CN107208137A

CN107208137A - 检测rna病毒的组合物和方法

Info

Publication number: CN107208137A
Application number: CN201580069867.5A
Authority: CN
Inventors: L·彼得斯; S·A·茹迪塞; D·谢弗; B·帕克
Original assignee: One Imperial Co
Current assignee: One Imperial Co; Envirologix Inc
Priority date: 2014-10-20
Filing date: 2015-10-20
Publication date: 2017-09-26
Also published as: US20170327911A1; JP2021045140A; AU2015336086B2; AU2021201378A1; WO2016064894A2; AU2015336086C1; JP2017536813A; WO2016064894A3; US20210025016A1; EP3209802A4; JP7114676B2; US10793922B2; AU2015336086A1; CA2965137A1; AU2021201378B2; BR112017008082A2; EP3209802A2; EP3209802B1; HK1243463A1; MX2017005159A

Abstract

本发明提供使用恒温核酸扩增反应快速鉴别RNA病毒感染的方法，其可对从粗制生物样品中提取的RNA进行检测。

Description

检测RNA病毒的组合物和方法

相关申请的交叉引用

本申请主张2014年10月20日提交的第62/066,277号和2015年1月15日提交的第62/104,008号美国临时专利申请案的优先权，该美国临时专利申请案各自的整体内容通过引用而并入本文。

背景技术

埃博拉病毒造成出血热，且被感染人类的四万率高达50％至90％。埃博拉病毒(EBOV)包括四种类型，扎伊尔型埃博拉(Zaire EBOV)、苏丹型埃博拉(Sudan EBOV)、科特迪瓦型埃博拉(Ivory Coast EBOV)和莱斯顿型埃博拉(Reston EBOV)。人类感染埃博拉病毒典型为接触感染埃博拉病毒的患者的被污染的血液、组织、及/或排泄物所致。患者典型在感染埃博拉病毒4至10天后显现症候。如此长的病毒潜伏期提供了病毒在携带者显示任何患病迹象之前被携带至新地区的机会。埃博拉病毒感染的症候包括发热、发冷、精神萎靡和肌痛。由于多种病症均显示这些症候，在埃博拉病毒感染的早期，存在极大的误诊风险，从而促进疾病传播。在晚期，感染埃博拉病毒的个体典型发展为呕吐、腹泻、咳嗽、血管症候、头痛、神志不清、昏迷、黏膜出血、血性腹泻、最后器官衰竭，导致死亡。感染埃博拉病毒的患者的体液和埃博拉病毒致死的患者的尸体具有同样的高度感染性。

随着2014年末西非的埃博拉病毒感染人数预计将为每周10,000人，对于埃博拉感染的公共卫生关注逐渐增加。由于医护人员与埃博拉病毒感染患者的体液有接触，因此他们具有被来自埃博拉病毒感染患者的埃博拉病毒感染的风险。随着接触程度和频率的增加，感染的风险也增加。在1976的苏丹型埃博拉爆发中，81％的护理埃博拉患者的医护人员被该病毒感染。为了医护人员和卫生保健工作者避免不必要的感染，埃博拉病毒的早期检测是关键，因此，创建了适宜的感染控制措施并最小化传播风险。

为了停止埃博拉病毒在西非和全球的传播，快速诊断必不可少，因此，被感染的个体可立即隔离，并对护理这些个体的卫生保健工作者使用适当的防护设备。在患病过程中，高效价的传染性线状病毒存在在血液和组织中。目前，通过病毒分离、逆转录-PCR(RT-PCR)包括实时定量RT-PCR、抗原捕获酶联免疫吸附检验(ELISA)、通过免疫染色的抗原检测、以及使用真实病毒抗原的IgG-ELISA和IgM-ELISA来鉴别埃博拉病毒。不幸的是，因为这些测试只能对经纯化且分离的RNA进行测试，这些设备耗时且需要使用实验室设备及受训过的工作人员，而埃博拉病毒爆发的多数地区均缺乏这些设备和人员。

据此，迫切需要改善的用于快速鉴别被埃博拉病毒感染的患者的方法。

发明内容

本发明提供使用恒温核酸扩增反应来快速鉴别埃博拉病毒感染的方法，该方法可对从未精制生物样品中提取的RNA进行检测。

一方面，本发明提供将恒温扩增反应与逆转录耦合来检测特异性靶标多核苷酸(如，RNA)的方法，该方法包括

(a)在容许cDNA合成的条件下，令样品中的靶标多核苷酸分子与引物在逆转录酶和dNTPs的存在下接触，从而产生cDNA；

(b)在容许cDNA的恒温扩增的条件下，令该cDNA与正向引物和反向引物在切口酶、dNTPs、可检测的寡核苷酸探针、及链置换聚合酶的存在下接触，且每一引物在其各自5’-末端区域内携带至少一个切口酶识别序列，并在其各自3’-末端区域内特异性结合该cDNA；以及

(c)检测该可检测寡核苷酸探针杂交至扩增子的特异性信号，其中，检测到该信号表明该样品中靶标多核苷酸的存在或数量，未检测到该信号则表明该样品中不存在靶标多核苷酸。

另一方面，本发明提供检测样品中RNA病毒的方法，该方法包括

(a)在容许cDNA合成的条件下，令样品中的RNA病毒靶标多核苷酸分子与引物在逆转录酶和dNTPs的存在下接触，从而产生cDNA；

(c)检测该可检测寡核苷酸探针杂交至扩增子的特异性信号，其中，检测到该信号表明该样品中靶标RNA病毒多核苷酸分子的存在或数量，未检测到该信号则表明不存在靶标RNA病毒。

