KR20230106038A - 새로운 등온 증폭 기술 기반 표적 유전자 검출 시스템 - Google Patents

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송자연
문정
장효원
임은경
정주연
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Abstract

본 발명은 정밀도가 향상된 새로운 고리매개등온증폭법과 CRISPR시스템을 이용한 표적 유전자 검출 시스템에 관한 것이다. 증폭된 표적 핵산의 고리에 DNA자임이 형성되도록 하여 DNA자임에 의한 변색반응을 통해 표적 핵산의 존부를 1차적으로 확인하는 한편, 표적 핵산을 인식하여 DNA자임을 절단할 수 있는 CRISPR/Cas 시스템을 추가로 적용하여 위 변색 반응이 중단되는지 여부를 통해 증폭된 생성물이 표적 핵산이 맞는지 2차적으로 확인함으로써, 위양성에 의한 노이즈를 저감시킨 표적 핵산 검출 기술이다. 빠르고 정확하게 질병을 정성적 및 정량적으로 진단할 수 있어 감염병 상황에서 현장진단에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

새로운 등온 증폭 기술 기반 표적 유전자 검출 시스템{Target gene detection system based on novel isothermal amplification technology}
본 발명은 원스텝의 새로운 핵산 등온증폭기술을 개발하고, 이를 기반으로 현장에서 진단 및 정량 분석하는 표적 유전자 검출 시스템에 관한 것이다.
감염병 바이러스의 감염으로 인한 질병의 확산을 초기에 대처하고, 감염병 바이러스에 대하여 적절한 치료를 진행하기 위하여서는, 해당 바이러스에 대한 감염 여부를 신속하고 정확하게 진단하는 것이 필요하다. 현재까지, 바이러스 감염을 초기에 진단하는 방법으로는 주로 유전자를 증폭하여 검출하는 중합효소연쇄반응 (PCR)을 기초로 하는 방법들이 보고되어 있다. 그러나 이러한 방법은 검출까지 4 ~ 6시간이 이상이 소요되며, 별도의 열 순환 장비 및 온도조절 장치가 필요하다.
최근 현장검사 (point-of-care testing, POCT) 기술 개발에 대한 수요가 증가하면서, 온도 조절 장치를 필요로 하는 PCR 기술의 단점을 해결하여 소형화를 구현할 수 있는 대체 기술에 대한 관심이 높아지고 있다. 이러한 기술 흐름에 발맞추어, 1990년대 초부터 온도 조절 과정 없이 일정한 온도에서 핵산 증폭이 가능한 등온 핵산 증폭 기술들 (nucleic acid sequence-based amplification (NASBA); helicase-dependent amplification (HDA); recombinase polymerase amplification (RPA); strand displacement amplification (SDA); loop-mediated isothermal amplification (LAMP); rolling circle amplification (RCA); exponential amplification reaction (EXPAR))이 활발히 개발되었다.
이러한 핵산 증폭 기술 중 LAMP 기술은 약 1시간의 짧은 반응 시간 내 최대 109배의 표적 핵산 증폭 효율을 구현함으로써, POCT 기술로서의 높은 활용 가능성을 보유한 기술로 평가받고 있다. 구체적으로, LAMP 기술은 표적 핵산과 4개의 프라이머 혼성화 반응 후, DNA 중합 효소의 작용으로 인해 생성된 덤벨 형태의 DNA 산물이 프라이머와의 혼성화 과정을 통해 증폭되는 기술이다. 하지만, LAMP 기술은 여러 개의 프라이머를 사용하기 때문에 프라이머간 무작위적 혼성화에 따라 배경신호 또한 빠르게 증폭하여 샘플의 위양성 (False-Positive) 반응 및 위음성 (False-Negative) 반응을 촉진할 수 있어, 정확한 표적 유전자 검출이 어렵다.
CRISPR/Cas 시스템은 박테리아의 면역체계로서, 외부에서 유입된 핵산을 인지 및 절단함으로써 외부로부터의 감염을 막는 역할을 한다. 특히, CRISPR/Cas 시스템이 염기서열 특이적인 인지와 절단이 가능하다는 것이 밝혀진 이후, 새로운 유전자 편집 기술로 주목받고 있는 동시에, 표적 유전자를 검출, 진단하는 기술에 까지 다양하게 응용되고 있다. 특히, CRISPR/Cas 시스템을 이용한 유전자 검출 기술들은 표적 유전자에 대한 높은 특이성, 빠른 검출 시간, 편리한 등온 반응과 같은 장점을 가지고 있다.
다만, 아직까지 바이러스 유전자 추출 및 정제과정 없이 등온 증폭 기술과 비색반응 (DNAzyme)을 활용하여 우수한 증폭 효율로 표적 유전자를 육안으로 검출하는 기술이 부재한 실정이다. 특히, 비색반응을 활용한 육안 검출의 경우, 표적유전자의 정확한 정량 검출이 어렵다는 단점이 있다. 또한, RT-LAMP의 양성반응을 위음성 및 위양성 반응과 구별하는 기술이 필요한 실정이다.
이에, 본 발명자들은 별도의 유전자 추출, 정제 과정을 수행하지 않고도 높은 증폭 효율을 보이는 새로운 등온 증폭 기술을 개발하고자 하였다. 유전자가위 시스템을 기반으로 하여 RT-LAMP의 위음성 및 위양성 반응을 구별하고 표적 유전자만 신속 검출 가능한 기술을 개발하여, 본 발명을 완성하였다. 또한 현장진단 기기 및 스마트폰 앱을 개발하여 쉽고 편리하게 표적 타겟 유무 확인 및 농도 정량화가 가능함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 원스텝의 새로운 등온증폭 기술을 개발하여, 비색반응으로 표적 유전자를 육안으로 검출할 수 있은 프라이머 세트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 채취된 생물학적 샘플(Cell lysate, 비인두 흡입물, 객담, 환자샘플 등)에서 유전자를 분리, 정제하는 단계 없이도 진단 및 정량 분석 기술을 이용하여 1시간 이내에 표적 유전자 검출하는 표적 유전가 검출 키트 및 방법을 제공하는 것에 있다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 표적 핵산의 제1 영역에 상보적으로 결합하는 제1F 결합부, 상기 표적 핵산에서 상기 제1 영역보다 더 5’-방향에 위치하는 제2 영역과 동일한 서열을 갖는 제2F 결합부 및 상기 제1F 결합부와 상기 제2F 결합부를 연결하고 시토신-풍부(C-rich) 서열을 포함하는 제1 고리 형성부를 포함하는 정방향 내측 프라이머;
표적 핵산에서 상기 제1 영역보다 더 3’-방향에 위치하는 제3 영역과 상보적으로 결합하는 정방향 외측 프라이머;
표적 핵산의 제4 영역에 상보적으로 결합하는 제1B 결합부, 상기 표적 핵산에서 상기 제4 영역보다 더 5’-방향에 위치하는 제5 영역과 동일한 서열을 갖는 제2B 결합부 및 상기 제1B 결합부와 상기 제2B 결합부를 연결하고 시토신-풍부(C-rich) 서열을 포함하는 제2 고리 형성부를 포함하는 역방향 내측 프라이머;
표적 핵산에서 상기 제4 영역보다 더 3’-방향에 위치하는 제6 영역과 상보적으로 결합하는 역방향 외측 프라이머; 를 포함하는, 고리매개등온증폭법용 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 고리매개등온증폭법용 프라이머 세트를 포함하는 제1 조성물; 및 구아닌-사중나선구조(G-quadruplex)에 의해 변색 반응을 일으키는 시약을 포함하는 제2 조성물;을 포함하는 표적 핵산 검출을 위한 고리매개등온증폭법용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 표적 핵산이 포함되어 있을 것으로 예상되는 시료를 대상으로 상기 프라이머 세트를 이용하여 고리매개등온증폭 반응을 수행하는 단계; 및 상기 고리미개등온증폭 반응의 생성물에 변색 반응을 일으키는 시약을 처리하여 변색 반응을 확인하는 단계; 를 포함하는 표적 핵산의 정밀 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 표적 핵산 검출 방법에 따르면, 별도로 유전자를 정제하거나 표지하는 등의 과정 없이, 그리고 고가의 온도 조절 시스템이 구비된 장비 없이도, 표적 핵산의 존부를 나안으로 확인할 수 있을 뿐만 아니라, CRISPR/Cas 시스템을 통해 증폭된 산물이 표적 핵산이 맞는지를 다시 한번 확인할 수 있도록 하여 위양성을 판별함으로써, 검출 정밀도를 획기적으로 향상시킬 수 있다.
아울러, 변색 반응의 세기를 흡광도로 정량화하고, 기계학습을 통해 이를 데이터베이스화함으로써, 현장에서 스마트폰 등의 기계로 변색 반응을 측정하여 표적 핵산의 존부를 정성적으로뿐만 아니라, 정량적으로까지 분석할 수 있다. 따라서 각종 전염병 관련 바이러스 핵산과 관련된 다른 질병 진단에도 활용될 수 있고, 물질적 및 시간적 비용을 크게 절감할 수 있으며, 빠르고 정확하게 다중 연속 검출이 가능하므로 감염병 상황에서 대량 진단에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 본원 발명의 새로운 고리매개등온증폭과정을 도시한 것이다. 도 1a 내지 도 1g는 비순환기를, 도 1h는 순환기에서 고리매개등온증폭산물의 고리형성부에서 구아닌-사중나선이 형성되는 것을 도시한 것이다. 상기 도 1에서 “G*”는 구아닌-사중나선 구조를 형성하는 서열과 상보적인 시토신-풍부 서열을 의미하고, “G”는 구아닌-사중나선 구조를 형성하는 서열을 의미한다.
