KR20220018036A - 핵산 증폭 및/또는 검출을 위한 방법 및 시약 - Google Patents

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피터 제이. 언라우
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Abstract

본 발명은 핵산 분자의 증폭 및/또는 검출에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 핵산 분자의 민감한 증폭, 검출 및/또는 정량화에 관한 것이다.

Description

핵산 증폭 및/또는 검출을 위한 방법 및 시약
본 발명은 핵산 분자의 증폭 및/또는 검출에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 핵산 분자의 민감한 증폭, 검출 및/또는 정량화에 관한 것이다.
박테리아, 바이러스 및 진핵생물 기생충과 같은 병원성 미생물에 의해 유발되는 전염병은 전 세계적으로 가장 심각한 공중 보건 문제 중 하나이다. 따라서, 질병 진단 및 치료, 식품 안전 관리 및 환경 모니터링을 위한 성공적인 방법을 위해서는 감염원의 신속하고 구체적인 동정이 필요하다. 단순성과 저렴한 비용도 똑같이 중요하다. 예를 들어 고급 장비와 숙련된 인력에 의존하지 않는 방법은 COVID19, HIV, TB, 말라리아, 특정 유형의 인플루엔자 A 및 에볼라 바이러스 발병이 환자 치료, 환경, 경제적인 제약으로 인해 고급 진단 기술이 제한되거나 존재하지 않는 경우의 환경에서 사용될 수 있다1,2.
병원체 검출을 위한 전통적인 방법은 한천 플레이트에서 미생물을 배양한 후 표준 생화학적 동정을 수반하는데, 이는 저렴하고 간단하지만 힘들고 시간이 많이 소요된다3. 그들은 종종 예비 동정에 2~3일 및 병원체 동정 확인에 1주일 이상이 필요하므로 효과적인 진단이 느려진다4,5. 이 지연은 이환율과 사망률에 큰 영향을 미친다. 잘못 진단된 치료법은 심각한 감염에 대한 생존을 5배 감소시키는 것으로 나타났다6. 또한, 이러한 방법은 낮은 민감도로 인해 제한될 수 있다7,8. 또한, 배양 방법은 배양 시에 성장할 수 있는 유기체만 동정할 수 있으며, 생존 가능하지만 배양-음성인 병원체는 검출할 수 없다6,4. 그러나, 이들은 분자 핵산 검출 방법을 사용하여 동정할 수 있다.
병원체 검출을 포함하는 다양한 응용분야에서는 바이오마커로서 핵산을 광범위하게 사용하고 있다5,1,4. 다목적 기능과 광범위한 용도로 인해 복잡한 생물학적 샘플에서 극소량의 핵산을 검출하기 위한 여러 방법이 개발되었다4. 많은 살아있는 병원체가 증폭을 위한 더 큰 초기 주형 농도를 제공할 뿐만 아니라 일부 유명 바이러스 병원체(홍역 바이러스, 인플루엔자 및 HIV)내 유전 정보의 유일한 소스인 RNA의 여러 복사본(리보솜 RNA의 경우, 수천)을 가지고 있기 때문에 RNA와 DNA 사이에서, RNA 검출은 특히 중요하다. 핵산 검사(NAT)는 기존의 방법보다 빠르고 본질적으로 더 구체적이고 민감하다. 또한, 배양하지 않고 임상 검체에서 직접 미생물을 동정할 수 있어 검출 시간을 획기적으로 단축할 수 있다. 신속한 병원체 검출은 입원 기간 단축, 환자 치료 개선, 지역사회 발병 및 전 세계적인 전염병 예방으로 이어진다.
NAT의 목표는 임상 샘플에서 특정 핵산 서열을 동정하고 잠재적으로 정량화하는 것이다. 이 기술은 전통적으로 핵산 분리, 증폭 및 검출의 3단계로 이루어졌다. 그러나, 증폭 산물을 실시간으로 정량화할 수 있게 하는 형광 DNA 프로브 및 삽입 염료의 출현으로 인해, 이제 증폭 및 검출을 한 단계로 결합할 수 있어 검출 시간을 상당히 단축할 수 있다.
폴리머라제 연쇄반응(PCR)은 최초의 것으로, 낮은 존재비의 핵산을 증폭하고 검출하기 위한 가장 대중적인 증폭 기술로 남아 있다. 거의 30년 전에 발명되었으며9, 단일 박테리아 병원체에 해당하는 특정 표적 DNA 서열을 검출할 수 있다10,11. PCR 증폭 산물은 인터칼레이팅(intercalating) 형광 염료로 염색된 전기영동 젤로 시각화될 수 있다. PCR 변형에는 다중 PCR(mPCR) 및 실시간 또는 정량적 PCR(qPCR)이 포함된다. 다중 PCR은 여러 프라이머 세트로 여러 표적을 동시에 증폭하기 때문에 단순 PCR에 비해 더 빠른 검출을 제공한다. 프라이머 설계와 농도는 프라이머 이합체화를 피하고 신뢰할 수 있는 PCR 산물을 생산하는 데 특히 중요하다. 이에 비해 qPCR은 검출을 위해 겔 전기영동을 필요로 하지 않지만, 인터칼레이팅 염료(예를 들어, SYBR Green) 이중 표지 프로브(Taqman) 또는 분자 비콘(beacon)에 의해 생성된 형광을 측정하여 산물 형성을 지속적으로 모니터링한다12. RNA 게놈을 갖는 병원체의 경우, RT-PCR이 사용되며, 이는 RNA를 주형으로 사용하여 cDNA를 생성하고, 이는 차례로 PCR에 의해 증폭된다13. 매우 민감하고 특이적이지만, 다양한 PCR 방법은 핵산 prep에 존재하는 PCR 억제제의 영향을 받고, 열순환 장비 및 형광 프로브가 필요하기 때문에 비용이 많이 들고, 시간이 많이 걸린다4.
핵산의 등온 증폭(INA)은 PCR의 대안으로서, 열순환이 필요 없이 일정한 온도에서 증폭이 이루어지기 때문에 덜 복잡하고 덜 비싸다14,15. INA 방법은 수조 또는 이에 상응하는 고정 온도 가열 장치와 같은 광범위한 조건에서 수행할 수 있으며, 세포 내부 또는 세포 표면에서 PCR을 수행할 수 있다14. INA 반응은 반응 역학에 기반하여 기하급수적(예를 들어, 핵산서열기반 증폭(NASBA)16, 롤링-써클 증폭(RCA: rolling circle amplification)14, 루프 매개 등온 증폭(LAMP)17, 재조합효소 폴리머라제 증폭(RPA)18, 헬리카제 의존 증폭(HDA: helicase dependent amplification)19), 닉킹 효소 증폭(NEAR: nicking enzyme amplification)35, 가닥 변위 증폭(SDA)36 또는 선형 및 캐스케이드 증폭 방법으로 분류될 수 있다. qPCR과 마찬가지로 INA 반응은 반응이 진행되는 동안 분석할 수 있으므로 반응 시간을 단축할 수 있지만, 기기 측면에서 더 복잡해진다.
NASBA16은 41℃에서 등온적으로 RNA 산물을 증폭하기 위해 3개의 효소를 사용한다. 먼저, T7 프로모터를 포함하는 프라이머가 표적 RNA에 혼성화되고, 역전사효소(RT)에 의해 연장된다. 그런 다음 RNase H는 혼성화된 RNA를 분해하여 무표지(bare) cDNA를 남긴다. 다음으로, 제2 프라이머가 cDNA에 혼성화되고 RT에 의해 초기 혼성화 프라이머의 끝까지 연장되어, T7 프로모터를 포함하는 dsDNA를 생성한다. 그런 다음 T7 RNA 폴리머라제는 원래 어닐링된 프라이머가 사용된 영역 사이에서 암호화된 RNA를 전사한다. RNA의 여러 복사본이 만들어짐에 따라, 프리 프라이머는 계속해서 혼성화되고 확장되며, 더 많은 주형을 생성할 수 있다. 그 결과 DNA 주형과 RNA 산물이 기하급수적으로 증폭된다.
롤링 서클 증폭(RCA)14은 긴 RNA/DNA 산물을 생성하기 위해 원형 DNA 주형을 사용하는 DNA 또는 RNA 폴리머라제를 포함한다. 원형 주형은 전형적으로 폴리머라제 프로모터, 혼성화 부위, 및 리포터 역할을 할 수 있는 산물의 주형(일반적으로 분자 비콘과 같은 혼성화-기반 리포터의 표적 부위)을 포함한다. 산물의 단일 복사본을 생성하는 선형 표적을 사용한 전사와 달리, 폴리머라제는 많은 복사본을 생성하는 원형 주형의 완전한 원을 완성할 수 있다. 기하급수적 증폭 방법은 표적 서열에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드 혼성화, 닫힌 원형 주형을 형성하기 위한 이들의 결찰, 및 선형 주형 하이브리드화를 위한 새로운 주형으로 작용할 수 있는 표적 서열의 여러 복사본을 포함하는 새로 생성된 산물인 폴리머라제에 의한 다중 복사본 생산을 포함한다.
루프 매개 등온 증폭(LAMP)17은 60~65℃에서 등온적으로 여러 혼합 종의 DNA 산물을 등온적으로 생성하기 위해 DNA 폴리머라제를 치환하는 가닥이 있는 프라이머의 2개 또는 3개 세트를 사용한다. 이 방법은 이미 확장된 DNA 산물에 프라이머의 혼성화를 허용하는 단일-가닥 루프 영역을 포함하는 DNA 산물을 생산하는 데 의존한다. 역전사효소를 첨가하면 RNA 샘플을 검출할 수 있다.
재조합 폴리머라제 증폭(RPA)18은 3가지 효소에 의존하며, 37℃에서 등온적으로 DNA 산물을 증폭하여 많은 DNA 복사본을 생성할 수 있다. 처음에, 재조합효소 단백질은 프라이머 가닥이 DNA 주형에 혼성화하도록 안내한다. 단일-가닥 결합 단백질(SSB)은 변위되는 DNA 이중체의 가닥에 결합하고 추가로 변위된다. 다음으로, DNA 폴리머라제는 프라이머를 확장하여 새로운 이중체를 형성한다. 반대 가닥에서 동일한 반응이 일어나서, DNA 분자가 완전히 복제된다. 이러한 단계는 기하급수적 증폭을 위해 주기적으로 계속된다. RPA는 여러 표적을 동시에 검출하기 위해 LAMP와 다중화되었다20.
헬리카제 의존 증폭(HDA)19은 DNA 헬리카제의 사용이 필요한 등온 증폭 방법이다. 본질적으로, 이 시스템은 가닥의 용융, 프라이머의 어닐링 및 폴리머라제에 의한 확장에 의존한다는 점에서 PCR과 유사하게 기능한다. PCR은 증폭 과정을 돕기 위해 온도 변화가 필요하지만, HDA는 효소 처리에 의존한다. 첫째, DNA 헬리카제는 두 가닥의 DNA 복합체를 용융시킨다. 둘째, 프라이머는 표적 DNA에 혼성화할 수 있다. 셋째, 가닥 변위 DNA 폴리머라제가 프라이머를 확장하여 새로운 DNA 이중체를 완성한다. 이 과정은 37℃에서 기하급수적 증폭에 대해 반복된다.
니킹 효소 증폭(NEAR)35 및 가닥 변위 증폭(SDA)36은 가닥 변위 DNA 폴리머라제(Bst DNA 폴리머라제, Large Fragment 또는 Klenow Fragment(3'-5' 엑소-) 및 니킹 효소를 사용하여 일정한 온도(55℃~59℃)에서 DNA를 증폭하는 등온 방법이다. 프라이머 내에 포함된 한 부위에 가닥-한정된 제한 엔도뉴클레아제에 의해 닉이 생성된다. 각 폴리머라제 변위 단계에서 닉(nick)이 생성되어, 기하급수적 증폭이 발생한다.
매우 낮은 농도의 핵산을 증폭하는 것은 어려운 문제이며, 수반되는 증폭 인공물이 없는 경우 RNA 주형을 등온적으로 증폭하는 것이 어렵다는 것이 얼마 동안 알려져 왔다15. 이 문제를 해결하기 위한 한 가지 시도는 SHERLOCK 접근 방식을 사용하는 것이며, 여기에서 RPA 기반 증폭의 산물이 CRISPR-매개 절단 메커니즘을 사용하여 원하는 앰플리콘(amplicon)에 대해 스크리닝되어 형광 태그된 리포터 작제물이 특이적으로 절단된다21,22. 감도를 높이고 SNP 기반 특이성을 활성화하는 동안, 추가 효소 단계와 형광 리포터에 대한 요건은 RNA 검출에 상당한 복잡성을 추가한다.
SHERLOCK 및 DETECTR23,21은 T7 프로모터 및 가이드 RNA 카세트 서열을 포함하는 프라이머 세트를 사용하여 표적을 증폭하기 위해 초기 등온 증폭 시스템(RPA)을 사용한다. RPA의 산물은 T7 RNA 폴리머라제를 사용하여 전사되어, 가이드 RNA의 여러 복사본이 생성된다. 그런 다음, 가이드 RNA는 RNA 종을 검출하도록 Cas13a 단백질을 안내하여, RNA 종의 비특이적 분해에 대해 Cas13a를 활성화하며, 이 경우 RNA 분자 비콘이 분해되고 형광 신호(SHERLOCK)가 방출된다. 대안적으로, 가이드 RNA는 RNA 분자를 표적화하도록 Cas12a를 안내하여, DNA 분자 비콘의 비특이적 절단을 위한 효소를 활성화하여 형광(DETECTR)이 생성될 수도 있다. 이러한 기술은 초기 RPA 반응에서 역전사효소를 추가하여 RNA 종을 검출하도록 조정될 수 있다. 전체적으로 이러한 시스템에는 DNA 검출을 위한 5개의 효소와 리포터 및 RNA 종의 검출을 위한 추가 효소가 필요하다.
형광원성(fluorogenic) RNA 압타머와 같은 RNA 태그를 사용하여 관심 RNA를 표지할 수 있다. 결합 시 형광을 생성하는 형광원성 화합물에 대한 RNA 압타머는 형광원성 압타머 시스템(FE)의 형광 향상과 압타머-형광단 상호작용의 K D 를 모두 최적화하기 위해 시험관 내 선택을 사용하여 선택될 수 있다24,25. 두 매개변수를 모두 최대화하면, 형광원성 압타머에 MS2-형광 단백질 모집 유형 시스템보다 더 높은 고유 대비를 제공한다26,27,28. 형광단 리간드가 저렴하고 RNA 형광원성 압타머가 전사에 의해 제조될 수 있기 때문에 형광원성 압타머는 잠재적으로 리포터로서 많은 고유 이점을 제공한다.
RNA 망고 압타머 시리즈는 매우 높은 대비(contrast)를 가지므로 시험관 내 형광 리포터에 유용하다. 이 압타머는 RNA 망고 압타머에 결합할 때 최대 4,000배 더 밝아질 수 있는 티아졸 오렌지-기반 리간드(TO1-비오틴)에 대한 나노몰 결합 친화도를 가지고 있다29,30,31. 특히, 2세대 RNA 망고 압타머(망고 II, III, 및 IV)는 마그네슘 이온 농도에 대한 내성이 매우 강하며, 이는 전형적으로 시험관 내 분석에서 발견되며, 1가 금속 이온 농도 범위에서 작동한다30. 망고 III도 최근 구조 유도 조작으로 개선되어 더욱 밝아졌다32.
발명의 개요
본 발명은 핵산 분자의 증폭 및/또는 검출에 관한 것이다.
한 양태에서, 본 발명은 표적 핵산 서열의 적어도 일부에 혼성화할 수 있는 제1 핵산 서열, 또는 그의 역-보체; 및 표적 핵산 서열의 적어도 일부에 혼성화할 수 있는 제2 핵산 서열, 또는 그의 역-보체를 포함하고 압타머-암호화 주형 서열을 추가로 포함하는 핵산 분자 또는 그의 유사체를 제공하며, 여기서 압타머-암호화 주형 서열은 제1 핵산 서열의 3' 말단에 위치하며, 상기 제2 핵산 서열의 5' 말단은 제1 핵산 서열의 3' 말단에 공유적으로 부착되며, 상기 제2 핵산 서열의 3' 말단은 제1 핵산 서열에 실질적으로 혼성화되지 않는다.
일부 실시형태에서, 제2 핵산 서열의 3' 말단의 적어도 3개의 말단 뉴클레오타이드는 제1 핵산 서열에 혼성화하지 않는다.
일부 실시형태에서, 제1 핵산 서열은 길이가 약 20 내지 약 100개의 뉴클레오타이드일 수 있다.
일부 실시형태에서, 압타머-암호화 주형 서열은 형광원성 압타머 서열을 암호화할 수 있다.
일부 실시형태에서, 형광원성 압타머 서열은 약 0.01 nM 내지 약 100 nM의 형광단 결합 해리 상수(KD)를 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 핵산 분자는 말단 줄기 구조를 포함할 수 있으며, 여기서 제2 핵산 서열의 5' 말단의 적어도 말단 뉴클레오타이드는 말단 줄기 구조의 적어도 일부를 형성하는 제1 핵산의 5' 말단의 적어도 말단 뉴클레오타이드에 상보적일 수 있다.
일부 실시형태에서, 제2 핵산 서열의 5' 말단의 적어도 2개 또는 3개의 말단 뉴클레오타이드는 말단 줄기 구조의 적어도 일부를 형성하는 제1 핵산의 5' 말단의 적어도 2개 또는 3개의 말단 뉴클레오타이드에 상보적일 수 있다.
일부 실시형태에서, 핵산 분자, 또는 그의 유사체는 DNA-기반 또는 RNA-기반일 수 있다.
일부 실시형태에서, 제2 핵산 서열은 디제너레이트(degenerate) 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 핵산 분자는 RNA 폴리머라제 프로모터 서열을 포함하지 않는다.
일부 실시형태에서, 표적 핵산 서열은 바이러스, 미생물, 진균, 동물 또는 식물 유래일 수 있거나, 합성 작제물일 수 있다.
일부 실시형태에서, 표적 핵산 서열은 병원성 바이러스 또는 병원성 박테리아로부터 유래할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 제1 핵산 분자를 포함하는 조성물을 제공한다.
일부 실시형태에서, 조성물은 표적 핵산 서열의 적어도 일부에 혼성화할 수 있고 제1 RNA 폴리머라제 프로모터 서열을 포함하는 제2 핵산 분자, 또는 그의 역-보체를 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 제1 및 제2 핵산 분자는 표적 핵산 서열의 제1 서열을 증폭할 수 있는 제1 프라이머 쌍을 형성한다.
일부 실시형태에서, 제1 핵산 분자의 3' 말단은 제2 핵산 분자 또는 그 자체에 실질적으로 혼성화하지 않을 수 있다.
일부 실시형태에서, 제1 및 제2 핵산 분자는 서로 실질적으로 혼성화하지 않을 수 있다.
일부 실시형태에서, 제1 핵산 분자의 3' 말단의 1, 2 또는 3개의 말단 염기는 제2 핵산 분자의 3' 말단의 1, 2 또는 3개의 말단 염기에 혼성화할 수 있다.
일부 실시형태에서, 제1 핵산 분자의 3' 말단은 표적 핵산의 서열과 정렬될 때 제2 핵산 분자의 3' 말단과 인접할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물은 제3 핵산 분자 및 제4 핵산 분자를 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 제3 및 제4 핵산 분자는 표적 핵산 분자의 제2 서열을 증폭할 수 있는 제2 프라이머 쌍을 형성하며, 제3 핵산 분자 또는 제4 핵산 분자는 제2 RNA 폴리머라제 프로모터 서열을 포함할 수 있고, 제2 프라이머 쌍은 제1 프라이머 쌍 외부의 위치에서 표적 핵산 분자에 혼성화할 수 있으며, 제1 서열 및 제2 서열을 증폭할 수 있다.