在相关的一方面，本发明提供检测样品中埃博拉病毒的方法，该方法包括

(a)在容许cDNA合成的条件下，令样品中的埃博拉病毒多核苷酸与引物在逆转录酶和dNTPs的存在下接触，从而产生cDNA；

(c)检测该可检测寡核苷酸探针杂交至扩增子的特异性信号，其中，检测到该信号表明该样品中埃博拉病毒多核苷酸的存在或数量，未检测到该信号则表明该样品中不存在埃博拉病毒多核苷酸。

在本文中描述的发明上述方面或任何其它方面的多个具体实施形式中，通过令生物样品与能提取该样品中存在的RNA分子的剂和能稳定化RNA分子而防止其降解的剂接触，从而获得埃博拉病毒多核苷酸。

又一方面，本发明提供检测样品中埃博拉病毒的方法，该方法包括

(a)令生物样品与能提取该样品中存在的多核苷酸分子的剂和能稳定多核苷酸分子而防止其降解的剂接触；

(b)在容许cDNA合成的条件下，令所提取并稳定化的埃博拉病毒RNA与引物在逆转录酶和dNTPs的存在下接触，从而产生埃博拉病毒cDNA；

(c)在容许cDNA的恒温扩增的条件下，令该埃博拉病毒cDNA与正向引物和反向引物在切口酶、dNTPs、可检测的寡核苷酸探针、及链置换聚合酶的存在下接触，从而产生扩增子；其中每一引物在其各自5’-末端区域内携带至少一个切口酶识别序列，并在其各自3’-末端区域内特异性结合该埃博拉病毒cDNA；以及

(d)检测该扩增子，其中，检测到埃博拉病毒扩增子的存在表明该样品中存在埃博拉病毒多核苷酸分子，未检测到该扩增子则表明该样品中不存在埃博拉病毒多核苷酸。

又一方面，本发明提供用于检测RNA病毒多核苷酸分子的试剂盒，包含特异性结合RNA病毒序列的引物、特异性结合病毒(如，埃博拉病毒)扩增子的可检测的探针、逆转录酶、切口酶、和链置换聚合酶。一种具体实施形式中，该引物含有下述序列：

正向引物：

GACTCGATATCGAGTCGCTTCCA[MeOC]AGTTATC[MeOU][MeOA][MeOC][MeOC][MeOG]

反向引物：

GACTCGATATCGAGTCGAAATGC[MeOA]ACGA[MeOC][MeOA][MeOC][MeOC][MeOU]；且该探针含有下述序列：gctacACGACTTTYGCTGAAGgtagc。

另一具体实施形式中，该探针在5’端具有荧光染料且在3’端具有淬灭剂，或相反。一种具体实施形式中，该探针是

5’-CALRed_610nm-gctacACGACTTTYGCTGAAGgtagc BHQ2-3’或

5’-FAM或FITC-gctacACGACTTTYGCTGAAGgtagc-BHQ1-3’。

一种具体实施形式中，该3’淬灭剂被DABsyl替换。

另一方面，本发明提供用于在逆转录酶切口扩增反应中扩增埃博拉病毒多核苷酸分子的试剂盒，该试剂盒含有下述引物：

正向引物：

GACTCGATATCGAGTCGCTTCCA[MeOC]AGTTATC[MeOU][MeOA][MeOC][MeOC][MeOG]

反向引物：

GACTCGATATCGAGTCGAAATGC[MeOA]ACGA[MeOC][MeOA][MeOC][MeOC][MeOU]；

下述探针：

gctacACGACTTTYGCTGAAGgtagc；

逆转录酶、切口酶、链置换聚合酶、以及使用前述引物、探针和酶检测埃博拉病毒多核苷酸分子的使用说明。

一种具体实施形式中，该试剂盒进一步含有毛细管，且该毛细管可包含或不包含用于病毒多核苷酸提取的冻干细胞裂解液或RNA稳定化试剂。另一具体实施形式中，该试剂盒进一步含有一种或多种容器，该容器包含适用于进行逆转录酶和/或扩增反应的缓冲液。另一具体实施形式中，该试剂盒进一步含有多个容器，该容器包含冻干形式的逆转录酶、切口酶、和链置换聚合酶。

又一方面，本发明提供诊断人类或动物个体具有RNA病毒的方法，该方法包括

(a)令该个体的样品与能提取该样品中存在的RNA病毒的剂和能稳定化所提取的多核苷酸分子以防止其降解的剂接触；

(b)在容许cDNA合成的条件下，令该多核苷酸分子与逆转录酶引物在逆转录酶和dNTPs的存在下接触，从而产生该多核苷酸分子的cDNA复本；

(c)在容许该cDNA的恒温扩增的条件下，令该cDNA与正向引物和反向引物在切口酶、dNTPs、可检测的寡核苷酸探针、及链置换聚合酶的存在下接触，从而产生扩增子；且每一引物在其各自5’-末端区域内携带至少一个切口酶识别序列，并在其各自3’-末端区域内特异性结合该cDNA；以及