도 2의 (a)는 현장진단 기기 및 스마트폰을 활용한 전체적인 실험 순서 및 반응시간을 개략적으로 도시한 것이다. (b)는 등온 유전자증폭 기술(RT-LAMP), 변색 반응(DNAzyme) 및 유전자가위(CRISPR-Cas9)를 활용한 유전자 검출 시스템의 구체적인 모식도를 도시한 것이다.
도 3는 PS-DNA 프라이머와 DNA 프라이머를 사용하여 RT-LAMP를 수행하면서 측정한 실시간 형광 곡선(real time flourescence curve)과 비색반응 후 흡광도 스펙트럼을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 4의 (a)는 표적 RNA인 SARS-CoV-2의 ORF1 유전자, S 유전자, N 유전자 내 표적 유전자 서열 위치를 도시한 것이다. (b)는 다양한 SARS-CoV-2의 표적 유전자별 등온 유전자증폭 기술(RT-LAMP), 변색 반응(DNAzyme) 후 이미지 및 guide RNA 별로 처리하였을 때의 변색 반응 이미지 및 416 nm에서 상대적 흡광도 세기를 나타낸 것이다.
도 5의 (a), (c) 및 (e)는 RT-LAMP과 DNA자임 반응 후, 변색반응 결과를 이용하여 SARS-CoV-2 ORF1, N 및 S 유전자의 농도별(1aM ~ 1nM) 흡광도 스펙트럼을 각각 나타낸 것이다. (b), (d) 및 (f)는 RT-LAMP과 DNA자임 반응 후, 크리스퍼 반응 전(ON), 후(OFF)의 ORF1, N 및 S 유전자의 농도별 416 nm에서 흡광도를 각각 그래프로 그려, 검출 민감도를 보여주는 결과를 나타낸 것이다.
도 6의 (a)는 현장진단 기기의 모식도를 나타낸 것이다. (b)는 기계 학습결과 가장 잘 예측하는 분류기 결과를 보여주는 것이다. (c)는 스마트폰 앱을 이용해 변색반응 샘플을 측정하고 해당 샘플의 표적 유전자 진단 및 농도를 정량화하여 보여주는 것을 나타낸다.
도 7는 코로나 환자 샘플을 등온 유전자증폭 기술 (RT-LAMP), 변색 반응 (DNAzyme) 처리 후 샘플의 비색반응 이미지 (ON)와 유전자가위 (CRISPR-Cas9) 처리 후 샘플의 변색 반응 이미지 (OFF)를 기반으로 분석된 진단 결과와 농도 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 8의 (a)는 SARS-CoV-2 변이바이러스 중 공통적으로 나타나는 D614G 돌연변이에 대한 특징을 보여준다. (b)는 코로나 변이바이러스 표적인 D614G 서열을 보여준다. (c)는 코로나 변이바이러스를 검출 및 체액 샘플에 스파이크하여 검출한 결과이다.
도 9은 SARS-CoV-2 변이바이러스 보유 환자 샘플을 야생형 SARS-CoV-2 바이러스와 구분하여 검출한 것으로, 임상 적용가능성을 보여준 결과를 나타낸 것이다.
먼저, 본 발명에서 사용된 용어를 정의한다.
본 발명에서 일컫는 ‘고리매개등온증폭법(loop mediated isothermal amplification, LAMP)’은 기존 PCR(polymerase chain reaction) 법과 달리 등온의 조건에서 표적 서열의 증폭 반응을 수행할 수 있는 방법을 의미한다. 상기 고리매개등온증폭법은 표적 핵산과 4종의 프라이머가 서로 혼성화된 이후 DNA 중합효소에 의해 생성된 덤벨 형태의 증폭 산물이 다시 프라이머와의 혼성화되고 증폭되는 과정을 통해 표적 핵산을 증폭하는 기술을 의미한다. 상기 고리매개등온증폭법은 증폭시킬 표적 핵산의 6개의 영역을 인식하도록 특별히 고안된 4종의 프라이머를 사용하게 된다. 따라서 종래 표적 핵산 내 2개의 위치를 인식하는 PCR(polymerase chain reaction) 반응에 비해 표적 핵산을 더욱 높은 특이성으로 증폭해 낼 수 있다.
상기 고리매개등온증폭법에서 이용되는 DNA 중합효소, 예컨대 Bst DNA 중합효소는 상기 외측 프라이머에 의하여 3’-방향에서 합성되어 신장되는 사슬에 의하여 상기 내측 프라이머에서 합성되어 신장된 사슬이 주형으로부터 이탈되도록 하는 사슬 치환을 유발할 수 있는 것이 이용될 수 있고, 상기와 같은 사슬 치환 현상에 의하여 주형으로부터 이탈된 증폭 산물의 3’-말단에서 덤벨 형태의 구조가 형성된다.
상기 4종의 프라이머는 외측(outer) 프라이머 2종과 내측(inner) 프라이머 2종으로 구성된다. 상기 2종의 내측 프라이머는 각각 정방향 내측 프라이머(forward inner primer, FIP)와 역방향 내측 프라이머(backward inner primer, BIP)이고, 상기 고리매개등온증폭 반응에 필수적인 고리(loop)를 만드는 고리 형성부를 포함하는 뉴클레오티드로 구성된다. 또한, 상기 2종의 외측 프라이머는 정방향 외측 프라이머(forward outer primer, FP)와 역방향 외측 프라이머(backward outer primer, BP)이고, 상기 고리매개등온증폭 반응의 비순환기(non-cyclic step) 동안 상기 내측 프라이머로부터 합성되어 신장된 가닥을 주형으로부터 이탈시키기 위한 사슬의 신장 개시점이 되는 역할을 한다.
상기 고리매개등온증폭 반응은, 먼저 정방향 또는 역방향 내측 프라이머가 표적 핵산에 상보적으로 결합하여 DNA 중합효소에 의해 신장되고, 이어 상기 정방향 또는 역방향 내측 프라이머의 외측, 다시 말해서 상기 표적 핵산의 3’ 방향의 외측에 상기 정방향 또는 역방향 외측 프라이머가 각각 상보적으로 결합되고 DNA 중합효소에 의해 신장되면서 상기 정방향 또는 역방향 내측 프라이머에 의해 먼저 형성된 증폭 산물을 상기 표적 핵산으로부터 떨어뜨리는 사슬 치환(strand displacement) 현상을 유발한다. 상기와 같이 표적 핵산에서 이탈된 증폭 산물의 5′-말단 및 3′-말단 각각에서 고리구조가 형성되고, 이러한 덤벨 형태의 프로브가 형성되면 순환기에서 증폭 산물이 기하급수적으로 형성된다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 일 측면은 표적 핵산을 고리매개등온증폭법으로 증폭시키기 위한 프라이머 세트를 제공한다.
상기 본 발명의 표적 핵산의 고리매개등온증폭법용 프라이머 세트는 정방향 내측 프라이머, 정방향 외측 프라이머, 역방향 내측 프라이머 및 역방향 외측 프라이머를 포함한다.
상기 ‘프라이머 세트’는 표적 핵산을 고리매개등온증폭법을 이용하여 증폭시키기 위한 염기서열들로, 하나의 진단대상 유전자 또는 표적 핵산에 정방향 프라이머와 역방향 프라이머가 세트로 이루어진 것이다. 구체적으로, 4개의 정방향 내측 프라이머(FIP), 정방향 외측 프라이머(FP), 역방향 내측 프라이머(BIP), 역방향 외측 프라이머(BP)를 포함한다.
상기 ‘표적 핵산’은 증폭하고자 하는 임의의 핵산일 수 있고, 상기 핵산은 RNA 또는 DNA일 수 있다. 또한, 상기 표적 핵산은 병원성 미생물 유래일 수 있고, 이 경우 상기 프라이머 세트는 상기 병원성 미생물을 검출하는데 이용될 수 있다. 이때 상기 병원성 미생물은 인간이나 동물의 체내에서 병을 일으키는 감염원이 되는 미생물을 의미하며, 바이러스(virus), 박테리아(bacteria) 등일 수 있다. 상기 바이러스는 단일가닥 RNA, 이중가닥 RNA 또는 DNA 바이러스일 수 있고, 예컨대 코로나바이러스과(Coronaviridae), 필로바이러스과(Filoviridae), 오소믹소바이러스과(Orthomyxoviridae), 헤르페스바이러스과(Herpesviridae), 파필로마바이러스과(papilomaviridae) 또는 피코르나바이러스과 (Picornaviridae)에 속하는 바이러스 일 수 있고, 구체적으로 인플루엔자 바이러스 (Influenza virus), SARS-CoV-2 바이러스 등이거나 또는 이의 변이바이러스일 수 있다. 상기 박테리아는 그람양성균 또는 그람음성균일 수 있고, 예컨대, 병원성 대장균, 살모넬라균, 클로스트리디움, 연쇄상구균, 황색포도상구균일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 프라이머는 상기 프라이머는 복제하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥의 올리고뉴클레오티드 서열을 의미하며, 고리매개등온증폭 반응에 의하여 핵산이 합성되어 신장되는 증폭 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작할 수 있도록 결정되어야 하며. 상기 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 표적 핵산의 복합도(complexity) 뿐만 아니라 온도 및 이온 강도 조건에 의존적으로 결정할 수 있다.
상기 프라이머는 핵산으로 구성될 수 있고, 상기 핵산은 gDNA, cDNA 등과 같은 DNA나 RNA일 수 있다. 또한, 상기 핵산에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함할 수 있다. 예컨대, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다.
상기 정방향 내측 프라이머는 제1F 결합부, 제2F 결합부 및 제1 고리 형성부를 포함한다.