일부 실시형태에서, 제2 RNA 폴리머라제 프로모터 서열은 표적 핵산 분자의 제2 서열을 제2 핵산 분자의 방향과 반대 방향으로 전사할 수 있다.
일부 실시형태에서, 제3 핵산 분자가 제2 RNA 폴리머라제 프로모터 서열을 포함하는 경우, 제4 핵산 분자는 제2 압타머-암호화 서열을 포함하며, 또는 제4 핵산 분자가 제2 RNA 폴리머라제 프로모터 서열을 포함하는 경우, 제3 핵산 분자는 제2 압타머-암호화 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 제3 핵산 분자의 3' 말단은 제4 핵산 분자에 실질적으로 혼성화되지 않을 수 있다.
일부 실시형태에서, 제3 및 제4 핵산 분자는 서로 실질적으로 혼성화하지 않을 수 있다.
일부 실시형태에서, 제1, 제2, 제3 및 제4 핵산 분자의 3' 말단은 서로 실질적으로 혼성화하지 않을 수 있다.
일부 실시형태에서, 제1, 제2, 제3 및 제4 핵산 분자는 서로 실질적으로 혼성화하지 않을 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물은 제5 핵산 분자 및 제6 핵산 분자를 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 제5 및 제6 핵산 분자는 표적 핵산 분자의 제3 서열을 증폭할 수 있는 제3 프라이머 쌍을 형성할 수 있으며, 여기서 제5 핵산 분자 또는 제6 핵산 분자는 제3 RNA 폴리머라제 프로모터 서열을 포함할 수 있으며, 여기서 제3 프라이머 쌍은 제1 및 제2 프라이머 쌍의 외부 위치에서 표적 핵산 분자에 혼성화할 수 있으며, 제1, 제2 및 제3 서열을 증폭할 수 있다.
일부 실시형태에서, 제3 RNA 폴리머라제 프로모터 서열은 표적 핵산 분자의 제3 서열을 제2 핵산 분자와 동일한 방향으로 전사할 수 있다.
일부 실시형태에서, 제5 핵산 분자가 제3 RNA 폴리머라제 프로모터 서열을 포함하는 경우, 제4 핵산 분자는 제3 압타머-암호화 서열을 포함하며, 또는 제4 핵산 분자가 제3 RNA 폴리머라제 프로모터 서열을 포함하는 경우, 제5 핵산 분자는 제3 압타머-암호화 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 제5 핵산 분자의 3' 말단은 제4 핵산 분자의 3' 말단에 실질적으로 혼성화하지 않을 수 있다.
일부 실시형태에서, 제5 및 제4 핵산 분자는 서로 실질적으로 혼성화하지 않을 수 있다.
일부 실시형태에서, 제1, 제2, 제3, 제4, 제5 및 제6 핵산 분자의 3' 말단은 서로 실질적으로 혼성화하지 않을 수 있다.
일부 실시형태에서, 제1, 제2, 제3, 제4, 제5 및 제6 핵산 분자는 서로 실질적으로 혼성화하지 않을 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물은 표 3에 기재된 서열을 포함하는 하나 이상의 핵산 분자를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 핵산 분자 중 하나 이상이 예비 혼합될 수 있다.
일부 실시형태에서, 핵산 분자 중 하나 이상이 액체로 제공될 수 있다.
일부 실시형태에서, 핵산 분자 중 하나 이상이 동결 건조될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 표적 핵산 서열의 증폭을 위한 지침서와 함께 본원에 기재된 바와 같은 핵산 분자 또는 조성물 중 하나 이상을 포함하는 키트를 제공한다.
일부 실시형태에서, 증폭은 등온 증폭, 예컨대 핵산 서열 기반 증폭, 롤링 서클 증폭, 루프 매개 등온 증폭, 헬리카제 의존 증폭, 또는 가닥 변위 증폭일 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 표적 핵산 분자를 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 제공하는 단계; 본원에 기재된 바와 같은 제1 핵산 분자를 제공하는 단계; 표적 핵산 서열 또는 이의 상보체의 적어도 일부에 혼성화할 수 있고 제1 RNA 폴리머라제 프로모터 서열을 포함하는 제2 핵산 분자를 제공하는 단계로서, 여기서 제1 및 제2 핵산 분자는 표적 핵산 서열의 제1 서열을 증폭할 수 있는 제1 프라이머 쌍을 형성하는 단계; 및 표적 핵산 분자 및 제1 프라이머 쌍을 포함하는 제1 증폭 반응을 수행하여 제1 증폭 산물을 수득하는 단계로서, 여기서 제1 증폭 산물이 표적 핵산 서열의 제1 서열을 포함하는 단계를 포함하는, 표적 핵산 서열의 증폭 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 제1 핵산 분자의 3' 말단은 제2 핵산 분자의 3' 말단에 실질적으로 혼성화하지 않을 수 있다.
일부 실시형태에서, 제1 및 제2 핵산 분자는 서로 실질적으로 혼성화하지 않을 수 있다.
일부 실시형태에서, 제1 핵산 분자의 3' 말단의 1, 2 또는 3개의 말단 염기는 제2 핵산 분자의 3' 말단의 1, 2 또는 3개의 말단 염기에 혼성화할 수 있다.
일부 실시형태에서, 제1 핵산 분자의 3' 말단은 표적 핵산의 서열과 정렬될 때 제2 핵산 분자의 3' 말단과 인접할 수 있다.
일부 실시형태에서, 상기 방법은 제3 핵산 분자 및 제4 핵산 분자를 제공하는 단계로서, 여기서 제3 및 제4 핵산 분자가 표적 핵산 분자의 제2 서열을 증폭할 수 있는 제2 프라이머 쌍을 형성하고, 상기 제3 핵산 분자 또는 제4 핵산 분자가 제2 RNA 폴리머라제 프로모터 서열을 포함하고, 제2 프라이머 쌍이 제1 프라이머 쌍의 외부 위치에서 표적 핵산 분자에 혼성화할 수 있고 표적 핵산 분자의 제1 서열 및 제2 서열을 증폭할 수 있는 단계; 및 제1 증폭 산물 및 제2 프라이머 쌍을 포함하는 제2 증폭 반응을 수행하여 제2 증폭 산물을 수득하는 단계로서, 여기서 제2 증폭 반응이 제1 증폭 반응 전에 수행될 수 있고, 제2 증폭 산물이 표적 핵산 분자의 제1 서열 및 제2 서열을 포함할 수 있는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 제2 RNA 폴리머라제 프로모터 서열은 표적 핵산 분자의 제2 서열을 제2 핵산 분자의 방향과 반대 방향으로 전사할 수 있다.
일부 실시형태에서, 제3 핵산 분자가 제2 RNA 폴리머라제 프로모터 서열을 포함하는 경우, 제4 핵산 분자는 제2 압타머-암호화 서열을 포함하며, 또는 제4 핵산 분자가 제2 RNA 폴리머라제 프로모터 서열을 포함하는 경우, 제3 핵산 분자는 제2 압타머-암호화 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 제3 핵산 분자의 3' 말단은 제4 핵산 분자의 3' 말단에 실질적으로 혼성화하지 않을 수 있다.
일부 실시형태에서, 제3 및 제4 핵산 분자는 서로 실질적으로 혼성화하지 않을 수 있다.
일부 실시형태에서, 제1, 제2, 제3 및 제4 핵산 분자의 3' 말단은 서로 실질적으로 혼성화하지 않을 수 있다.
일부 실시형태에서, 제1, 제2, 제3 및 제4 핵산 분자는 서로 실질적으로 혼성화하지 않을 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같은 방법은 표적 핵산 서열을 검출하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 표적 핵산 서열을 정량화하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 증폭은 등온 증폭, 예컨대 핵산 서열 기반 증폭, 롤링 서클 증폭, 루프 매개 등온 증폭, 헬리카제 의존 증폭, 가닥 변위 증폭, 또는 이들의 조합일 수 있다.
일부 실시형태에서, 증폭은 RNA 기반 또는 DNA 기반일 수 있다.
일부 실시형태에서, 증폭은 다중화될 수 있다.
일부 실시형태에서, 증폭은 적어도 2개의 컬러 이미징을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 증폭은 적어도 3개의 컬러 이미징을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 샘플은 바이러스, 미생물, 진균, 동물, 식물 또는 환경 유래일 수 있다.
일부 실시형태에서, 샘플은 코로나바이러스(예를 들어, SARS, MERS 또는 SARS-CoV-2)와 같은 병원성 바이러스 또는 병원성 박테리아로부터 유래할 수 있다.
일부 실시형태에서, 샘플은 물, 토양, 타액, 대변, 소변, 혈액, 기관 흡인물 또는 비강 흡인물로부터 수득될 수 있다.
일부 실시형태에서, 동물은 인간일 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 핵산 분자를 포함하는 샘플을 제공하는 단계; 및 등온 핵산 증폭(INA)에 의해 핵산 분자를 증폭하는 단계에 의한 표적 핵산 분자의 검출 방법을 제공하며, 여기서 증폭은 네스팅된(nested) 올리고뉴클레오타이드 프라이머 쌍의 사용을 포함한다.
일부 실시형태에서, 네스팅된 올리고뉴클레오타이드 프라이머 쌍은 형광원성 압타머 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 검출은 매우 민감할 수 있다.
대안적인 양태에서, 본 발명은 네스팅된 올리고뉴클레오타이드 프라이머 쌍을 포함하는 키트를 제공하며, 여기서 네스팅된 올리고뉴클레오타이드 프라이머 쌍은 등온 핵산 증폭 방법에 사용하기 위한 지침서와 함께 형광원성 압타머 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 이러한 개요는 반드시 본 발명의 모든 특징을 설명하는 것은 아니다.
본 발명의 이들 및 다른 특징은 첨부된 도면을 참조하는 하기 설명으로부터 더욱 명백해질 것이며, 여기서:
도 1은 RNA 생성 등온 증폭 시스템 내로의 RNA 형광원성 압타머의 삽입을 나타낸다. A. 전통적인 NASBA는 RNA 산물을 생산하기 위해 2개의 프라이머를 사용한다. 인공물도 일반적으로 생산된다(흑색 및 회색 산물). B. 형광원성 압타머-NASBA 시스템은 T7 전사 후 형광의 형광원성 압타머 태그를 포함하는 RNA 산물을 생산하는 상단 가닥(PB) 프라이머에 형광원성 압타머 주형 서열을 추가하는 것이 특징이다. C. 네스팅된 형광원성 압타머-NASBA는 외부 프라이머 NASBA 반응을 특징으로 하며, 이후 이 반응의 산물은 희석되어 내부 형광원성 압타머-NASBA 반응으로 공급된다(여기에는 망고 압타머를 사용하여 표시되지만 이들로 한정되지 않음).
도 2는 네스팅된-형광원성 압타머 NASBA가 표적 RNA 서열에 민감하고 특이적이며, 관련 없는 핵산 배경이 추가된 경우에도 강건함을 나타낸다. A. 네스팅되지 않은 외부(에스케리치아 콜리(E. coli) ClpB RNA) 및 B. 내부 네스팅되지 않은 형광원성 압타머 NASBA(슈도모나스 플루오레센스(P. fluorescence) ClpB RNA) 반응. C. 네스팅된 RNA 형광원성 압타머 NASBA는 민감도를 극적으로 향상시킨다. 에스케리치아 콜리 표적이 있는 에스케리치아 콜리 프라이머(Ec/Ec 왼쪽 회색 막대 세트). 동일한 에스케리치아 콜리 프라이머를 사용하여 에스케리치아 콜리 표적 대신에 슈도모나스 플루오레센스 표적(암회색 막대의 Ec/Pf 중간 세트)을 추가했다. 슈도모나스 플루오레센스 표적이 있는 슈도모나스 플루오레센스 프라이머(가장 밝은 회색 막대의 Pf/Pf 오른쪽 세트). D. 에스케리치아 콜리 프라이머를 사용한 네스팅된-형광원성 압타머 NASBA는 도시된 내부 NASBA 시간 경과로 수행되었다. 흑색 - 주형이 추가되지 않음, 최상단의 연회색 - 150 에스케리치아 콜리 표적 분자/μL 반응, 하단의 연회색 - 5 ng/μL의 A549 인간 폐 암종 총 핵산, 회색 - 5 ng/μL의 A549 인간 폐 암종 총 핵산의 존재 하의 150 에스케리치아 콜리 표적 분자/μL. 오차 막대는 모든 패널에 대한 3회 반복의 표준 편차를 반영한다.
도 3은 네스팅(nesting) NASBA 프라이머가 특이성을 얼마나 증가시키는 지를 보여주는 개략도를 나타낸다. A: 네스팅된 PCR(왼쪽)은 제1 외부 프라이머 쌍 내에서 혼성화하는 제2 내부 프라이머 세트의 요건으로 인해 특이성이 더 높아진다. 네스팅된 등온 반응(오른쪽)은 표적에 대한 특이성을 향상시킬 수 있다. B: 네스팅된 형광원성 압타머 NASBA의 과정의 개략도.
도 4는 네스팅되지 않은 외부 형광원성 압타머 NASBA 형광 출현이 상대적으로 둔감함을 보여준다. A. 외부 형광원성 압타머 NASBA의 개략도; B. 에스케리치아 콜리 표적이 있는 네스팅되지 않은 에스케리치아 콜리 외부 형광원성 압타머 NASBA 프라이머(Ec O/Ec); Ec O/Ec에 대한 점선(40분 시점)의 값을 취하여 도 2a와 같이 플로팅했다.
도 5는 슈도모나스 플루오레센스와 함께 네스팅되지 않은 내부 형광원성 압타머 NASBA 형광 출현이 또한 상대적으로 둔감함을 보여준다. A. 내부 형광원성 압타머 NASBA의 개략도. B. 슈도모나스 플루오레센스 내부 표적이 있는 슈도모나스 플루오레센스 내부 형광원성 압타머 NASBA 프라이머(Pf/Pf/내부). Ec O/Ec에 대한 점선(40분 시점)의 값을 취해 도 2b와 같이 플로팅했다.
도 6은 네스팅된 형광원성 압타머 NASBA 형광이 민감하고 특이적임을 나타낸다. 에스케리치아 콜리 ClpB RNA 표적이 있는 에스케리치아 콜리 프라이머(Ec/Ec 표 제목). 동일한 에스케리치아 콜리 프라이머를 사용하여, 에스케리치아 콜리 표적 대신 슈도모나스 플루오레센스 표적이 추가되었다(Ec/Pf 표 제목). 슈도모나스 플루오레센스 표적이 있는 슈도모나스 플루오레센스 프라이머(Pf/Pf 표 제목). 모든 흔적은 관련된 내부 형광원성 압타머 NASBA 반응의 시간 의존도를 보여준다. 주형 농도는 관련 외부 반응의 RNA 분자/μl로 지정된다. 표시된 점선(100분 시점)의 값을 취해 도 2c와 같이 플로팅했다.
도 7은 네스팅된 형광원성 압타머 NASBA를 사용한 MCF7 인간 조직 배양 배지에서 에스케리치아 콜리 RNA 검출을 보여준다. 인간 조직 배양에서 추출한 에스케리치아 콜리 세포 추출물의 희석 시리즈의 네스팅된 형광원성 압타머 NASBA. 고갈된 배지(0 ng) 및 27 nM 최종 ClpB 짧은 표적 에스케리치아 콜리(PC)로부터의 핵산 추출을 각각 음성 및 양성 대조군으로 사용하였다. 20 μL 반응 당 에스케리치아 콜리 세포 추출물의 나노그램(Nanodrop에 의해 결정됨) 양이 표시된다. 20 μL 반응에서 예상되는 총 박테리아 세포 수는 괄호 안에 표시된다.
도 8은 형광원성 압타머 네스팅되지 않은 NASBA가 프라이머 농도와 무관하게 낮은 농도의 주형에서 비특이적 생성물을 생성함을 보여준다. A. Ec 외부 형광원성 압타머 NASBA 반응을 2시간 동안 수행하고, 샘플을 변성시키고 8% PAGE로 실행한 후 완충액에서 TO1-비오틴으로 염색했다. 에스케리치아 콜리 ClpB 표적 농도가 250 nM에서의 프라이머로 표시된다. B. 형광원성 압타머 NASBA에서 Ec 외부 프라이머 세트의 연속 희석은 비특이적 산물이 프라이머 농도에 크게 의존하지 않고 광범위한 프라이머 농도에서 발생함을 보여준다. 프라이머 농도: 125 nM, 25 nM, 5 nM, 1 nM, 0 M. 각각 밝거나 어두운 흔적에 대응하여 25 pM 에스케리치아 콜리 ClpB 표적이 추가되거나 추가되지 않았다(예/아니오 표적).
도 9는 네스팅되지 않은 NASBA와 대조적으로 네스팅된 형광원성 압타머 NASBA에서 예상되는 RNA 크기의 산물만이 형광성을 띤다는 것을 보여준다. A. 네스팅된 형광원성 압타머 NASBA(40분)에서 외부 NASBA 반응의 산물이 8% 변성 PAGE에 로딩된 다음, SYBR Safe로 염색되었으며; 도 S5에 도시된 내부 NASBA 샘플은 배양 240분 후에 수집되었으며, 변성된 다음 2개의 8% PAGE 겔로 실행된 다음 완충액에서 TO1-비오틴(B) 또는 SYBR Safe(C)로 염색되었다.
도 10은 에스케리치아 콜리(SEQ ID NO: 1) 및 슈도모나스 플루오레센스(SEQ ID NO: 2)로부터의 ClpB 단표적(Short Targets)의 정렬을 보여준다. 에스케리치아 콜리 프라이머 혼성화 부위, 슈도모나스 플루오레센스 혼성화 부위. 프라이머 넘버링은 표 1에 개시된 것과 일치한다.
도 11은 형광원성 압타머 주형 롤링 서클 증폭을 사용한 핵산 검출에 대한 개략도를 보여준다. A. 2단계 결찰-롤링 서클 증폭(RCA) 방법을 사용하여 RNA와 DNA가 간단하고 등온적으로 검출될 수 있다. 주형은 표적에 혼성화할 수 있으며, 원형 주형으로 결찰된다. B. 이 주형은 이제 전사에 의해 RNA 형광원성 압타머를 대량 생산할 수 있다. C. 설명된 대로 생성된 RNA는 추가 네스팅된 결찰에 사용할 수 있는 추가 표적 부위를 생성하여, 이 반응을 기하급수적 증폭 과정으로 효율적으로 전환시킨다.
도 12는 원형 주형(좌측 레인) 및 선형(우측 레인) 주형을 사용한 전사가 시간의 함수로서 각각 긴 RNA 산물 및 짧은 산물을 초래함을 나타낸다. 시점은 0, 30초로 64분까지 두 배로 증가한다.
도 13은 전사(t = 5분)가 뒤따르는 DNA 또는 RNA 표적과의 결찰이 형광원성 압타머 형광의 신속한 출현을 초래함을 보여준다.
도 14는 SARS-CoV-2 서열에 대해 표적화된 4/5 프라이머 세트가 네스팅된 망고 NASBA에서 1 fM의 표적 RNA를 성공적으로 검출할 수 있음을 나타낸다. 40분 동안 외부 반응. 표 2의 각 세트의 P1 및 P2가 외부 반응으로 사용되고, 표 2의 각 프라이머 세트의 P3 및 P4가 내부 반응으로 사용되었다.