(d)检测该扩增子，其中，检测到RNA病毒扩增子的存在表明该个体体内存在RNA病毒感染，未检测到该扩增子则表明该个体体内不存在RNA病毒感染。

在本文中描述的任何方面的多个具体实施形式中，在缺少靶标多核苷酸的对照检验中，在检验开始后第7、10和/或15分钟无可检测信号。在本文中描述的任何方面的其它具体实施形式中，步骤(a)中所用的引物具有与步骤(b)所用的引物相同或不同的序列。在上文任何其它具体实施形式中，步骤(a)至(c)在单一反应中进行。上述方面的其它具体实施形式中，该逆转录酶与该链置换DNA聚合酶是相同或不同的酶。再其它具体实施形式中，步骤(a)的cDNA是在第一反应容器内产生的，随后被转移至第二反应容器，而步骤(b)在该第二反应容器内进行。本文中描述的任何方面的再其它具体实施形式中，该多核苷酸分子是埃博拉病毒多核苷酸分子。本文中描述的任何方面的再其它具体实施形式中，该样品是体液(如，唾液、汗液、泪液、体腔内蓄积的液体、尿液、精液、阴道分泌物、脑脊髓液、淋巴液、粪便、痰、液体消化物、呕吐物、汗液、乳汁、血液、血清和血浆)。本文中描述的任何方面的再其它具体实施形式中，该体腔是腹腔或心包腔。本文中描述的任何方面的再其它具体实施形式中，检出限是每反应10个或20个复本。本文中描述的任何方面的再其它具体实施形式中，该方法进行约5、7、10、15、20、25或30分钟。本文中描述的任何方面的再其它具体实施形式中，步骤(a)至(d)是对生物样品进行的。本文中描述的任何方面的再其它具体实施形式中，埃博拉病毒RNA并未从该生物样品纯化或分离(如，原样品)。本文中描述的任何方面的再其它具体实施形式中，该方法在便携式电池供电装置中的护理或诊断点进行。本文中描述的任何方面的再其它具体实施形式中，不需要单独的逆转录酶引物，但使用正向引物和/或反向引物。本文中描述的任何方面的再其它具体实施形式中，该样品是生物样品或环境样品。本文中描述的任何方面的再其它具体实施形式中，该生物样品是从个体、蝙蝠、丛林肉或家畜获得的。本文中描述的任何方面的再其它具体实施形式中，该生物样品是颊、鼻、眼、直肠及阴道黏膜的一种或多种黏膜拭片或皮肤。本文中描述的任何方面的再其它具体实施形式中，该生物样品是从个体、尸体、或培养基获得的组织样品。本文中描述的任何方面的再其它具体实施形式中，该尸体是人类、灵长类、蝙蝠或其它哺乳动物的尸体。本文中描述的任何方面的再其它具体实施形式中，该环境样品是可能被患有埃博拉病毒感染或具有埃博拉病毒感染发展倾向的个体的生物体液污染的材料。本文中描述的任何方面的再其它具体实施形式中，该环境样品是寝具、坐垫、地毯、空调过滤器或其它材料。本文中描述的任何方面的再其它具体实施形式中，该聚合酶是BstDNA聚合酶I、Gst DNA聚合酶I、Gka DNA聚合酶I、Gca DNA聚合酶I、Gan DNA聚合酶I、Gbo DNA聚合酶I、Gsp70 DNA聚合酶I、GspT3 DNA聚合酶I、Gsp52 DNA聚合酶I及/或其片段的5’-exo^-衍生物。本文中描述的任何方面的再其它具体实施形式中，该切口酶是Nt.BstNBI、Nt.BspD6I、Nt.BspQI、Nt.BsmAI、Nt.AlwI、N.Bst9I、或N.BstSEI的一种或多种。本文中描述的任何方面的再其它具体实施形式中，该逆转录酶是M-MLV RT、AMV RT、RSV RT、及/或其突变体/衍生物。本文中描述的任何方面的再其它具体实施形式中，该可检测的探针包含分子信标。本文中描述的任何方面的多个具体实施形式中，扩增引物(如，正向引物及/或反向引物)在3’端包含一种或多种2’-改性的核苷酸(如，2’-O-甲基核糖核苷酸)。特别的具体实施形式中，该扩增引物在3’端包含一种或多种2’-O-甲基改性的核苷酸，包括，举例而言，2’-O-甲基、2'-甲氧基乙氧基、2'-氟、2’-羟基、2’-烷基、2'-烯丙基、2'-O-[2-(甲基氨基)-2-氧代乙基]、4'-硫、4'-CH₂-O-2'-桥、4'-(CH₂)₂-O-2'-桥、2'-LNA、及2'-O-(N-甲基氨基甲酸酯)。

本文中描述的任何方面的再其它具体实施形式中，用于埃博拉病毒检测的正向引物和反向引物分别包含下述序列：

正向引物：

GACTCGATATCGAGTCGCTTCCA[MeOC]AGTTATC[MeOU][MeOA][MeOC][MeOC][MeOG]

反向引物：

GACTCGATATCGAGTCGAAATGC[MeOA]ACGA[MeOC][MeOA][MeOC][MeOC][MeOU]。

本文中描述的任何方面的再其它具体实施形式中，使用具有下述序列的探针检测扩增：gctacACGACTTTYGCTGAAGgtagc。本文中描述的任何方面的再其它具体实施形式中，该探针在5’端具有荧光染料且在3’端具有淬灭剂，或相反。本文中描述的任何方面的再其它具体实施形式中，该探针是