상기 제1F 결합부는 표적 핵산의 제1 영역에 상보적으로 결합한다. 상기 제1 영역은 표적 핵산에서 증폭하고자 하는 서열의 5’-말단의 임의의 서열일 수 있다. 상기 제1F 결합부는 상기 정방향 내측 프라이머가 표적 핵산의 제1 영역에 상보적으로 결합하여 고리매개등온증폭 반응의 개시할 수 있도록 하는 역할을 한다.
상기 제2F 결합부는 표적 핵산의 제2 영역과 동일한 서열을 가지는 것일 수 있다. 상기 제2 영역은 상기 표적 핵산의 제1 영역에서 5‘-방향에 위치하는 것일 수 있고, 상기 제1F 결합부에서 고리매개등온증폭 반응을 통해 새롭게 합성되어 신장되는 가닥에 상보적으로 결합할 수 있다.
또한, 상기 제1F 결합부와 상기 제2F 결합부의 사이에는 상기 제1 고리 형성부가 개재될 수 있다. 다시 말해서, 상기 제1 고리 형성부는 상기 제1F 결합부와 상기 제2F 결합부 사이에 위치하여 상기 제1F 및 제2F 결합부를 연결하는 것일 수 있다. 상기 제1 고리 형성부는 상기 표적 핵산에 상보적이지 않은 서열일 수 있다. 따라서 상기 제1F 결합부에서 새롭게 합성되어 신장되는 가닥에 상기 제2F 결합부가 상보적으로 결합할 때, 상기 제1F 결합부와 상기 제2F 결합부의 사이에서 제1 고리를 형성할 수 있다. 또한, 상기 제1 고리 형성부는 시토신-풍부(C-rich) 서열을 포함할 수 있다. 상기 시토신-풍부 서열은 시토신(cytosine), 그 유사체 또는 유도체가 다른 영역(region)에 비해 높은 빈도로 나타나는 핵산 분자의 영역을 의미하며, 구체적으로는 시토신이 연속으로 3번 이상 반복되는 모티프(motif)를 적어도 하나 이상 가지는 영역일 수 있다. 상기 제1 고리 형성부의 시토신-풍부 영역은 고리매개등온증폭 반응에 의하여 그에 상보적인 구아닌-풍부 영역을 생성할 수 있다. 상기 구아닌-풍부영역은 후술하는 바와 같이 구아닌-사중나선(G-quadruplex) 구조를 형성할 수 있다. 이를 위해, 상기 시토신 풍부 영역은 구아닌-사중나선(G-quadruplex) 구조를 형성할 수 있는 공지의 서열과 상보적인 것일 수 있다. 상기 구아닌-사중나선 구조를 형성할 수 있는 공지의 서열로는 GGGGGGTGGGTGGG(T30695, 서열번호 35), GGGTGGGGGGTTGGG(PW17, 서열번호 36), GGGTGGGTGGGTGGGT(서열번호 37), TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG(서열번호 38), GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG(서열번호 39), ACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGT(서열번호 40), TGGGTAGGGCGGGTTGGGAAA(서열번호 41), TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG(서열번호 42), GGTTGGTGTGGTTGG(서열번호 43), GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG(서열번호 44), GGGCGCGGGAGGAAGGGGGCGGG(서열번호 45), GAGGGTGGGGAGGGTGGGGAAG(서열번호 46), GTGGGTCATTGTGGGTGGGTGTGG(서열번호 47), GTGGGTAGGGCGGGTTGG(서열번호 48)등을 들 수 있고, 이외에도 구아닌-사중나선 구조를 형성할 수 있는 것이라면 제한없이 이용될 수 있다. 상기 구아닌-사중나선(G-quardruplex) 구조는 구아닌 또는 그의 유사체 및/또는 유도체가 풍부(G-rich)하여 4개의 구아닌이 한 평면에서 후그스틴(hoogsteen) 형태로 수소결합을 이루는 특유의 사중나선 구조를 의미한다.
상기 정방향 내측 프라이머의 제1 고리 형성부에 포함된 시토신-풍부 서열은 올리고뉴클레오티드를 형성하는 적어도 하나 이상의 인산디에스터 결합이 이중나선 구조의 염기 중층(base stacking) 상호작용을 감소시켜 Tm(melting point)을 낮출 수 있는 다른 형태로 개질된 것일 수 있다. 예컨대, 상기 인산디에스터 결합은 포스포로티오에이트 결합으로 개질될 수 있다. 또한 상기 제1 고리형성부는 미스매치(mismatch) 서열을 도입하거나, UNA(Unlocked nucleic acid) 등으로 개질될 수도 있다. 상기와 같은 개질에 의해 상기 시토신-풍부 서열과 새롭게 형성되는 구아닌-풍부 서열의 염기 중층 상호작용이 약해지므로, Tm이 낮아지거나 시토신-풍부 서열과 구아닌-풍부 서열이 쉽게 분리되고, 그로 인해 구아닌-사중나선(G-quadruplex) 구조가 더욱 잘 형성될 수 있다.
상기 정방향 외측 프라이머는 표적 핵산의 제3 영역과 상보적으로 결합할 수 있다. 상기 제3 영역은 상기 표적 핵산에서 상기 정방향 내측 프라이머의 제1F 결합부가 상보적으로 결합되는 제1 영역보다 더 3’-방향에 위치하는 것일 수 있다. 따라서 상기 정방향 외측 프라이머는 상기 정방향 내측 프라이머보다 더 3’-방향의 위치에 결합되고, 고리매개등온증폭 반응의 초기 단계인 비순환기(non-cyclic step)에 상기 정방향 외측 프라이머에서 새로운 가닥이 합성되어 신장되도록 함으로써 상기 정방향 내측 프라이머에서 합성되어 신장된 가닥을 표적 핵산에서 분리시키는 사슬 치환을 일으킬 수 있다.
상기 역방향 내측 프라이머는 제1B 결합부, 제2B 결합부 및 제2 고리 형성부를 포함한다.
상기 제1B 결합부는 표적 핵산의 제4 영역에 상보적으로 결합한다. 상기 제4 영역은 표적 핵산에서 증폭하고자 하는 서열의 5’-말단의 임의의 서열일 수 있다. 상기 제1B 결합부는 상기 역방향 내측 프라이머가 표적 핵산의 제4 영역에 상보적으로 결합하여 고리매개등온증폭 반응의 개시할 수 있도록 하는 역할을 한다.
상기 제2B 결합부는 표적 핵산의 제2 영역과 동일한 서열을 가지는 것일 수 있다. 상기 제2B 영역은 상기 표적 핵산의 제1 영역에서 5’-방향에 위치하는 것일 수 있고, 상기 제1B 결합부에서 고리매개등온증폭 반응을 통해 새롭게 합성되어 신장되는 가닥에 상보적으로 결합할 수 있다.
또한, 상기 제1B 결합부와 상기 제2B 결합부의 사이에는 상기 제1 고리 형성부가 개재될 수 있다. 다시 말해서, 상기 제1 고리 형성부는 상기 제1B 결합부와 상기 제2B 결합부 사이에 위치하여 상기 제1B 및 제2B 결합부를 연결하는 것일 수 있다. 상기 제1 고리 형성부는 상기 표적 핵산에 상보적이지 않은 서열일 수 있다. 따라서 상기 제1B 결합부에서 새롭게 합성되어 신장되는 가닥에 상기 제2B 결합부가 상보적으로 결합할 때, 상기 제1B 결합부와 상기 제2B 결합부의 사이에서 제2 고리를 형성할 수 있다.
상기 제2 고리 형성부는 시토신-풍부(C-rich) 서열을 포함한다. 상기 시토신-풍부 서열은 제1 고리 형성부를 설명하면서 상술한 내용과 동일하고, 구체적인 설명은 생략한다.
상기 역방향 외측 프라이머는 표적 핵산의 제3 영역과 상보적으로 결합할 수 있다. 상기 제6 영역은 상기 표적 핵산에서 상기 역방향 내측 프라이머의 제1B 결합부가 상보적으로 결합되는 제4 영역보다 더 3’-방향에 위치하는 것일 수 있다.
또한, 상기 역방향 내측 프라이머의 제2 고리 형성부에 포함된 시토신-풍부 서열 역시, 상기 정방향 내측 프라이머의 제1 고리 형성부와 마찬가지로 구아닌-사중나선(G-quadruplex) 구조의 형성을 더욱 용이하게 하기 위해, 올리고뉴클레오티드를 형성하는 적어도 하나 이상의 인산디에스터 결합이 이중나선 구조의 염기중층(base stacking) 상호작용을 감소시키거나 Tm(melting point)을 낮출 수 있는 다른 형태, 예컨대 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 결합으로 개질될 수 있다. 또한 상기 제1 고리형성부는 미스매치(mismatch) 서열을 도입하거나, UNA(Unlocked nucleic acid) 등으로 개질될 수 있다.
도 1은 본 발명의 프라이머 세트가 고리매개등온증폭 반응의 비순환기 과정에서 구아닌-사중나선 구조를 갖는 덤벨 형상의 증폭 산물을 형성하는 과정을 개략적으로 설명한 모식도이다.
도 1을 참고하면, 먼저 정방향 내측 프라이머의 제1F 결합부가 표적 핵산의 임의의 영역인 제1 영역에 결합하고(도 1의 b), 상기 내측 프라이머의 3’-말단부터 DNA 중합효소에 의하여 새로운 가닥이 합성된다(도 1의 c). 상기와 같은 내측 프라이머로부터의 신장이 진행되는 동안, 상기 표적 핵산의 제1 영역보다 3’-방향에 있는 제3 영역에 상기 정방향 외측 프라이머가 상보적으로 결합하고(도 1의 d) 사슬치환능이 있는 DNA 중합효소에 의하여 상기 정방향 외측 프라이머로부터 새로운 가닥이 합성되면서 상기 정방향 내측 프라이머로부터 합성되어 신장된 가닥이 상기 표적 핵산으로부터 분리된다(도 1의 e). 한편, 상기 표적 핵산으로부터 분리된 가닥의 5’-말단에 있는 제2F 결합부가 상기 분리된 가닥의 3’-방향에 존재하는 상보적인 서열과 혼성화되어 고리 구조를 형성한다(도 1의 f). 이러한 일련의 과정이 상기 표적 핵산의 반대편에서도 역방향 내측 프라이머 및 역방향 외측 프라이머에 의하여 동일하게 일어나고, 결국 증폭 산물의 양 말단에 고리 구조가 형성된 덤벨 형상의 LAMP 프로브가 형성된다(도 1의 g).