도 15는 액체 NASBA 키트를 사용한 RNA 검출 및 총 인간 RNA의 배경에서 SARS-CoV-2 표적 4 RNA의 검출의 민감도를 나타낸다. A. 40분 동안 수행된 외부 반응. 인간 RNA(HNA)가 5 ng/μL 최종 추가됨(회색 - 양성; 흑색 - 음성). B. (A)에 표시된 데이터 세트의 기울기는 확실하게 양의 신호이다. 프라이머 세트 4의 P1 및 P2(외부)에 이어 P3 및 P4(위의 내부 반응)(표 2).
도 16은 액체(습식) 및 동결건조(건식) NASBA 키트를 사용한 SARS-CoV-2 표적 4 RNA 검출의 민감도를 보여준다. 40분 동안 수행된 외부 반응. 프라이머 세트 4의 P1 및 P2(외부)에 이어 P3 및 P4(위의 내부 반응)(표 2).
도 17은 낮은 복사본 SARS-CoV-2 표적 4 RNA 검출에 EDTA 및 가열이 필요하지 않음을 보여준다. 100 aM RNA는 EDTA(T1)가 제외된 경우뿐만 아니라 샘플이 가열되지 않고 EDTA가 추가되지 않은(T2) 경우에도 동일하게 검출된다. 40분 동안 수행된 외부 반응. 도 1의 습식 데이터. 프라이머 세트 4(표 2)의 P1 및 P2(외부)에 이어 P3 및 P4(위의 내부 반응).
도 18은 동결건조된 NASBA 키트 및 SARS-CoV-2 표적 4 RNA를 사용한 외부 반응 시간 최적화를 보여준다. 주형 농도는 10 aM였다. 20분 외부 배양은 40분 외부 배양과 동일한 강력한 신호를 생성하는 가장 짧은 시간임이 입증되었다. 프라이머 세트 4(표 2)의 P1 및 P2(외부)에 이어 P3 및 P4(위의 내부 반응).
도 19는 SARS-CoV-2 표적 4 RNA를 검출하기 위해 동결 건조된 NASBA 키트를 사용하는 단일 단계 망고 NASBA의 민감도를 보여준다. 프라이머 세트 4의 P5 및 P6(표 2).
도 20은 액체 LS 키트를 사용한 배양된 SARS-CoV-2 RNA의 성공적인 검출을 보여준다. 액체 LS 키트는 표시된 희석액과 함께 네스팅된 방식으로 사용되었다. 프라이머 세트 4(표 2)의 P1 및 P2(외부)에 이어 P3 및 P4(위의 내부 반응).
도 21은 LS 동결 건조 키트를 사용한 배양된 SARS-CoV-2 RNA의 성공적인 검출을 보여준다. 1 fM 합성 SARS-CoV-2 표적 4 RNA를 양성 대조군으로 사용했다. 배양된 바이러스 RNA의 검출은 다양한 조건에서 테스트되었다. NOD - 외부 반응을 내부로 1/20 희석(일반적으로 1/100 희석 사용); NOR - RNA 주형만 가열되고 프라이머는 없음; NH - 가열 없음. 프라이머 세트 4(표 2)의 P1 및 P2(외부)에 이어 P3 및 P4(위의 내부 반응).
도 22는 동결 건조된 NASBA 키트를 사용하여 환자 샘플로부터 SARS-CoV-2 RNA의 성공적인 검출을 보여준다. A. 낮은 시간에 약간의 초기 탁도를 보여주는 원 데이터. B. 이 데이터의 기울기를 플로팅하면 명확한 출현 시간을 알 수 있다. 합성은 표적 4 ß RNA에 해당한다. 프라이머 세트 4(표 2)의 P1 및 P2(외부)에 이어 P3 및 P4(위의 내부 반응).
도 23은 환자에서 SARS-CoV-2의 검출을 위해 주형 자체 또는 프라이머를 사용한 가열이 필요하지 않음을 보여준다. 환자 샘플은 주형으로 가열하기 전에 (NH)가 있거나 없는 동결 건조된 LS 키트를 사용하여 네스팅된 망고 NASBA에 적용되었다. POS는 COVID-19가 있는 것으로 알려진 환자 샘플을 나타낸다. 프라이머 세트 4(표 2)의 P1 및 P2(외부)에 이어 P3 및 P4(위의 내부 반응).
도 24는 내부 대조군 반응을 갖는 형광원성 압타머 NASBA의 개략도이다. 반응 혼합물을 포함하는 액체 용기에는 내부 대조군 RNA(예컨대, 인간 18S 리보솜 RNA)뿐만 아니라 표적 RNA(예컨대, SARS-CoV-2 RNA)를 표적으로 하는 올리고머가 있을 수 있다.
도 25는 예시적인 압타머-융합 프라이머의 개략도이다.
본 개시내용은 부분적으로 핵산 분자의 증폭, 검출 및/또는 정량화에 관한 것이다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 등온 핵산 증폭(INA) 반응, 예컨대 핵산서열기반 증폭(NASBA), 롤링 서클 증폭(RCA), 루프 매개 등온 증폭(LAMP), 재조합효소 폴리머라제 증폭(RPA), 헬리카제 의존 증폭(HDA), 닉킹 효소 증폭(NEAR)35, 가닥 변위 증폭(SDA)36, 선형 및 캐스케이드 증폭 방법, 등에서 네스팅되지 않은 및/또는 네스팅된 올리고뉴클레오타이드 프라이머 쌍을 사용하여 표적 핵산 분자를 증폭하는 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 등온 핵산 증폭(INA) 반응, 예컨대 핵산서열기반 증폭(NASBA), 롤링 서클 증폭(RCA), 루프 매개 등온 증폭(LAMP), 재조합효소 폴리머라제 증폭(RPA), 헬리카제 의존 증폭(HDA), 닉킹 효소 증폭(NEAR)35, 가닥 변위 증폭(SDA)36, 선형 및 캐스케이드 증폭 방법, 등에서 네스팅되지 않은 및/또는 네스팅된 올리고뉴클레오타이드 프라이머 쌍을 사용하여 표적 핵산 분자를 검출하는 방법을 추가로 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 등온 핵산 증폭(INA) 반응, 예컨대 핵산서열기반 증폭(NASBA), 롤링 서클 증폭(RCA), 루프 매개 등온 증폭(LAMP), 재조합효소 폴리머라제 증폭(RPA), 헬리카제 의존 증폭(HDA), 닉킹 효소 증폭(NEAR)35, 가닥 변위 증폭(SDA)36, 선형 및 캐스케이드 증폭 방법, 등에서 네스팅되지 않은 및/또는 네스팅된 올리고뉴클레오타이드 프라이머 쌍을 사용하여 표적 핵산 분자를 정량화하는 방법을 추가로 제공한다.
일 양태에서, 본 개시 내용은 표적 핵산 서열의 적어도 일부에 혼성화할 수 있는 제1 핵산 서열, 또는 그의 역-보체; 및 표적 핵산 서열의 적어도 일부에 혼성화할 수 있는 제2 핵산 서열, 또는 그의 역-보체를 포함하고 압타머-암호화 주형 서열을 추가로 포함하는 핵산 분자 또는 그의 유사체를 제공하며, 여기서 압타머-암호화 주형 서열은 제1 핵산 서열의 3' 말단에 위치하며, 상기 제2 핵산 서열의 5' 말단은 제1 핵산 서열의 3' 말단에 공유적으로 부착된다.
일부 실시형태에서, 제2 핵산 서열의 3' 말단은 제1 핵산 서열에 실질적으로 혼성화하지 않는다. 일부 실시형태에서, 제2 핵산 서열의 3' 말단의 적어도 3개의 말단 뉴클레오타이드는 제1 핵산 서열에 혼성화하지 않는다. 일부 실시형태에서, 핵산 분자는 말단 줄기 구조를 포함할 수 있고, 여기서 적어도 제2 핵산 서열의 5' 말단의 말단 뉴클레오타이드는 제1 핵산 서열의 5' 말단의 적어도 말단 뉴클레오타이드에 상보적일 수 있어서, 말단 줄기 구조의 적어도 일부를 형성한다. 일부 실시형태에서, 제2 핵산 서열의 5' 말단의 적어도 2개 또는 3개의 말단 뉴클레오타이드는 제1 핵산의 5' 말단의 적어도 2개 또는 3개의 말단 뉴클레오타이드에 상보적이어서 말단 줄기 구조의 적어도 일부를 형성할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 제1 핵산 분자를 포함하는 조성물을 제공한다.
일부 실시형태에서, 조성물은 표적 핵산 서열의 적어도 일부에 혼성화할 수 있고, 제1 RNA 폴리머라제 프로모터 서열을 포함하는 제2 핵산 분자, 또는 그의 역-보체를 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 제1 및 제2 핵산 분자는 표적 핵산 서열의 제1 서열을 증폭할 수 있는 제1 프라이머 쌍을 형성한다.
일부 실시형태에서, 제1 핵산 분자의 3' 말단은 제2 핵산 분자 또는 그 자체에 실질적으로 혼성화하지 않을 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 및 제2 핵산 분자는 서로 실질적으로 혼성화하지 않을 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 핵산 분자의 3' 말단의 1, 2 또는 3개의 말단 염기는 제2 핵산 분자의 3' 말단의 1, 2 또는 3개의 말단 염기에 혼성화할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 핵산 분자의 3' 말단은 표적 핵산의 서열과 정렬될 때 제2 핵산 분자의 3' 말단과 인접할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물은 제3 핵산 분자 및 제4 핵산 분자를 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 제3 및 제4 핵산 분자는 표적 핵산의 제2 서열을 증폭할 수 있는 제2 프라이머 쌍을 형성하며, 제3 핵산 분자 또는 제4 핵산 분자가 제2 RNA 폴리머라제 프로모터 서열을 포함할 수 있으며, 제2 프라이머 쌍은 제1 프라이머 쌍 외부의 위치에서 표적 핵산 분자에 혼성화할 수 있고, 제1 서열 및 제2 서열을 증폭할 수 있다.
일부 실시형태에서, 제2 RNA 폴리머라제 프로모터 서열은 표적 핵산 분자의 제2 서열을 제2 핵산 분자의 방향과 반대 방향으로 전사할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제3 핵산 분자가 제2 RNA 폴리머라제 프로모터 서열을 포함하는 경우, 제4 핵산 분자는 제2 압타머-암호화 서열을 포함하거나, 제4 핵산 분자가 제2 RNA 폴리머라제 프로모터 서열을 포함하는 경우, 제3 핵산 분자는 제2 압타머-암호화 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제3 핵산 분자의 3' 말단은 제4 핵산 분자에 실질적으로 혼성화하지 않을 수 있다. 일부 실시형태에서, 제3 및 제4 핵산 분자는 서로 실질적으로 혼성화하지 않을 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1, 제2, 제3 및 제4 핵산 분자의 3' 말단은 서로 실질적으로 혼성화하지 않을 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1, 제2, 제3 및 제4 핵산 분자는 서로 실질적으로 혼성화하지 않을 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물은 제5 핵산 분자 및 제6 핵산 분자를 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 제5 및 제6 핵산 분자는 표적 핵산 분자의 제3 서열을 증폭할 수 있는 제3 프라이머 쌍을 형성할 수 있으며, 여기서 제5 핵산 분자 또는 제6 핵산 분자는 제3 RNA 폴리머라제 프로모터 서열을 포함할 수 있으며, 여기서 제3 프라이머 쌍은 제1 및 제2 프라이머 쌍 외부의 위치에서 표적 핵산 분자에 혼성화할 수 있으며, 제1, 제2 및 제3 서열을 증폭할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제3 RNA 폴리머라제 프로모터 서열은 표적 핵산 분자의 제3 서열을 제2 핵산 분자와 동일한 방향으로 전사할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제5 핵산 분자가 제3 RNA 폴리머라제 프로모터 서열을 포함하는 경우, 제4 핵산 분자는 제3 압타머-암호화 서열을 포함하며, 또는 제4 핵산 분자가 제3 RNA 폴리머라제 프로모터 서열을 포함하는 경우, 제5 핵산 분자는 제3 압타머-암호화 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제5 핵산 분자의 3' 말단은 제4 핵산 분자의 3' 말단에 실질적으로 혼성화되지 않을 수 있다. 일부 실시형태에서, 제5 및 제4 핵산 분자는 서로 실질적으로 혼성화하지 않을 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1, 제2, 제3, 제4, 제5 및 제6 핵산 분자의 3' 말단은 서로 실질적으로 혼성화하지 않을 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1, 제2, 제3, 제4, 제5 및 제6 핵산 분자는 서로 실질적으로 혼성화하지 않을 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물은 표 3에 기재된 서열을 포함하는 하나 이상의 핵산 분자를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 핵산 분자 중 하나 이상이 예비 혼합될 수 있다. 일부 실시형태에서, 핵산 분자 중 하나 이상이 액체로 제공될 수 있다. 일부 실시형태에서, 핵산 분자 중 하나 이상이 동결 건조될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 표적 핵산 서열을 증폭하는 방법을 제공하며, 이 방법은 표적 핵산 분자를 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 제공하는 단계; 본원에 기재된 바와 같은 제1 핵산 분자를 제공하는 단계; 표적 핵산 서열의 적어도 일부 또는 이의 상보체에 혼성화할 수 있고 제1 RNA 폴리머라제 프로모터 서열을 포함하는 제2 핵산 분자를 제공하는 단계로서, 여기서 제1 및 제2 핵산 분자가 표적 핵산 서열의 제1 서열을 증폭할 수 있는 제1 프라이머 쌍을 형성하는 단계; 및 표적 핵산 분자 및 제1 프라이머 쌍을 포함하는 제1 증폭 반응을 수행하여 제1 증폭 산물을 수득하는 단계로서, 여기서 제1 증폭 산물이 표적 핵산 서열의 제1 서열을 포함하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 핵산 분자의 3' 말단은 제2 핵산 분자의 3' 말단에 실질적으로 혼성화하지 않을 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 및 제2 핵산 분자는 서로 실질적으로 혼성화하지 않을 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 핵산 분자의 3' 말단의 1, 2 또는 3개의 말단 염기는 제2 핵산 분자의 3' 말단의 1, 2 또는 3개의 말단 염기에 혼성화할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 핵산 분자의 3' 말단은 표적 핵산의 서열과 정렬될 때 제2 핵산 분자의 3' 말단과 인접할 수 있다.
일부 실시형태에서, 방법은 제3 핵산 분자 및 제4 핵산 분자를 제공하는 단계로서, 여기서 제3 및 제4 핵산 분자는 표적 핵산 분자의 제2 서열을 증폭할 수 있는 제2 프라이머 쌍을 형성하고, 여기서 제3 핵산 분자 또는 제4 핵산 분자는 제2 RNA 폴리머라제 프로모터 서열을 포함하고, 제2 프라이머 쌍은 제1 프라이머 쌍의 외부 위치에서 표적 핵산 분자에 혼성화할 수 있고 표적 핵산 분자의 제1 서열 및 제2 서열을 증폭할 수 있는 단계; 및 제1 증폭 산물 및 제2 프라이머 쌍을 포함하는 제2 증폭 반응을 수행하여 제2 증폭 산물을 수득하는 단계로서, 여기서 제2 증폭 반응은 제1 증폭 반응 전에 수행될 수 있고, 제2 증폭 산물은 표적 핵산 분자의 제1 서열 및 제2 서열을 포함할 수 있는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제2 RNA 폴리머라제 프로모터 서열은 표적 핵산 분자의 제2 서열을 제2 핵산 분자의 방향과 반대 방향으로 전사할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제3 핵산 분자가 제2 RNA 폴리머라제 프로모터 서열을 포함하는 경우, 제4 핵산 분자는 제2 압타머-암호화 서열을 포함하며, 또는 제4 핵산 분자가 제2 RNA 폴리머라제 프로모터 서열을 포함하는 경우, 제3 핵산 분자는 제2 압타머-암호화 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제3 핵산 분자의 3' 말단은 제4 핵산 분자의 3' 말단에 실질적으로 혼성화하지 않을 수 있다. 일부 실시형태에서, 제3 및 제4 핵산 분자는 서로 실질적으로 혼성화하지 않을 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1, 제2, 제3 및 제4 핵산 분자의 3' 말단은 서로 실질적으로 혼성화하지 않을 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1, 제2, 제3 및 제4 핵산 분자는 서로 실질적으로 혼성화하지 않을 수 있다. "핵산" 또는 "핵산 분자"는 각각 오탄당(pentose sugar)에 부착된 질소-함유 방향족 염기로 구성된 뉴클레오타이드 사슬이며, 이는 차례로 포스포디에스테르 결합을 통해 사슬내에서 한 당의 5'-하이드록실기를 다음 당의 3'-하이드록실기에 브릿징함으로써 연속적인 당 잔기를 연결하는 인산기에 부착된다. 따라서, 핵산은 5' 말단과 3' 말단으로 방향성을 가지며, 관례에 따라, 3' 말단에 새로운 뉴클레오타이드가 추가된다. 관례에 따라, 핵산 "서열"은 5'에서 3' 방향으로 작성된다.
핵산은 이중-가닥 또는 단일-가닥일 수 있다. 단일-가닥인 경우, 핵산은 센스 가닥 또는 안티센스 가닥일 수 있다. 핵산 분자는 자연 발생 또는 변형된 뉴클레오타이드를 포함하여, 2개 이상의 공유 결합된 뉴클레오타이드의 임의의 사슬일 수 있다. "RNA"는 2개 이상의 공유 결합된, 자연 발생 또는 변형된 리보뉴클레오타이드의 서열을 의미한다. "DNA"는 2개 이상의 공유 결합된, 자연 발생 또는 변형된 데옥시리보뉴클레오타이드의 서열을 의미한다. "cDNA"는 RNA-의존성 DNA 폴리머라제(역전사효소)의 작용에 의해 RNA 주형으로부터 생성된 상보적 또는 복제 DNA를 의미한다. 용어 "핵산" 또는 "핵산 분자"는 cDNA, 게놈 DNA 및 합성(예를 들어, 화학적으로 합성된) DNA를 포함하는, RNA(플러스 및 마이너스 가닥) 및 DNA를 모두 포함한다.
본원에 사용된 핵산 "유사체"는 폴리머라제와 같은 효소에 의해 증폭될 수 있는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 핵산이다. 일부 실시형태에서, 핵산 유사체는 T7 RNA 폴리머라제, T3 RNA 폴리머라제, SP6 RNA 폴리머라제 및 박테리아 DNA 의존성 RNA 폴리머라제와 같은 RNA 폴리머라제에 의해 증폭될 수 있다. 일부 실시형태에서, 핵산 유사체는 잠금 핵산(LNA) 뉴클레오타이드(문헌[Latorra et al., Hum. Mutat. 22:79-85 2003]) 또는 펩타이드 핵산을 포함할 수 있다.
"변형된 리보뉴클레오타이드" 또는 "변형된 RNA"는 비제한적으로, 리보스의 2'-OH 기의 변형 및 표준 왓슨-크릭(Watson-Crick) 혼성화를 방해하지 않는 핵염기의 변형을 갖는 RNA(예컨대, 2'-NH2, 2'-플루오로, 또는 2'-O-메틸)를 포함한다.