5‘-CALRed_610nm-gctacACGACTTTYGCTGAAGgtagc BHQ2-3’或

5’-FAM或FITC-gctacACGACTTTYGCTGAAGgtagc-BHQ1-3”。

本文中描述的任何方面的再其它具体实施形式中，该3’淬灭剂被DABsyl替换。

本文中描述的任何方面的再其它具体实施形式中，用于检测HIV病毒的正向引物和反向引物分别包含下述序列：

正向引物：

GACTCGATATCGAGTCTGACTAGmCGGAGGmCmTmAmGmAmAmG、

GACTCGATATCGAGTCTGACTAGmCAGAGGmCmTmAmGmAmAmG；以及

反向引物：

GACTCGATATCGAGTCTATTGACmGCTCmTmCmGmCmAmC、

GACTCGATATCGAGTCTACTGACmGCTCmTmCmGmCmAmC。

本文中描述的任何方面的再其它具体实施形式中，使用具有下述序列的探针来检测扩增：cgcaagGGAGAGAGATGGGTGcttgcg。

本文中描述的任何方面的再其它具体实施形式中，用于检测登革热病毒的正向引物和反向引物分别包含下述一种或多种序列：

正向引物：

GACTCGATATCGAGTCCAAAAACmAGCATATTmGmAmCmGmC；以及

反向引物：

GACTCGATATCGAGTCAGACAGCmAGGATCmTmCmTmGmG、

GACTCGATATCGAGTCAGACAGCmAGGATCmTmGmTmGmG。

本文中描述的任何方面的再其它具体实施形式中，使用具有下述序列的探针来检测扩增：cgcatcTGGTCTTTCCCAGCgatgcg。

本文中描述的任何方面的再其它具体实施形式中，用于检测乙型流感病毒的正向引物和反向引物分别含有一种或多种下述序列：

正向引物：

GACTCGATATCGAGTCAAATGCAmGATGGTCTCmAmGmCmTmA、

GACTCGATATCGAGTCAAATGCAmAATGGTCTCmAmGmCmTmA、

GACTCGATATCGAGTCAAATGCAmGATGGTTTCmAmGmCmTmA；以及

反向引物：

GACTCGATATCGAGTCCTCCTTTmTCCCATTCCATmTmCmAmTmT、

GACTCGATATCGAGTCCTCCCTTmTCCCATTCCATmTmCmAmTmT、

GACTCGATATCGAGTCCTCCTTTmCCCCATTCCATmTmCmAmTmT。

本文中描述的任何方面的再其它具体实施形式中，使用具有下述序列的探针来检测扩增：gccaaGCTATGAACACAGCAAActtggc。

本文中描述的任何方面的再其它具体实施形式中，用于检测BVDV1病毒的正向引物和反向引物分别含有一种或多种下述序列：

正向引物：

GACTCGATATCGAGTCGGCCCACmTGTATTGCTmAmCmTmGmAmAmA、

GACTCGATATCGAGTCGGCCCACmTGCACTGCTmAmCmTmAmAmAmA；以及

反向引物：

GACTCGATATCGAGTCTGTGATCmAACTCCmAmTmGmTmGmCmC。

本文中描述的任何方面的再其它具体实施形式中，使用具有下述序列的探针来检测扩增：cgctacATCTCTGCTGTACATGgtagcg。

本文中描述的任何方面的再其它具体实施形式中，该探针在5’端具有荧光染料且在3’端具有淬灭剂，或在3’端具有荧光染料且在5’端具有淬灭剂。在特别的具体实施形式中，该荧光染料是CALRed_610nm，而该淬灭剂是BHQ2或DABsyl。某些具体实施形式中，该荧光染料是FAM或FITC，而该淬灭剂是BHQ1或DABsyl。

本文中描述的任何方面的再其它具体实施形式中，该RNA病毒是埃博拉病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、登革热病毒、流感病毒(如，乙型流感病毒)、牛病毒性腹泻病毒(如，BVDV基因型1)、黄热病毒、西尼罗河病毒、丙肝病毒、拉沙病毒、黄冰冰的、或单链RNA病毒。本文中描述的任何方面的再其它具体实施形式中，该能提取病毒的剂是十二烷基硫酸钠、月桂基硫酸钠、硫氰酸胍、及/或盐酸胍的一种或组合。多个具体实施形式中，以约0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、7.5、10、15、20、25、50、100、250、500mM或更大的浓度使用硫氰酸胍或其它能提取病毒的剂。本文中描述的任何方面的再其它具体实施形式中，该方法用于医护人员的日常筛查。本文中描述的任何方面的再其它具体实施形式中，该样品经汇集且对人类或动物群体进行该筛查。

定义

“埃博拉病毒(EBOV)”意为具有与埃博拉病毒的至少约85％氨基酸序列一致性的丝状病毒。例示性埃博拉病毒包括，但不限于，造成人体内疾病的扎伊尔型埃博拉病毒、苏丹型埃博拉病毒、科特迪瓦型埃博拉病毒、及本迪布焦型埃博拉病毒，以及影响非人灵长动物的莱斯顿型埃博拉病毒。

