BR112012004788B1

BR112012004788B1 - método para quantificação de ácidos nucléicos e kit utilizado pelo método

Info

Publication number: BR112012004788B1
Application number: BR112012004788-4A
Authority: BR
Inventors: Hong Ha; George Hodge; Karen Annette Duggan
Original assignee: Accugen Pty Ltd
Priority date: 2009-09-02
Filing date: 2010-09-02
Publication date: 2021-02-09
Also published as: CN102725421B; KR20170051544A; IL218423A; DK2473632T3; ZA201202210B; RU2012111733A; CA2772770C; JP5870030B2; RU2562161C2; SG178960A1; MX2012002734A; EP2473632A4; WO2011026182A1; EP2473632A1; US20120231465A1; AU2010291867A1; IL218423A0; KR20120100902A; MY159569A; US9238831B2

Abstract

MÉTODO PARA QUANTIFICAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLÉICOS E KIT PARA USO EM UM MÉTODO A presente invenção se refere a métodos de quantificação de ácidos nucléicos e, em particular, a um método universal melhorado de quantificação de ácidos nucléicos para estudos de expressão de gene sem a necessidade de normalizar dados a um gene de controle ou a um gene sintético de interesse.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001]A presente invenção se refere a métodos de quantificação de ácidos nucléicos e, em particular, a um método universal melhorado de quantificação de ácidos nucléicos para estudos de expressão de gene sem a necessidade de normalizar dados a um gene de manutenção ou a um gene sintético de interesse. Esse método é aplicável ao uso diagnóstico, forense e de pesquisa; entretanto, será apreciado que a invenção não se limita a esses campos particulares de uso.

HISTÓRICO DA INVENÇÃO

[002]Qualquer discussão da técnica anterior em toda a especificação não deve ser de forma alguma considerada uma admissão de que essa técnica anterior é amplamente conhecida ou forma parte do conhecimento geral comum no campo.

[003]As tecnologias de PCR para quantificação de expressão de gene melhoraram por meio do desenvolvimento de termocicladores rápidos e a introdução de monitoramento fluorescente de produtos amplificados após cada ciclo (PCR em tempo real). A quantificação da expressão do gene ocorre por meio do uso de corantes, particularmente, corantes fluorescentes, e da detecção da fluorescência crescente durante a fase exponencial da amplificação de PCR proporcional à quantidade de ácidos nucléicos na amostra no começo da reação. A quantificação tem base no ciclo de início, isto é, o primeiro ciclo com fluorescência detectável, e pode ser realizada de maneira absoluta com padrões externos (geralmente, um gene sintético) ou de maneira relativa com um gene de referência de normalização comparativo que serve como um calibrador interno (isto é, gene de manutenção). Os genes de controle ou genes de manutenção são utilizados para normalizar os níveis de mRNA entre diferentes amostras.

[004]É crucial que o gene de referência selecionado não oscile, uma vez que mesmo variações marginais na expressão do gene alterarão o perfil de quantificação relativo do gene alvo. Erros de pipetagem e diluição também alteram o nível da amplificação e, portanto, alteram o perfil de quantificação.

[005]Genes, como gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH), porfobilinogênio desaminase (PBGD), beta2- microglobina ou beta-actina, são geralmente utilizados como calibradores internos em PCR em tempo real. Entretanto, os genes mencionados acima mostraram se movimentarem em resposta a condições ou tratamentos experimentais. Genes que são expressos de maneira abundante, como 18S, também não são genes de referência ideais, uma vez que as condições de PCR precisam ser restritas de modo a não encharcar a reação.

[006]Assim, genes de manutenção adequados devem ser expressos adequadamente no tecido de interesse e, de modo mais importante, apresentar variabilidade mínima na expressão entre as amostras e sob as condições ou tratamentos experimentais utilizados.

[007]Muitos desses genes de controle; entretanto, podem apresentar variabilidade inaceitável na expressão. Foi apresentado que o nível de expressão desses genes pode variar entre tecidos ou células e podem mudar sob determinadas circunstâncias, isto é, diferentes tratamentos. Assim, é crucial validar os genes de manutenção em qualquer sistema experimental novo. Isso, geralmente, leva tempo e é uma tarefa difícil encontrar um gene de controle ou gene de referência que seja adequado para uso em um sistema experimental específico. Em algumas situações isso pode não ser possível.

[008]O uso de padrões externos (isto é, uma sequência sintética) nos estudos de expressão do gene, geralmente, requer que o gene de interesse seja clonado para prover o gene de referência sintético. Nesse método, quantidades conhecidas da sequência de gene de referência sintética são diluídas em série, então, sujeitas à amplificação para produzirem uma curva padrão. A produção da sequência clonada para esse método geralmente leva tempo, é uma tarefa de trabalho intenso e os erros de diluição são exponencialmente amplificados, o que pode levar à avaliação imprecisa dos níveis de ácido nucléico. A estabilidade e preservação das sequências clonadas altamente diluídas também podem causar dificuldades.

[009]Assim, permanece uma necessidade de um método de quantificação de ácidos nucléicos universal rápido e eficiente, que seja aplicável a qualquer situação experimental ou condição de tratamento, que não precise do uso de um gene de manutenção ou de um gene sintético de interesse para normalizar dados.

[010]É um objetivo da presente invenção superar ou melhorar pelo menos uma das desvantagens da técnica anterior ou prover uma alternativa útil.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[011]Em um aspecto amplo, a presente invenção se refere a um método para quantificação de ácidos nucléicos que não requer o uso de um gene de manutenção ou gene sintético de referência para normalizar os dados de expressão do ácido nucléico. Preferivelmente, o método da presente invenção utiliza um oligonucleotídeo de referência universal (ou pode usar um ou mais desses oligonucleotídeos) em combinação com um corante adequado, que pode ser utilizado para gerar uma curva padrão a partir da qual o nível absoluto de um ácido nucléico alvo amplificado em uma amostra pode ser calculado. Assim, o método da presente invenção pode fazer uso do mesmo oligonucleotídeo de referência para quantificar diferentes ácidos nucléicos de interesse, seja individualmente ou em uma mistura desses ácidos nucléicos de interesse.

[012]A presente invenção também se refere a kits para uso no método da invenção. Em um primeiro aspecto, é provido um método para quantificação de um ácido nucléico alvo compreendendo: a) marcação de um oligonucleotídeo de referência que tem um comprimento predeterminado com um marcador detectável; b) geração de uma curva padrão utilizando diluições em série do oligonucleotídeo de referência marcado ao delinear a intensidade do marcador detectável em relação à concentração do oligonucleotídeo de referência marcado; c) amplificação de um ácido nucléico alvo na presença do marcador detectável que marca o ácido nucléico alvo amplificado, d) comparação da intensidade do marcador detectável associado ao ácido nucléico alvo amplificado marcado com a curva padrão e a determinação da quantidade do ácido nucléico amplificado, em que a dita curva padrão não é amplificada ou co-amplificada com o ácido nucléico alvo.

[013]Em um segundo aspecto, é provido um método para quantificação de um ácido nucléico alvo compreendendo: a) marcação de um oligonucleotídeo de referência que tem um comprimento predeterminado com um marcador detectável; b) geração de uma curva padrão utilizando diluições em série do oligonucleotídeo de referência marcado ao delinear a intensidade do marcador detectável em relação à concentração do oligonucleotídeo de referência marcado; c) amplificação de um ácido nucléico alvo; d) marcação do ácido nucléico alvo amplificado com o marcador detectável; e) comparação da intensidade do marcador detectável associado ao ácido nucléico alvo amplificado marcado, com a curva padrão e determinação da quantidade do ácido nucléico alvo amplificado, em que a dita curva padrão não é amplificada ou co-amplificada com o ácido nucléico alvo.