"변형된 데옥시리보뉴클레오타이드" 또는 "변형된 DNA"는 비제한적으로, 5-프로피닐-우라실, 2-티오-5-프로피닐-우라실, 5-메틸시토신, 슈도이소시토신, 2-티오우라실 및 2-티오티민, 2-아미노퓨린, N9-(2-아미노-6-클로로퓨린), N9-(2,6-디아미노퓨린), 하이포잔틴, N9-(7-데아자-구아닌), N9-(7-데아자-8-아자-구아닌) 및 N8-(7-데아자-8-아자-아데닌)을 포함한다.
"상보적" 또는 "상보성"은 2개의 핵산, 예를 들어 DNA 및/또는 RNA가 왓슨-크릭 염기 쌍을 형성하여 2개의 핵산들 사이에 이중-가닥 영역을 생성할 수 있는 충분한 수의 뉴클레오타이드를 함유함을 의미한다. 따라서, DNA 및/또는 RNA의 한 가닥에 있는 아데닌은 반대 상보적 DNA 가닥에 있는 티민 또는 반대 상보적 RNA 가닥에 있는 우라실과 쌍을 이룬다. 핵산 분자의 각각의 모든 뉴클레오타이드는 듀플렉스를 형성하기 위해 반대 상보적 가닥의 뉴클레오타이드와 매칭되는 왓슨-크릭 염기 쌍을 형성할 필요가 없다는 것이 이해될 것이다. 핵산은 또한 다른 핵산과 혼성화하거나 "혼성화할 수 있는" 경우 또 다른 핵산에 "상보적"이다.
본원에 사용된 "역보체" 또는 "상보체" 서열은 5'에서 3'으로 제시된 핵산 가닥의 상보적 서열이다.
본원에 사용된 "혼성화할 수 있는"은 핵산이 실질적으로 상보적인 서열을 갖는 또 다른 핵산과 염기 쌍을 이룰 수 있음을 의미한다. 일부 실시형태에서, "혼성화할 수 있는"은 핵산이 등온 증폭과 같은 증폭에 적합한 조건 하에 실질적으로 상보적인 서열을 갖는 또 다른 핵산과 염기 쌍을 이룰 수 있음을 의미한다. "실질적으로" 상보적이라는 것은 염기 쌍이 부분적일 수 있음, 즉, 한 핵산의 모든 뉴클레오타이드가 다른 핵산의 모든 뉴클레오타이드와 적절하게 염기 쌍을 형성할 필요가 없고 2개의 핵산들 사이에 하나 이상의 염기 쌍 미스매치가 있을 수 있음을 의미한다. "~의 일부"는 핵산(들)의 전체 길이를 따라 혼성화가 일어날 필요가 없음을 의미한다.
생성된 이중나선 분자의 안정성은 발생하는 염기 쌍의 정도에 따라 달라지며, 두 핵산들 간의 상보성 정도 및 혼성화 조건의 엄격한 정도와 같은 매개변수에 의해 영향을 받는다고 이해되고 있다. 혼성화의 엄격한 정도는 온도, 염 농도 및 포름아미드와 같은 유기 분자의 농도와 같은 매개변수에 의해 영향을 받을 수 있으며, 당업자에게 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다.
"실질적으로 혼성화하지 않음"은 등온 증폭과 같은 증폭에 적합한 조건하에서 핵산이 또 다른 핵산과 실질적으로 염기 쌍을 이루지 않는다는 것을 의미한다. 따라서, 일부 실시형태에서 "실질적으로 혼성화하지 않는다"는 본원에 기재된 바와 같은 핵산, 예컨대 제1, 제2, 제3, 제4, 제5 또는 제6 핵산 또는 제1, 제2 또는 제3 프라이머 쌍이 서로 또는 내부적으로 혼성화하지 않는다는 것을 의미한다. 일부 실시형태에서, "실질적으로 혼성화하지 않는다"는 핵산의 3' 말단, 예를 들어 말단 9개 뉴클레오타이드, 예컨대 말단 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9개 뉴클레오타이드가 시스템의 임의의 다른 핵산 서열 내에서 염기 쌍을 형성하지 않는다는 것을 의미한다. 일부 실시형태에서, "실질적으로 혼성화하지 않는다"는 핵산의 3' 말단, 예를 들어 말단 9개 뉴클레오타이드, 예컨대 말단 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9개 뉴클레오타이드가 또 다른 핵산의 3' 말단, 예를 들어 말단 9개 뉴클레오타이드, 예컨대 말단 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9개 뉴클레오타이드와 염기 쌍을 형성하지 않는다는 것을 의미한다.
"증폭"은 핵산 서열의 추가 복사본이 생성되는 과정을 의미한다. 핵산 증폭 공정은 당업계에 공지되어 있으며, 비제한적으로 폴리머라제 연쇄 반응(PCR), 예컨대 메틸화 민감성 PCR, 네스팅된-PCR, 저온-PCR, 디지털 PCR, 액적 디지털 PCR, ICE-저온-PCR, 멀티플렉스 PCR(mPCR), 실시간 또는 정량적 PCR(qPCR), 역전사효소(RT)-PCR 또는 정량적 역전사효소(RT)-PCR을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서 "증폭" 과정은 등온일 수 있는데, 즉, 증폭이 일정한 온도에서 수행되는 경우이다. 핵산의 등온 증폭(INA)은 비제한적으로 핵산 서열 기반 증폭(NASBA), 롤링 서클 증폭(RCA), 루프 매개 등온 증폭(LAMP), 재조합효소 폴리머라제 증폭(RPA), 헬리카제 의존 증폭(HDA), 닉킹 효소 증폭(NEAR), 가닥 변위 증폭(SDA), 또는 선형 및 캐스케이드 증폭 방법을 포함한다.
일부 실시형태에서, RNA 중간체를 포함하는 등온 증폭 방법과 같은 적합한 등온 증폭 방법이 본원에 기재되거나 당업계에 공지된 NASBA 또는 TMA 방법에 의해 예시된 바와 같이 사용될 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, RNA 생성 등온 증폭 방법은 T7, T3 또는 SP6과 같은 RNA 폴리머라제 프로모터 서열을 포함하는 역방향 프라이머를 사용하여 안티센스 서열을 생성할 수 있다. 이것은 입력 서열의 역 보체인 RNA 출력을 생성할 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서 반응을 네스팅할 때 내부 네스팅된 반응은 반대 프라이머 상에 RNA 폴리머라제 프로모터 서열을 필요로 한다. 일부 실시형태에서, RNA 생성 등온 증폭 방법은 본원에 기재되거나 당업계에 공지된 형광원성 압타머 주형(들)과 함께 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 다른 등온 증폭 방법이 본원에 기재된 바와 같이 용이하게 조정되고 사용될 수 있다. 예를 들어, RCA는 본원에 기재된 바와 같이 DNA 원(circle)으로부터 RNA를 전사함으로써 적응될 수 있다.
대안적인 실시형태에서, LAMP, RPA, NEAR, HDA 또는 SDA와 같은 다른 DNA-기반 등온 방법은 사용되는 등온 증폭 방법에 따라 RNA 폴리머라제 프로모터를 DNA 올리고뉴클레오타이드에 첨가함으로써 유사하게 적용될 수 있으며, 이에 의해 RNA 전사가 등온법에 의해 생성된 DNA 증폭 산물을 보고하는 역할을 한다. 일부 실시형태에서, HDA, RPA 또는 NEAR 프라이머는 RNA 폴리머라제 프로모터 및 효소(들) 및 형광원성 압타머 주형(들)을 갖도록 변형될 수 있으며, 이는 성공적인 증폭의 리포터로서 RNA 압타머 생산을 가능하게 한다. 일부 실시형태에서, HDA, RPA 또는 NEAR 프라이머는 DNA 형광원성 압타머 주형(들)을 갖도록 변형될 수 있으며, 이는 성공적인 증폭의 리포터로서 DNA 압타머 생산을 가능하게 한다.
일부 실시형태에서, 증폭에 적합한 조건은 당업계에 공지된 바와 같이 PCR에 적합한 조건일 수 있다. 일부 실시형태에서, 등온 증폭에 적합한 조건은 본원에 기재되거나 당업계에 공지된 바와 같이, NASBA, RCA, LAMP, HAD, SDA 등과 같은 선택된 특정 등온 증폭 방법에 적합한 조건일 수 있다.
예를 들어, NASBA의 경우, 증폭에 적합한 조건은 본원에 기재되거나 당업계에 공지된 바와 같이, 표적 핵산, 예를 들어 RNA에 혼성화하고 역전사효소(RT)에 의해 연장된 RNA 폴리머라제 프로모터(예를 들어, T7 프로모터)를 함유하는 프라이머를 사용하여 먼저 약 41℃에서 등온적으로 RNA 산물의 증폭을 포함할 수 있다. 그런 다음 RNase H는 혼성화된 RNA를 분해하여 무표지(bare) cDNA를 남긴다. 다음으로, 본원에 기재되거나 당업계에 공지된 제2 프라이머가 cDNA에 혼성화되고, RT에 의해 초기 혼성화 프라이머의 말단까지 연장되어, T7 프로모터를 함유하는 dsDNA를 생성한다. 그런 다음 RNA 폴리머라제는 프라이머가 원래 어닐링되어 사용된 영역들 사이에 암호화된 RNA를 전사한다. RNA의 여러 복사본이 생성되면 유리 프라이머는 계속해서 혼성화되고 확장되고 더 많은 주형을 생성할 수 있으므로 DNA 주형과 RNA 산물이 기하급수적으로 증폭된다.
일부 실시형태에서, 예를 들어, 망고 압타머를 사용하는 NASBA에 대한 증폭 파라미터는 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있다:
a. NASBA 반응을 수행하기 전에 RNA 샘플을 가열하지 않음.
b. EDTA 없음;
c. 더 짧은 반응 시간, 예를 들어 약 20분;
d. 네스팅된 반응의 경우, 외부 반응에서 내부 반응으로 약 20배 희석; 및/또는
e. 시약의 동결건조.
일반적으로 등온 반응은 기하급수적 증폭 과정을 완료하는 데 필요한 세트로 지정된 단일 세트의 등온 증폭 핵산으로 구성된다. 대조적으로, 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같이 다중화될 수 있는 등온 증폭 반응을 제공한다. 예를 들어, n이 1, 2 또는 3 이상이 될 수 있는 "n"의 경우 등온 증폭 프라이머 세트 또는 "프라이머 쌍"이 생성될 수 있다. 프라이머 세트 또는 쌍은 증폭될 각각의 표적 핵산에 대해 구별될 수 있다. 이것은 "다중화", 즉 동일한 반응 내에서 다중 표적 핵산의 동시 검출에 의한 "n" 표적 핵산의 증폭, 검출 및/또는 정량화를 허용하여 중요한 내부 대조군 및 검증을 허용할 수 있다. 이 예에서 적절한 수의 프라이머 세트가 예를 들어 반응 혼합물에 제공된다. 예를 들어, 2개의 표적 핵산 서열을 우선적으로 증폭하기 위해 2개의 프라이머 세트가 제공될 수 있고, 3개의 표적 핵산 서열을 우선적으로 증폭하기 위해 3개의 프라이머 세트가 제공될 수 있으며, 그 이상도 마찬가지이다. 일부 실시형태에서, 검출은 사용된 각 프라이머 세트의 고유한 서열을 기반으로 할 수 있다. 일부 실시형태에서, 형광원 검출은 본원에 기재되거나 당업계에 공지된 다중 증폭 방법에 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어 별개의 방출 스펙트럼을 갖는 상이한 형광단이 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같이 직교 2색 또는 3색 형광원성 압타머 및 이들의 상응하는 리간드가 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 등온 증폭 반응은 본원에 기재된 바와 같이 "네스팅"될 수 있다. 이러한 실시형태에서, 예를 들어 네스팅된 프라이머 쌍을 사용하여 후속 증폭을 수행하기 전에 증폭 산물을 희석하면 감도 및 특이성을 실질적으로 개선하고 증폭 인공산물(artifacts)을 감소시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 네스팅된 증폭 반응, 예를 들어 네스팅된 등온 증폭 반응은 "다중화"될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 네스팅된 및 다중 증폭 반응은 형광원 검출 방법과 함께 사용될 수 있다.
일반적으로, 증폭 반응은 반응 혼합물에서 수행된다. 본원에 사용된 "반응 혼합물"은 증폭 반응이 수행되도록 하는 관련 성분을 포함하는 조성물을 의미한다. 예시적인 반응 혼합물은 비제한적으로, 핵산 샘플, 프라이머 쌍, 및 폴리머라제와 같은 적합한 효소를 포함할 수 있다. 당업자는 반응 혼합물이 완충제, 안정화제, 주형, 뉴클레오타이드 등과 같은 다른 성분을 또한 포함할 수 있고 이러한 성분이 수행되는 증폭 반응에 의해 지시될 수 있음을 이해할 것이다.
뉴클레오타이드 농도, 증폭에 사용된 핵산 폴리머라제, 완충제 조성, 증폭 주기의 수, 주기 동안의 온도와 같은 증폭 매개변수는 본원에 기술되거나 당업계에 공지된 바와 같이 최적화될 수 있음을 이해해야 한다.
"표적 핵산", "표적 핵산 분자" 또는 "표적 핵산 서열"은 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이 증폭될 수 있는 임의의 핵산을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 표적 핵산이 검출될 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적 핵산이 정량될 수 있다.
표적 핵산은 예를 들어 RNA 폴리머라제와 같은 폴리머라제를 사용하여 증폭될 수 있는 한 임의의 크기일 수 있음을 이해해야 한다. 일부 실시형태에서, 표적 핵산은 약 100개 내지 약 10,000개의 뉴클레오타이드 길이, 또는 그 사이의 임의의 값일 수 있다. 또 다른 예에서, 표적 핵산은 약 100 내지 약 5,000개의 뉴클레오타이드 길이, 또는 그 사이의 임의의 값일 수 있다. 또 다른 예에서, 표적 핵산은 약 100 내지 약 3,000개의 뉴클레오타이드 길이, 또는 그 사이의 임의의 값일 수 있다. 또 다른 예에서, 표적 핵산은 약 100 내지 약 2,000개의 뉴클레오타이드 길이, 또는 그 사이의 임의의 값일 수 있다. 또 다른 예에서, 표적 핵산은 약 100 내지 약 1,000개의 뉴클레오타이드 길이, 또는 그 사이의 임의의 값일 수 있다. 또 다른 예에서, 표적 핵산은 약 100 내지 약 500개의 뉴클레오타이드 길이, 또는 그 사이의 임의의 값일 수 있다.
표적 핵산 분자는 비제한적으로, RNA 또는 DNA, 예를 들어 염색체 DNA, 미토콘드리아 DNA, 메신저 RNA, 리보솜 RNA, 전이 RNA, 바이러스 RNA 및 염색체외 DNA, 예컨대 병원성 플라스미드를 포함한다. 표적 핵산 분자는 생물학적 샘플, 법의학 샘플, 합성 샘플 또는 환경 샘플과 같은 샘플에 존재할 수 있다.
본원에 사용된 "압타머"는 펩타이드, 소분자(예를 들어, 항생제), 탄수화물 등과 같은 리간드에 높은 선택성 및 특이성으로 결합, 즉, 리간드를 "특이적으로 결합"할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 압타머는 폴리머라제와 같은 효소에 의해 증폭될 수 있는 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 압타머는 T7 RNA 폴리머라제, T3 RNA 폴리머라제, SP6 RNA 폴리머라제, 또는 박테리아 또는 진핵생물 RNA 폴리머라제와 같은 RNA 폴리머라제에 의해 증폭될 수 있는 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. RNA 폴리머라제는 바이러스, 박테리오파지, 박테리아, 또는 식물 또는 동물과 같은 진핵생물과 같은 임의의 적합한 공급원으로부터 수득될 수 있음을 이해해야 한다. 일부 실시형태에서, 압타머는 단일-가닥(ss) 핵산(예를 들어, ssRNA 또는 ssDNA)일 수 있다. 단일-가닥 핵산 압타머는 나선 및 단일-가닥 루프를 비롯한 다양한 형태를 취할 수 있다. 따라서, 압타머-리간드 결합은 1차 구조가 아닌 3차 구조에 의해 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 압타머는 말단 줄기 구조, 즉 압타머의 3' 및 5' 말단을 포함하는 이중 구조를 포함한다. 일부 실시형태에서, 말단 줄기 구조는 2 bp만큼 짧을 수 있고 임의로 길 수 있다. 일부 실시형태에서, 말단 줄기 구조는 약 6 bp 내지 약 8 bp일 수 있다.
본원에 사용된 "압타머-암호화 주형 서열"은 핵산 압타머 서열의 역보체인 핵산 서열이다.
일부 실시형태에서, 리간드는 예를 들어 (예를 들어, 형광단으로부터의) 형광 신호 또는 비색 신호를 생성하는 신호-생성 리간드일 수 있다. 형광원성 RNA 압타머 서열은 형광원성 압타머 시스템(FE)의 형광 향상 및 압타머-형광단 상호작용의 K D 둘 다를 최적화하기 위해 시험관 내 선택을 사용하여 선택될 수 있다. 형광단 결합 압타머의 예는 비제한적으로 망고, 후추, 브로콜리, 옥수수, 시금치 및 시금치2(문헌[Strack et al, Nature Methods 2013, 10: 1219-1224]), 당근 및 무(문헌[Paige et al, Science 2011, 333: 642-646]), RT 압타머(문헌[Sato et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2014, 54: 1855-1858]), 헤민(hemin)-결합 G-사중나선구조(G-quadruplex) DNA 및 RNA 압타머, 또는 말라카이트 그린 결합 압타머(문헌[Babendure et al., J. Am. Chem. Soc. 2003)를 포함한다. 형광단은 비제한적으로 적외선(IR) 염료, 디오믹스(Dyomics) 염료, 피코에리트린(phycoerythrine), 캐스케이드 블루, 오레곤 그린 488, 퍼시픽 블루, 로다민 그린과 같은 로다민 유도체, 5(6)-카르복시플루오레세인, 시아닌 염료(즉, Cy2, Cy3, Cy 3.5, Cy5, Cy5.5, Cy 7)(디에틸아미노)쿠마린, 플루오레세인(즉, FITC), 테트라메틸로다민, 리사민, 텍사스 레드, AMCA, TRITC, 바디피 염료 또는 알렉사 염료를 포함한다.
"망고" 또는 "망고 압타머"는 RNA 압타머를 의미한다. RNA 망고 압타머 시리즈는 매우 높은 대비(contrast)를 가지고 있어 시험관 내 형광 리포터에 유용하다. 이러한 압타머는 RNA 망고 압타머에 결합할때 최대 4,000배 더 밝아질 수 있는 티아졸 오렌지-기반 리간드(TO1-비오틴)에 대하여 나노몰 결합 친화성을 갖는다. RNA 망고 압타머 망고 II, III 및 IV는 시험관 내 분석에서 발견되는 마그네슘 이온 농도에 대한 내성이 강하고, 다양한 1가 금속 이온 농도에서도 작동한다. 망고 III은 최근 구조 유도 조작으로 개선되어 더욱 밝아졌다.
"브로콜리" 또는 "브로콜리 압타머"는 문헌[Song et al., J. Am. Chem. Soc. 2014, 136: 1198]에 기재된 바와 같이 결합된 형광단 DFHBI 또는 DFHBI-유래 형광단, 예컨대 (Z)-4-(3,5-디플루오로-4-하이드록시벤질리덴)-2-메틸-1-(2,2,2-트리플루오로에틸)-1H-이미다졸-5(4H)-온)(DFHBI-1T)의 활성화를 통해 관심 표적 분석물(예를 들어, 표적 RNA)에 형광을 부여하는 49-nt 형광 RNA 압타머를 의미한다(예를 들어, 문헌[Filonov et al., J. Am. Chem. Soc. 2014, 136(46): 16299-16308] 참조).