例示性扎伊尔型埃博拉病毒基因组的序列提供为NCBI保藏号KC242800.1，其重现于下：

本发明进一步提供具有与此序列至少约85、90、95、96、97、98、99或100％一致性的多核苷酸。其它扎伊尔型埃博拉基因组是该领域已知的，且揭示于例如Baize et al.,NEngl J Med 2014；371:1418-25中，该文献通过引用而并入本文。

“核糖核酸酶P RNA成分H1(RPPH1)”意为该RNase P核糖核蛋白的RNA成分，一种内切核糖核酸酶，其裂解tRNA前体分子以形成其tRNA序列的成熟5-终端(prime termini)。例示性核酸序列提供为NCBI保藏号NR_002312。

“扩增子”意为在感兴趣的多核苷酸扩增过程中产生的多核苷酸。一个实施例中，扩增子是在聚合酶链反应过程中产生的。

“扩增速率修饰剂”意为能影响聚合酶外延速率的剂。

“碱基取代”意为核酸碱基聚合物的取代基，其并不对互补核苷酸链间的杂交造成显着破坏。

本公开中，“包含(comprises、comprising)”、“含有”和“具有”等可具有美国专利法中所认定的含义，且可意指“包括(includes、including)”等；同样，“主要由…组成(consisting essentially of或consists essentially)”具有美国专利法中所认定的含义，且该术语是开放式的，允许超过其所引用者的存在，只要其所引用者的基本特征或新颖特征并未被超过其所引用者的存在所改变即可，但不包括先前技术的具体实施形式。

“互补的”或“互补性”意为，一个核酸可通过传统瓦特生-克里克(Watson-Crick)碱基配对或胡斯坦(Hoogsteen)碱基配对与另一核酸序列形成一种或多种氢键。互补碱基配对不仅包括G-C和A-T碱基配对，而且包括牵涉普适碱基如肌苷的碱基配对。互补性百分比表明核酸分子中可与第二核酸序列形成氢键(如，Watson-Crick碱基配对)的连续残基的百分比(如，该第一寡核苷酸中总计10个核苷酸中的5、6、7、8、9、或10个核苷酸与具有10个核苷酸的第二核酸序列形成碱基配对，分别表示50％、60％、70％、80％、90％、和100％的互补性)。为了确认互补性百分比是至少某一百分比，计算核酸分子中能与第二核酸序列形成氢键(如，Watson-Crick碱基配对)的连续残基的百分比，并四舍五入至最接近的数字(如，第一寡核苷酸中总计23个核苷酸中的12、13、14、15、16、或17个核苷酸与具有23个核苷酸的第二核酸序列进行碱基配对，分别表示52％、57％、61％、65％、70％、和74％的互补性；以及分别具有至少50％、50％、60％、60％、70％、和70％互补性)。本文中，“大体上互补”指代链之间的互补性能令这些链在生物条件下杂交。大体上互补的序列具有60％、70％、80％、90％、95％、或甚至100％的互补性。据此，通过检查两条链的核苷酸序列而确定其能否在生物条件下杂交的技术是该领域中已知的。

本文中，“双链(duplex)”指代通过两个单股核酸的相互反应而形成的双螺旋结构。双链典型通过两个单链核酸间碱基的成对氢键键结即“碱基配对”而形成，该两个单链核酸相对于彼此反平行对准。双链中的碱基配对一般以Watson-Crick碱基配对出现，例如，在DNA和RNA中，鸟嘌呤(G)与胞嘧啶(C)形成碱基对；在DNA中，腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)形成碱基对；且在RNA中，腺嘌呤(A)与尿嘧啶(U)形成碱基对。可形成碱基对的条件包括生理学或生物学有关条件(如，细胞内：pH 7.2，140mM钾离子；细胞外：pH 7.4，145mM钠离子)。此外，双链通过相邻核苷酸间的堆叠反应而得以稳定化。本文中，双链可通过碱基配对或通过堆叠反应而得以建立或维持。通过两条互补的核酸链形成双链，该两条核酸链可以是大体上互补或完全互补。大量碱基上形成碱基对的多个单链核酸称为“杂交”。

“检测”指代鉴别待检测的被分析物的存在、不存在、或其量。一种具体实施形式中，该被分析物是埃博拉病毒多核苷酸或其它RNA病毒多核苷酸。

“可检测的部分”意为，当链接至感兴趣的分子时，使得后者可经由光谱学、光化学、生化、免疫化学、或化学手段检测的组成。举例而言，可用的标记包括放射性同位素、磁珠、金属性微珠、胶体颗粒、荧光染料、高电子密度试剂、酶(例如，一般用于ELISA中的酶)、生物素、地高辛(digoxigenin)、或半抗原。

“片段”意为核酸分子的一部分。这一部分优选含有参考核酸分子或多肽整个长度的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或90％。一个片段可含有5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、或100个核苷酸。一种具体实施形式中，该片段包含埃博拉病毒多核苷酸或其它RNA病毒多核苷酸的至少约50、75、80、85、89、90、或100个核苷酸。

“自由能(ΔG)”意指恒温恒压下系统与其环境间的净能量交换，以式ΔG＝ΔH–TΔS揭示。自由能表示一个结构如何是热力学稳定的，具有负ΔG(如，以kcal/mole表达)的结构形式是热力学稳定的(即，ΔG较低的结构比ΔG较高的结构稳定)。当系统在恒温恒压下达到平衡时，热力学势最小。