[014]A sequência de oligonucleotídeo de referência não precisa ter qualquer homologia com o ácido nucléico alvo ou com qualquer sequência de gene de manutenção. Entretanto, devido à maneira particular na qual o oligonucleotídeo de referência é utilizado no método da presente invenção (isto é, para preparar uma curva padrão após a diluição em série do oligonucleotídeo de referência), a sequência do oligonucleotídeo de referência pode ter um grau de homologia ou mesmo identidade com uma sequência de ácido nucléico alvo ou um gene de manutenção, a partes menores disso. Uma vantagem da presente invenção é que o método pode fazer uso do mesmo oligonucleotídeo de referência único para quantificar diferentes ácidos nucléicos alvos. Na prática, o oligonucleotídeo de referência pode ser universal, com um comprimento fixo particular e conteúdo de GC, tipicamente, um oligonucleotídeo de 100 bp e 50% de conteúdo de GC.

[015]Preferencialmente, a amplificação do ácido nucléico alvo é realizada por método de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). Tipicamente, o ácido nucléico alvo é amplificado em 15 ciclos, mas isso não é crucial ao método da presente invenção. A amplificação simultânea de múltiplos ácidos nucléicos alvos de interesse em uma reação também podem ser realizada (isto é, PCR multiplex).

[016]O oligonucleotídeo de referência pode ser do mesmo comprimento ou de comprimento semelhante ao da sequência de ácido nucléico alvo, mas não precisa ser assim. O oligonucleotídeo de referência pode ser mais longo ou mais curto que o ácido nucléico alvo. Preferencialmente, uma única curva padrão é preparada com um único oligonucleotídeo de referência e utilizada para múltiplas amplificações e quantificações de ácido nucléico alvo. As múltiplas amplificações e quantificações de ácido nucléico alvo podem ser, cada uma, realizadas em diferentes momentos, se desejado.

[017]Preferencialmente, o marcador detectável é um corante que se liga ao dsDNA e pode ser um corante de intercalação. Preferencialmente, o corante é um corante fluorescente. O corante utilizado pode ser selecionado de qualquer um dentre SYBR green I, SYBR green II, CYBR gold, Evagreen, oxazole yellow, thiazole orange, picogreen, TOTO ou BEBO, Deep Purple™; entretanto, a escolha do corante não é crucial, uma vez que outros corantes adequados também podem ser utilizados e seriam conhecidos aos técnicos no assunto. Preferencialmente, a estequiometria do corante é um a um, mas pode ser maior.

[018]Em um terceiro aspecto, é provido um kit para uso no método do primeiro ou segundo aspecto, compreendendo um ou mais oligonucleotídeos de referência e um corante fluorescente. Preferencialmente, somente um oligonucleotídeo de referência está presente no kit. Se mais de um oligonucleotídeo estiver presente, cada um pode ter o mesmo comprimento ou comprimentos diferentes.

[019]Em um quarto aspecto, é provido um kit para uso no método do primeiro ou segundo aspecto, compreendendo um ou mais oligonucleotídeos de referência marcados com um corante fluorescente.

[020]Em um quinto aspecto, é provido um kit para uso no método do primeiro ou segundo aspecto, compreendendo diluições em série de um ou mais oligonucleotídeos de referência marcados com um corante fluorescente.

[021]O oligonucleotídeo de referência terá, preferencialmente, um comprimento maior que 60 bp e estaria tipicamente na variação entre cerca de 60 bp e cerca de 170 bp. Mais preferencialmente, o oligonucleotídeo de referência terá o comprimento de 100 bp, que pode ser utilizado para quantificar ácidos nucléicos alvos, que estão comumente na variação entre cerca de 60 a cerca de 210 bp de comprimento. O limite mais alto de comprimento do oligonucleotídeo de referência não é crucial e será determinado por considerações práticas.

[022]É desejável que o conteúdo de GC de um oligonucleotídeo de referência seja 45% ou acima. Tipicamente, o conteúdo de GC do oligonucleotídeo de referência pode ser selecionado na variação de cerca de 45% a cerca de 75% e, mais preferencialmente, é 50%. O limite mais alto do conteúdo de GC não é crucial.

[023]O oligonucleotídeo de referência pode ser obtido a partir de uma fonte biológica, natural ou, de outra forma, utilizando técnicas conhecidas ou pode ser preparado sinteticamente.

[024]A menos que o contexto precise claramente de outra forma, em toda a descrição e reivindicações, as palavras “compreende”, “compreendendo” e similares devem ser construídas em um sentido inclusivo, conforme oposto a um sentido exclusivo ou exaustivo; isso quer dizer, no sentido de “incluindo, entre outros”.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[025]Figura 1: Fluorescência do padrão do oligonucleotídeo de referência em concentrações que variam ao longo de 15 ciclos. Cada linha horizontal representa uma concentração. A falta de enzima na mistura da reação garante que a fluorescência está inalterada ao longo de numerosos ciclos.

[026]O gráfico ainda indica a estabilidade e capacidade de reprodução do complexo de corante do oligonucleotídeo de referência entre os ciclos de desnaturação e anelamento repetidos.

[027]Figura 2: Curva padrão gerada a partir dos dados de fluorescência apresentados na Figura 1.

[028]Figura 3: Curvas de ciclagem para seis genes (definidos pelos parênteses). Os ciclos necessários para cada gene para obter três determinados níveis de fluorescência fl, f2, f3 (por exemplo, 65, 60 e 55) são obtidos a partir desses dados.

[029]Figura 4: Expressão de cinco genes de interesse nos corações dos ratos SHR. A expressão de cada gene de interesse foi calculada utilizando oligonucleotídeo de referência (barras abertas), oligonucleotídeo de referência mais 20 pares de base (barras com traços finos) e oligonucleotídeo de referência mais 100 pares de base (barras sólidas). O aumento do comprimento do oligonucleotídeo de referência não afetou significativamente o cálculo da expressão do gene de interesse. TNFα p=0,3946; TGFβ p=0,7151; AngO p=0,6158; CTGF p=0,4955 e ATla p=0,5589, para o oligonucleotídeo de referência vs. oligonucleotídeo de referência mais 20 e 100 pares de base (ANOVA).

[030]Figura 5: Expressão de cinco genes de interesse nos corações de ratos WKY em uma dieta rica em sal em 3 grupos experimentais - um controle de tempo zero (com 14 semanas) barras abertas, após 4 semanas de infusão excipiente de controle (com 18 semanas) barras com traços finos e após 4 semanas de tratamento com VIP (18 semanas) barras sólidas.

[031]Figura 6: Curvas padrão geradas ao longo de 3 semanas. As misturas da reação do corante do oligonucleotídeo de referência foram refrigeradas e armazenadas a -20°C entre séries de descongelamento para cada série e refrigeradas. Como pode ser visto, as curvas padrão geradas são estáveis no decorrer do tempo do refrigeramento e novo descongelamento repetidos.

[032]Figuras 7A-F: Resultados de quantificação para seis genes de interesse (angiotensinogênio, TGFβ, TNFα, CTGF, Atla e NONO) utilizando 5 oligonucleotídeos de referência que variam de 70 a 170 pares de base de comprimento e que variam no conteúdo de GC de 50% a 74%. Os oligonucleotídeos de referência apresentados nesses exemplos são CTGF 70 pares de base, 50% de conteúdo de GC (CTGF 70/50), CTGF 73 pares de base, 74% de conteúdo de GC (CTGF73/74), β Actina 90 pares de base 50% de conteúdo de GC (Actina 90/50), CTGF 90 pares de base, 50% de conteúdo de GC (CTGF 90/50) e CTGF 170 pares de base, 52% de conteúdo de GC (CTGF 170/52).