압타머는 리간드, 예를 들어 형광단을 인식하고 결합할 때 리간드를 "특이적으로 결합"하지만, 샘플 내 다른 분자를 실질적으로 인식하고 결합하지 않는다. 일부 실시형태에서, 압타머는 예를 들어 샘플 내 또 다른 기준 분자에 대한 압타머의 친화도보다 적어도 10, 100, 1000 또는 10,000배 더 큰 리간드에 대한 친화도를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 압타머 서열은 약 0.01 nM 내지 약 100 nM, 또는 그 사이의 임의의 값, 예컨대 0.2 nM의 리간드 결합 해리 상수(K D )를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 형광원성 압타머 서열은 약 0.01 nM 내지 약 100 nM, 또는 그 사이의 임의의 값, 예컨대 0.2 nM의 형광단 결합 해리 상수(K D )를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 형광원성 압타머 암호화 서열은 약 0.01 nM 내지 약 100 nM, 또는 그 사이의 임의의 값, 예컨대 0.2 nM의 형광단 결합 해리 상수(K D )를 가질 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이 사용하기 위한 형광 RNA 압타머-형광단 복합체와 같은 적합한 압타머의 선택은 결합 친화도, 밝기, 2차 구조, 서열 수정에 대한 순응성 등과 같은 압타머의 특성에 따라 다양한 매개변수에 의존할 수 있음을 이해해야 한다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같이 직교 2색 형광원성 압타머 및 리간드가 사용될 수 있다. 2개의 형광원성 리간드 결합 압타머는 제1 압타머가 그의 리간드에 특이적으로 결합하고 제2 압타머가 그의 리간드에 특이적으로 결합하는 경우 결합과 관련하여 서로 직교한다. 결합에서 일부 중복이 발생할 수 있음을 이해해야 한다. 일부 실시형태에서, 각각의 형광원성 리간드는 각각의 압타머 농도의 강력한 2색 정량화를 허용하도록 다른 것과 구별되는 방출 스펙트럼을 갖는다. 일부 실시형태에서, 동일한 개념에 기초하여 직교 3색 형광원성 압타머 및 리간드가 사용될 수 있다. 이러한 직교성의 개념은 당업자에 의해 이해되는 바와 같이 3색 이미징 이상으로 쉽게 확장된다.
용어 "프라이머"는 표적 핵산 분자 또는 서열의 적어도 일부에 상보적인 비교적 짧은 핵산 서열을 지칭한다. 프라이머는 또한 표적 핵산 분자 또는 서열의 적어도 일부의 역보체에 상보적일 수 있음을 이해해야 한다.
일부 실시형태에서, 프라이머는 "디제너레이트" 서열을 갖는데, 즉, 핵산 서열은 프라이머가 여러 상이한 표적 핵산으로 혼성화할 수 있는 상이한 서열의 혼합물이도록 동일한 위치에 상이한 뉴클레오타이드를 갖는 서열의 조성이다. 다시 말해서, 디제너레이트 서열은 복수의 표적 핵산 서열에 상보적일 수 있다.
일부 실시형태에서, 프라이머는 표적 핵산 서열의 적어도 일부 또는 그의 상보체에 혼성화할 수 있는 제1 핵산 서열뿐만 아니라 압타머-암호화 주형 서열; 및 표적 핵산 서열의 적어도 일부 또는 그의 상보체에 혼성화할 수 있는 제2 핵산 서열을 포함할 수 있으며, 여기서 압타머-암호화 주형 서열은 제1 핵산 서열의 3' 말단에 위치하며, 여기서 제2 핵산 서열의 5' 말단은 제1 핵산의 3' 말단에 공유적으로 부착되고, 여기서 제2 핵산 서열의 3' 말단은 제1 핵산 서열에 실질적으로 혼성화하지 않는다. 이러한 프라이머는 본원에 "압타머-융합 프라이머"로 지칭될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제2 핵산 서열의 5' 말단의 적어도 말단 뉴클레오타이드는 말단 줄기 구조의 적어도 일부를 형성하기 위해 제1 핵산의 5' 말단의 적어도 말단 뉴클레오타이드에 상보적일 수 있다. 일부 실시형태에서, 제2 핵산 서열의 5' 말단의 적어도 2개 또는 3개의 말단 뉴클레오타이드는 제1 핵산의 5' 말단의 적어도 2개 또는 3개의 말단 뉴클레오타이드에 상보적이어서 말단 줄기 구조의 적어도 일부를 형성할 수 있다. 예시적인 압타머-융합 프라이머의 개략도가 도 25에 도시되어 있다.
일부 실시형태에서, 제1 핵산 서열은 길이가 약 20개 내지 약 100개 뉴클레오타이드, 또는 그 사이의 임의의 값, 예컨대 약 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100일 수 있다.
일부 실시형태에서, 제1 핵산 서열은 길이가 약 100개 초과 뉴클레오타이드, 예컨대 200 nt 길이일 수 있다.
일부 실시형태에서, 제2 핵산 서열은 길이가 약 15개 내지 약 100개 뉴클레오타이드, 또는 그 사이의 임의의 값, 예컨대 약 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100일 수 있다.
일부 실시형태에서, 압타머-융합 프라이머는 제1 핵산 서열과 제2 핵산 서열 사이에 링커 서열을 포함할 수 있다. 링커 서열은 길이가 0 내지 약 65 nt 뉴클레오타이드, 또는 그 사이의 임의의 값, 예컨대 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64 또는 65일 수 있다.
압타머 융합 프라이머를 형성하도록 설계되었는지 또는 폴리머라제 프로모터를 포함하는지 여부에 따라 당업자에 의해 이해되거나 본원에 기재된 바와 같이 제3, 제4, 제5, 또는 제6 핵산, 또는 추가 핵산에 유사한 고려 사항이 적용됨을 이해해야 한다.
"프라이머 쌍"은 핵산 서열이 표적 핵산 서열 상의 상보적 서열에 어닐링되는 등온 증폭 반응과 같은 증폭 반응을 프라이밍하는 역할을 할 수 있는 본원에 기재된 바와 같은 2개의 최적으로 설계된 핵산 서열을 의미한다.
"샘플"은 유기체에서 분리되거나 추출된 임의의 기관, 조직, 체액, 세포 또는 세포 추출물 또는 유기체로부터의 핵산을 함유하거나 잠재적으로 함유하거나 함유하는 것으로 의심되는 임의의 물질일 수 있다. 예를 들어, 포유동물과 같은 동물로부터의 샘플에는 비제한적으로 뼈, 뇌, 유방, 결장, 근육, 신경, 난소, 전립선, 망막, 피부, 골격근, 장, 고환, 심장, 간, 폐, 신장, 위, 췌장, 자궁, 부신, 편도선, 비장, 연조직, 말초혈, 전혈, 적혈구 농축액, 혈소판 농축액, 백혈구 농축액, 혈액 세포 단백질, 혈장, 혈소판-풍부 혈장, 혈장 농축물, 혈장 분획의 침전물, 혈장 분획의 상층액, 혈장 단백질 분획, 정제되거나 부분적으로 정제된 혈액 단백질 또는 기타 성분, 혈청, 정액, 포유동물 초유, 점막 세포, 우유, 소변, 배설물, 대변, 누액, 타액, 태반 추출물, 양수, 동결 침전물, 동결 상층액, 세포 용해물, 포유 동물 세포 배양 또는 배양 배지, 발효 생성물, 복수 체액, 혈액 세포에 존재하는 단백질, 기관 흡인물, 비강 흡인물, 인두 면봉, 또는 유기체(예를 들어, 인간 또는 동물), 실험 대상체 또는 실험 동물로부터 얻은 임의의 기타 표본 또는 이들의 임의의 추출물로부터의 (예를 들어, 생검 또는 부검으로부터의) 세포 또는 조직이 포함될 수 있다. 샘플에는 비제한적으로, 정상 또는 (예를 들어, 재조합 DNA 또는 단일클론 항체 기술을 통해) 형질 전환된 세포에 의해 세포 배양에서 생산된 산물이 포함될 수 있다. 샘플은 또한 비제한적으로, 새, 물고기, 곤충 또는 벌레와 같은 비포유류 동물로부터 분리된 임의의 기관, 조직, 세포 또는 세포 추출물을 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 샘플은 진균 샘플일 수 있다. 또 다른 예에서, 샘플은 식물에서 얻을 수 있다.
"샘플"은 또한 유기체에서 직접 분리되지 않는 실험 조건에서 생성된 세포 또는 세포주일 수 있다. 샘플은 브러시, 면봉, 스패츌러, 헹굼/세척액, 펀치 생검 장치, 바늘구비 천공 천자 또는 수술 기구와 같은 표준 기술을 사용하여 분리될 수 있다. 조직 또는 기관 샘플은 예를 들어 생검 또는 기타 외과적 절차에 의해 임의의 조직 또는 기관에서 얻을 수 있다. 분리된 세포는 여과, 원심분리 또는 세포 분류와 같은 분리 기술에 의해 체액 또는 조직 또는 기관에서 얻을 수 있다.
일부 실시형태에서, "샘플"은 비제한적으로, 공기, 물 또는 토양과 같은 환경에서; 육류, 어류, 유제품 또는 사료와 같이 사람 또는 동물이 섭취하도록 의도된 재료로부터; 화장품, 농산물, 플라스틱 및 포장재, 종이, 의류 섬유, 금속 표면 등으로부터 수집되거나 추출될 수 있으며; 샘플은 또한 무세포일 수 있고, 인공적으로 유도되거나 합성될 수 있으며, 예를 들어 합성 핵산과 같은 합성 작제물일 수 있다. 샘플은 비제한적으로, 액체의 전통적인 정의뿐만 아니라 콜로이드, 현탁액, 슬러리 및 분산액을 포함하는 액체 형태일 수 있다.
DNA 또는 RNA와 같은 핵산을 얻거나 추출하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 비제한적으로 RNA 추출 스핀 컬럼, 페닐/클로로포름-기반 추출 방법 등을 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산은 자동화된 기술 및 장비를 사용하여 추출할 수 있는 DNA 또는 RNA 표적이 될 수 있다.
"대조군"에는 기준선 발현 또는 활성을 결정하는 데 사용하기 위해 얻은 샘플이 포함된다. 대조군에는 이전에 확립된 표준 또는 참조도 포함된다. 따라서, 본 발명에 따라 수행된 모든 테스트 또는 분석은 확립된 표준 또는 참조와 비교할 수 있으며, 매번 비교를 위해 대조군 샘플을 얻을 필요가 없을 수 있다.
유기체는 비제한적으로, 바이러스, 미생물, 마이코플라스마, 진균, 동물(예를 들어, 포유동물), 식물, 박테리아, 조류, 기생충, 진균 또는 원생동물일 수 있다. 일부 실시형태에서, 동물은 인간, 비인간 영장류, 래트, 마우스, 소, 말, 돼지, 양, 염소, 개, 고양이 등일 수 있다. 유기체는 임상 환자, 임상 시험 지원자, 실험동물, 가축 등일 수 있다.
예시적인 식물은 단자엽, 쌍자엽 및 침엽수를 포함한다. 예를 들어, 식물은 곡물, 포도, 비트, 이과, 석류 및 부드러운 과일; 콩과 식물, 오일 식물, 오이 식물, 섬유 식물, 감귤류 과일, 야채, 녹나무과(lauraceae) 및 식물, 예컨대 옥수수, 담배, 견과류, 커피, 사탕수수, 차, 덩굴, 홉, 터프, 바나나, 천연 고무 식물 또는 관상용 식물을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
진균의 예는 효모, 아스퍼질루스 속(Aspergillus spp.); 블라스토마이세스 더마티티디스(Blastomyces dermatitidis); 칸디다(Candida); 콕시디오이데스 이미티스(Coccidioides immitis); 콕시디오이데스 포사다시(Coccidioides posadasii); 크립토코커스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans); 히스토플라스마 캡슐라툼(Histoplasma capsulatum); 뉴모시스티스 종(Pneumocystis species)을 포함한다.
옥수수 녹병; 도열병; 벼 갈색 점무늬병; 호밀 도열병; 스포로트리쿰증(Sporothrix schenckii); 밀 곰팡이 등.
원생동물 및 벌레의 예는 비제한적으로, 기생 원생동물 및 벌레, 예컨대 가시아메바(Acanthamoeba) 및 기타 자유생활 아메바; 아니사키스 종(Anisakis sp.) 및 기타 관련 벌레; 크립토스포리디움 파르붐(Cryptosporidium parvum); 사이클로스포라 카예타넨시스(Cyclospora cayetanensis); 디필로보트리움 속(Diphyllobothrium spp.); 엔트아메바 히스토리티카(Entamoeba histolytica); 유스트롱길리데스 종(Eustrongylides sp.); 지아디아 람블리아(Giardia lamblia); 나노피에투스 속(Nanophyetus spp.); 쉬스토소마 속(Shistosoma spp.); 톡소플라스마 곤디이(Toxoplasma gondii); 또는 트리키넬라(Trichinella)를 포함한다.
분석물의 예는 비제한적으로, 식물 꽃가루 및 밀 글루텐과 같은 알레르겐을 포함한다.
일부 실시형태에서, 유기체는 박테리아 또는 바이러스 병원체와 같은 병원성일 수 있다.
박테리아 병원체의 예는 비제한적으로 아에로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila); 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis); 바실러스 세레우스(Bacillus cereus); 클로스트리디움의 보툴리눔 신경독 생산 종(Botulinum neurotoxin producing species of Clostridium); 브루셀라 아보투스(Brucella abortus); 브루셀라 멜리텐시스(Brucella melitensis); 브루셀라 수이스(Brucella suis); 부르크홀데리아 말레이(Burkholderia mallei)(이전에는 슈도모나스 말레이(Pseudomonas mallei)); 부르크홀데리아 슈도말레이(Burkholderia pseudomallei)(이전에는 슈도모나스 슈도말레이(Pseudomonas pseudomallei)); 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni); 클라미디아 프시타시(Chlamydia psittaci); 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum); 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum); 클로스트리디움 퍼프린겐스(Clostridium perfringens); 콕시디오이데스 이미티스(Coccidioides immitis); 콕시디오이데스 포사다시(Coccidioides posadasii); 코우드리아 루미난티움(Cowdria ruminantium); 콕시엘라 부르네티(Coxiella burnetii); 장독성 에스케리치아 콜리(Enterovirulent Escherichia coli) 그룹(EEC 그룹) 예컨대 에스케리치아 콜리(Escherichia coli) - 장독소생성(enterotoxigenic)(ETEC), 에스케리치아 콜리 - 장병원성(EPEC), 에스케리치아 콜리 - O157:H7 장출혈성(EHEC), 및 에스케리치아 콜리 - 장침습성(EIEC); 에를리키아 속(Ehrlichia spp.) 예컨대 에를리키아 샤펜시스(Ehrlichia chaffeensis); 프란시셀라 툴라렌시스(Francisella tularensis); 레지오넬라 뉴모필리아(Legionella pneumophilia); 리베로박터 아프리카누스(Liberobacter africanus); 리베로박터 아시아티쿠스(Liberobacter asiaticus); 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes); 다양한 장용제, 예컨대 클렙시엘라(Klebsiella), 엔테로박터(Enterobacter), 프로테우스(Proteus), 시트로박터(Citrobacter), 아에로박터(Aerobacter), 프로비덴시아(Providencia), 및 세라티아(Serratia); 미코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis); 미코박테리움 투버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis); 미코플라스마 카프리콜룸(Mycoplasma capricolum); 미코플라스마 미코이데스 속 미코이데스(Mycoplasma mycoides ssp mycoides); 리케치아 프로바제키(Rickettsia prowazekii); 리케치아 리케치이(Rickettsia rickettsii); 살모넬라 속(Salmonella spp.); 쉴레로프토라 레이시애 바르제아(Schlerophthora rayssiae varzeae); 쉬겔라 속(Shigella spp.); 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus); 스트렙토코커스(Streptococcus); 신키트리움 엔도비오티쿰(Synchytrium endobioticum); 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae) 비-O1 ; 비브리오 콜레라 01 ; 비보리오 파라해모라이티쿠스(Vibrio parahaemolyticus) 및 기타 비브리오; 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus); 크산토모나스 오리자에(Xanthomonas oryzae); 자일렐라 파스티디오사(XyIeIIa fastidiosa); 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica) 및 예르시니아 슈도투버쿨로시스(Yersinia pseudotuberculosis); 또는 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis)를 포함한다.
바이러스 병원체의 예는 비제한적으로, 단일 가닥 RNA 바이러스, 단일 가닥 DNA 바이러스, 이중-가닥 RNA 바이러스, 또는 이중-가닥 DNA 바이러스를 포함한다. 일부 실시형태에서, 병원성 바이러스는 비제한적으로, 아프리카 말병 바이러스; 아프리카돼지열병 바이러스; 아카바네 바이러스; 반자 바이러스; 칼리시바이러스(예를 들어, 노로바이러스 및 사포바이러스와 같은 인간 장내 바이러스), 세르코피테신 헤르페스바이러스 1; 치쿤구냐 바이러스; 고전 돼지열병 바이러스; 코로나바이러스(예를 들어, 중증 급성 호흡기 증후군(SARS), 중동 호흡기 증후군(MERS), 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2)); 혈청형 1(DENV1) 및 3(DENV3)과 같은 뎅기 바이러스, 및 치쿤구냐 바이러스(CHIKV)와 같은 관련 바이러스; 덕베 바이러스; 에볼라 바이러스; 뇌염 바이러스, 예컨대 동부 말 뇌염 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 머레이 밸리 뇌염 및 베네수엘라 말 뇌염 바이러스; 말 모르빌리바이러스; 플라바이러스, 플렉살 바이러스; 구제역 바이러스; 저미스톤 바이러스; 염소 수두 바이러스; 한타안(Hantaan) 또는 기타 한타(Hanta) 바이러스; 헨드라 바이러스; 인간 면역결핍 바이러스(HIV); 인플루엔자 바이러스(예를 들어, H1N1, H5N1, 조류 인플루엔자 바이러스); 라사열 바이러스; 루핑 병 바이러스; 림프구성 맥락수막염 바이러스; 폴리오바이러스; 감자 바이러스; 수두 바이러스; 남미 출혈열 바이러스; 바리올라(Variola) 주요 바이러스(천연두 바이러스); 수포성 구내염 바이러스; 웨스트 나일 바이러스; 황열병 바이러스; 인간-병원성 플라비바이러스, 예컨대 지카바이러스 등을 포함한다.
일부 실시형태에서, 표적 핵산은 증폭과 동시에 또는 후속적으로 검출될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "검출하다" 또는 "검출"은 샘플 또는 반응 혼합물에서 표적 핵산 또는 신호의 존재, 존재 또는 사실의 결정을 나타낸다.
일부 실시형태에서, 표적 핵산은 증폭 및 검출과 동시에 또는 후속적으로 정량화될 수 있다. 정량화는 비제한적으로, 표적 또는 신호의 정량 또는 양의 측정(정량화라고도 함)을 포함할 수 있으며, 이는 표적 또는 신호의 양 또는 비율을 결정하도록 설계된 임의의 분석을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 검출은 정량화되지 않은 또 다른 표적 또는 신호에 대한 상대적 풍부도 측면에서 표적 또는 신호의 품질 또는 종류를 언급하거나, 이와 관련되거나 동정을 포함할 때 "정성적"이다. "광학 검출"은 시각적으로 검출 가능한 신호, 즉 형광, 스펙트럼 또는 관심 표적으로부터의 이미지 또는 표적에 부착된 프로브를 통해 수행되는 검출을 나타낸다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 방법은 질병, 장애 또는 병리학적 상태를 나타내는 표적 서열의 수준을 증폭, 검출 및/또는 정량화함으로써 진단 방법에 포함될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 방법은 범죄 또는 오염을 나타내는 표적 서열의 수준을 증폭, 검출 및/또는 정량화함으로써 법의학 또는 환경 분석 방법에 통합될 수 있다.