“杂交”意为在互补的多核苷酸序列(如，本文中揭示的基因)之间或其部分之间在多种严格条件下形成双链分子(见，如，Wahl,G.M.and S.L.Berger(1987)MethodsEnzymol.152:399；Kimmel,A.R.(1987)Methods Enzymol.152:507)。杂交通过互补性核酸碱基之间的氢键键结而出现，该氢键键结可以是Watson-Crick氢键键结、Hoogsteen氢键键结或逆Hoogsteen氢键键结。举例而言，腺嘌呤和胸腺嘧啶是通过形成氢键而配对的互补性核酸碱基。

“分离的多核苷酸”意为不包含基因的核酸(如，DNA、RNA)，而该基因在本发明核酸分子来源有机体的天然出现的基因组中，该核酸处于基因侧翼。该术语因此包括，举例而言，并入载体、并入自主复制质粒或病毒、或并入原核生物或真核生物基因组DNA的重组DNA；或作为独立于其它序列的单独分子(举例而言，通过PCR或限制性内且核酸酶消解而生产的cDNA或基因组或cDNA片段)存在的重组DNA。此外，该术语包括从DNA分子转录的RNA分子，以及作为编码杂交基因的其它多肽序列的一部分的重组DNA。

术语“分离的”、“纯化的”、或“生物纯的”指代不同程度地不含有天然状态中发现的正常伴随组分的材料。“分离的”指示从原始来源或周遭环境中单独的程度。“纯化”指示比分离更高的单独程度。“纯化的”或“生物纯的”蛋白质足够不含有其它材料，因此任何杂质都不能材料性地影响该蛋白质的生物学性质或造成其它不利后果。也就是说，当通过重组DNA技术生产本发明的核酸或肽，如果核酸或肽大体上不含细胞性材料、病毒性材料、或培养基，则其是纯化的；或当化学合成时，如果不含化学前体或其它化学品，则其是纯化的。典型使用分析化学技术，如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱测定纯度和同质性。术语“纯化的”可指示核酸偶蛋白质在电泳凝胶中基本上导致一条带。对于可进行改性如磷酸化或糖基化的蛋白，不同的改性可导致不同的分离的蛋白，它们可单独纯化。

“解链温度(Tm)”意为处于平衡中的系统的温度，该平衡为50％的分子群体处于一种状态，而50％的群体处于另一种状态。对于本发明的核酸，Tm是50％的群体为单链而50％为双链(如，分子内双链或分子间双链)时的温度。

“监控反应”意为检测反应的进度。一种具体实施形式中，监控反应进度涉及检测聚合酶扩展及/或检测扩展反应的完成。

本文中，“获得一剂”中的“获得”包括合成、购买或其它途径获取该剂。

本文中，术语“核酸”指代单链或双链形式的脱氧核糖核酸、核糖核酸、或改性核苷酸、及其聚合物。该术语涵盖含有已知核苷酸类似物或改性的骨架残基或链接基的核酸，该核酸是合成的、天然出现的、和非天然出现的，它们具有与参考核酸相似的结合性质，且它们以与参考核苷酸相似的方式被代谢。这些类似物的实例包括而不限于，2’-改性的核苷酸(如，2’-O-甲基核糖核苷酸、2’-F核苷酸)。

本文中，“改性的核苷酸”指代具有对核苷酸、核酸碱基、戊糖环、或磷酸酯基的一种或多种改性的核苷酸。举例而言，改性的核苷酸不包括含有单磷酸腺苷、单磷酸鸟苷、单磷酸尿苷、及单磷酸胞苷的核糖核苷酸和含有单磷酸脱氧腺苷、单磷酸脱氧鸟苷、单磷酸脱氧尿苷、及单磷酸脱氧胞苷的脱氧核糖核苷酸。改性包括那些通过改性核苷酸的酶如甲基转移酶进行改性而得到的天然出现的改性。改性的核苷酸也包括合成核苷酸或非天然出现的核苷酸。核苷酸中合成的或非天然出现的改性包括那些具有2’-改性的，如，2’-O-甲基、2'-甲氧基乙氧基、2'-氟、2’-羟基(RNA)、2'-烯丙基、2'-O-[2-(甲基氨基)-2-氧代乙基]、4'-硫、4'-CH₂-O-2'-桥、4'-(CH₂)₂-O-2'-桥、及2'-O-(N-甲基氨基甲酸酯)或那些包含碱基类似物的。

“核苷酸加合物”意为共价结合至或通过其它方式固定至标准核苷酸碱基的部分。

“切口剂”意为能识别并接合至双链核酸分子中的特定结构的一个化学整体，其在结合至所识别的特定结构时，能破坏单链上相邻核苷酸之间的磷酸二酯键，从而在该切口位点之前的末端核苷酸上创建自由的3’-羟基。在优选的具体实施形式中，该3’末端可通过核酸外切酶缺陷聚合酶来延伸。例示性的切口剂包括切口酶、RNA酶(RNAzymes)、DNA酶(DNAzymes)、和过渡金属螯合剂。

“回文(palindromic)”意为一类核酸序列，其在从一条链的5’端至3’端读取的序列与从互补链的5’端至3’端读取的序列完全相同或大体上相同。完美的回文指代具有两个毗连子序列的序列，因此，当以从5'至3'方向读取一个子序列时，该子序列与从3’至5’方向读取的另一子序列完全相同。