상기와 같이 덤벨 형상의 LAMP 프로브가 형성되면, 상기 LAMP 프로브의 3’-말단 자체가 프라이머로 작용하여 별도의 가열과정 없이 표적 핵산이 지수적으로 증폭되는 고리매개등온증폭 반응의 순환기가 시작되는데, 이때는 상기 정방향 내측 프라이머와 상기 역방향 내측 프라이머만이 관여하게 되고, 상기 정방향 내측 프라이머 또는 상기 역방향 내측 프라이머에서 합성되어 신장되는 가닥에서 상기 제1 또는 제2 고리 형성부에 포함된 시토신-풍부 영역에 의해 구아닌-풍부 서열이 합성되며, 이러한 구아닌-풍부 서열에 의하여 구아닌-사중나선 구조(G-quadruplex)가 형성된다(도 1의 h).
한편, 상기 구아닌-사중나선 구조(G-quadruplex)는 DNA 네가닥으로 이루어진 육면체 모양의 구조로, DNA 염기서열 중 구아닌이 연이어 존재하는 경우, 구체적으로는 구아닌이 연속으로 3번 이상 반복되는 모티프(motif)를 적어도 하나 이상 가지는 영역에서 형성된다. 핵산에서 핵염기간 수소 결합이 왓슨-크릭 염기쌍과 달라진 특별한 염기쌍을 후그스틴 염기쌍이라고 하는데, 구아닌-사중나선 구조(G-quadruplex)가 형성되려면 구아닌들의 후그스틴 염기쌍도 중요하지만 구아닌들이 만든 사각 판들 사이에 양이온이 들어가 구조를 안정화하여야한다. 구아닌-사중나선 구조(G-quadruplex)는 헤민과 비공유결합하여 과산화효소의 활성, 금속이온과 결합하여 비대칭 Diels-Alder 반응과 Friedle-Crafts 반응에서 비대칭 촉매 활성(Chiral catalytic function), 또는 다른 고분자전해질과 결합하여 형광을 나타내는 활성을 가질 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 상기 고리매개등온증폭법의 생성물에서 형성된 구아닌-사중나선 구조는 헤민과 결합하여 겨자무과산화효소(HRPzyme)와 같은 활성을 나타낼 수 있다.본 발명의 다른 측면은 상기 고리매개등온증폭법용 프라이머 세트를 이용하여 표적 핵산을 검출하기 위한 키트를 제공한다.
상기 본 발명의 표적 핵산 검출용 키트는 상기 고리매개등온증폭법용 프라이머 세트를 포함하는 제1 조성물과 함께, 구아닌-사중나선구조(G-quadruplex)에 의해 변색 반응을 일으키는 시약을 포함하는 제2 조성물을 포함한다.
상기 제1 조성물은 상기 프라이머 세트를 포함한다. 상기 제1 조성물은 DNA 중합효소 또는 Bst DNA 중합효소를 더 포함할 수 있다. 또한 버퍼 및 염, 예컨대 트윈 20, Tris-HCl, Triton X-100, 증류수(DW), DEPC,황산마그네슘, 염화마그네슘, 황산암모늄, BSA, 염화칼륨, 글리세롤, DSMO, TMAC 및 포름아마이드 로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 더 포함할 수 있다. 또한, 실시간으로 증폭산물의 양을 측정할 수 있는 하이드록시나프톨 파랑 지시약(Hydroxylnaphtol blue,) 칼세인(calcein), SYBR 그린 II 및 EtBr로 이루어진 군에서 어느 하나 이상의 염료를 더 포함할 수 있다. 이외에도 LAMP 반응에 필요하고 프라이머 세트를 안정화시키는 것이라면 이에 한정되지 않고 포함될 수 있다.
상기 제2 조성물은 구아닌-사중나선 구조(G-quadruplex)에 의해 변색 반응을 일으키는 시약을 포함한다. 상기 구아닌-사중나선 구조는 효소 활성을 가지는 핵산 분자인 DNA자임(DNAzyme)일 수 있다. 따라서 상기 구아닌-사중나선 구조가 가지는 효소 활성에 의하여 변색 반응이 일어날 수 있고, 예컨대 헤민(hemin)의 존재 하에서 과산화효소의 활성을 나타낼 수 있다. 상기 DNA자임은 열 안정성, 기능화의 용이성, 비용 효율성 덕분에 과산화효소 대신 수많은 현장진단이나 비색 센싱 시스템에 유용하게 사용될 수 있다는 장점이 있다. 상기 변색 반응은 육안으로 확인할 수 있는 색상의 변화(colorimetric assay) 또는 형광 변화를 의미한다. 제2 조성물에서 변색 반응을 일으키는 시약은 구아닌-사중나선 구조를 형성할 수 있는 구아닌-풍부 서열과 결합하여 변색 반응 또는 비색 반응을 촉매하는 DNA자임 보조인자(cofactor)와 기질(substrate)을 포함할 수 있다. 헤민과 과산화물, 구체적으로, 과산화수소, ABTS, TMB(3,3‘,5,5’-tetramethylbenzidine), 루미놀, Amplex-Red (10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine), OPD(o-페닐렌다이아민 다이하이드로클로라이드), DAB(다이아미노벤지딘), AEC(3-아미노-9-에틸카보졸), CN(4-클로로-1-나프톨) 및 호모바닐산으로 이루어지는 군 중 선택된 어느 하나 이상의 과산화물을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 구아닌-풍부 서열과 결합하여 비색 반응 또는 변색반응을 촉매할 수 있는 보조인자(cofactor)와 기질이라면 제한 없이 사용될 수 있다.
비색 반응은 등온 증폭 반응 종료 후 반응 용액에 헤민(hemin)을 첨가하여, 등온 증폭 반응 산물의 DNA자임(HRPzyme) 서열과 헤민이 결합하여 구아닌-사중나선/헤민 복합체를 형성하도록 유도한 후, 과산화수소(H2O2)와 ABTS 또는 TMB(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine)과 같은 기질을 넣고 반응시키면 DNA자임이 기질을 산화하여 푸른색(비색)을 나타나게 한다. 다만 이에 한정되지 않고 기질을 산화하여 변색 반응을 일으킬 수 있는 시약이라면 어느 것이든 사용할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는, 표적 핵산이 포함된 양성 시료의 경우 상기 키트의 제1 조성물을 사용하여 생성된 구아닌-사중나선 구조를 갖는 고리매개등온증폭 반응의 생성물에 헤민을 첨가하는 경우에 DNA자임으로서의 활성을 나타냄을 확인한 반면, 표적 핵산이 포함되지 않는 음성 시료의 경우 고리매개등온증폭에 의하더라도 표적 핵산이 증폭되지 않으므로 반응물 내에 구아닌-사중나선 구조가 생성될 수 없다. 따라서 양성 시료의 고리매개등온증폭 반응의 생성물에 헤민, 과산화수소, 기질이 포함된 제2 조성물을 첨가하면, 생성된 구아닌-사중나선 구조가 ABTS와 같은 기질과 반응하여 강한 비색 반응을 나타내며, 음성 시료에서는 약한 비색 반응 또는 비색 반응이 나타나지 않아, 검출결과를 나안으로 확인할 수 있다.
다른 실시예에서, 상기 변색 반응은 포함된 표적 핵산의 농도별로 비색반응에서 흡광도의 차이가 나타나 정량적으로 분석이 가능하다.
또한, 본 발명의 상기 표적 핵산 검출용 키트는 표적 핵산에 상보적으로 결합하는 gRNA, 및 상기 gRNA와 결합하여 구아닌-사중나선구조를 절단하는 Cas9 단백질을 포함하는 제3 조성물을 더 포함할 수 있다.
상기 gRNA는 표적 핵산을 특이적으로 인식하는 RNA로, 세포 내로 전달된 재조합 핵산 구조체의 전사를 통해 발현되어 표적 유전자를 인식하고 Cas9 단백질과 복합체를 형성하며, Cas9 단백질을 표적 핵산으로 가져오는 RNA이다. 상기 gRNA는 표적 핵산을 인식할 수 있는 스페이서; 및 표적과 무관한 불변 서열(non-variable sequence)로 이루어진 가이드 RNA 스캐폴드를 포함할 수 있다. 상기 스페이서는 gRNA가 표적 핵산을 인식할 수 있게 하는 서열을 의미하며, 표적 핵산 위치의 근처에 있는 PAMs 서열의 일부 또는 전체를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 PAMs(Protospacer Adjacent Motif sequence)에 인접한 서열을 사용할 수 있다. 또한, 상기 스페이서는 표적 세포의 종류에 따라 적당한 변형이 가해질 수 있다. 상기 gRNA는 PAMs 영역으로부터 5’ 말단 방향으로 6 내지 12 bp에 위치한 서열을 절단을 유도하며, 이는 매우 높은 특이성을 가진다.
일 구현예에서, 상기 gRNA는 표적 핵산과 구아닌-사중나선 서열에 상보적인 염기서열을 포함하고, DNAzyme(구아닌-사중나선) 서열 내 존재하는 PAM (5’-NGG-3’) 서열을 인식하여 표적 핵산의 절단을 유도할 수 있다.