[033]Figuras 8A-F: Apresentam resultados de quantificação para seis genes de interesse (angiotensinogênio, TGFβ, TNFα, CTGF, Atla e NONO) utilizando 4 oligonucleotídeos de referência que variam de 50 a 144 pares de base de comprimento e que variam no conteúdo de GC de 40% a 50%. Os oligonucleotídeos de referência apresentados nesses exemplos são Actina 144/40 (β Actina 144 pares de base, 40% de conteúdo de GC), CTGF 50/50 (CTGF 50 pares de base, 50% de conteúdo de GC), Actina 90/50 (β Actina 90 pares de base, 50% de conteúdo de GC) e CTGF 90/50 (CTGF 90 pares de base, 50% de conteúdo de GC). * p<0,005, ** p<0,0005 vs Actina 90/50; # p<0,01, ## p<0,005, ###p<0,001 e #### p<0,0005 vs CTGF 90/50.

[034]Figura 9 A: Efeitos de tratamento de VIP ou enalapril na expressão de angiotensinogênio (AGT), TGFβ e CTGF em SHR, Controle de tempo zero (barras abertas), controle de excipiente (barras com traços finos), infusão de VIP (barras sólidas) e tratamento de enalapril (barras com traços finos cruzados). * p<0,05, ** p<0,025, ***p<0,0005 para VIP ou enalapril vs controle de excipiente. # p<0,001 ## p<0,0005 para VIP ou enalapril vs controle de tempo zero.

[035]Figura 9B: Efeito de tratamento com VIP ou enalapril na expressão de receptor de NF Kappa B, TNFα e AT1a em SHR. * p<0,01 ** p<0,0005 para VIP ou enalapril vs Controle de Excipiente; # p<0,05, ## p<0,0005 para VIP enalapril vs controle de tempo zero.

[036]Figura 9C: Efeito do tratamento com VIP ou enalapril na expressão de metalloproteinase e TIMP em SHR. *p<0,025, ** p<0,0005 para VIP ou enalapril vs controle de excipiente; # p<0,01, ## p<0,001, ### p<0,0005 VIP ou enalapril vs controle de tempo zero. Os valores são média ± sem para n=6 ratos.

DEFINIÇÕES

[037]O termo/frases “gene” ou “ácido nucléico alvo” ou “gene alvo” ou “gene de interesse” ou “sequência de interesse alvo” ou “alvo de interesse” ou “ácido nucléico de interesse” conforme aqui utilizados, são utilizados permutavelmente e se referem ao mesmo conceito.

[038]O termo “ácido nucléico” se refere a moléculas que são compostas de cadeias de nucleotídeos monoméricos. Conforme aqui utilizado, o termo pretende incluir DNA, RNA e suas variantes e derivados.

[039]Um “gene”, conforme aqui utilizado, pode ser um gene natural (por exemplo, genômico) ou sintético, compreendendo sequências regulatórias transcripcionais e/ou translacionais e/ou uma região de codificação e/ou sequências não translacionais (por exemplo, introns, 5'- e 3'-sequências não translacionais). A região de codificação de um gene pode ser uma codificação de sequência de nucleotídeo para uma sequência de amino ácidos ou um RNA funcional, como tRNA, rRNA, RNA catalítico, siRNA, miRNA ou RNA antisense. O termo “gene” também pode incluir cDNA correspondente às regiões de codificação (por exemplo, exons) opcionalmente compreendendo 5'- ou 3'-sequências não translacionais ligadas a elas. Um gene também pode ser uma molécula de ácido nucléico amplificada, produzida in vitro, compreendendo toda ou parte da região de codificação e/ou 5'- ou 3'- sequências não translacionais ligadas a ela.

[040]“Amplificação” de sequências de ácidos nucléicos pode ser convenientemente realizada por Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), mas também pode ser realizada por outro método adequado, como reação em cadeia da ligase. No contexto da presente especificação, os termos “Reação em Cadeia da Polimerase” e seu acrônimo “PCR” são utilizados de acordo com seu significado comum, conforme entendido pelos técnicos no assunto. Exemplos de métodos de PCR podem ser encontrados em livros de biologia molecular comuns e manuais de referência utilizados na técnica. Por exemplo, PCR Technology: Principles e Applications for DNA Amplification (1989) Ed H A Erlich. Stockton Press, New York. A fim de otimizar a amplificação de PCR, os primers podem ser utilizados em diferentes concentrações e proporções. A seleção dessas e outras variáveis será apreciada e capaz de ser obtida por técnicos no assunto.

[041]“Amplicon”, no contexto da presente invenção, refere-se a fragmentos de produtos de DNA ou ácido nucléico que são formados pelas reações de amplificação, como as realizadas por PCR ou reações em cadeia da ligase. Em um contexto, o amplicon pode ser o produto do “ácido nucléico alvo” ou “gene de interesse” ou “ácido nucléico de interesse”, etc.

[042]“Primer” pode ser utilizado permutavelmente com “oligonucleotídeo”, e pode ser natural, sintético ou uma modificação disso e capaz de agir como um ponto de iniciação da síntese de nucleotídeo suficientemente complementar a uma sequência de nucleotídeo específica em uma molécula de modelo.

[043]“Oligonucleotídeo de referência” ou “sequência de ácido nucléico de referência” ou “oligonucleotídeo de referência universal”, conforme aqui utilizados no contexto da presente invenção, é um ácido nucléico, preferencialmente DNA de dupla fita, e inclui qualquer ácido nucléico com tamanho adequado útil na preparação de uma curva padrão ou, de outra forma, adequado para quantificação de ácidos nucléicos alvos de interesse. Consequentemente, oligonucleotídeo de referência pode ser um polinucleotídeo, mas também pode ser uma sequência menor. As características do oligonucleotídeo de referência adequado são aqui descritas.

[044]O oligonucleotídeo de referência pode ser inteiramente sintético ou pode ser obtido de fontes naturais de DNA utilizando uma enzima de restrição adequada para obter ácidos nucléicos de tamanho adequado como um oligonucleotídeo de referência.

[045]Para obter quantidades adequadamente grandes, o oligonucleotídeo de referência pode ser amplificado utilizando uma reação de amplificação (por exemplo, PCR ou reação em cadeia da ligase) ou pode ser expresso de maneira recombinante em um micro-organismo e purificado antes do uso. Se o tamanho do oligonucleotídeo de referência permitir, ele também pode ser preparado em quantidade por meios sintéticos.

[046]Um “gene de controle” é tipicamente um gene constitutivo que é necessário para manutenção da função celular basal. Esses genes são encontrados em todas as células. Alguns genes de manutenção são expressos em níveis relativamente constantes; entretanto, outros genes de manutenção podem variar na expressão dependendo das condições experimentais utilizadas.

[047]Uma “curva padrão” é uma ferramenta de pesquisa quantitativa, um método de dados de ensaio de delineação que é utilizado para determinar a concentração absoluta de uma substância, como DNA e proteínas.

[048]“Quantificação”, conforme aqui utilizado no contexto da presente invenção, significa a detecção da quantidade absoluta de uma substância, no presente caso, o “gene alvo de interesse”.

[049]“Diluição em série” se refere a qualquer forma de diluição necessária para preparar uma curva padrão que abrange uma variação de concentrações de uma substância (por exemplo, ácido nucléico), a partir da qual, a quantidade de um “ácido nucléico alvo” pode ser quantificada.

[050]No contexto da presente invenção “dsDNA” se refere a DNA de dupla fita, “bp” se refere a pares de base, “dNTP's” se refere a deoxinucleotídeo trifosfato, “RNA” se refere ao ácido ribonucléico, “tRNA” se refere ao RNA de transferência, “rRNA” se refere ao RNA ribossômico, “siRNA” se refere a RNA de interferência pequeno, “miRNA” se refere ao micro RNA, “mRNA” se refere ao RNA mensageiro e “cDNA” se refere ao DNA complementar.

[051]O “conteúdo de GC” de uma sequência de ácido nucléico, como um primer, tem um efeito em diversas propriedades de um primer que inclui sua temperatura de dissolução (Tm).