“聚合酶阻滞分子”意为与多核苷酸模板/引物相关的部分，其阻止或显着降低聚合酶在多核苷酸模板上的前进。优选地，该部分被并入该多核苷酸。一个优选具体实施形式中，该部分阻止聚合酶在该模板上前进。

“聚合酶扩展”意为聚合酶的正向前进，其将进入的单体匹配至它们的位于模板多核苷酸上的结合伙伴。

本文中，“引物二聚体”意为两个单体寡核苷酸引物的二聚体。本发明的寡核苷酸引物中，单体引物的5’尾部区域进行二聚。

“半定量”意为提供基于内部对照的相对数量的评估。

“特定产物”意为从引物寡核苷酸至互补靶标序列的杂交和后续聚合酶介导的该靶标序列的扩展获得的多核苷酸产物。

“大体上恒温条件”意为处于单一温度或并不显着变化的窄温度范围内。一种具体实施形式中，在大体上恒温条件下进行的反应是在仅变化1至5℃(如，变化1、2、3、4、或5度)的温度下进行的。另一具体实施形式中，该反应是在所用仪器的操作参数内的单一温度下进行的。

“数量阈方法”意为提供基于相对于比较标准的超量或不超量的数量评估。

“参考”意为标准或对照条件。如该领域技术人员所显而易见，适宜的参考是为了确定要素的效果而改变该要素之处。

“逆转录酶”意为一种酶，其在脱氧核糖核苷酸和容许的反应介质的存在下，将引动的单链RNA模板链复制为互补的DNA链，该反应介质包含但不限于，缓冲剂(pH 7.0至9.0)、钠离子及/或钾离子、以及镁离子。如该领域技术人员所显而易见，容许的反应介质的浓度和pH范围可关于具体逆转录酶而变动。该领域习知的适当“逆转录酶”的实例是，但不限于，MmLV逆转录酶及其商用衍生物“Superscript I、II和III”(Life Technologies)、“MaxiScript”(Fermentas)；RSV逆转录酶及其商用衍生物“OmniScript”(Qiagen)；AMV逆转录酶及其商用衍生物“Thermoscript”(Sigma-Aldrich)。

“个体”意为哺乳动物，包括但不限于，人或非人哺乳动物如牛、马、犬、羊或猫。

“靶标核酸分子”意为待分析的多核苷酸。这一多核苷酸可以是该靶标序列的正义链或反义链。术语“靶标核酸分子”也指代原始靶标序列的扩增子。

本文中提供的范围理解为该范围内全部数值的缩写。举例而言，1至50的范围理解为包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50所组成组中的任意数字、数字组合或子范围。

除非具体指明或从语境中明显可见，术语“或”理解为包括性的。除非具体指明或从语境中明显可见，本文中，“一”和“该”理解为单数或复数。

除非具体指明或从语境中明显可见，本文中，术语“约”理解为处于该领域正常公差范围内，举例而言，处于均值的2标准偏差内。约可理解为处于与所指明数值偏差10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、或0.01％的范围内。除非从语境中明确排除，本文中提供的全部数字值可由术语“约”修饰。

本文中变量的任何定义中对化学基团的详述和列举包括该变量的作为所列举基团的任何单一基团的定义或组合。对于本文中变量或方面的具体实施形式的详述，包括其作为任何单一具体实施形式或其与任何其它具体实施形式或其一部分的组合。

本文中提供的任何组成或方法可与本文中提供的任何其它组成及方法的一者或多者组合。

附图说明

图1是例示性说明检验埃博拉病毒(EBOV)的候选设计的示意图。

图2显示所测试的多种探针和引物，以及检验发展中使用的埃博拉病毒gBlock序列。gBlock是大小为100bp至1000bp范围的合成双链DNA片段，其完全在体外从合成单链寡核苷酸组装，且表示基因组DNA的序列已证实的合成嵌段。除非具体指明或从语境中明显可见，本文中，每当天然靶标序列或靶标基因组无法使用及/或无用时，“”作为合成性靶标核酸而使用。任何靶标序列的基因组DNA的序列已证实的嵌段可作为自定义顺序服务从IDT技术公司(IDT Technologies Inc.(1710Commercial Park,Coralville,Iowa52241,USA))获得，且术语“”是该公司的注册商标。

图3A至3X显示使用检验1和检验2获得的扩增结果。

图4显示一步检验中以人类总RNA为背景的埃博拉病毒的检测。

图5显示一步检验中以人类总RNA为背景的合成性埃博拉病毒RNA的检测。

图6A至6C提供例示性说明样品加工用于扩增和检测仪器的流程图，该仪器包括例如手持式装置。图6A表明稳定/裂解试剂(如，异硫氰酸胍(GITC))被冻干至毛细管内壁上。图6B例示性说明浸有经冻干的GITC和缓冲液(如，Whatman^TM FTA^TM Elute Cards)的纸的使用。图6C说明在多个管(如，8孔片)或单个管中的冻干检验过程。

图7A和7B显示样品制备方法。图7A说明从拭片样品制备的样品。图7B说明来自血液样品的样品制备。

图8是显示从一步反应过程中获得的结果的图，其中，该逆转录酶和聚合酶包括于单一反应中。

图9是显示从两步反应过程中获得的结果的图，其中，该逆转录酶反应在室温或56℃进行，且该cDNA被转移至第二管，扩增反应在该第二管内在56℃进行。

图10是显示对于1x10e4复本在56℃的RT、在56℃的DNAble的图。

图11A和11B显示在含有细胞总RNA的样品中的靶标RNA的检测。图11A是显示两步反应中检测RPPH1(RNase P RNA组分)的图。图11B是显示一步反应中检测RPPH1的图。

