社)脱塩凍結乾燥生成物として合成した。TE(10mMのTris−HCl、pH値8.0、1mMのEDTA)(Invitrogen社)を用いて、上記プライマーの濃度を50μMにし、−20℃で保存した。
各プライマーのセットを固定量のエバグリーンに結合するdsDNAの異なる濃度を決定できるように設定して、SHRの心臓に対してPCRを実施した。このPCRにおいて使用する全ての試薬は、Invitrogen社からキットの一部として、または、個別に購入した。10X PCRバッファ(5μL)、10mMのdNTP混合物(1μL)、50mMのMgCl2(1.5μL)、10μMのプライマー対混合物(各2μL)、Platinum Taq DNAポリメラーゼ(0.2μL)、および、DEPCで処理した水(39.3μL)を含有する全体で50μLの反応混合物において、1μLのcDNAを増幅した。PCRは、Rotor−Gene6000(Corbett Research社、Sydney、オーストラリア; Qiagen社)を用いて実施した。増幅条件は、最初に94℃で2分間変性、95℃で10秒間の変性を30サイクル〜35サイクル、60℃で20秒間のアニーリング、および、72℃で20秒間の合成である。cDNAを用いないネガティブコントロールを、全ての実験時に一緒に用いた。
最大で4μLまでのプールしておいたPCR生成物を、DNAを濃縮するためのセルロース膜である、30K Amicon Ultra−4フィルタユニット(Millipore社、North Ryde、NSW、オーストラリア)、に追加し、スウィンギングバケットローター、Sigma 2−16PK(John Morris Scientific社、Chatswood、NSW、オーストラリア)を用いて、5000rpm(4025g)、22℃で10分間遠心分離にかけた。濃縮溶質をフィルタユニットの底部において収集し、次のPCRに備えて−20℃で保存した。
濃縮PCR生成物を、マイクロチップ自動電気泳動器MCE−202 MultiNA(Shimadzu Biotech社、Rydalmere、NSW、オーストラリア)で分析し、バンドサイズおよび濃度の確認を行った。全てのステップを製造者の指示にしたがいながら、わずかな修正を加えて実施した。簡潔に記すと、濃縮PCR生成物を、DEPCで処理した水で希釈した1/10(v/v)希釈物(6μL)を、96ウェルを有するプレートの各ウェルに加え、粘着性PCRアルミニウム箔(Thermo Scientific社、Integrated Sciences、NSW、オーストラリア)で封止した。10,000X SYBRゴールド(Invitrogen社)からなるDNA−500 Separation Buffer(Shimadzu Biotech社、Rydalmere、NSW、オーストラリア)を、TE(10mMのTris−HCl、1mMのEDTA二ナトリウム、pH値8.0)(Sigma−Aldrich社)で1/100に希釈して使用し、マイクロチップ(Shimadzu Biotech社、Rydalmere、NSW、オーストラリア)でDNA試料を分離した。DNAのバンドサイズおよび濃度を、それぞれ、25bpのDNAラダー(Invitrogen社)をTE(10mMのTris−HCl、1mMのEDTA二ナトリウム、pH値8.0)(Sigma−Aldrich社)で1:49に希釈したもの、および、内部マーカーDNA−500(Shimadzu Biotech社、Rydalmere、NSW、オーストラリア)を用いて分析した。 参照文献 Chomczynski, P., and Sacchi, N. (1987) Anal. Biochem. 162, 156。
i)検量線の作成
反応容積が50μLのTE(10mMのTris−HCl、pH値8.0、1mMのEDTA)(Invitrogen社)を収納する0.2mLのPCR用チューブ中の、1:1(v/v)のTE(10mMのTris−HCl、pH値8.0、1mMのEDTA)(Invitrogen社)(希釈していない状態から1/32まで)、および、1.25μMのエバグリーン色素(Biotium Inc,社、Hayward、CA; Jomar Biosciences社、SA、Australia)において、7μLの濃縮DNA試料(つまり、70bp、90bp、または、170bp生成物)を、連続的に繰り返し希釈した。滴定は、Rotor−Gene6000(Corbett Research社、Sydney、オーストラリア; Qiagen社)で実施した。サイクリング条件は、最初に94℃で2分間変性、95℃で30秒間の変性を15サイクル、さらに、60℃で30秒間の各アニーリングステップ間に、蛍光性シグナルを取得した。鋳型を用いないコントロール、および、エバグリーン色素を用いないもっとも高い濃度のオリゴヌクレオチドの2つのネガティブコントロールを、各検量線を作成する実験時に一緒に用いた。DNAの混合物は、次の蛍光繰り返し測定に備えて−20℃で保存した。