상기 gRNA는 두 개의 RNA, 즉, CRISPR RNA(crRNA) 및 트랜스활성화 crRNA(transactivating crRNA, tracrRNA)로 이루어져 있거나, crRNA 및 tracrRNA의 필수적 부분의 융합에 의해 생성된 단일 사슬 RNA(single-chain guide RNA, sgRNA)일 수 있다. 상기 gRNA는 crRNA 및 tracrRNA를 포함하는 이중 RNA(dual RNA)일 수 있다. gRNA는 crRNA 및 tracrRNA의 필수적인 부분 및 표적 핵산과 상보적인 부분을 포함하는 어떠한 gRNA라도 이용될 수 있다.
상기 Cas9 단백질은 Cas9 단백질 또는 Cas9 단백질을 발현하는 벡터를 의미한다. 또한, Cas9 단백질 또는 Cas9 단백질을 발현하는 벡터는 Cas 단백질이 핵 내에서 작용할 수 있게 하는 형태일 수 있다. Cas9 단백질은 CRISPR/Cas9 시스템에서 필수적인 단백질 요소를 의미하고, gRNA와 복합체를 형성할 때, 활성 엔도뉴클레아제 또는 니카아제(nickase)를 활성을 나타낼 수 있다. Cas9 유전자 및 단백질의 정보는 국립생명공학정보센터(national center for biotechnology information, NCBI)의 GenBank에서 구할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 Cas9 단백질은 또한 세포 내로 도입되기에 용이한 형태일 수 있다. 상기 Cas9 단백질은, 단백질 전달 도메인(protein transduction domain) 또는 세포 침투 펩타이드와 연결될 수 있다. 상기 단백질 전달 도메인은 폴리-아르기닌(poly-arginine) 도메인 또는 HIV로부터 유래한 TAT 단백질일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 단백질 전달 도메인 또는 세포 침투 펩타이드는 상기 기술된 예 외에도 다양한 종류가 당업계에 공지되어 있으므로, 상기 예에 제한되지 않고 다양하게 적용할 수 있다.
상기 제3 조성물은 gRNA 및 Cas9 단백질을 안정화시키는 부형제를 더 포함할 수 있다. 상기 부형제는 버퍼, NEBuffer, NaCl, tris-HCl, MgCl2, 알부민, 염, 산, 염기일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니고 통상적으로 CRISPR/Cas9 조성물을 안정화시키는 것이라고 알려진 것이라면 사용될 수 있다.
상기 키트에서 제3 조성물은 표적 핵산에 특이적인 gRNA와 Cas9을 포함하며, LAMP 생성물에서 표적 핵산을 절단 및 구아닌-사중나선 구조를 해체하여 변색반응에 변화를 일으킬 수 있다.
일 실시예에서, 표적 핵산이 포함된 양성시료의 LAMP 산물에서 1차적으로 비색반응이 나타남을 확인하고, 그 후 표적 유전자에 특이적인 gRNA와 Cas9 처리했을 때 표적 유전자에서만 DNA자임이 절단되어 2차적으로 비색반응이 감소하는 것을 확인할 수 있다. 표적 유전자 검출을 2번 확인(double check)함으로써 고리매개등온증폭 반응의 단점인 위양성 및 위음성 반응을 제거하고 정확하게 표적 유전자가 함유된 샘플을 비색반응에 의해 육안으로 확인할 수 있다.
상기 제3 조성물은 검출하고자 하는 표적 핵산별로 gRNA를 다르게 구성한 CRISPR/Cas9 시스템을 활용하여 야생형 표적 핵산과 변이형 표적 핵산을 특이적으로 구분할 수 있다. 제1 조성물 및 제2 조성물을 이용하여 비색반응을 확인한 후, 제3 조성물을 이용해서 비색반응으로 구별할 수 없는 표적 핵산의 변이형을 구분할 수 있다. 상기 표적 핵산의 변이형은, 야생형 표적 핵산과 적어도 하나 이상의 염기서열이 차이가 있는 돌연변이를 가진 핵산을 의미한다.
일 실시예에서, 야생형 표적 핵산과 하나 이상의 돌연변이가 있는 표적 핵산 변이형이 포함된 시료에 대하여, LAMP 생성물에서 비색반응을 확인한 후, 검출하고자 하는 표적 핵산에 따라 설계된 CRISPR/gRNA를 처리하여 비색반응에 변화를 확인하여, 야생형과 변이형의 표적 핵산을 구분하여 특이적으로 검출할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 고리매개등온증폭법용 프라이머 세트를 이용하여 표적 핵산을 정밀 검출하는 방법을 제공한다.
상기 표적 핵산의 정밀 검출 방법은 표적 핵산이 포함되어 있을 것으로 예상되는 시료를 대상으로 상기 프라이머 세트를 이용하여 고리매개등온증폭 반응을 수행하는 단계 및 상기 고리미개등온증폭 반응의 생성물에 변색 반응을 일으키는 시약을 처리하여 변색반응을 확인하는 단계를 포함한다.
상기 시료는 생물학적 시료(biological sample) 또는 비생물학적 시료로서, 상기 생물학적 시료는 살아있는 생명체로부터 채취, 분리하거나, 또는 이로부터 유래한 관심 성분의 유효량을 함유하고 있는 가공되지 않거나 또는 전처리된 시료를 의미한다. 구체적으로 복잡한 인간 또는 동물에서 채취한 체액 샘플, 구체적으로 객담, 비인두흡인물, 혈액, 가래 또는 세포용해물(cell lysate) 일 수 있다. 상기 비생물학적 시료는 동물, 식물의 조직 절편(section) 및 약리학적, 진단학적 또는 식품학적 목적을 위해 동물, 식물로부터 채취한 동결 또는 파라핀 포매 절편, 세포, 세포 배양액, 초대배양물(primary culture), 절편체(explant)를 포함할 수 있고, 구체적으로 또한, 상기 시료는 특정 생명체가 존재하는 것으로 의심되는 환경(예를 들어, 물, 대기, 토양 등)으로부터 채취한 물질일 수 있다.
상기 표적 핵산의 정밀 검출 방법은 표적 핵산을 특이적으로 인식하는 gRNA와 이에 결합하여 구아닌-사중나선구조를 절단할 수 있는 CRISPR/Cas 시스템을 적용하여 변색반응의 변화를 재확인하는 단계를 더 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 표적 핵산의 정밀 검출 방법을 통해 복잡한 체액 샘플에서도 유전자의 분리, 정제과정 없이 표적 핵산을 정밀하게 검출할 수 있다.
상기 고리매개등온증폭법 반응을 수행하는 단계, 변색 반응을 확인하는 단계 및 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 변색 반응의 변화를 재확인하는 단계는 상기 표적 핵산 검출용 키트를 설명하면서 상술한 내용과 동일하므로, 이미 상술한 내용을 원용하며, 중복하여 설명하지 않는다.
상기 표적 핵산의 정밀 검출 방법은 상기 변색 반응의 결과를 장치를 통해 분석하여 정성적 및 정량적으로 진단하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 장치는 일정한 광원을 제공하는 것일 수 있다. 상기 장치는 일정한 광원으로 비색반응의 흡광도 또는 형광을 측정하는 것일 수 있다. 또는 상기 장치는 변색 반응의 결과를 정성적 및 정량적으로 진단할 수 있는 것일 수 있다. 구체적으로 상기 장치는 인공지능(AI) 분석 기반 스마트폰 앱일 수 있다. 상기 AI 분석 기반 스마트폰 앱은 표적 핵산의 농도별 변색 반응의 이미지 또는 흡광도 데이터를 기계 학습시킨 것으로, 비색반응의 결과를 빠르게 정성적 및 정량적으로 진단하는 것일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 장치는 일정한 광원이 공급되는 기기에 사진을 찍을 수 있는 장치가 장착되어, 변색 반응 결과의 사진을 찍고 화면에 진단결과를 정성적 및 정량적으로 표시하는 것일 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되지 아니한다.
고리매개등온증폭법(LAMP)을 통한 표적 유전자의 육안 검출 확인
[1-1] 프라이머의 설계
본 발명에 따라 표적 핵산의 육안 검출이 가능한지 여부를 확인하기 위하여, 표적 핵산으로 서열번호 1의 SARS-CoV-2 ORF1 유전자, 서열번호 2의 SARS-CoV-2 N 유전자 및 서열번호 3의 SARS-CoV-2 S 유전자를 정하였고, 이들 각각에 대한 4종 LAMP　프라이머들(정방향 내측 프라이머, 정방향 외측 프라이머, 역방향 내측 프라이머 및 역방향 외측 프라이머)을 각각 아래 표 1과 같이 설계하였다.