REALIZAÇÃO PREFERIDA DA INVENÇÃO

[052]A presente invenção é motivada pela falta de meios precisos e eficientes para quantificar a expressão de ácido nucléico nos grupos controle e de tratamento animal/humano. Também é motivada pelo fato de que a maioria dos genes de manutenção conhecidos utilizados em estudos de expressão do gene, movimentam-se em resposta a condições ou tratamentos experimentais, distorcendo, assim os resultados.

[053]Uma vantagem da presente invenção é que os métodos descritos dispõem da necessidade de genes de manutenção ou genes sintéticos de referência utilizados para normalizar dados e quantificar a expressão do gene. Outra vantagem da presente invenção é que a amplificação de um ácido nucléico alvo, geralmente por PCR, mas outros métodos podem ser utilizados, pode ser realizada ao longo de um número reduzido de ciclos (por exemplo, 15 ciclos) em vez dos normais 30 ciclos ou igualmente, utilizados para estudos de expressão do gene, provendo, assim, quantidade suficiente de ácidos nucléicos alvos para uso no ensaio de quantificação enquanto reduz significativamente o tempo e o custo dos ensaios.

[054]Na abordagem inovadora aqui descrita, um corante em combinação com um oligonucleotídeo de referência de um comprimento predeterminado, que pode estar vantajosamente não relacionado ao ácido nucléico alvo de interesse, mas também pode ser semelhante ou idêntico ao gene de interesse, é utilizado para gerar uma curva padrão. A curva padrão é gerada ao diluir em série um oligonucleotídeo de referência marcado de forma fluorescente, de acordo com a invenção e delineando o nível de intensidade do corante fluorescente vs. a concentração do oligonucleotídeo de referência marcado. Não é necessária a amplificação do oligonucleotídeo de referência para produzir a curva padrão. Isso contrasta com as metodologias atuais para avaliar a expressão do gene, por meio das quais a amostra de teste e o gene de manutenção/gene sintético de referência são ambos amplificados, seja lado a lado ou combinados em uma mistura de reação.

[055]A mesma curva padrão, uma vez preparada, pode ser utilizada diversas vezes, se necessário, para quantificar mais de um ácido nucléico alvo de interesse. As soluções de oligonucleotídeo de referência diluídas utilizadas para preparação da curva padrão são estáveis ao longo do tempo, por exemplo, ao longo de um período de cerca de um mês, e o congelamento e descongelamento repetidos das soluções. Isso permite a preparação e o armazenamento das soluções de oligonucleotídeo de referência à frente de quaisquer exigências experimentais.

[056]O oligonucleotídeo de referência pode ser uma sequência completamente sintética, uma sequência amplificada (por exemplo, gerada por PCR) ou um fragmento de restrição de tamanho adequado de um ácido nucléico maior, isolado de uma fonte natural. O oligonucleotídeo de referência utilizado nos métodos da presente invenção não é o que é descrito como um “gene de manutenção” ou um “gene sintético de referência”, isto é, não precisa ser amplificado junto ao gene de interesse.

[057]Pode ser desejável projetar oligonucleotídeos de referência de diferentes comprimentos para preparar curvas padrão para quantificar ácidos nucléicos alvos de diferentes comprimentos, mas isso não é crucial para o método da presente invenção. Entretanto, uma vantagem particular da presente invenção é que um único oligonucleotídeo de referência de um comprimento fixo em particular pode ser utilizado em uma curva padrão para quantificar ácidos nucléicos alvos que são maiores ou menores que o oligonucleotídeo de referência, assim como tendo diferentes sequências de ácido nucléico.

[058]O oligonucleotídeo de referência terá desejavelmente um comprimento maior que 60 bp e estaria tipicamente na variação entre cerca de 60 bp e cerca de 170 bp (isto é, cerca de 60, 70, 80, 90 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160 ou cerca de 170 bp), que poderá ser utilizado para quantificar ácidos nucléicos alvos na variação entre cerca de 80 a cerca de 210 bp em comprimento, mais tipicamente na variação entre cerca de 80 e cerca de 150 bp em comprimento. Ainda, qualquer oligonucleotídeo de referência tendo um comprimento na variação declarada acima pode ser utilizado para quantificar qualquer um ou mais produtos de ácido nucléico alvo de comprimento na variação declarada acima. Será entendido que o comprimento da sequência alvo não é importante ao método da presente invenção, uma vez que é selecionado como ácido nucléico de interesse (ou múltiplos ácidos nucléicos de interesse) pelos que utilizam o método.

[059]O limite mais alto do comprimento do oligonucleotídeo de referência não é crucial e será determinado por considerações práticas. Assim, um oligonucleotídeo de referência maior que 170 bp pode ser utilizado, se desejado, no método da presente invenção sem efeitos deletérios na quantificação de um ácido nucléico alvo (por exemplo, comprimentos de entre cerca de 170-180, 180-200, 200-220, 220240, 240-260, 260-280, 280-300, 300-320, 320-340, 340-360, 360-380, 380-400 bp etc.).

[060]É desejável que o conteúdo de GC de um oligonucleotídeo de referência seja de 45% ou acima. O limite mais alto de conteúdo de GC não é crucial. Assim, oligonucleotídeos de referência com 75% de conteúdo de GC produziram resultados semelhantes aos oligonucleotídeos de referência tendo menor conteúdo de GC. Tipicamente, o conteúdo de GC do oligonucleotídeo de referência pode ser selecionado na variação de cerca de 45% a cerca de 75% (por exemplo, de cerca de 45%, 50%, 55%, 55%, 60%, 65%, 70% ou cerca de 75%).

[061]A sequência de oligonucleotídeo de referência não precisa ter qualquer homologia com o ácido nucléico alvo ou com qualquer sequência de gene de manutenção. Entretanto, devido ao modo particular no qual o oligonucleotídeo de referência é utilizado no método da presente invenção (isto é, para configurar uma curva padrão após a diluição em série do oligonucleotídeo de referência), a sequência de oligonucleotídeo de referência pode ter um grau de homologia ou mesmo se identificar com uma sequência de ácido nucléico alvo ou um gene de manutenção, ou suas partes menores. Uma vantagem da presente invenção é que o método pode fazer uso do mesmo oligonucleotídeo de referência para quantificar diferentes ácidos nucléicos alvos. Na prática, o oligonucleotídeo de referência será um universal, com um comprimento e conteúdo de GC fixos e particulares, tipicamente, um oligonucleotídeo de 100 bp e 50% de conteúdo de GC. Encara- se que pelo menos três diferentes oligonucleotídeos de referência nas variações descritas acima são incluídos em um kit a fim de ser capaz de quantificar a variação completa dos tamanhos de gene (ácido nucléico) que seriam comumente medidos.

[062]Se um oligonucleotídeo de referência for obtido de uma fonte biológica, natural ou, de outra forma, utilizando enzimas de restrição para obter um fragmento de um tamanho adequado, o conteúdo de GC pode ser determinado utilizando técnicas de biologia molecular padrão bem conhecidas aos técnicos no assunto e não precisaria mais que procedimentos analíticos simples para selecionar e determinar um fragmento de um tamanho adequado (Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.). Os oligonucleotídeos de referência sintéticos também podem ser convenientemente utilizados e podem ser simplesmente preparados por técnicas conhecidas, como, por exemplo, as descritas em Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. e Roe et al. DNA Isolation e Sequencing” (Essential Techniques Series) (1996) John Wiley & Sons, Inc., N.Y. O comprimento e conteúdo de GC desejados de um oligonucleotídeo de referência sintético podem ser facilmente selecionados durante a síntese.