検量線式から、3つの蛍光レベルf1、f2、f3をpmolに換算したものを算出する(つまり、3つの閾値を選択した。図3を参照)。
・注目している遺伝子の効率(e)を得、
・3つの各蛍光レベル(f1、f2、f3)のサイクル(c1、c2、c3)を得、さらに、
・検量線式を用いて、f1、f2、f3に対応する、試料[DNA(pmol)i]中に存在する注目している遺伝子の発現量をpmolで求める。
n(反応の開始時に存在する注目している遺伝子の発現量(単位はpmol))を次式から算出する。
niの平均値を計算して、試料中に存在する注目している遺伝子のモル数を求める。各反応中に存在する全RNAについて補正し、niを全RNA100ng当たりのpmol数で表わす。アボガドロ数を掛ければ、RNA100ng当たりの複製物の個数として別の形で表わすことができる(図4を参照)。
以上によって、図1は、繰り返し実施した参照オリゴヌクレオチドの各濃度に対する蛍光を示している。存在する参照オリゴヌクレオチド(pmol)(x軸)に対する蛍光(y軸)としてプロットした図2のデータによって、この関係を規定する等式の値を最小二乗回帰で計算できるようになる。f1、f2、f3(f1、f2、f3はサイクル数に対する注目している各遺伝子の蛍光のプロットから求められる。図3を参照)を上記検量線式に代入すると、サイクルc1、c2、c3において存在する注目している遺伝子(DNAi)のpmol数が算出できる。次に、時刻ゼロにおいて存在する注目している遺伝子のpmolを上述のように算出することができ、全RNAについて補正し、アボガドロ数を掛けた後に複製物の個数として表わされる。
長さが20塩基対および100塩基対異なる3つのオリゴヌクレオチドを使用し、上記i)検量線の作成法に記載したようにして3つの検量線を作成した。次に、ii)計算に記載したように各検量線を順に用いて、注目している5つの遺伝子を独立して定量した。3つの曲線によって各遺伝子について得られた結果をANOVAによって比較した。有意差を0.05レベルに設定した(図4を参照)。注目している遺伝子の発現量は、この3群間で有意な差がなかった。したがって、最大で100塩基対までの参照オリゴヌクレオチドの長さの違いは、注目している遺伝子の計算に影響しなかったと言える。
上述の方法を用いて、ゼロ時間コントロール(白抜きバー)、媒体コントロール(ハッチング入りバー)、および、VIP処理後(黒塗りバー)の3つの実験群のWKYラットの心臓において、注目している5つの遺伝子を測定した。
3週間かけて繰り返し凍結・解凍した後に、さまざまな濃度の参照オリゴヌクレオチドおよびエバグリーン色素を収納するチューブについて蛍光を測定した。蛍光レベルは、全ての濃度について安定していた。したがって、同じバッチの色素を使用し、各実験間で色素濃度にばらつきがない限り、多数のrt−PCR実験について、1つの基準を定量基準として使用してかまわないと言える(図6を参照)。
長さが50塩基対〜170塩基対の範囲であり、GC含有率が40%〜75%の範囲である参照オリゴヌクレオチドを、CTGF、αアクチン、および、βアクチンのさまざまな部分から得た。参照オリゴヌクレオチドを実施例2に記載のように調製し、検量線を実施例3記載のように作成した。参照オリゴヌクレオチド(50bp〜170bp)を生成するプライマーを、CTGFに対応するラットmRNA(受託番号AB023068)ならびにαアクチンおよびβアクチンに対応するラットmRNA(受託番号NM_019183およびBC063166)についてNCBI GenBankによって報告されている配列に基づいて設計した(表2を参照)。
これらの各参照オリゴヌクレオチドを順に使用して、遺伝子産物が80塩基対〜120塩基対の範囲である、注目している9つの遺伝子(アンジオテンシノーゲン、TNFα、TGFβ、CTGF、NONO MMP2、MMP9、および、TIMP1)を定量した(増幅産物の配列については表3を参照)。