표적 핵산 구분 서열번호 서열 (5’ -> 3’)
ORF1 ORF1
target		 1 GCA CCG TAG CTG GTG TCT CTA TCT GTA GTA CTA TGA CCA ATA GAC AGT TTC ATC AAA AAT TAT TGA AAT CAA TAG CCG CCA CTA GAG GAG CTA CTG TAG TAA TTG GAA CAA GCA AAT TCT ATG GTG GTT GGC ACA ACA TGT TAA AAA CTG TTT ATA GTG ATG TAG AAA ACC CTC ACC TTA TGG GTT GGG ATT ATC CTA AAT GTG ATA GAG CCA TGC CTA ACA TGC TTA GAA TTA TGG CCT CAC TTG TTC TTG CTC GCA AAC ATA CAA CGT GTT GTA GCT TGT CAC ACC GTT TCT ATA GAT TAG CTA ATG AGT GTG CTC AAG TAT TGA GTG AAA TGG TCA TGT GTG GCG GTT CAC TAT ATG TTA AAC CAG GTG GAA CCT CAT CAG GAG ATG CCA CAA CTG CTT ATG CTA ATA GTG TTT TTA ACA TTT G
FP 4 GCA CCG TAG CTG GTG TCT CTA
BP 5 CAA ATG TTA AAA ACA CTA TTA GCA TA
FIP 6 AGG TGA GGG TTT TCT ACA TCA CTA TCC CAA CCC GCC CTA CCC ATT GGA ACA AGC AAA TTC TAT GG
BIP 7 ATG GGT TGG GAT TAT CCT AAC CCA ACC CGC CCT ACC CAT GTG TGC GAG CAA GAA CAA GTG
N N target 2 GCC AAA AGG CTT CTA CGC AGA AGG GAG CAG AGG CGG CAG TCA AGC CTC TTC TCG TTC CTC ATC ACG TAG TCG CAA CAG TTC AAG AAA TTC AAC TCC AGG CAG CAG TAG GGG AAC TTC TCC TGC TAG AAT GGC TGG CAA TGG CGG TGA TGC TGC TCT TGC TTT GCT GCT GCT TGA CAG ATT GAA CCA GCT TGA GAG CAA AAT GTC TGG TAA AGG CCA ACA ACA ACA AGG CCA AA
FP 8 GCC AAA AGG CTT CTA CGC A
BP 9 TTT GGC CTT GTT GTT GTT GG
FIP 10 TCC CCT ACT GCT GCC TGG AGT TTT CCC AAC CCG CCC TAC CCC GGC AGT CAA GCC TCT TC
BIP 11 TCC TGC TAG AAT GGC TGG CAA TTT TCC CAA CCC GCC CTA CCC TTT TGC TCT CAA GCT GGT TCA
S S target 3 TGC TGA CAC TAC TGA TGC TGT CCG TGA TCC ACA GAC ACT TGA GAT TCT TGA CAT TAC ACC ATG TTC TTT TGG TGG TGT CAG TGT TAT AAC ACC AGG AAC AAA TAC TTC TAA CCA GGT TGC TGT TCT TTA TCA GGA TGT TAA CTG CAC AGA AGT CCC TGT TGC
FP 12 TGC TGA CAC TAC TGA TGC
BP 13 GCA ACA GGG ACT TCT GTG CA
FIP 14 ACT GAC ACC ACC AAA AGA ACA TGC CCA ACC CGC CCT ACC CTG TCC GTG ATC CAC AGA C
BIP 15 ATA ACA CCA GGA ACA ACC CAA CCC GCC CTA CCC TTA ACA TCC TGA TAA AGA ACA GCA A
[1-2] 고리매개등온증폭 반응의 수행 및 변색 반응의 확인
상기 실시예 [1-1]에서 설계한 4종의 프라이머들을 이용하여 상기 표적 핵산들에 대한 고리매개등온증폭 반응을 수행하였다. 구체적으로, 상기 고리매개등온증폭 반응은 프라이머 스탁(16 μM FIP, 16 μM BIP, 2 μM FIP 및 2 μM BIP)을 준비한 뒤, 12.5 μL의 WarmStart LAMP 2x Master Mix, 2.5 μL의 10x 프라이머 스탁, 9 μL의 증류수 및 1 μL의 다양한 표적유전자 1 nM를 포함하는 LAMP 반응 혼합물(25 μL)을 준비하고 65°C에서 30분간 반응시켜 실시간-고리매개등온증폭법(RT-LAMP)으로 핵산을 증폭하였다.
상기와 같이 얻어진 고리매개등온증폭 반응의 증폭 산물에 7 μL의 증류수, 8 μL의 10 μM 헤민(Hemin), 10 μL의 3 mM ABTS 및 10μL의 6 mM 과산화수소(H2O2)를 RT-LAMP 반응 생성물에 첨가하고 25℃에서 10분 동안 배양하여 색상 변화를 확인하였고, 마이크로플레이트 기계로 416 nm에서 흡광도를 관찰하였다.
그 결과, 시료가 비색으로 변색하는 것을 확인하였으며, 이는 육안으로도 관찰이 가능하였다.
[1-3] 정방향 내측 프라이머 및 역방향 내측 프라이머 내 시토신-풍부 서열의 인산디에스터 결합의 개질에 대한 효과 확인
상기 실시예 [1-1]에서 설계한 4종의 프라이머에서 상기 표 1에서 밑줄 친 시토신-풍부 서열의 인산디에스터 결합을 포스포로티오에이트 결합으로 개질하여 프라이머를 다시 제작하였고(이하 ‘PS-DNA 프라이머’라고 함), 이를 이용하여 상기 실시예 [1-2]에서와 같은 방법으로 실시간 고리매개등온증폭 반응을 수행하고 DNA자임 반응을 통해 변색을 확인하였다.
그 결과, 도 3의 (a)에 나타난 바와 같이, 핵산 등온증폭과정에서 실시간 형광 곡선은 PS-DNA 프라이머를 사용한 경우와 DNA 프라이머를 사용한 경우가 거의 차이가 나지 않아 유전자 증폭 효율은 비슷한 것을 확인할 수 있었다. 반면, 도 2의 (b)에 나타난 바와 같이, 변색 반응의 흡광도 스펙트럼에서는 PS-DNA 프라이머를 사용한 경우에 신호가 더 높은 것을 확인할 수 있었다. 이는 PS-DNA 프라이머를 사용했을 때, 이중나선에서 염기간 쌓기 상호작용(base-stacking interaction)이 약해져 DNA 프라이머를 사용한 경우보다 DNA자임이 더 잘 형성되어 변색 반응의 민감도가 높아진다는 것을 의미한다.
[2-1] CRISPR/Cas9 시스템을 추가로 적용한 변색반응 변화의 재확인
상시 실시예 [1-3]에서 제작한 PS-DNA 프라이머를 이용한 RT-LAMP 및 DNA자임 반응생성물에 28 μL의 증류수, 10 μL의 10X NEBuffer r3.1(100 mM NaCl, 50 mM tris-HCl, 10 mM MgCl2,100 μg/mL 재조합 알부민, pH 7.9), 1 μL의 다양한 gRNA (1 μM) 및 1 μL의 Cas9 (1 μM)로 구성된 CRISPR 용액을 첨가하고 25°C에서 10분 동안 반응시켜 색상 변화를 확인하였고, 마이크로플레이트 기계로 416 nm에서 흡광도를 관찰하였다. 표적 유전자와 상응하는 gRNA의 염기서열은 하기 표 2에 나타내었다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 표적 유전자에 의해서 1차적으로 변색 반응이 나타남을 확인할 수 있었고, 그 후 표적 유전자에 상응하는 gRNA를 처리했을 때 표적 유전자에서만 2차적으로 변색 반응이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 표적 유전자 검출을 2번 확인(double check)함으로써 RT-LAMP 반응의 단점인 위양성 및 위음성 반응을 제거하고 정확하게 표적 유전자가 함유된 샘플을 변색 반응에 의해 육안 검출이 가능하였다.
표적 핵산 구분 서열번호 서열 (5’ -> 3’)
ORF1 gRNA FIP 1 16 UCC AAU GGG UAG GGC GGG UU
gRNA FIP 2 17 CUU GUU CCA AUG GGU AGG GC
gRNA FIP 3 18 UUU GCU UGU UCC AAU GGG UA
gRNA BIP 1 19 ACA CAU GGG UAG GGC GGG UU
gRNA BIP 2 20 CUC GCA CAC AUG GGU AGG GC
gRNA BIP 3 21 CUU GCU CGC ACA CAU GGG UA
N gRNA FIP 1 22 CUG CCG GGG UAG GGC GGG UU
gRNA FIP 2 23 CUU GAC UGC CGG GGU AGG GC
gRNA FIP 3 24 GAG GCU UGA CUG CCG GGG UA
gRNA BIP 1 25 GCA AAA GGG UAG GGC GGG UU
gRNA BIP 2 26 UGA GAG CAA AAG GGU AGG GC
gRNA BIP 3 27 AGC UUG AGA GCA AAA GGG UA
S gRNA FIP 1 28 CGG ACA GGG UAG GGC GGG UU
gRNA FIP 2 29 GAU CAC GGA CAG GGU AGG GC
gRNA FIP 3 30 UGU GGA UCA CGG ACA GGG UA
gRNA BIP 1 31 GUU AAG GGA UGU UAA GGG UA
gRNA BIP 2 32 CAG GAU GUU AAG GGU AGG GC
gRNA BIP 3 33 UUA UCA GGA UGU UAA GGG UA
S 유전자 D614G D614G gRNA 34 UUA UCA GGG UGU UAA GGG UA
[2-2] 표적 핵산의 농도별 민감도 측정
다양한 농도 (1 aM ~1 nM)의 표적 핵산을 포함하는 분석 시료 (100 μL)를 제조한 후, 상기 실시예 [2-1]과 같은 방법으로 CRISPR/Cas9 처리 전후에 대해 방법으로 흡광도를 측정하여 민감도 검증 실험을 진행하였다.
그 결과, 도 5의 (a), (c) 및 (e)에 나타난 바와 같이, 표적 유전자에 농도의존적으로 흡광도가 증가하는 것을 확인하였다. 또한, 도 5의 (b), (d) 및 (f)에 나타난 바와 같이, 본 기술의 표적 핵산 검출 한계(limit of detection, LOD)는 ORF1 유전자의 경우 0.902 aM (10 copies/sample), N 유전자의 경우 0.809 aM (9 copies/sample), S 유전자의 경우 0.904 aM (10 copies/sample)인 것을 확인하였다. 이를 통해, 실시간 등온 유전자증폭 기술(RT-LAMP), 비색 반응(DNAzyme) 및 유전자가위(CRISPR-Cas9)를 활용한 해당 유전자 검출 시스템을 이용한 표적 유전자의 농도별 흡광도 증가 및 변색 반응을 통한 육안 검출이 가능함을 확인하였다.