[063]O método da invenção é adequado para uso com corantes de intercalação assim como sondas fluorescentes (corantes). Para corantes de intercalação, o comprimento do oligonucleotídeo de referência não afeta a intensidade da fluorescência para uma determinada concentração do oligonucleotídeo de referência, contanto que o comprimento do oligonucleotídeo de referência seja 60 bp ou maior. Parece haver nenhum limite superior do comprimento do oligonucleotídeo de referência que cause impacto na intensidade da fluorescência. Como uma consequência, um oligonucleotídeo de referência é adequado para uso como um padrão de referência para qualquer número de sequências de ácido nucléico alvo de interesse que podem ter diferentes comprimentos, conteúdo de GC e/ou sequência de nucleotídeo. Para sondas fluorescentes, o mesmo oligonucleotídeo de referência pode ser utilizado para numerosos alvos de ácido nucléico estudados em série contanto que o mesmo fluoróforo seja utilizado. De modo alternativo, múltiplas curvas padrão podem ser geradas utilizando um oligonucleotídeo de referência, mas diferindo fluoróforos para prover uma estrutura quantitativa para múltiplos produtos de rt-PCR.

[064]Assim, o método da presente invenção é vantajoso uma vez que dispõe da necessidade de amplificar um gene de manutenção e executar constantemente ensaios para genes de manutenção ou genes sintéticos de referência para normalizar dados de expressão do ácido nucléico dentro de cada experimento. Uma curva padrão pode ser preparada e utilizada ao longo de um período de tempo para quantificar mais de um ácido nucléico alvo de interesse, que pode variar no tamanho e sequência, cortando assim o custo e o tempo quando comparado a ensaios de expressão do gene convencionais.

[065]Os métodos da presente invenção servem para automação assim como para monitoramento de amplificação e quantificação de ácido nucléico alvo em tempo real ao armazenar as informações de curva padrão de oligonucleotídeo de referência em um sistema com base em computador antes de começar a amplificar o ácido nucléico alvo de interesse e considerar as amostras das reações de amplificação em determinados períodos de tempo ou aumentar o monitoramento na fluorescência ao longo do tempo (tempo real) e relacionar as informações às informações de curva padrão armazenadas. Ao operar os métodos nesse modo, uma curva padrão pode ser gerada periodicamente, por exemplo, semanal ou mensalmente, e essas informações são armazenadas e utilizadas para quantificar ácidos nucléicos alvos de interesse ao longo de um período de tempo sem a necessidade de preparar novas curvas padrão.

[066]O método e kit da presente invenção podem ser vantajosamente utilizados para quantificar genes (ácidos nucléicos) de interesse tendo produtos de gene (ácido nucléico) que são comumente encontrados em laboratórios analíticos e de pesquisa e estão geralmente na variação de 80 a 150 bp em comprimento e tendo de 30% a 60% de conteúdo de GC, utilizando um único oligonucleotídeo de referência. Mais particularmente, o método e kit da presente invenção são úteis na quantificação de produtos de ácido nucléico que excedem 60 bp em comprimento e 35% de conteúdo de GC utilizando um único oligonucleotídeo de referência que tem preferencialmente 100 bp de comprimento e tem 50% de conteúdo de GC. O formato preferido do kit, portanto, consiste nesse oligonucleotídeo de referência ou suas diluições em série e o corante ou outro marcador detectável utilizado na reação para o ácido nucléico de interesse. De modo alternativo, o kit inclui um oligonucleotídeo de referência marcado com um corante ou outro marcador adequado ou diluições em série desse oligonucleotídeo de referência marcado, e o corante ou marcador a ser utilizado para marcar o ácido nucléico de interesse.

[067]Como um guia geral para preparar uma curva padrão a ser utilizado no método da presente invenção, o oligonucleotídeo de referência é diluído em série em duplicata utilizando o mesmo buffer de reação que o utilizado para o gene de interesse, para dar quantidades finais, por exemplo, na variação de cerca de 0,01 a cerca de 10 pmol (pode estar em uma variação mais estreita ou mais ampla) do oligonucleotídeo de referência por tubo de reação, para permitir a construção de uma curva padrão (de referência), conforme aqui descrito. A variação das concentrações do nucleotídeo de referência é determinada por estudo simples e erro, dependendo das exigências. Um marcador detectável, como um corante fluorescente (o mesmo que o utilizado para o gene de interesse e na mesma quantidade que a utilizada para a reação do gene de interesse), é então adicionado a cada tubo de reação. Tipicamente, os tubos de reação se submetem a 15 ciclos (podem ser mais ciclos, se desejado) em uma máquina de rt-PCR em tempo real, as condições de ciclagem refletindo as utilizadas para o gene de interesse. Assim, se as condições de desnaturação iniciais para o gene de interesse forem, por exemplo, 94°C e 2 minutos, os tubos que contêm as diluições em série do oligonucleotídeo de referência (a ser utilizado para construir a curva padrão) se submetem à desnaturação inicial a 94°C por 2 minutos. Os próximos 15 ciclos, então paralelizam os do gene de interesse, de modo que se as condições de ciclagem do gene de interesse incluírem, por exemplo, desnaturação a 95°C por 30 segundos seguido por anelamento a 60°C por 30 segundos, os tubos que contêm as diluições em série do oligonucleotídeo de referência também são ciclados a 95°C por 30 segundos (desnaturação) e 60°C por 30 segundos (anelamento). Se um corante fluorescente for utilizado como um rótulo ou marcador, a fluorescência pode ser adquirida durante cada fase de anelamento, conforme demonstrado nas Figuras 1 e 2. Uma curva padrão (de referência) da fluorescência vs. quantidade de ácido nucléico (por exemplo, DNA) é, então, construída, conforme aqui descrito.

[068]Apesar de a invenção ter sido descrita a título de exemplo, deve ser apreciado que variações e modificações podem ser feitas sem se desviar do escopo da invenção. Além disso, onde existirem equivalentes conhecidos às características específicas, esses equivalentes são incorporados como se mencionou especificamente nessa especificação. EXEMPLOS EXEMPLO 1 Cálculos

[069]Na rt-PCR após um número predeterminado de ciclos (c), a quantidade de genes de interesse presentes (R) é relacionada à quantidade daqueles genes presentes no início da amplificação de PCR (n) em uma maneira reproduzível, se a eficiência da replicação for 100% e em cada ciclo cada cópia do gene é replicada. R = n x 2c n = replica os presentes no momento 0 c = número de ciclos em uma fluorescência predeterminada R = replica os presentes após c ciclos

[070]Quando a eficiência for menor que 100%: e nem todas as cópias de um gene são replicadas em cada ciclo e a equação é modificada para considerar essa redução na eficiência da replicação, então R = n x ec e = eficiência de replicação c = número de ciclos em uma fluorescência predeterminada R = replica os presentes após c ciclos EXEMPLO 2

[071]Preparação do Oligonucleotídeos de referência

[072]Embora o exemplo mencionado utilize RNA para fator de crescimento de tecido conectivo (CTGF- connective tissue growth factor) para gerar os oligonucleotídeos de referência, deve ser apreciado que os oligonucleotídeos de referência para uso como padrões podem ser gerados do RNA para qualquer gene ou para codificar ou não codificar o DNA.