다양한 실시형태에서, 프라이머의 설계가 최적화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 네스팅되지 않은 및/또는 네스팅된 올리고뉴클레오타이드 프라이머 쌍은 프라이머 이량체 형성에 대한 기회가 감소할 뿐만 아니라 표적 핵산 분자에 대한 비-특이적 혼성화에 대한 기회가 감소될 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 네스팅되지 않은 및/또는 네스팅된 올리고뉴클레오타이드 프라이머 쌍은 하기 특성들 중 하나 이상을 가질 수 있다.
1. 프라이머 쌍은 서로 잠재적인 혼성화 가능성이 가장 낮도록 설계될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서 프라이머 쌍은 서로 혼성화할 수 있는 3개 이하의 뉴클레오타이드를 갖도록 설계될 수 있다. 대안적 실시형태에서, 프라이머 쌍은 서로 혼성화되어서는 안 된다.
2. 프라이머는 관심 있는 핵산(예를 들어, RNA) 서열에 대한 가능한 한 적은 대체 표적 부위를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 프라이머는 3' 말단에서 원하지 않는 표적 부위 또는 설계의 다른 프라이머 서열에 대한 혼성화를 방지하도록 설계될 수 있다. 일부 실시형태에서, 3' 말단은 (예를 들어, 폴드백 혼성화에 의해) 프라이머의 자가-연장을 허용하지 않아야 한다.
3. 네스팅되지 않은 상황의 경우: 활용의 등온 온도에서 DNA 프라이머의 3' 서열을 사용하여 관심 RNA의 3' 영역에 혼성화할 수 있는 DNA 프라이머. 일부 실시형태에서, 이 프라이머의 3' 말단은 말단 서열의 적어도 1 내지 3 nt만큼 관심 RNA에 완전히 혼성화할 수 있다. 일부 실시형태에서, 관심 RNA에 완전히 혼성화되거나 혼성화되지 않을 수 있는 이 혼성화 영역의 5'에서 RNA 폴리머라제 프로모터 서열이 프라이머 서열(예를 들어, T7, T3 또는 SP6의 서열)에 포함될 수 있다(PA, 도 1a 및 1b). RNA 표적에 대한 PA 프라이머의 혼성화는 표준 기술을 사용하여 등온 증폭 시스템에 사용되는 염 및 완충제 조건에서 안정적인 것으로 열역학적 계산에 의해 추정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 15~30 bp의 혼성화가 있을 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다.
4. RNA 표적 서열의 역보체에 혼성화할 수 있고 달리 프라이머 PA와 유사하게 설계된 제2 프라이머(PB, 도 1a 및 1b)는 PA 프라이머의 혼성화 위치의 5'에서 발견된 RNA의 역보체 서열에 혼성화할 수 있다. 형광원성 압타머 리포터가 설계에 포함되어야 하는 경우, 이러한 압타머 서열의 역보체는 PB 프라이머의 5' 영역 내에 포함될 수 있다(PB, 도 1b). 일부 실시형태에서, 프라이머 PA 및 PB에 대한 혼성화 부위는 가장 효율적인 등온 증폭을 위해 가능한 한 서로 가깝게 설계될 수 있다. 일부 실시형태에서, 프라이머의 3' 말단은 중첩되지 않는다. 대안적인 실시형태에서 프라이머의 3' 말단은 내부 프라이머 쌍의 효과적인 네스팅을 허용하도록 서로 500-nt 내에 있을 수 있다.
5. 네스팅된 프라이머 설계의 경우, '외부' 프라이머 쌍은 하기 추가 기준과 함께 본원에 설명된 네스팅되지 않은 프라이머와 같이 설계될 수 있다: PA와 PB 외부 프라이머 사이의 거리는 외부 PA 및 PB 프라이머의 3' 말단 사이에서 내부 프라이머가 혼성화할 수 있도록 하기에 충분할 수 있다. 이러한 경우 프라이머 PB는 형광원성 압타머 서열을 포함하도록 설계되거나, 일부 활용에서는 압타머 서열이 포함되지 않도록 설계할 수 있다(예를 들어, 망고 도 1c). 내부 프라이머 PC 및 PD(도 1c)는 각각 PA 및 PB와 동일한 기준으로 혼성화하도록 설계될 수 있다. 이들 프라이머는 원래 RNA 표적의 역보체인 RNA를 증폭하고 PC는 본원에서 PA에 대해 논의된 바와 같은 프로모터 서열을 포함할 수 있고 프라이머 PD가 형광원성 압타머 서열을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다는 점을 유의한다. 일부 실시형태에서 이것은 관련된 RNA 폴리머라제의 누출로 인해 필요하지 않는다. 일부 실시형태에서, PC 및 PD에 대한 혼성화 영역은 PA 및 PB 혼성화 영역과 부분적으로 중첩되어, 예를 들어 인공 서열 증폭의 가능성을 최소화할 수 있다.
일부 실시형태에서, 내부 프라이머 PD가 형광원성 압타머(예를 들어, 망고, 도 1c)를 포함하는 경우 외부 프라이머 PB는 형광원성 압타머를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 형광원성 압타머가 PB에 포함되는 경우, 별개의 형광원성 압타머 서열이 내부 프라이머 PD에 포함될 수 있다. 일부 실시형태에서, 별개의 압타머는 외부 프라이머 PB에서 발견되는 형광원성 압타머에 스펙트럼적으로 별개의 특성을 가질 수 있다(예를 들어, PB 상의 후추, 브로콜리 또는 옥수수 압타머 및 PD 상의 망고 압타머). 일부 실시형태에서, 형광원성 압타머는 등온 증폭 시스템의 등온 완충제에서 완전히 기능할 수 있다(예를 들어, 염 및 pH 및 화학적 조건에 대해 광범위하게 내성인 RNA 망고 압타머).
일부 실시형태에서, 네스팅된 올리고뉴클레오타이드 프라이머 쌍의 사용은 INA의 민감도 및/또는 특이성을 증가시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같은 네스팅된 올리고뉴클레오타이드 프라이머 쌍의 사용은 적어도 10-19 M 내지 약 10-6 M 농도의 민감도를 초래한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같은 네스팅된 올리고뉴클레오타이드 프라이머 쌍의 사용은 아토몰 10-18 M 농도의 민감도를 초래한다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같은 네스팅된 올리고뉴클레오타이드 프라이머 쌍을 사용하는 INA 검출 방법은 비제한적으로, 망고 등과 같지만 형광원성 압타머, 분자 비콘, 비특이적 NA 삽입 형광 염색 및/또는 겔-기반 탐지 방법론에 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같은 네스팅된 올리고뉴클레오타이드 프라이머 쌍을 사용하는 INA 검출 방법은 비특이적 증폭 인공물(표적 외 효과)에 둔감하거나 덜 민감하다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같은 네스팅된 올리고뉴클레오타이드 프라이머 쌍을 사용하는 INA 검출 방법은 빠르고 편리하며, 실시간 형광 판독을 직접 제공하도록 배열될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같은 네스팅된 올리고뉴클레오타이드 프라이머 쌍은 RNA 망고와 같으나 이에 제한되지 않는 형광원성 압타머 서열을 포함할 수 있다. 그의 해당 압타머에 대한 형광원성 리간드의 도입은 실시간 형광 리포터 시스템을 생성할 수 있다. 따라서, 형광원성 압타머 서열(INAF)을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하는 INA 검출 방법은 실시간 등온 NA 검출을 가능하게 할 수 있다. 일부 실시형태에서, INAF 방법은 마이크로M 내지 피코M 농도 범위의 주형 농도와 같으나 이에 제한되지 않는 비교적 높은 존재비의 핵산 표적 서열의 검출에 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 프라이머 및/또는 표적은 본원, 예컨대 표 3에 기재된 핵산 서열 또는 표 3의 서열에 대한 적어도 90% 내지 99.9% 유사도, 또는 이 사이의 임의의 값, 예컨대 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 유사도를 갖는 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 프라이머 및/또는 표적은 비제한적으로, 표 3에 기재된 서열 또는 표 3의 서열에 대한 적어도 90% 내지 99.9% 동일성, 또는 이 사이의 임의의 값, 예컨대 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, INAF 방법은 비제한적으로 마이크로리터 샘플당 아토몰, 10-18 M 또는 1 NA 분자와 같지만 이에 한정되지 않은 저농도 또는 저 존재비 핵산 표적 서열의 검출에 사용될 수 있다. 등온 네스팅된 형광원성 증폭 및 검출(INFAD)이라고 하는 이러한 방법에는 초기 외부 프라이머 등온 증폭 단계가 포함되며, 이어서 형광원성 압타머 태그된 프라이머를 포함하는 프라이머를 사용하는 후속 네스팅된 내부 등온 반응이 수행된다. 방법은 단일 네스팅 이벤트로 제한되지 않으며, 예를 들어 하나 이상의 네스팅 이벤트가 발생할 수 있음을 이해해야 한다. 특정 가설에 얽매이지 않으면서, 단일 네스팅으로 많은 증폭 인공산물을 배제할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제2 또는 추가적인 네스팅은 민감도를 더욱 향상시킬 수 있다.
INFAD 내부 및 외부 프라이머 쌍은 민감도를 최대화하도록 변형되며, 핵산 형광원성 압타머가 가장 안쪽 기하급수적 등온 증폭 주기의 끝에서 만들어지고 증폭 과정의 초기 단계에서는 만들어지지 않도록 프라이머가 배열되는 방법론을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
네스팅되지 않은 RCA의 경우, DNA 또는 RNA 표적 서열이 검출될 수 있다. 일부 실시형태에서, 선형 DNA 올리고뉴클레오타이드는 형광원성 압타머(예를 들어, 망고, 도 11), 압타머 서열의 생산을 허용하도록 배향된 DNA 프로모터 서열(예를 들어, T7, T3, SP6)을 함유해야 하며, 또한 결찰되는 능력을 함유해야 한다. 이것은 예를 들어 DNA 올리고에 5' 포스페이트를 추가하고, 구현시에 T4 DNA 리가제를 사용하여 수행될 수 있다. 이 올리고뉴클레오타이드의 5' 및 3' 영역("선형 RCA 주형"이 사용되지만 표 1 또는 3에 제한되지 않음)은 5' 및 3' 말단이 바로 근접하도록 DNA 올리고뉴클레오타이드의 혼성화를 허용하여 결찰(예를 들어 5' 포스페이트의 이미다졸 활성화가 구현되는 경우 효소적 또는 화학적일 수 있음)을 허용하도록 관심 DNA 또는 RNA 표적에 대한 혼성화 영역("표적 RCA 스플린트"가 사용되지만 이들로 한정되지는 않지만 표 1 또는 3에 제한되지 않음)을 포함해야 한다. 결찰 후 또는 전에 상부 가닥 프로모터 서열("T7 프로모터 상보체"가 사용되지만 이에 제한되지 않지만 표 1 또는 3에 제한되지 않음)의 추가는 예를 들어 T7 또는 SP6 폴리머라제(T7, 도 11, 12)에 의한 전사를 허용한다. DNA 또는 RNA 표적으로 인한 증폭은 DNA 올리고뉴클레오타이드 서열의 역보체를 갖는 긴 반복 RNA 서열의 생성에 의해 구현될 수 있다(도 11~13). 이 시스템은 RNA 폴리머라제에 의한 원의 각 회전이 추가 원 생성을 촉진할 수 있는 새로운 결찰 표적 부위를 생성하기 때문에 기하급수적 증폭 가능성을 보유한다.
RCA의 네스팅은 올리고뉴클레오타이드의 혼성화 부위 사이에 갭 서열을 포함하도록 상기 설명된 바와 같이 5' 및 3' 올리고뉴클레오타이드의 혼성화에 의해 간단하게 구상될 수 있다. 이는 올리고뉴클레오타이드의 길이가 RNA 표적 서열의 20 내지 50 nt인 것으로 상상할 수 있는 이러한 갭을 허용하기에 충분하다는 것을 의미한다. 비가닥 변위 RT 효소를 추가하면 이 간격이 채워져 상기 설명한 대로 결찰이 가능하다. 생성된 반복 서열은 2개의 올리고뉴클레오타이드 혼성화 부위 사이에서 발견되는 표적 RNA 서열에 상보적인 RNA 서열 영역을 포함하지 않을 것이다. 따라서, 제2 증폭 주기는 현재 이 서열의 내부 영역에 혼성화하도록 설계된 DNA 올리고뉴클레오타이드 서열로 설계될 수 있다. 일부 실시형태에서, 내부 프라이머 올리고뉴클레오타이드에 형광원성 압타머만을 포함하거나 2개가 설계의 '외부' 및 '내부' 올리고뉴클레오타이드에 별개의 형광원성 압타머를 갖는 것이 효과적이다.
일부 실시형태에서, INFAD 방법은 핵산 압타머1이 형광단1(A1:F1 형광원성 복합체)에 특이적으로 결합하고 압타머2가 형광단2(A2:F2 형광원성 복합체)에 특이적으로 결합하는 2색 압타머 형광단 시스템을 포함할 수 있으며, 여기서 A1:F1 및 A2:F2로부터의 형광 방출은 형광계를 사용하여 구별할 수 있으며, 민감한 2채널 INFAD 시스템을 가능하게 한다. 이러한 시스템에는 망고 및 후추, 망고 및 브로콜리 및 후추 압타머 등이 포함되지만 이들로 한정되지는 않는다.
일부 실시형태에서, 2색 INFAD 시스템은 2개의 핵산 주형의 검출을 허용할 수 있으며, 그 중 하나는 INFAD 방법에 대한 내부 대조군일 수 있다. 이러한 2채널 INFAD 시스템은 1채널에 비해 향상된 신뢰성을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 2-채널 INFAD 시스템의 내부 대조군은 진음성(true negative)과 위음성(false negative)을 구별하는데 사용될 수 있다. 이를 통해 사용자는 실패한 반응이 내부 반응 및/또는 외부 반응의 결과인지 여부를 결정할 수 있다. 따라서, INFAD 프라이머는 두 가지 색상 압타머 서열을 암호화하도록 변형될 수 있다. 또한 2개의 형광단을 추가하여 2채널 이미징이 가능하다. 3개 이상의 색상 압타머 서열을 사용하여 3개 이상의 채널 이미징에 유사한 접근 방식이 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 내부 대조군 2색 분석의 가능한 결과의 개략도를 보여주는 도 24에서와 같이 동일한 튜브에서 2개의 동시 등온 반응(예를 들어, NASBA 반응)이 수행될 수 있다. 한 반응은 관심 RNA(예컨대 SARS-CoV-2)를 표적으로 하는 올리고를 가지고 있어서, 형광(예컨대 녹색 형광, 도 24에서 막대 선으로 표시됨)이 있는 압타머를 생성할 것이다. 제2 반응은 내부 대조군 RNA(예컨대 인간 18S 리보솜 RNA)를 표적으로 하는 올리고를 가지고 있어서, 형광(예컨대 적색 형광, 제1 압타머와 동일한 형광은 아님, 도 24에서 점선으로 표시됨)이 있는 압타머를 생성할 것이다. 반응으로부터의 가능한 결과는 하기와 같다: A. SARS-CoV-2 RNA가 검출되고(막대선, 도 24a), 인간 리보솜 RNA가 검출됨(점선, 도 24a); B. SARS-CoV-2 RNA가 검출되지 않고(막대선 부족, b), 인간 리보솜 RNA가 검출됨(점선, 도 24b); C. SARS-CoV-2 RNA가 검출되었지만 내부 대조군 인간 리보솜 RNA는 검출되지 않았으며, 이는 위양성 또는 단순히 테스트 실패를 의미함(도 24c). 분석 실패, 내부 대조군이 실패했기 때문에 SARS-CoV-2 RNA가 존재하는지 여부를 결정할 수 없음(도 24d). 위에서 설명한 RNA는 예시일 뿐이며, 위의 임의의 RNA가 원하는 RNA로 대체될 수 있다. 이 접근법은 3개 이상의 동시 등온 반응(예를 들어, NASBA 반응)으로 확장될 수 있음을 이해해야 한다.
일부 실시형태에서, 망고 압타머는 NASBA DNA 프라이머에 삽입되어 등온 방법에서 RNA 리포터의 기하급수적 합성을 모니터링할 수 있다. NASBA는 2개의 프라이머를 사용하며, 제1 프라이머는 초기 역전사 프라이머 역할을 하고 T7 프로모터를 포함한다. cDNA가 생성된 후 새로 형성된 헤테로이중가닥(heteroduplex)의 RNA는 RNase H에 의해 분해되어 제2 DNA 프라이머가 결합하고 역전사효소(RT)에 의해 다시 확장되도록 할 수 있다. 이것은 T7 RNA 폴리머라제에 의해 전사될 수 있는 이중 가닥 DNA 주형을 생성한다. 생성된 RNA가 RT에 의해 활용될 수 있기 때문에 기하급수적 증폭이 발생한다(도 1a). 형광원성 망고 압타머를 암호화하도록 제2 또는 하단 가닥 NASBA 프라이머를 변형시킴으로써 기하급수적 RNA 성장이 형광으로 직접 모니터링될 수 있다(도 1b). DNA 프라이머의 변경은 NASBA의 복잡성을 획기적으로 줄이고 실시간 모니터링을 가능하게 한다. 네스팅된 접근 방식(도 1c)과 결합할 때 이 방법은 반응의 μl당 최소 1.5개 정도의 RNA 분자를 검출할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 방법에 사용될 수 있는 조성물을 제공한다. 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 등온 증폭을 위해 올리고뉴클레오타이드 프라이머(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 핵산 분자 또는 조성물 중 하나 이상) 및 이들의 상응하는 리간드, 예를 들어 염료에 접합된 형광원성 압타머를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 방법에 사용될 수 있는 키트를 제공한다. 일부 실시형태에서, 키트는 표적 핵산 서열의 증폭을 위한 지침서와 함께 본원에 기재된 바와 같은 핵산 분자 또는 조성물 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 증폭은 등온 증폭, 예컨대 핵산 서열 기반 증폭, 롤링 서클 증폭, 루프 매개 등온 증폭, 헬리카제 의존 증폭, 또는 가닥 변위 증폭일 수 있다.
일부 실시형태에서, 키트는 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 등온 증폭을 위해 올리고뉴클레오타이드 프라이머에 접합된 형광원성 압타머(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 핵산 분자 또는 조성물 중 하나 이상) 및 그의 상응하는 리간드, 예를 들어 염료를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 키트는 샘플에서 표적 서열의 검출을 허용하는 정도로 핵산 표적 서열을 증폭시키는 데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 키트는 사용 지침서, 또는 본원에 기재된 바와 같은 방법을 수행하기 위한 지침서를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물, 키트 및 방법은 예를 들어 특정 표적 유전자 검출 및 정량화, 조직 배양, 혈청 및 혈장과 같은 임상적으로 또는 과학적으로 관련된 샘플 내 병원체 검출, 임상 샘플내 질병 마커 검출, 환경 및 통제된 조직 배양 샘플, 시험관 내 샘플내 오염물 검출, 생체 내 이미징 및 국소화 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는 용도를 위한 분야 또는 실험실에서 예를 들어 매우 낮은 농도의 RNA 및/또는 DNA 주형 및 고농도의 검출에 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물, 키트 및 방법은 생물학적 및/또는 비-생물학적 샘플 내 병원체의 존재에 대해, 식품 안전 및 식품 생물보안 용도, 예컨대 식품 가공 또는 포장에 사용되는 식품 및 물질을 선별하는데 사용될 수 있다. 다른 실시형태에서, 본원에 제공된 방법은 의약품이 진품인지 확인하거나 특정 핵산 종을 함유하는 것으로 알려진 또는 조작된 고가 품목의 정체를 확인하는 것과 같은 위조-방지 용도에 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물, 키트 및 방법은 현장 진료 장치(point of care device)와 함께 사용될 수 있다.