현장진단기기 및 스마트폰 앱 개발
DAMPR 시스템의 현장진단 기기를 개발하여 수행하고 이를 스마트폰 앱을 통해 모바일 진단을 가능하게 하였다.
[3-1] 휴대용 현장진단기기
구체적으로, 3D 프린터로 제작된 휴대용 현장 진단기기를 제작하였다. 폭 170 mm, 깊이 250 mm, 높이 207 mm로, 힌지 구조를 적용하여 휴대용 현장 진단기기를 디자인하였다. 휴대용 현장 진단기기 상단에는 스마트폰을 고정할 수 있는 홀더가 부착되어 있으며, 휴대용 현장 진단기기 앞단에는 온도 표시기를 배치시켰다. 두 개의 핸들을 통해 웰플레이트를 제어할 수 있어 휴대용 현장 진단기기를 열지 않고도 쉽게 스마트폰을 활용하여 사진을 찍을 수 있다. 현장 진단 기기의 내부에는, 도 6의 (a)에 나타낸 바와 같이, 핀홀, 발광 다이오드(LED) 조명 및 암실을 통해 일정한 조건에서 사진을 찍을 수 있도록 하였다. 웰플레이트는 온도 조절을 위한 히트 베드와 히팅 필름이 포함된 트레이 위에 올려놓게 구성하였고, 웰플레이트 아래에는 트레이 이동을 위한 평면 슬라이딩 베어링 시스템이 있다. 휴대용 현장 진단기기 하단에는 제어 보드가 삽입되었다. 구성된 DAMPR 시스템의 무게는 1 kg이며 배터리 또는 외부 전원 공급 장치로 작동된다.
[3-2] 머신러닝을 이용한 진단용 스마트폰 앱
표적 유전자의 정확한 진단 결과를 얻기 위해 머신러닝 기술을 사용했다. 구체적으로, 머신러닝 분석을 기반으로 한 선형 판별 분석(LDA), 랜덤 포레스트(RF), 기울기 부스팅 분류기(GBC) 분류기를 사용하여 각 300개의 샘플 이미지를 학습시켰다. LDA, RF, GBC 분류기의 성능 비교에 따르면 RF 분류기가 99.38%의 정확도를 보였다. True label과 Prediction label 간의 상관관계를 기반으로 한 오차행렬(confusion matrix)를 도 6의 (b)에 나타내었다.
또한, 바이러스의 모바일 진단을 위해 사용자 친화적인 스마트폰 앱을 개발하였다. 스마트폰 앱에서 이미지 처리 알고리즘은 이미지를 서버로 전달하기 전에 관심 영역(ROI)을 감지하기 위해 내장되어 있다. 처리된 이미지는 파이어베이스를 통해 서버로 전송되어 분류되며, 그 결과는 도 4의 (c)에 나타낸 바와 같이, 농도 분류 후 스마트폰 화면에 표시되도록 앱을 개발하였다.
SARS-CoV-2 보유 환자 샘플을 이용한 실용성 검증
DAMPR 시스템의 실용성을 검증하기 위해, COVID-19 환자 진단에 적용하였다. COVID-19 환자로부터 비인두 흡인물과 가래 샘플은 비인두 면봉으로 수집하여 바이러스 수송 배지 (UTM 배지)에 넣은 샘플을 사용하였다. 총 136개의 검체를 경상대학교 의과대학과 연세대 보건센터, 세브란스병원에서 획득한 뒤, 무작위 배정 및 블라인드 조건에서 해당 시스템을 적용하였다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 등온 유전자증폭 기술 (RT-LAMP), 비색 반응 (DNAzyme) 처리 후 샘플의 비색반응 이미지 (ON)와 유전자가위 (CRISPR-Cas9) 처리 후 샘플의 비색반응 이미지 (OFF)를 통해 진단이 가능하였으며, 농도의 진단도 가능함을 확인하였다.
스마트폰 앱과 휴대용 진단기기를 활용한 DAMPR 시스템을 통해 SARS-CoV-2를 진단 및 정량적으로 검출할 수 있음을 확인하였다.
[5-1] SARS-CoV-2 변이바이러스 검출 확인
SARS-CoV-2 변이바이러스 (D614G SARS-CoV-2)를 SARS-CoV-2와 구별하여 특이적으로 검출할 수 있는지 적용성을 확인하였다. 바이러스 샘플 및 비인두 흡입물에 찌른(Spike) 바이러스 샘플을 별도의 키트를 통한 유전자 추출 및 정제과정 없이, DAMPR 시스템에 두 종류의 CRISPR 시스템을 적용하여 SARS-CoV-2 변이바이러스를 구별하고자 하였다.
구체적으로, 90 μL 의 103 PFU/mL농도의 SARS-CoV-2 변이바이러스를 10 μL TCEP/EDTA (최종 농도 100 mM/1 mM) 용액으로 처리하였다. 이후, 50 ℃에서 5분, 64 ℃에서 5분 순차적으로 열처리하여 샘플로 사용하였다. 상기 실시예 2와 같은 방법으로, 실시간 등온 유전자 증폭 기술 (RT-LAMP), 변색 반응 (DNAzyme) 및 유전자가위 (CRISPR-Cas9)를 활용한 DAMPR 시스템을 사용하여 SARS-CoV-2 변이바이러스를 구분하고자 하였다. 다만, 특이적인 부분은 야생형 및 D614G SARS-CoV-2 검출을 위해 두 종류의 CRISPR-Cas9 시스템을 사용한 것인데, 첫 번째는 야생형 SARS-CoV-2의 S 유전자를 인식하는 Cas9/S gRNA 복합체를 사용한 것(DAMPR 시스템)이고, 두 번째는 D614G SARS-CoV-2의 S 유전자를 인식하는 Cas9/D614G gRNA 복합체를 사용한 것(v-DAMPR 시스템)이다. 표적 별로 gRNA를 다르게 구성한 두 종류의 CRISPR-Cas9 시스템을 활용하여 야생형 SARS-CoV-2와D614G SARS-CoV-2의 S 유전자를 특이적으로 구별할 수 있다.
실험 결과, 도 8의 (c)에서 나타난 바와 같이, 야생형 SARS-CoV-2 바이러스 및 SARS-CoV-2 변이바이러스 (D614G SARS-CoV-2)는 등온 유전자증폭 기술 (RT-LAMP), 비색 반응 (DNAzyme) 후 샘플이 짙은 녹색으로 변색 반응을 보였다. 이후 Cas9/D614G gRNA를 처리한 뒤, SARS-CoV-2 변이바이러스 샘플의 색상이 연해졌지만 야생형 SARS-CoV-2의 색상은 유지되었다. 반면, Cas9/S gRNA 복합체를 처리했을 때, 야생형 바이러스 샘플의 색상은 연해졌지만 돌연변이 SARS-CoV-2 변이바이러스 샘플의 색상은 변하지 않았다.
이러한 실험결과는 본 발명에 따른 DAMPR 시스템이 D614G 돌연변이 SARS-CoV-2를 특이적으로 검출할 수 있음을 명확하게 검증한 것이며, 또한 복잡한 인간 체액 샘플 (비인두 흡입물 또는 객담)에서도 코로나 변이바이러스 (D614G SARS-CoV-2)를 선택적으로 검출 가능함을 확인한 것이다. 이를 통해, 별도의 유전자 분리 및 정제 과정 없이도, DAMPR 시스템을 이용하여 SARS-CoV-2 변이바이러스(D614G SARS-CoV-2)를 야생형 SARS-CoV-2로부터 정밀하게 구별할 수 있고, 향후 CRISPR 시스템 내 가이드 RNA를 표적 유전자에 맞게 디자인하면 다양한 SARS-CoV-2 변이바이러스를 검출하는데 적용할 수 있음을 알 수 있다.
[5-2] SARS-CoV-2 변이바이러스 보유 환자 샘플을 이용한 실용성 검증
본 발명에 따른 DAMPR 시스템의 실용성을 검증하기 위해, SARS-CoV-2 변이바이러스 (D614G SARS-CoV-2) 보유 환자 샘플을 검출하였다. SARS-CoV-2 변이바이러스 보유 환자로부터 비인두 면봉으로 수집한 가래 샘플과 비인두 흡입물을 바이러스 수송 배지(UTM 배지)에 넣은 샘플을 사용하였다.
상기 실시예 3 및 상기 실시예 5와 같은 방법으로 SARS-CoV-2 변이체의 현장검출을 위해 v- DAMPR 데이터를 휴대용 시스템에 적용하고 스마트폰 애플리케이션을 개발하였다. 상기 실시예 [5-1]에서 개발한 v-DAMPR분석 시스템은 SARS-CoV-2 변이바이러스 보유 환자 진단에 사용했다. 비교를 위해 야생형 SARS-CoV-2 감염 환자의 10개 임상 샘플도 테스트하였다.
그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, LAMP 증폭 및 DNAzyme반응 후 모든 샘플에 대해 변색 반응이 나타나 SARS-CoV-2 환자 샘플 및 SARS-CoV-2 변이바이러스 (D614G SARS-CoV-2) 보유환자 샘플내 표적 유전자가 성공적으로 감지되었다. 이후 SARS-CoV-2 변이바이러스(D614G SARS-CoV-2)에 특이적인 Cas9/D614G gRNA 복합체를 사용하였을 때 SARS-CoV-2 변이체 샘플에 대해서만 색상 변화가 나타남을 확인할 수 있었다. 결과적으로 코로나 변이바이러스 보유환자 샘플 내에서만 특이적인 색상 변화를 감지하여 임상샘플에도 적용이 가능함을 확인할 수 있었다.
상기에서는 본 출원의 대표적인 실시예를 예시적으로 설명하였으나, 본 출원의 범위는 상기와 같은 특정 실시예만 한정되지 아니하며, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 출원의 청구범위에 기재된 범주 내에서 적절하게 변경이 가능하다.