[073]Os oligonucleotídeos de referência de 70, 90 e 170 pares de base em comprimento foram preparados por amplificação de segmentos do gene de CTGF do tecido cardíaco de ratos hipertensos espontâneos (SHR- spontaneous hypertensive rats) como segue: 1) Extração de RNA

[074]Os tecidos foram coletados de animais SHR para extração de RNA total por fenol e isotiocianato de guanidina (Chomczynski e Sacchi 1987) com modificação. Os corações de SHR resfriados em nitrogênio líquido foram homogeneizados por um Mixer Mill MM300 (Retsch GmbH, Germany). As amostras criogênicas, cada uma de 100 mg, foram adicionadas a l mL de Reagente Trizol (Invitrogen) em um tubo de microteste de 1,5 mL Safe-Lock (Eppendorf Biopur, Hamburg, Germany) com contas de carboneto Tungsten 3 mm (Qiagen) e fundamentados em uma frequência de 30 Hz. A extração de RNA então seguiu, de acordo com as recomendações do fabricante (Invitrogen). Após as amostras serem interrompidas para RNA, a separação de fase procedeu por meio de 200 mL de clorofórmio (Lab-Scan Analytical Sciences, Lomb Scientific, Taren Point, NSW, Australia) foram adicionados e a amostra agitada manualmente por mão por 15 segundos e, então, incubada em temperatura ambiente (23-30°C) por 5 minutos antes da centrifugação a 12.000 rpm (13.201 g) por 20 minutos a 4°C (quebra), utilizando uma centrífuga Sigma 1- 15PK (John Morris Scientific, Chatswood, NSW, Australia). Os 300 mL da fase aquosa superior foram coletados em um tubo eppendorf fresco de 1,5 mL e 500 mL de propan-2-ol (isopropanol) pré-resfriado (Lab-Scan Analytical Sciences, Lomb Scientific, Taren Point, NSW, Australia) foram adicionados, e a amostra invertida manualmente por poucas vezes para misturar. A mistura foi incubada em temperatura ambiente por 10 minutos para precipitar o RNA. Uma pastilha foi formada por centrifugação a 12.000 rpm por 20 minutos a 4°C (John Morris Scientific, Chatswood, NSW, Australia). O flutuante foi descartado e a pastilha, então, lavada com 1 mL de 75% (v/v) de etanol de grau molecular absoluto (Lab-Scan Analytical Sciences, Lomb Scientific, Taren Point, NSW, Australia) diluído em pirocarbonato de dietila (DEPC- diethyl pyrocarbonate) (Sigma-Aldrich, Castle Hill, NSW, Australia) e girada a 10.000 rpm por 10 minutos a 4°C (John Morris Scientific, Chatswood, NSW, Australia). A pastilha foi coletada e secada ao ar por poucos minutos em um exaustor, então, dissolvida em água Milli-Q tratada em DEPC e armazenada a -80°C. A concentração de RNA total foi determinada por absorbância de espectrofotômetro, utilizando Nanodrop 1000 (Nd-1000, Thermo Scientific) a 260 nm (A260); e a pureza do RNA foi considerada satisfatória se a provisão A206 :A280 for de cerca de 2,0. 2) Tratamento de deoxiribonuclease 1 (DNase-1)

[075]As amostras de RNA foram tratadas com DNase-1 (Invitrogen) antes da reação em cadeia da polimerase por transcrição reversa (RT-PCR) para eliminar o DNA de dupla e de única fita. Em tubos eppendorf livres de DNase e RNase de 0,5 mL, até 1 μg de RNA foi digerido com Buffer de Reação 1 unidade/ μL DNase-1 e 1 μL de 10X DNase-1 em um volume total de 10 μL com água tratada por DEPC. As amostras foram incubadas por 15 minutos em temperatura ambiente antes de desativar a DNase-1 por quelante de cálcio e íons de magnésio com 1 μL de 25 mM EDTA na mistura de solução e aquecimento de 65°C por 10 minutos. As amostras foram resfriadas em gelo e armazenadas a -80°C. Todos os componentes da mistura foram fornecidos no kit de DNase-1 (Invitrogen). 3) Avaliação da Qualidade e Concentração de RNA

[076]As amostras de RNA tratadas por DNase-1 foram analisadas no instrumento de eletroforese automatizado de microchip MCE-202 MultiNA (Shimadzu Biotech, Rydalmere, NSW, Australia) em relação à pureza, tamanho e concentração de 18S e 28S subunidades de RNA ribossômico (rRNA). Todas as etapas foram realizadas de acordo com a recomendação do fabricante, com modificações sem importância. Resumidamente, 3 μL de cada amostra foi misturado com volume igual de marcador de RNA interno (Shimadzu Biotech, Rydalmere, NSW, Australia) em uma placa de 96 poços e vedada com lâmina de alumínio de PCR adesiva (Thermo Scientific, Integrated Sciences, NSW, Australia). O RNA junto aos marcadores padrão internos de concentração e tamanho conhecidos, (marcadores de tamanho molecular inferior e superior), resulta em eletroforese automaticamente correta para previsão e quantificação de tamanho automático de amostras de RNA. A progressão de 6000 de RNA (Applied Biosystems, Victoria, Australia) foi diluída a água tratada por DEPC em uma proporção de 1:5 (v/v); a mistura de solução foi então misturada à solução de marcador de RNA a 1 : 1 (v/v). Ambas, as misturas de amostras e de progressão, fora desnaturadas por calor a 65°C por 5 minutos e imediatamente resfriadas em gelo por 5 minutos. Essas separações de variação de tamanho foram realizadas nos microchips de MultiNA (Shimadzu Biotech, Rydalmere, NSW, Australia) em um Buffer de Separação de RNA (Shimadzu Biotech, Rydalmere, NSW, Australia) que contém 10.000X de corante fluorescente de intercalação SYBR Green II (Invitrogen), diluído em 1 :99 com TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM dissódio EDTA, pH 8,0) (Sigma- Aldrich), e 20% (v/v) de formamida (Invitrogen). 4) Transcrição reversa

[077]O primeiro DNA de fita complementar (cDNA) foi sintetizado de um modelo de RNA de fita única utilizando a Transcriptase Reversa de Vírus da Moloney-Murine (M-MLV RT) do kit de Supermistura de Síntese de primeira fita de sobrescrito III (Invitrogen), de acordo com as instruções do fabricante. Todas as reações foram realizadas em tubos eppendorf de paredes finas de 0,2 mL; e todas as etapas de incubação foram realizadas em um Rotor-Gene 6000 (Corbett Research, Sydney, Australia; Qiagen). Até 5 μg de RNA total foi desnaturado por calor a 65°C por 5 minutos com 1 μL de 50 μM de oligo (dT)20 e 1 μL de Buffer de Anelamento em um volume total de 8 μL com água tratada por DEPC. As amostras foram resfriadas em gelo por pelo menos 1 minuto antes de serem adicionadas a 10 μL de Mistura de Reação da primeira Fita 2X e 2μ L de Mistura de Enzima de III/RNaseOUT Sobrescrito. As amostras foram brevemente vorticadas para misturar, e então coletadas por giro de pulso, então, incubadas a 50°C por 50 minutos para síntese de cDNA. A enzima RT foi desnaturada para encerrar a reação a 85°C por 5 minutos, e a amostra foi imediatamente resfriada em gelo e armazenada a -20°C. As amostras de controle negativas sem enzima de RT ou RNA foram incluídas para verificar a ausência de contaminação de DNA. 5) Primers

[078]Os pares de primers que geram comprimentos de produto de PCR de 70 bp, 90 bp e 170 bp foram designados com base na seqüência publicada por NCBI GenBank para mRNA de rato em relação ao fator de crescimento de tecido conectivo (CTGF) (Número de aceso AB023068). As sequências de primer (sequências de primer em si tendo 21 a 24 bases em comprimento) foram enviadas para síntese (Invitrogen) como produtos liofilizados dessalinizados. Os primers foram reconstituídos a uma concentração de 50 μM com TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, ImM EDTA) (Invitrogen) e armazenados a -20°C.