Claims (20)
- 核酸を定量する方法であって、以下のa)〜d)を含んでいる方法:
a)所定の長さを有する参照オリゴヌクレオチドを、検出可能なマーカーで標識する工程、
b)該標識された参照オリゴヌクレオチドの連続希釈物を用いて、該検出可能なマーカーの強度を標識された参照オリゴヌクレオチドの濃度に対してプロットすることによって検量線を作成する工程、
c)増幅される標的核酸を標識する該検出可能なマーカーの存在下で、標的核酸を増幅する工程、
d)該標識が付された増幅された標的核酸に付随する該検出可能なマーカーの強度と該検量線とを比較して、該増幅された標的核酸の量を求める工程であって、該標識された参照オリゴヌクレオチドは、増幅されず、該標的核酸との共増幅もされない工程であって、同じ該標識された参照オリゴヌクレオチドを用いて異なる標的核酸を定量する工程。 - 上記検出可能なマーカーが色素である、請求項1に記載の方法。
- 上記色素が二重鎖DNA(dsDNA)に結合する、請求項2に記載の方法。
- 上記色素が、インターカレート色素である、請求項3に記載の方法。
- 上記色素が、蛍光色素である、請求項2〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 上記使用される色素は、SYBRグリーンI、SYBRグリーンII、CYBRゴールド、エバグリーン、オキサゾールイエロー、チアゾールオレンジ、ピコグリーン、TOTO、BEBO、または、Deep Purpleのうちのいずれか1つから選択されるものである、請求項5に記載の方法。
- 上記参照オリゴヌクレオチドの長さが、60bp以上である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 上記参照オリゴヌクレオチドのGC含有率が、45%以上である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 上記参照オリゴヌクレオチドの長さが、60bp〜170bpである、請求項7に記載の方法。
- 上記参照オリゴヌクレオチドのGC含有率が、45%〜75%である、請求項8または9に記載の方法。
- 上記参照オリゴヌクレオチドの長さが100bpであり、GC含有率が50%である、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 上記参照オリゴヌクレオチドが、上記標的核酸よりも長い、または、短い、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 上記標的核酸の増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応法(PCR)によって実施される、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 単一の検量線を使用して、複数回の標的核酸の増幅および定量が実施される、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 上記複数回の標的核酸の増幅および定量が、それぞれ異なるタイミングで実施される、請求項14に記載の方法。
- 上記標的核酸が、15サイクルよりも多いサイクルにて増幅される、請求項13〜15のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法に使用するためのキットであって、
蛍光色素と参照オリゴヌクレオチドとを有している、キット。 - 請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法に使用するためのキットであって、
検出可能なマーカーで標識された参照オリゴヌクレオチドを有している、キット。 - 請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法に使用するためのキットであって、
検出可能なマーカーで標識された参照オリゴヌクレオチドの連続希釈物を有している、キット。 - 参照オリゴヌクレオチドは、長さが60bp〜170bpであり、GC含有率が45〜75%である、請求項17〜19のいずれか一項に記載のキット。
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