<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF BIOSCIENCE AND BIOTECHNOLOGY <120> Target gene detection system based on novel isothermal amplification technology <130> 2021DPA4430 <160> 48 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 427 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 ORF1 target <400> 1 gcaccgtagc tggtgtctct atctgtagta ctatgaccaa tagacagttt catcaaaaat 60 tattgaaatc aatagccgcc actagaggag ctactgtagt aattggaaca agcaaattct 120 atggtggttg gcacaacatg ttaaaaactg tttatagtga tgtagaaaac cctcacctta 180 tgggttggga ttatcctaaa tgtgatagag ccatgcctaa catgcttaga attatggcct 240 cacttgttct tgctcgcaaa catacaacgt gttgtagctt gtcacaccgt ttctatagat 300 tagctaatga gtgtgctcaa gtattgagtg aaatggtcat gtgtggcggt tcactatatg 360 ttaaaccagg tggaacctca tcaggagatg ccacaactgc ttatgctaat agtgttttta 420 acatttg 427 <210> 2 <211> 233 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 N target <400> 2 gccaaaaggc ttctacgcag aagggagcag aggcggcagt caagcctctt ctcgttcctc 60 atcacgtagt cgcaacagtt caagaaattc aactccaggc agcagtaggg gaacttctcc 120 tgctagaatg gctggcaatg gcggtgatgc tgctcttgct ttgctgctgc ttgacagatt 180 gaaccagctt gagagcaaaa tgtctggtaa aggccaacaa caacaaggcc aaa 233 <210> 3 <211> 162 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 S target <400> 3 tgctgacact actgatgctg tccgtgatcc acagacactt gagattcttg acattacacc 60 atgttctttt ggtggtgtca gtgttataac accaggaaca aatacttcta accaggttgc 120 tgttctttat caggatgtta actgcacaga agtccctgtt gc 162 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 ORF1 forward primer <400> 4 gcaccgtagc tggtgtctct a 21 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 ORF1 backward primer <400> 5 caaatgttaa aaacactatt agcata 26 <210> 6 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 ORF1 forward inner primer <400> 6 aggtgagggt tttctacatc actatcccaa cccgccctac ccattggaac aagcaaattc 60 tatgg 65 <210> 7 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 ORF1 backward 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Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 S forward inner primer <400> 14 actgacacca ccaaaagaac atgcccaacc cgccctaccc tgtccgtgat ccacagac 58 <210> 15 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 S backward inner primer <400> 15 ataacaccag gaacaaccca acccgcccta cccttaacat cctgataaag aacagcaa 58 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 ORF1 gRNA FIP 1 <400> 16 uccaaugggu agggcggguu 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 ORF1 gRNA FIP 2 <400> 17 cuuguuccaa uggguagggc 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 ORF1 gRNA FIP 3 <400> 18 uuugcuuguu ccaaugggua 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 ORF1 gRNA BIP 1 <400> 19 acacaugggu agggcggguu 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 ORF1 gRNA BIP 2 <400> 20 cucgcacaca uggguagggc 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 ORF1 gRNA BIP 3 <400> 21 cuugcucgca cacaugggua 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 N gRNA FIP 1 <400> 22 cugccggggu agggcggguu 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 N gRNA FIP 2 <400> 23 cuugacugcc gggguagggc 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 N gRNA FIP 3 <400> 24 gaggcuugac ugccggggua 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 N gRNA BIP 1 <400> 25 gcaaaagggu agggcggguu 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 N gRNA BIP 2 <400> 26 ugagagcaaa aggguagggc 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 N gRNA BIP 3 <400> 27 agcuugagag caaaagggua 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 S gRNA FIP 1 <400> 28 cggacagggu agggcggguu 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 S gRNA FIP 2 <400> 29 gaucacggac aggguagggc 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 S gRNA FIP 3 <400> 30 uguggaucac ggacagggua 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 S gRNA BIP 1 <400> 31 guuaagggau guuaagggua 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 S gRNA BIP 2 <400> 32 caggauguua aggguagggc 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 S gRNA BIP 3 <400> 33 uuaucaggau guuaagggua 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 S D614G gRNA <400> 34 uuaucagggu guuaagggua 20 <210> 35 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G-quadruplex sequence 1 <400> 35 ggggggtggg tggg 14 <210> 36 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G-quadruplex sequence 2 <400> 36 gggtgggggg ttggg 15 <210> 37 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G-quadruplex sequence 3 <400> 37 gggtgggtgg gtgggt 16 <210> 38 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G-quadruplex sequence 4 <400> 38 tttggtggtg gtggttgtgg tggtggtgg 29 <210> 39 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G-quadruplex sequence 5 <400> 39 ggtggtggtg gttgtggtgg tggtgg 26 <210> 40 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G-quadruplex sequence 6 <400> 40 acctggggga gtattgcgga ggaaggt 27 <210> 41 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G-quadruplex sequence 7 <400> 41 tgggtagggc gggttgggaa a 21 <210> 42 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G-quadruplex sequence 8 <400> 42 ttagggttag ggttagggtt aggg 24 <210> 43 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G-quadruplex sequence 9 <400> 43 ggttggtgtg gttgg 15 <210> 44 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G-quadruplex sequence 10 <400> 44 ggtggtggtg gttgtggtgg tggtgg 26 <210> 45 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G-quadruplex sequence 11 <400> 45 gggcgcggga ggaagggggc ggg 23 <210> 46 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G-quadruplex sequence 12 <400> 46 gagggtgggg agggtgggga ag 22 <210> 47 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G-quadruplex sequence 13 <400> 47 gtgggtcatt gtgggtgggt gtgg 24 <210> 48 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G-quadruplex sequence 14 <400> 48 gtgggtaggg cgggttgg 18

Claims (11)

  1. 표적 핵산의 제1 영역에 상보적으로 결합하는 제1F 결합부, 상기 표적 핵산에서 상기 제1 영역보다 더 5’-방향에 위치하는 제2 영역과 동일한 서열을 갖는 제2F 결합부 및 상기 제1F 결합부와 상기 제2F 결합부를 연결하고 시토신-풍부(C-rich) 서열을 포함하는 제1 고리 형성부를 포함하는 정방향 내측 프라이머;
    표적 핵산에서 상기 제1 영역보다 더 3’-방향에 위치하는 제3 영역과 상보적으로 결합하는 정방향 외측 프라이머;
    표적 핵산의 제4 영역에 상보적으로 결합하는 제1B 결합부, 상기 표적 핵산에서 상기 제4 영역보다 더 5’-방향에 위치하는 제5 영역과 동일한 서열을 갖는 제2R 결합부 및 상기 제1R 결합부와 상기 제2B 결합부를 연결하고 시토신-풍부(C-rich) 서열을 포함하는 제2 고리 형성부를 포함하는 역방향 내측 프라이머;
    표적 핵산에서 상기 제4 영역보다 더 3’-방향에 위치하는 제6 영역과 상보적으로 결합하는 역방향 외측 프라이머;
    를 포함하는, 고리매개등온증폭법용 프라이머 세트.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 제1 고리 형성부의 시토신-풍부 서열 및 상기 제2 고리 형성부의 시토신-풍부 서열 중 적어도 하나는, 인산디에스터 결합이 포스포로티오에이트 결합으로 변형된 것인 고리매개등온증폭법용 프라이머 세트.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2의 고리매개등온증폭법용 프라이머 세트를 포함하는 제1 조성물; 및
    구아닌-사중나선구조(G-quadruplex)에 의해 변색 반응을 일으키는 시약을 포함하는 제2 조성물; 을 포함하는 표적 핵산 검출을 위한 고리매개등온증폭법용 키트.
  4. 청구항 3에 있어서,
    상기 키트는 표적 핵산에 상보적으로 결합하는 gRNA, 및 상기 gRNA와 결합하여 구아닌-사중나선구조를 절단하는 Cas9 단백질을 포함하는 제3 조성물을 더 포함하는 표적 핵산 검출을 위한 고리매개등온증폭법용 키트.
  5. 청구항 3에 있어서,
    상기 표적 핵산은 바이러스 또는 병원성 미생물에서 유래한 것인, 표적 핵산 검출을 위한 고리매개등온증폭법용 키트.
  6. 청구항 3에 있어서,
    상기 표적 핵산은 SARS-Cov-2 바이러스에서 유래한 것인, 표적 핵산 검출을 위한 고리매개등온증폭법용 키트.
  7. 표적 핵산이 포함되어 있을 것으로 예상되는 시료를 대상으로 청구항 1 또는 청구항 2의 프라이머 세트를 이용하여 고리매개등온증폭 반응을 수행하는 단계; 및
    상기 고리미개등온증폭 반응의 생성물에 발생반응을 일으키는 시약을 처리하여 변색반응을 확인하는 단계;
    를 포함하는 표적 핵산의 정밀 검출 방법.
  8. 청구항 7에 있어서,
    표적 핵산을 특이적으로 인식하는 gRNA와 이에 결합하여 구아닌-사중나선구조를 절단할 수 있는 CRISPR/Cas 시스템을 적용하여 변색 반응의 변화를 재확인하는 단계;를 더 포함하는 표적 핵산의 정밀 검출 방법.
  9. 청구항 7에 있어서,
    상기 표적 핵산은 바이러스 또는 병원성 미생물 유래인 것인, 표적 핵산의 정밀 검출 방법.
  10. 청구항 7에 있어서,
    상기 변색반응 결과를 장치를 통해 분석하여 정성적 및 정량적으로 진단하는 단계를 더 포함하는, 표적 핵산의 정밀 검출 방법.
  11. 청구항 10에 있어서,
    상기 장치는 인공지능(AI) 분석 기반 스마트폰 앱인 것인, 표적 핵산의 정밀 검출 방법.
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