Tabela 1: Sequências de primer para CTGF de rato 6) PCR

[079]A PCR foi realizada em corações de SHR, com cada primer ajustado para determinar diferentes concentrações de ligação de dsDNA à quantidade fixa de EvaGreen. Todos os reagentes utilizados nessa PCR foram comprados da Invitrogen, fornecidos em um kit ou em itens individuais. Um microlitro de cDNA foi amplificado em um total de mistura de reação de 50 μL contendo 5 μL de Buffer de PCR 10X, 1 μL de 10 mM de mistura de dNTP, 1,5 μL de 50 mM de MgCl2, 2 μL de cada mistura de par de primer (10μM cada), 0,2 μL de polimerase de DNA Platinum Taq e 39,3 μL de água tratada em DEPC. A PCR foi realizada por um Rotor-Gene 6000 (Corbett Research, Sydney, Australia; Qiagen). As condições para amplificação foram inicialmente desnaturadas a 94°C, 2 minutos; 30 a 35 ciclos de desnaturação a 95°C, 10 segundos; anelamento a 60°C, 20 segundos e síntese a 72°C por 20 segundos. Um controle negativo sem cDNA foi incluído em todas as execuções. 7) Concentração de Produtos de PCR

[080]Até 4 μL de produto de PCR agrupado foi adicionado à unidade de filtro 30K Amicon Ultra-4 (Millipore, North Ryde, NSW, Australia), uma membrana de celulose para concentrar DNA, e centrifugado em um rotor de caçamba móvel Sigma 2-16PK (John Morris Scientific, Chatswood, NSW, Australia) a 22°C, 5000 rpm (4025g) por 10 minutos. O soluto concentrado foi coletado na parte inferior da unidade de filtro e armazenado a -20°C para PCR subsequente. 8) Confirmação e Quantificação do tamanho do DNA

[081]Os produtos de PCR concentrados foram analisados no instrumento de eletroforese automatizado de microchip MCE-202 MultiNA (Shimadzu Biotech, Rydalmere, NSW, Australia) para confirmação e concentração de tamanho de faixa. Todas as etapas foram seguidas de acordo com as instruções do fabricante com modificação sem importância. Resumidamente, 6 μL de uma diluição de 1/10 (v/v) de produtos de PCR concentrados (diluídos em água tratada por DEPC) foram adicionados a cada poço da placa de 96 poços com lâmina de alumínio de PCR adesiva (Thermo Scientific, Integrated Sciences, NSW, Australia). O Buffer de Separação de DNA 500 (Shimadzu Biotech, Rydalmere, NSW, Australia) consistindo em 10.000X SYBR Gold (Invitrogen), diluído em diluição de 1/100 em TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM dissódio EDTA, pH 8,0) (Sigma- Aldrich), foi então utilizado para separar as amostras de DNA por meio dos microchips (Shimadzu Biotech, Rydalmere, NSW, Australia). Os tamanhos de faixa e concentração de DNA foram analisados ao lado de uma progressão de DNA de 25 bp (Invitrogen), diluída em 1:49 em TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM dissódio EDTA, pH 8,0) (Sigma-Aldrich), e marcador interno de DNA 500 (Shimadzu Biotech, Rydalmere, NSW, Australia), respectivamente.

[082]Referências: Chomczynski, P., e Sacchi, N. (1987) Anal. Biochem. 162, 156. EXEMPLO 3 Preparação de curva padrão

[083]Sete microlitros de amostras de DNA concentradas (isto é, produtos de 70, 90 ou 170 bp), em duplicata, foram diluídos em série em 1:1 (v/v) de TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA) (Invitrogen), variando da pureza para 1/32 de diluição, e 1,25 μM de corante EvaGreen (Biotium Inc, Hayward, CA; Jomar Biosciences, SA, Australia) em tubos de PCR de 0,2 mL que contêm um volume de reação de 50 μL TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA) (Invitrogen). A titulação foi realizada em um Rotor-Gene 6000 (Corbett Research, Sydney, Australia; Qiagen). As condições para ciclagem foram a desnaturação inicial a 94°C, 2 minutos; 15 ciclos de desnaturação a 95°C, 30 segundos; e os sinais fluorescentes foram adquiridos durante cada etapa de anelamento a 60°C por 30 segundos. Dois controles negativos foram incluídos em cada controle sem modelo de uma execução de curva padrão e o oligonucleotídeo na mais alta concentração sem corante Evagreen. As misturas de DNA foram armazenadas a -20°C para medição repetida da fluorescência subsequente.

[084]A fluorescência para cada concentração de oligonucleotídeo de referência foi obtida (vide Figura 1). Os dados foram então delineados como fluorescência (eixo Y) vs. oligonucleotídeo de referência presente em picomols (eixo X) (vide Figura 2), a curva de melhor ajuste foi gerada pela regressão linear dos quadrados mínimos e uma equação de curva padrão foi gerada. 11) Cálculos

[085]A partir da equação da curva padrão, calcula-se os equivalentes de picomol a 3 níveis de fluorescência fl,f2 f3 (isto é, escolhe-se 3 limiares), vide Figura 3.

[086]Da RT-PCR de amostra de teste/alvo obtém-se: - eficiência para gene de interesse (e) - ciclos (cl, c2, c3) para cada um dos 3 níveis de fluorescência (fl,f2,f3) - gera-se pmols de gene de interesse presente na amostra [DNA(pmol)i] correspondente aos fl,f2,f3 utilizando a equação de curva padrão.

[087]Calcula-se n (pmols de gene de interesse presente no começo da reação) de - DNA(pmol)i = ni x eci - isto é, ni = DNAi / eci

[088]Mede-se n para obter mols de gene de interesse presente na amostra.

[089]Corrige-se o RNA total presente em cada reação e expresso Ni como pmols/100 ng de RNA total. A multiplicação por número de Avogadro deve ser alternativamente expressa como replicadas/100 ng de RNA (vide Figura 4). EXEMPLO 4

[090]Assim, a Figura 1 apresenta a fluorescência para cada concentração de oligonucleotídeo de referência realizada em duplicata. Os dados delineados como fluorescência (eixo y) vs. oligonucleotídeo de referência presente expresso em pmol (eixo x) na Figura 2 permite o cálculo, pela regressão dos quadrados mínimos, da equação que define essa relação.

[091]A substituição de fl,f2,f3 (obtidos da delineação da fluorescência para cada gene de interesse vs. número de ciclos, vide Figura 3) na equação da curva padrão resulta em pmols calculados do gene de interesse (DNAi) presente nos ciclos cl,c2,c3. Os pmols do gene de interesse presentes no momento zero podem ser então calculados como acima e corrigidos para o RNA total e expressos como Replicadas após a multiplicação pelo número de Avogadro.

[092]A comparação dos oligonucleotídeos de referência que diferem em comprimentos como padrões para o cálculo de n. Três oligonucleotídeos que diferem em comprimento em 20 e 100 pares de base foram utilizados para gerar três curvas padrão, conforme descrito sob i) método de preparação de curva padrão. Então, cinco genes de interesse foram quantificados de maneira independente utilizando cada curva padrão por sua vez, conforme descrito em ii) cálculos. Os resultados obtidos para cada gene pelas três curvas foram comparados por ANOVA, a diferença significativa foi ajustada ao nível 0,05 (vide Figura 4). A expressão dos genes de interesse não diferiu significativamente entre os três grupos. Assim, as variações no comprimento de um oligonucleotídeo de referência até 100 pares de base não afetaram o cálculo do gene de interesse. Aplicação à situação experimental (vide Figura 5).