본 발명은 하기 실시예에서 추가로 설명될 것이다.
실시예
실시예 1
재료 및 방법
표적 RNA 생성
5 pM 플라스미드 주형, Taq(NEB, 10 U), 0.2 mM 각 dNTP, 10 mM TRIS 완충액 pH 8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 및 0.01% 젤라틴을 사용하여 표 1에 나타낸 각각의 PCR 프라이머를 사용하여 콜로니 PCR 반응을 수행한후, 이어서 pGEM-T 이지 벡터(Easy Vector)(Promega)로 클로닝을 수행하였다. 서열은 Eurofins 튜브 시퀀싱에 의해 확인하였다. 플라스미드를 주형으로 사용하여 PCR 반응을 수행한 후 300 mM NaCl 및 70% 에탄올에서 에탄올 침전을 수행하였다. 펠릿을 10X 스톡에 대해 PCR 반응 부피의 1/10로 현탁하였다. 전사는 8 mM GTP, 5 mM CTP 및 ATP, 2 mM UTP, 40 mM TRIS 완충액 pH 7.9, 2.5 mM 스페르미딘, 26 mM MgCl2, 및 0.01% Triton X-100에서 2X 주형, T7 RNA 폴리머라제(ABM)를 사용하여 수행하였다. RNA를 5% PAGE(19:1 아크릴아미드:비스), 300 mM NaCl에서 밤새 회전 및 에탄올 침전을 통해 정제하였다. 농도는 SHIMADZU 이중 빔 분광 광도계를 사용하여 결정하였다.
[표 1]
Figure pct00001
Figure pct00002
망고-NASBA
검출 주형으로서 에스케리치아 콜리 또는 슈도모나스 플루오레센스 ClpB mRNA의 짧은 분절을 사용하여 RNA 증폭을 위해 NASBA 프라이머를 선택하였다(각각 "ClpB 단표적 에스케리치아 콜리" 및 "ClpB 단표적 슈도모나스 플루오레센스"로 표시됨, 표 1). NASBA 완충액 믹스(Life Sciences, NECB-1-24), 뉴클레오타이드 믹스(Life Sciences, NECN-1-24), 각 프라이머(IDT) 250 nM, cDNA 프라이머 P1을 포함하는 T7 및 "P2A Heijnen and Medema (2009)에서 채택된 역방향 프라이머, 480 nM TO1-비오틴(ABM) 및 NASBA 효소 혼합물(Life Sciences, NEC-1-24)를 포함하는 망고 주형을 사용하여 반응을 수행하였다. 효소 혼합물을 제외하고 NASBA 반응물을 혼합하고 RNA 표적을 최종 0, 25 aM, 25 fM, 25 pM으로 추가하였다. RNA를 2분 동안 65℃로 가열하고, MJ 연구 PTC-100 열순환기에서 5분 동안 41℃로 낮추었다. 반응을 시작하기 위해, 효소 혼합물을 반응물에 첨가하고, 광학 캡(Applied Biosystems, 카탈로그 번호 4358293, 4323032)이 있는 8-튜브 스트립에서 41℃에서 StepOne 실시간 PCR 시스템(Applied Biosystems) 세트에서 인큐베이션하여, 하기 프로그램으로 SYBR 그린 시약을 판독하였다: 1. 41℃로 램프, 판독, 2. 30초 동안 41℃ 유지, 판독, 3. 480 주기가 완료될 때까지 단계 2 반복. 보충 도 S6의 실험은 A10U 돌연변이가 없는 P2A로 수행하였다(WT 망고 III을 사용함).
네스팅된 망고-NASBA
외부 증폭 반응은 전술한 바와 같이 수행되었지만, P2A는 망고 주형이 없는 P2B로 대체하였다. 40분에 5 μL EDTA를 25 μL의 최종 부피에서 10 mM의 최종 농도로 첨가하여 반응을 정지시키고, 냉각된 액체 질소 또는 에탄올에서 급속 동결시켰다. cDNA 프라이머 P3을 포함하는 T7 프로모터와 역방향 프라이머 P4를 포함하는 망고 주형을 사용하는 것외에는, 이러한 반응으로부터의 분취량을 위와 같이 준비한 내부 네스팅된 망고-NASBA 반응물(20 μL)로 100배 희석하였다. 상기 기기를 사용하여 실시간으로 TO1-비오틴의 형광에 대해 반응물을 다시 모니터링하였다.
조건화된 포유동물 세포 배양 배지의 존재 하에 에스케리치아 콜리의 검출
LB 배지에 에스케리치아 콜리를 접종하고, 농도를 600 nm에서의 흡광도로 모니터링했다(세포 수는 Agilent 온라인 도구를 사용하여 계산됨). 4000 g에서 4분 동안 펠릿화되기 전에 41℃에서 10분 동안 108개 세포의 분취량을 열 충격 처리하여 세포에서 ClpB RNA를 유도하였다. 세포를 50 μL의 고갈된 세포 배양 배지(MCF7, 세포를 계대하는 동안 버려지는 배지)에 재현탁하고 41℃에서 3분 동안 인큐베이션하였다. DNase 단계를 피한 것외에는, 권장 프로토콜을 사용하여 Nucleospin RNA 키트(Macherey-Nagel)에 적용하기 전에 샘플을 4000 g에서 4분 동안 펠릿화하고, 2 mM EDTA를 사용하여 용출을 수행하였다. 위에서 설명한 대로 네스팅된 망고-NASBA 반응에 총 핵산 샘플을 사용하였다. 네스팅된 망고 NASBA에 대한 음성 대조군 샘플은 동일한 추출 절차로 처리된 에스케리치아 콜리 세포가 포함되지 않은 고갈 배지에서 핵산을 추출한 것이다.
PAGE 망고 시각화
PAGE에서 시각화할 샘플을 20 mM EDTA가 첨가된 3부피 포름아미드에 첨가하고, 5분 동안 90℃로 가열하였다. 샘플을 로드하고, 8% PAGE(19:1 아크릴아미드:비스)를 통해 실행했다. 겔의 염색 후는 20 nM TO1-비오틴을 포함하는 100 mL의 1X WB(140 mM KCl, 1 mM MgCl2, 10 mM NaH2PO4 pH 7.2, 0.05% Tween-20)에서 수행하였으며, 망고-NASBA 밴드를 앞서 설명한 GE AI600RGB 이미저 상에서 이미징하였다34). 대안적으로, 동일한 조건에서 겔을 1X SYBR Safe로 염색하였다.
서열 정렬
Geneious 소프트웨어를 사용하여 서열을 정렬하고, Clustal 방법을 사용하여 정렬했다.
결과
형광원성 압타머-NASBA의 민감도
상업적으로 이용 가능한 NASBA 효소 혼합물을 사용하여, 본 발명자들은 망고 NASBA를 사용하여 RNA 주형이 전혀 없는 경우에도 빠르게 증폭되는 배경 신호 위에 에스케리치아 콜리 ClpB RNA 주형의 약 25 pM(15 000 000 RNA/μL의 반응, 도 2a, 4, 5, 프라이머 P1/P2A)만큼 적은 양을 검출할 수 있었다(도 4, 8). 슈도모나스 플루오레센스 ClpB RNA 주형은 훨씬 더 가깝게 혼성화된 프라이머를 사용하여 유사한 민감도로 검출될 수 있기 때문에 이러한 고유한 수준의 민감도는 프라이머 또는 주형 특이적이지 않았다(도 2b, 프라이머 P7/P8).
네스팅된 형광원성 압타머-NASBA의 민감도
외부 프라이머는 망고 NASBA에서 사용된 것과 서열이 동일했지만, 이제 P2A에는 망고 III 태그가 없었다(P1/P2B, 표 1).
외부 NASBA 반응에 사용된 0.25 μM 농도의 프라이머에서, 본 발명자들은 100배 희석이 NASBA 활성을 억제하기에 충분하다는 것을 발견했다(도 8b). 이 외부 NASBA 반응물을 40분 동안 인큐베이션하고 내부 NASBA 망고 프라이머(P3/P4)를 사용하여 새로운 내부 NASBA 반응으로 100배 희석한 후, 이제 15 RNA/μL의 에스케리치아 콜리 ClpB 주형 서열을 쉽게 검출할 수 있었다(Ec/Ec 반응, 도 2c, 6). 동일한 희석 전략을 사용하여, 슈도모나스 플루오레센스 주형에서 네스팅된 망고 NASBA를 테스트했으며, 슈도모나스 플루오레센스-특이적 네스팅된 망고 NASBA 프라이머(외부: P5/P6, 내부: P7/P8. 도 2c, 6)를 사용하여 1.5 RNA 분자/μL를 검출할 수 있었다. 이 접근 방식은 동일한 에스케리치아 콜리 표적 RNA를 사용할 때 6차수만큼 민감도를 개선했다.
네스팅된 형광원성 압타머 NASBA 특이성 및 강건성
에스케리치아 콜리 및 슈도모나스 플루오레센스 ClpB 주형은 증폭된 영역에서 78 nt만큼 상이하며, 그 중 65 nt는 프라이머 혼성화 영역에 있다(정렬 도 10). 에스케리치아 콜리를 표적으로 하도록 설계된 프라이머가 슈도모나스 플루오레센스 표적과 함께 사용될 때, 형광은 0 RNA/μL 반응 대조군과 동일한 오차 범위 내에서 유지된다(Ec/Pf, 도 2c, 6). 네스팅된 망고 NASBA 반응이 인간 핵산의 큰 배경에서 실행 가능한지 확인하기 위해, 에스케리치아 콜리 ClpB 표적을 매우 과량의 인간 총 핵산(150 RNA 분자/μL 최종 ClpB 단표적 에스케리치아 콜리, 5 ng/μL 인간 총 핵산) 및, Ec 프라이머(외부: P1/P2B, 내부: P3/P4, 도 2d)를 사용하여 수행된 네스팅된 RNA 망고와 혼합하거나 혼합하지 않았다. 시간 의존적 신호의 출현은 약간 감소했지만, 강력한 신호는 이러한 조건에서 여전히 관찰되었으며, 이는 네스팅된 망고 NASBA가 이렇게 많은 양의 인간 RNA 및 DNA의 추가에도 불구하고 핵산 증폭 인공산물에 대체로 강건함을 시사한다.
실시예 2
RT-PCR 프라이머는 배양된 SARS-CoV-2(COVID-19; 표 2)로부터 1 kb 단편을 증폭하도록 설계되었다.
[표 2]
Figure pct00003
전사 후, 생성된 RNA(1 fM)는 NASBA Life Sciences(LS) 액체 NASBA 키트를 사용하여 네스팅된 망고 NASBA에 적용되었다. 5개 세트의 프라이머가 이들 영역 내에 중심에 있는 100 nt 영역을 증폭하도록 설계되었다. 프라이머 세트 5개 중 4개(표 3 참조)는 가장 빠른 상승 시간과 가장 높은 형광 신호를 생성하는 세트로 COVID-19 RNA를 성공적으로 증폭할 수 있었다(도 14).
[표 3]
Figure pct00004
Figure pct00005
1 aM의 민감도는 COVID-19 RNA의 희석 시리즈(1 fM~1 aM)를 수행하고 이를 네스팅된 NASBA에 적용함으로써 달성되었다(도 15a). 외부 반응물 20 μl당 100 ng의 외인성 핵산을 추가해도 양성(회색) 또는 음성(흑색) 신호에 영향을 미치지 않았다(도 15a). LS 동결건조 키트도 단일 단계 망고 NASBA에서 테스트되었으며, 10 pM의 민감도를 보여주었다(도 19).
LS 동결건조된 키트를 액체 키트 결과와 비교했다. 연속 희석된 SARS-CoV-2 RNA(1 fM~1 aM)는 도 15a에서와 같이 네스팅된 NASBA에 적용되었다. 도 16은 동결건조된 시약을 사용하여 10 aM 이상의 민감도를 나타냈다는 것을 보여준다.
도 17은 외부 네스팅된 NASBA 반응을 수행하기 전에 EDTA 또는 RNA 샘플 가열이 필요하지 않음을 보여준다.
전체 망고 NASBA 반응 시간을 단축시키기 위해, 10 aM SARS-CoV-2 RNA 표적 4를 사용하여 외부 반응 시간을 테스트했다(도 18). 20분의 외부 반응 시간은 40분 외부 인큐베이션 시간의 민감도와 견고성을 유지하는 것으로 입증되었다.
합성 바이러스 서열의 성공적인 검출 후, 진핵 세포에서 배양된 SARS-CoV-2 바이러스로부터 추출된 총 RNA에 대해 액체 및 동결건조된 LS 시약 모두를 망고 NASBA에서 테스트했다. 도 20(액체) 및 도 21(건조)은 배양 샘플(액체)을 100배 희석한 후, 배양된 바이러스의 성공적인 검출을 입증했다. 도 21은 또한 예열이 없고 외부 반응물에서 내부 반응물로의 20배 희석이 완전히 실행 가능함을 보여준다.
세인트 폴 병원의 ICU 유닛으로부터의 SARS-CoV-2 감염 환자의 기관 흡인물은 네스팅된 망고 NASBA를 사용하여 테스트되었으며(도 22), 환자는 원래 Roche RT-PCR 테스트를 수행하여 진단되었다. SARS-CoV-2 RNA는 감염된 환자(1a 및 2a)로부터의 샘플에서 20분 외부 및 12분 내부 NASBA 반응물에서 성공적으로 검출된 반면, 감염되지 않은 환자(5a)에 대한 곡선은 음성 대조군 물 샘플과 거의 동시에 상승했다. 합성 SARS-CoV-2와 마찬가지로, 네스팅된 망고 NASBA 이전에 바이러스 RNA 샘플을 가열할 필요가 없었다(도 23).
상업용 동결건조 시약은 인큐베이션 시작 시 약간 탁했다. 그러나, 이 탁도는 분석을 방해하지 않았으며, 도 15b 및 도 22b에서와 같이 데이터의 기울기를 플로팅함으로써 각 샘플에 대한 출현 시간을 모니터링할 수 있었다.
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다른 실시형태
본 발명은 하나 이상의 실시형태와 관련하여 설명되었다. 그러나, 특허청구범위에 정의된 본 발명의 범위를 벗어남이 없이 많은 변형 및 수정이 이루어질 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 다양한 실시형태가 본원에 개시되어 있지만, 이 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자의 일반적인 일반 지식에 따라 본 발명의 범위 내에서 많은 적응 및 수정이 이루어질 수 있다. 그러한 변형은 실질적으로 동일한 방식으로 동일한 결과를 달성하기 위해 본 발명의 임의의 양태에 대해 공지된 등가물을 대체하는 것을 포함한다. 숫자 범위에는 범위를 정의하는 숫자가 포함된다. "약"은 5% 이하의 값 또는 범위, 예를 들어, 0.5%, 1%, 1.5%, 2.0%, 2.5%, 3.0%, 3.5%, 4.0%, 4.5%, 5.0% 등의 편차(플러스 또는 마이너스)를 의미한다. 설명에서 "포함하는"이라는 단어는 "포함하지만, 이에 한정되지 않는" 구문과 실질적으로 동등한 개방형 용어로 사용되며, "포함하는"이라는 단어는 해당 의미를 갖는다. 그러나, "포함하는(comprising)" 또는 "포함한다(comprises)", 또는 동일한 어근을 갖는 변형이 본 명세서에서 사용되는 경우, "구성하는" 또는 "구성되는"에 대한 변형 또는 수정은 임의의 요소, 단계, 또는 특정되지 않은 성분, 또는 청구된 발명의 기본적이고 신규한 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 특정 재료 또는 인용된 단계로 제한되는, "본질적으로 구성되는" 또는 "본질적으로 구성하는"도 고려된다. 본원에서 참조문헌 인용은 그러한 인용이 본 발명에 대한 선행 기술임을 인정하는 것으로 간주되어서는 안 된다. 모든 공보는 각각의 개별 공보가 본원에 참조로 포함되는 것으로, 구체적이고 개별적으로 표시된 것처럼 그리고 마치 본원에 완전히 설명된 것처럼 본원에 참조로 포함된다. 본 발명은 실시예 및 도면을 참조하여 본원에 실질적으로 전술한 바와 같은 모든 실시형태 및 변형을 포함한다.