[093]Cinco genes de interesse foram medidos nos corações de ratos WKY em 3 grupos experimentais - Controle de tempo zero (barras abertas), Controle de excipiente (barras com traços finos) e tratamento seguinte com VIP (barras sólidas) utilizando o método descrito acima. Estabilidade e Reprodutibilidade de Curvas padrão

[094]Os tubos contendo diversas concentrações de oligonucleotídeo de referência e corante EvaGreen tiveram sua fluorescência medida após o congelamento e descongelamento repetidos ao longo de um período de três semanas. Os níveis de fluorescência foram estáveis para cada concentração. Assim, um padrão pode ser utilizado como o padrão de quantificação para um amplo número de execuções de rt-PCR contanto que o mesmo lote de corante tenha sido empregado e que a concentração de corante não tenha variado entre as execuções (vide Figura 6). EXEMPLO 5

[095]Os oligonucleotídeos de referência que variam em comprimento de 50 a 170 pares de base e em conteúdo de GC de 40 a 75% foram formulados a partir de diversas seções de CTGF, αActina e β Actina. Os oligonucleotídeos de referência foram preparados conforme descrito no Exemplo 2 e as curvas padrão preparadas conforme descrito no Exemplo 3. Os primers que geram os oligonucleotídeos de referência (50 a 170 bp) foram designados com base nas sequências publicadas por NCBI Genbank para mRNA de rato para CTGF (Acesso No AB023068) e mRNA de rato para αActina e β Actina (Acesso No NM_019183 e BC063166 respectivamente), Vide Tabela 2.

[096]Seis Genes de interesse (AT1a, Angiotensina, TGFβ, TNFa, NONO e CTGF) foram quantificados de maneira independente utilizando cada curva padrão por vez conforme descrito em ii) cálculos. Os resultados obtidos para cada gene pelas três curvas foram comparados por ANOVA. Tabela 2: Sequências de Primer utilizadas para PCR e Construção de Curvas padrão

[097]Os resultados são apresentados nas Figuras 7A-F e nas Figuras 8A-F. Nesses experimentos, a quantificação dos genes de interesse foi somente afetada (resultou em valores significativamente maiores de replicadas de gene de interesse) pelo oligonucleotídeo de referência tendo um comprimento de 50 bp e conteúdo de GC de 40%. Os oligonucleotídeos de referência de comprimento maior e conteúdo de GC maior, sem limitação aparente como para o limite superior do parâmetro, todos proveram quantificação precisa do gene de interesse. A partir desses experimentos pode ser concluído que o limite inferior do comprimento de um oligonucleotídeo de referência, útil no método da presente invenção, é 60 bp e o conteúdo de GC de 45%. Esses valores podem representar os limites inferiores da variação útil desses valores. Os limites superiores podem ser ajustados dependendo das exigências. Se um único oligonucleotídeo de referência universal tiver de ser utilizado, para conveniência, o comprimento pode ser ajustado a 100 bp e o conteúdo de GC a 50%. A partir dos dados aqui providos, qualquer comprimento e conteúdo de GC adequados alternativos para o oligonucleotídeo de referência também podem ser selecionados. EXEMPLO 6

[098]Cada um desses oligonucleotídeos de referência foi utilizado para, por sua vez, quantificar nove genes de interesse (angiotensinogênio, TNFα, TGFβ, CTGF, NONO MMP2, MMP9 e TIMP1), cujos produtos de gene variaram de 80 a 120 pares de base (Vide Tabela 3 para sequências de amplicon).

Tabela 3: Sequências de Amplicon para genes de interesse

[099]Os nove genes de interesse foram medidos nos corações de ratos SHR (n=6) em 4 grupos experimentais - Controle de tempo zero (barras abertas), Controle de excipiente (barras com traços finos) e tratamento seguinte com VIP (barras sólidas) e tratamento de enalapril (barras com traços finos cruzados), utilizando o método descrito acima.

[0100]Os resultados são apresentados nas Figuras 9A-C. Esses resultados demonstram a capacidade do método do oligonucleotídeo de referência quantificar precisamente a quantidade de produtos de ácido nucléico e assim elucidar precisamente as alterações na expressão do gene provocadas pelo tratamento de ratos hipertensos com compostos como VIP e enalapril. O método provê a sensibilidade para delinear estatisticamente diferenças significativas entre animais tratados e de controle, assim como a eficácia dos diferentes tratamentos em relação à regulamentação da expressão do gene por diferentes tratamentos. Considerando que estudos em animais particulares foram utilizados como um exemplo conveniente de como o método realiza em uma situação experimental particular, os mesmos princípios de quantificação e método são aplicáveis a qualquer situação na qual a quantificação precisa de produtos de ácido nucléico, não afetada por quaisquer alterações não desejáveis em genes de manutenção e similares, é necessária.

[0101]Experimentos semelhantes conduzidos utilizando corantes SYBR green I, SYBR green II, CYBR gold, Evagreen, oxazole yellow, thiazole orange, picogreen, TOTO e BEBO e os protocolos descritos acima produziram resultados semelhantes.

[0102]Será apreciado que o método ilustrado provê um método de quantificação de expressão dos produtos de gene melhorado sem a normalização a um gene de manutenção ou um gene sintético ou a necessidade de co-amplificar os genes de manutenção/sintético de referência com a sequência alvo.

[0103]Embora a invenção tenha sido descrita com referência aos exemplos específicos, será apreciado pelos técnicos no assunto que a invenção pode ser realizada em muitas outras formas.

Claims

1. MÉTODO PARA QUANTIFICAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLÉICOS, caracterizado por compreender: a) marcação de um oligonucleotídeo de referência que tem um comprimento predeterminado com um marcador detectável; b) geração de uma curva padrão utilizando diluições em série do oligonucleotídeo de referência marcado ao delinear a intensidade do marcador detectável em relação à concentração do oligonucleotídeo de referência marcado; c) amplificação de um ácido nucléico alvo na presença do marcador detectável que marca o ácido nucléico alvo amplificado, d) comparação em tempo real da intensidade do marcador detectável associado ao ácido nucléico alvo amplificado marcado com a curva padrão e a determinação da quantidade do ácido nucléico amplificado, em que o dito oligonucleotídeo de referência não é amplificado ou co- amplificado com o ácido nucléico alvo.

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo marcador detectável ser um corante.

3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo corante se ligar ao dsDNA.

4. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo corante ser um corante de intercalação.

5. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 4, caracterizado pelo corante ser um corante fluorescente.

6. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo corante fluorescente ser selecionado a partir de qualquer um dentre SYBR verde I, SYBR verde II, SYBR ouro, Evagreen, oxazol amarelo, tiazol laranja, picogreen, TOTO, BEBO ou Deep Purple.

7. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo oligonucleotídeo de referência ter um comprimento de cerca de 60 bp ou maior.

8. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo oligonucleotídeo de referência ter um conteúdo de GC de 45% ou maior.

9. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo oligonucleotídeo de referência ter um comprimento de 60 bp a 170 bp.

10. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 ou 9, caracterizado pelo oligonucleotídeo de referência ter um conteúdo de GC de 45% a 75%.

11. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo oligonucleotídeo de referência ter um comprimento de 100 bp e conteúdo de GC de 50%.

12. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo oligonucleotídeo de referência ser maior ou menor que o ácido nucléico alvo.

13. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pela amplificação do ácido nucléico alvo ser realizada pelo método de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR-Polymerase Chain Reaction).

14. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado por uma única curva padrão ser utilizada para múltiplas amplificações e quantificações de ácido nucléico alvo.

15. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelas múltiplas amplificações e quantificações de ácido nucléico alvo serem, cada uma, realizadas em momentos diferentes.

16. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 15, caracterizado pelo ácido nucléico alvo ser amplificado em 15 ciclos.

17. KIT UTILIZADO PELO MÉTODO, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado por compreender um ou mais oligonucleotídeos de referência e um corante fluorescente.

18. KIT, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por, se mais de um oligonucleotídeo de referência estiver presente, cada um ser de um comprimento diferente.

19. KIT UTILIZADO PELO MÉTODO, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por compreender um ou mais oligonucleotídeos de referência marcados com um marcador detectável.

20. KIT UTILIZADO PELO MÉTODO, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado por compreender diluições em série de um ou mais oligonucleotídeos de referência marcados com um marcador detectável.

21. KIT, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 20, caracterizado por pelo menos um oligonucleotídeo de referência ter 60 bp a 170 bp de comprimento com um conteúdo de GC de 45% a 75%.