SEQUENCE LISTING <110> SIMON FRASER UNIVERSITY <120> METHODS AND REAGENTS FOR NUCLEIC ACID AMPLIFICATION AND/OR DETECTION <130> 10102-019WO1 <140> PCT/IB2020/055348 <141> 2020-06-07 <150> 62/858,874 <151> 2019-06-07 <160> 58 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 247 <212> DNA <213> E. coli <400> 1 ggacgtctgg aagaacgtgg ttatgaaatc cacatttctg acgaggcgct gaaactgctg 60 agcgagaacg gttacgatcc ggtctatggt gcacgtcctc tgaaacgtgc aattcagcag 120 cagatcgaaa acccgctggc acagcaaata ctgtctggtg aattggttcc gggtaaagtg 180 attcgcctgg aagttaatga agaccggatt gtcgccgtcc agtaaatgat aaaacgagcc 240 cttcggg 247 <210> 2 <211> 247 <212> DNA <213> P. fluorescens <400> 2 ggtcgcctgg ccgagcgtga gcttgacctg gagctgagca gcgaggcgtt ggacaagctg 60 attgcggtcg gttacgaccc ggtgtatggc gcacggccac ttaaacgtgc gatccagcgc 120 tggatcgaaa acccactggc acagttgatc ctgtcgggca gcttcatgcc aggcacccgc 180 gtgacggcca cggtggaaaa cgacgaaatc gtcttccact aagcccagcc tgtagggtta 240 ttagaga 247 <210> 3 <211> 247 <212> RNA <213> E. coli <400> 3 ggacgucugg aagaacgugg uuaugaaauc cacauuucug acgaggcgcu gaaacugcug 60 agcgagaacg guuacgaucc ggucuauggu gcacguccuc ugaaacgugc aauucagcag 120 cagaucgaaa acccgcuggc acagcaaaua cugucuggug aauugguucc ggguaaagug 180 auucgccugg aaguuaauga agaccggauu gucgccgucc aguaaaugau aaaacgagcc 240 cuucggg 247 <210> 4 <211> 247 <212> RNA <213> P. fluorescens <400> 4 ggucgccugg ccgagcguga gcuugaccug gagcugagca gcgaggcguu ggacaagcug 60 auugcggucg guuacgaccc gguguauggc gcacggccac uuaaacgugc gauccagcgc 120 uggaucgaaa acccacuggc acaguugauc cugucgggca gcuucaugcc aggcacccgc 180 gugacggcca cgguggaaaa cgacgaaauc gucuuccacu aagcccagcc uguaggguua 240 uuagaga 247 <210> 5 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 ctttaatacg actcactata ggacgtctgg aagaacgtgg ttatg 45 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 cccgaagggc tcgttttatc attta 25 <210> 7 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 aattctaata cgactcacta tagggagaag gctggacggc gacaatccgg tcttca 56 <210> 8 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 ggcacgtacg aatataccac ataccaaacc ttccttcgta cgtgccaaat ccacatttct 60 gacgagg 67 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 9 aaatccacat ttctgacgag g 21 <210> 10 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 10 ggcacgtacg aatataccac ataccaatcc ttccttcgta cgtgccaaat ccacatttct 60 gacgagg 67 <210> 11 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 11 aattctaata cgactcacta tagggaagga agtctggtga attggttccg g 51 <210> 12 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 12 ggcacgtacg aatataccac ataccaaacc ttccttcgta cgtgccttcc aggcgaatca 60 ctttac 66 <210> 13 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 13 ctttaatacg actcactata ggtcgcctgg ccgagcgtga gcttg 45 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 14 tctctaataa ccctacaggc tgggc 25 <210> 15 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 15 ctttaatacg actcactata gggaggctgg gcttagtgga aga 43 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 16 gagcagcgag gcgttggaca 20 <210> 17 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 17 ctttaatacg actcactata gggcgaaaac ccactggcac agt 43 <210> 18 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 18 ggcacgtacg aatataccac ataccaaacc ttccttcgta cgtgcccgcg ggtgcctggc 60 atgaag 66 <210> 19 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Linear RCA template <400> 19 aagttttcag ctgcttgccc tatagtgagt cgtattaggc acgtacgaat ataccacata 60 ccaatccttc cttcgtacgt gcccggaaaa gtttgaagag 100 <210> 20 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Target RCA splint <400> 20 aaaagcggaa aagtttgaag agaagttttc agctgcttgc gcttatccta tagtgagtcg 60 tatta 65 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T7 promoter top strand sequence <400> 21 ctttaatacg actcactata gg 22 <210> 22 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 22 ctttaatacg actcactata ggggtgcaag gttacaagag tgtgaatatc 50 <210> 23 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 23 acacaaactc ttaaagaatg tatagggtca 30 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 24 gtagacattt gtgcgaacag 20 <210> 25 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 25 ctttaatacg actcactata gggtgtatac attaaaaatg cagacattgt ggaag 55 <210> 26 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 26 cagttccaag aatttcttgc ttctcatta 29 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 27 agcatttctc gcaaattcca 20 <210> 28 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 28 ctttaatacg actcactata gggatcttta taagctcatg ggacacttcg 50 <210> 29 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 29 ttaataggcg tgtgcttaga atatatttta aaataac 37 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 30 accctgaggg agatcacgca 20 <210> 31 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 31 ctttaatacg actcactata gggtgccact agtctctagt cagtgtg 47 <210> 32 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 32 aacttcacca aaagggcaca agtttg 26 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 33 cagatgcaaa tctggtggcg 20 <210> 34 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 34 ctttaatacg actcactata gggaagaaag acagaatgat tgaactttca ttaattgac 59 <210> 35 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 35 gattgcagca ttgttagcag gattg 25 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 36 ttgttccttg aggaagttgt 20 <210> 37 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 37 ctttaatacg actcactata gggttccatc tctaattgag gtt 43 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 38 tagtcaacaa actgttggtc 20 <210> 39 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 39 ctttaatacg actcactata ggggcagtga ggacaatcag aca 43 <210> 40 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 40 ggcacgtacg aatataccac ataccaaacc ttccttcgta cgtgccacaa ttgtttgaat 60 agtagt 66 <210> 41 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 41 ctttaatacg actcactata gggctttcag ttataaatgg ctt 43 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 42 agctttttgg aaatgaagag 20 <210> 43 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 43 ctttaatacg actcactata ggggcaagtt gaacaaaaga tcg 43 <210> 44 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 44 ggcacgtacg aatataccac ataccaaacc ttccttcgta cgtgccttcc tctttaggaa 60 tctcag 66 <210> 45 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 45 ctttaatacg actcactata gggggaaaag aaaggtaaga aca 43 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 46 taccccctgc atacactaat 20 <210> 47 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 47 ctttaatacg actcactata gggtaccctg acaaagtttt cag 43 <210> 48 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 48 ggcacgtacg aatataccac ataccaaacc ttccttcgta cgtgccttga atgtaaaact 60 gaggat 66 <210> 49 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 49 ctttaatacg actcactata gggtaagaac aagtcctgag ttg 43 <210> 50 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 50 ggcacgtacg aatataccac ataccaaacc ttccttcgta cgtgcccaga tcctcagttt 60 tacatt 66 <210> 51 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 51 ctttaatacg actcactata gggttcccta agatttttga aat 43 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 52 agtttattct agtgcgaata 20 <210> 53 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 53 ctttaatacg actcactata gggtttgaat atgtctctca gcc 43 <210> 54 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 54 ggcacgtacg aatataccac ataccaaacc ttccttcgta cgtgcctcct tcaaggtcca 60 taagaa 66 <210> 55 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 55 ctttaatacg actcactata gggttttagt ttgttcgttt aga 43 <210> 56 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 56 gttgttcgtt ctatgaagac 20 <210> 57 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 57 ctttaatacg actcactata gggtttttag agtatcatga cgt 43 <210> 58 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 58 ggcacgtacg aatataccac ataccaaacc ttccttcgta cgtgcctgaa atctaaaaca 60 acacga 66

Claims (66)

  1. i) 표적 핵산 서열의 적어도 일부에 혼성화할 수 있는 제1 핵산 서열, 또는 그의 역-보체; 및
    ii) 표적 핵산 서열의 적어도 일부에 혼성화할 수 있는 제2 핵산 서열, 또는 그의 역-보체
    를 포함하고,
    압타머-암호화 주형 서열을 추가로 포함하는,
    핵산 분자 또는 그의 유사체로서,
    상기 압타머-암호화 주형 서열은 제1 핵산 서열의 3' 말단에 위치하며, 상기 제2 핵산 서열의 5' 말단은 제1 핵산 서열의 3' 말단에 공유적으로 부착되며, 상기 제2 핵산 서열의 3' 말단은 제1 핵산 서열에 실질적으로 혼성화되지 않는, 핵산 분자.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 제2 핵산 서열의 3' 말단의 적어도 3개의 말단 뉴클레오타이드는 제1 핵산 서열에 혼성화하지 않는, 핵산 분자.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 제1 핵산 서열은 길이가 약 20 내지 약 100개의 뉴클레오타이드인, 핵산 분자.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 압타머-암호화 주형 서열이 형광원성 압타머 서열을 암호화하는, 핵산 분자.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 형광원성 압타머 서열이 약 0.01 nM 내지 약 100 nM의 형광단 결합 해리 상수(KD)를 갖는, 핵산 분자.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 핵산 분자는 말단 줄기 구조를 포함하며, 여기서 제2 핵산 서열의 5' 말단의 적어도 말단 뉴클레오타이드는 말단 줄기 구조의 적어도 일부를 형성하는 제1 핵산의 5' 말단의 적어도 말단 뉴클레오타이드에 상보적인, 핵산 분자.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 제2 핵산 서열의 5' 말단의 적어도 2개의 말단 뉴클레오타이드는 말단 줄기 구조의 적어도 일부를 형성하는 제1 핵산의 5' 말단의 적어도 2개의 말단 뉴클레오타이드에 상보적인, 핵산 분자.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 제2 핵산 서열의 5' 말단의 적어도 3개의 말단 뉴클레오타이드는 말단 줄기 구조의 적어도 일부를 형성하는 제1 핵산의 5' 말단의 적어도 3개의 말단 뉴클레오타이드에 상보적인, 핵산 분자.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 핵산 분자, 또는 그의 유사체가 DNA 또는 RNA인, 핵산 분자.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제2 핵산 서열은 디제너레이트(degenerate) 서열을 포함하는, 핵산 분자.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 핵산 분자가 RNA 폴리머라제 프로모터 서열을 포함하지 않는, 핵산 분자.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 표적 핵산 서열은 바이러스, 미생물, 진균, 동물 또는 식물 유래이거나, 합성 작제물인, 핵산 분자.
  13. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 표적 핵산 서열이 병원성 바이러스 또는 병원성 박테리아로부터 유래된, 핵산 분자.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 제1 핵산 분자를 포함하는 조성물.
  15. 제14항에 있어서,
    표적 핵산 서열의 적어도 일부에 혼성화할 수 있고 제1 RNA 폴리머라제 프로모터 서열을 포함하는 제2 핵산 분자, 또는 그의 역-보체를 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 제1 및 제2 핵산 분자는 표적 핵산 서열의 제1 서열을 증폭할 수 있는 제1 프라이머 쌍을 형성하는, 조성물.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서,
    상기 제1 핵산 분자의 3' 말단이 제2 핵산 분자 또는 그 자체에 실질적으로 혼성화하지 않는, 조성물.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 제1 및 제2 핵산 분자가 서로 실질적으로 혼성화하지 않는, 조성물.
  18. 제14항 또는 제15항에 있어서,
    상기 제1 핵산 분자의 3' 말단의 1, 2 또는 3개의 말단 염기는 제2 핵산 분자의 3' 말단의 1, 2 또는 3개의 말단 염기에 혼성화하는, 조성물.
  19. 제14항 또는 제15항에 있어서,
    상기 제1 핵산 분자의 3' 말단은 표적 핵산의 서열과 정렬될 때 제2 핵산 분자의 3' 말단과 인접하는, 조성물.
  20. 제14항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    제3 핵산 분자 및 제4 핵산 분자를 추가로 포함하고,
    여기서 상기 제3 및 제4 핵산 분자는 표적 핵산 분자의 제2 서열을 증폭할 수 있는 제2 프라이머 쌍을 형성하며,
    상기 제3 핵산 분자 또는 제4 핵산 분자는 제2 RNA 폴리머라제 프로모터 서열을 포함하고,
    상기 제2 프라이머 쌍은 제1 프라이머 쌍 외부의 위치에서 표적 핵산 분자에 혼성화하며, 제1 서열 및 제2 서열을 증폭할 수 있는, 조성물.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 제2 RNA 폴리머라제 프로모터 서열은 표적 핵산 분자의 제2 서열을 제2 핵산 분자의 방향과 반대 방향으로 전사하는, 조성물.
  22. 제20항 및 제21항에 있어서,
    상기 제3 핵산 분자가 제2 RNA 폴리머라제 프로모터 서열을 포함하는 경우, 상기 제4 핵산 분자는 제2 압타머-암호화 서열을 포함하며, 또는 상기 제4 핵산 분자가 제2 RNA 폴리머라제 프로모터 서열을 포함하는 경우, 상기 제3 핵산 분자는 제2 압타머-암호화 서열을 포함하는, 조성물.
  23. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제3 핵산 분자의 3' 말단이 제4 핵산 분자에 실질적으로 혼성화하지 않는, 조성물.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 제3 및 제4 핵산 분자가 서로 실질적으로 혼성화하지 않는, 조성물.
  25. 제20항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1, 제2, 제3 및 제4 핵산 분자의 3' 말단이 서로 실질적으로 혼성화하지 않는, 조성물.
  26. 제25항에 있어서,
    상기 제1, 제2, 제3 및 제4 핵산 분자가 서로 실질적으로 혼성화하지 않는, 조성물.
  27. 제14항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    제5 핵산 분자 및 제6 핵산 분자를 추가로 포함하며,
    여기서 제5 및 제6 핵산 분자는 표적 핵산 분자의 제3 서열을 증폭할 수 있는 제3 프라이머 쌍을 형성하며,
    여기서 제5 핵산 분자 또는 제6 핵산 분자는 제3 RNA 폴리머라제 프로모터 서열을 포함하며,
    여기서 제3 프라이머 쌍은 제1 및 제2 프라이머 쌍의 외부 위치에서 표적 핵산 분자에 혼성화하며, 제1, 제2 및 제3 서열을 증폭할 수 있는, 조성물.
  28. 제27항에 있어서,
    상기 제3 RNA 폴리머라제 프로모터 서열이 표적 핵산 분자의 제3 서열을 제2 핵산 분자와 동일한 방향으로 전사하는, 조성물.
  29. 제27항 및 제28항에 있어서,
    상기 제5 핵산 분자가 제3 RNA 폴리머라제 프로모터 서열을 포함하는 경우, 제4 핵산 분자가 제3 압타머-암호화 서열을 포함하며, 또는 상기 제4 핵산 분자가 제3 RNA 폴리머라제 프로모터 서열을 포함하는 경우, 제5 핵산 분자가 제3 압타머-암호화 서열을 포함하는, 조성물.
  30. 제27항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제5 핵산 분자의 3' 말단이 제4 핵산 분자의 3' 말단에 실질적으로 혼성화하지 않는, 조성물.
  31. 제30항에 있어서,
    상기 제5 및 제4 핵산 분자가 서로 실질적으로 혼성화하지 않는, 조성물.
  32. 제27항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1, 제2, 제3, 제4, 제5 및 제6 핵산 분자의 3' 말단이 서로 실질적으로 혼성화하지 않는, 조성물.
  33. 제32항에 있어서,
    제1, 제2, 제3, 제4, 제5 및 제6 핵산 분자가 서로 실질적으로 혼성화하지 않는, 조성물.
  34. 제14항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
    표 3에 기재된 서열을 포함하는 하나 이상의 핵산 분자를 포함하는, 조성물.
  35. 제14항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 핵산 분자가 예비혼합된, 조성물.
  36. 제14항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 핵산 분자 중 하나 이상이 액체로 제공되는, 조성물.
  37. 제14항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
    핵산 분자 중 하나 이상이 동결건조된, 조성물.
  38. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자, 또는 제15항 내지 제37항 중 어느 한 항의 조성물을 표적 핵산 서열의 증폭을 위한 지침서와 함께 포함하는, 키트.
  39. 제38항에 있어서,
    상기 증폭이 등온 증폭인, 키트.
  40. 제38항 또는 제39항에 있어서,
    상기 등온 증폭이 핵산 서열 기반 증폭, 롤링 서클 증폭, 루프 매개 등온 증폭, 헬리카제 의존 증폭, 또는 가닥 변위 증폭인, 키트.
  41. i) 표적 핵산 분자를 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 제공하는 단계;
    ii) 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 제1 핵산 분자를 제공하는 단계;
    iii) 표적 핵산 서열 또는 이의 상보체의 적어도 일부에 혼성화할 수 있고 제1 RNA 폴리머라제 프로모터 서열을 포함하는 제2 핵산 분자를 제공하는 단계로서, 여기서 제1 및 제2 핵산 분자가 표적 핵산 서열의 제1 서열을 증폭할 수 있는 제1 프라이머 쌍을 형성하는, 단계; 및
    iv) 표적 핵산 분자 및 제1 프라이머 쌍을 포함하는 제1 증폭 반응을 수행하여 제1 증폭 산물을 수득하는 단계로서, 여기서 제1 증폭 산물이 표적 핵산 서열의 제1 서열을 포함하는, 단계
    를 포함하는, 표적 핵산 서열의 증폭 방법.
  42. 제41항에 있어서,
    상기 제1 핵산 분자의 3' 말단이 제2 핵산 분자의 3' 말단에 실질적으로 혼성화하지 않는, 방법.
  43. 제42항에 있어서,
    상기 제1 및 제2 핵산 분자가 서로 실질적으로 혼성화하지 않는, 방법.
  44. 제41항에 있어서,
    상기 제1 핵산 분자의 3' 말단의 1, 2 또는 3개의 말단 염기는 제2 핵산 분자의 3' 말단의 1, 2 또는 3개의 말단 염기에 혼성화하는, 방법.
  45. 제41항에 있어서,
    상기 제1 핵산 분자의 3' 말단은 표적 핵산의 서열과 정렬될 때 제2 핵산 분자의 3' 말단과 인접하는, 방법.
  46. 제41항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서,
    v) 제3 핵산 분자 및 제4 핵산 분자를 제공하는 단계로서,
    여기서 제3 및 제4 핵산 분자가 표적 핵산 분자의 제2 서열을 증폭할 수 있는 제2 프라이머 쌍을 형성하고,
    상기 제3 핵산 분자 또는 제4 핵산 분자가 제2 RNA 폴리머라제 프로모터 서열을 포함하고,
    상기 제2 프라이머 쌍이 제1 프라이머 쌍의 외부 위치에서 표적 핵산 분자에 혼성화하고 표적 핵산 분자의 제1 서열 및 제2 서열을 증폭할 수 있는, 단계; 및
    vi) 제1 증폭 산물 및 제2 프라이머 쌍을 포함하는 제2 증폭 반응을 수행하여 제2 증폭 산물을 수득하는 단계로서, 여기서 제2 증폭 반응이 제1 증폭 반응 전에 수행될 수 있고, 제2 증폭 산물이 표적 핵산 분자의 제1 서열 및 제2 서열을 포함하는, 단계
    를 추가로 포함하는, 방법.
  47. 제46항에 있어서,
    상기 제2 RNA 폴리머라제 프로모터 서열은 표적 핵산 분자의 제2 서열을 제2 핵산 분자의 방향과 반대 방향으로 전사하는, 방법.
  48. 제46항 및 제47항에 있어서,
    상기 제3 핵산 분자가 제2 RNA 폴리머라제 프로모터 서열을 포함하는 경우, 제4 핵산 분자가 제2 압타머-암호화 서열을 포함하며, 또는 상기 제4 핵산 분자가 제2 RNA 폴리머라제 프로모터 서열을 포함하는 경우, 제3 핵산 분자가 제2 압타머-암호화 서열을 포함하는, 방법.
  49. 제46항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제3 핵산 분자의 3' 말단이 제4 핵산 분자의 3' 말단에 실질적으로 혼성화하지 않는, 방법.
  50. 제49항에 있어서,
    상기 제3 및 제4 핵산 분자가 서로 실질적으로 혼성화하지 않는, 방법.
  51. 제46항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1, 제2, 제3 및 제4 핵산 분자의 3' 말단이 서로 실질적으로 혼성화하지 않는, 방법.
  52. 제51항에 있어서,
    상기 제1, 제2, 제3 및 제4 핵산 분자가 서로 실질적으로 혼성화하지 않는, 방법.
  53. 제41항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 표적 핵산 서열을 검출하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  54. 제41항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 표적 핵산 서열을 정량화하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  55. 제41항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 증폭이 등온 증폭인, 방법.
  56. 제41항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 증폭이 RNA 기반 또는 DNA 기반인, 방법.
  57. 제55항에 있어서,
    상기 등온 증폭이 핵산 서열 기반 증폭, 롤링 서클 증폭, 루프 매개 등온 증폭, 헬리카제 의존적 증폭, 가닥 변위 증폭, 또는 이들의 조합인, 방법.
  58. 제41항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 증폭이 다중화되는, 방법.
  59. 제41항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 증폭이 적어도 2개의 컬러 이미징을 포함하는, 방법.
  60. 제59항에 있어서,
    상기 증폭이 적어도 3개의 컬러 이미징을 포함하는, 방법.
  61. 제41항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 샘플이 바이러스, 미생물, 진균, 동물, 식물 또는 환경으로부터 유래하는, 방법.
  62. 제41항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 샘플이 병원성 바이러스 또는 병원성 박테리아로부터 유래하는, 방법.
  63. 제62항에 있어서,
    상기 병원성 바이러스가 코로나바이러스인, 방법.
  64. 제63항에 있어서,
    상기 코로나바이러스가 SARS, MERS 또는 SARS-CoV-2인, 방법.
  65. 제41항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 샘플이 물, 토양, 타액, 대변, 소변, 혈액, 기관 흡인물 또는 비강 흡인물로부터 수득되는, 방법.
  66. 제61항에 있어서,
    상기 동물이 인간인, 방법.
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