图12是显示在一步反应中检测粗制血液制剂中扎伊尔型埃博拉病毒的图。

图13是说明特异性检测扎伊尔型埃博拉病毒Mayinga株(Zaire Ebola Mayinga)而非苏丹型埃博拉病毒Boniface株(Sudan Ebola Boniface)的扎伊尔型埃博拉病毒检验的图。

图14是说明多个扎伊尔型埃博拉病毒Mayinga株稀释液仪器比较的图。

图15A至15D说明该埃博拉病毒检验的检测限。图15A是说明在含有100复本的埃博拉病毒靶标RNA的样品中检测的图。图15B是说明在含有50复本的埃博拉病毒靶标RNA的样品中检测的图。图15C是说明在含有25复本的埃博拉病毒靶标RNA的样品中检测的图。图15D是说明在含有12复本的埃博拉病毒靶标RNA的样品中检测的图。

图16A和16B显示以一步检验法对人免疫缺陷病毒(HIV)的检测。图16A是显示在检验引物和探针的设计中使用的序列的扩增子地图。表明了正向引物和反向引物中的群体序列变异性。外部引物序列对HIV亚型C(用于所使用的纯化的RNA样品)是特异性的。图16B显示一步检验中HIV的实时靶标特异性扩增。对于每一复本数，显示横跨5个技术重复样本的Cp值(10uL反应)。通过COBAS TaqMan HIV-1v2.0测试进行定量，从而表明纯化的HIV RNA(亚型C)(SeraCare)的复本。

图17A和17B显示以一步检验法对4型登革热病毒(DENV-4)的检测。图17A是显示在检验引物和探针的设计中使用的序列的扩增子地图。表明了反向引物中的群体序列变异性。图17B显示一步检验中DENV-4的实时靶标特异性扩增。显示横跨4个技术重复样本的Cp值(10uL反应)。从细胞培养物分离的总RNA(20pg)包括病毒RNA和宿主细胞RNA，而病毒RNA的总复本数未知。

图18A和18B显示以一步检验法对乙型流感病毒的检测。图18A是显示在检验引物和探针的设计中使用的序列的扩增子地图。表明了正向引物和反向引物中的群体序列变异性。图18B显示一步检验中乙型流感病毒的实时靶标特异性扩增。显示横跨4个技术重复样本的Cp值(10uL反应)。来自细胞培养物的分离的总RNA(20pg)包括病毒RNA和宿主细胞RNA，而病毒RNA的总复本数未知。样品1和2是不同的病毒隔离种。

图19A和19B显示以一步检验法对牛病毒性腹泻病毒基因型1(BVDV1)的检测。图19A是显示在检验引物和探针的设计中使用的序列的扩增子地图。表明了正向引物的群体序列变异性。图19B显示一步检验中牛病毒性腹泻病毒基因型1(BVDV1)的实时靶标特异性扩增。显示技术重复样本(10uL反应)。来自细胞培养物的分离的总RNA(20pg)包括病毒RNA和宿主细胞RNA，而病毒RNA的总复本数未知。使用未稀释的和经1:100稀释的细胞培养粗制裂解液。

具体实施方式

本发明提供使用恒温核酸扩增反应来快速鉴别RNA病毒(如，埃博拉病毒)感染的方法，其可对从粗制生物样品中提取的RNA进行检测。

埃博拉病毒在临床上难以诊断和辨别。在埃博拉疑似病例中，需要快速且可靠的实验室诊断。本发明提供这一检验。本发明至少部分地基于下述发现：埃博拉病毒多核苷酸(如，RNA)可在用于埃博拉病毒多核苷酸的一步或两步实时逆转录-恒温扩增检验中被检出。

埃博拉病毒

埃博拉病毒是具有反向RNA基因组的丝状病毒。病毒体是含有病毒衣壳、基质、和核蛋白壳组分的筒状/管状，其直径约80nm且长度为800至1000nm。埃博拉病毒被归为4级生物安全剂。埃博拉病毒出血热的潜伏期一般为5至18天，但可延长2至21天，取决于所接触的病毒株和被感染个体的状况。埃博拉病毒作用迅速。埃博拉病的初始症候类似疟疾、流感、或多种细菌感染的症候。因此，在埃博拉病毒感染被确诊之前，可能已经过去的几天或几周。次要症候包括腹泻；红眼；吐血；鼻、口或直肠流血；甚至脑出血。约50％至90％的病毒感染者发展为全身性多器官衰减和死亡。

患者诊断和监控

通过检测生物样品中的埃博拉病毒多核苷酸并将这一检测与埃博拉病毒感染的存在相关联，可诊断患者是否罹患埃博拉病毒。一种具体实施形式中，使用本发明的方法和组合物来检测患者生物样品中的埃博拉病毒，可检测该患者罹患埃博拉病毒的疾病状态。例示性生物样品包括体液(如，唾液、汗液、泪液、体腔内蓄积的流体、尿液、精液、阴道分泌物、脑脊液、淋巴液、粪便、痰、液体消化物、呕吐物、汗液、乳汁、血液、血清和血浆)、组织提取物、培养基(如，其内部已经生长有细胞如病原体细胞的液体)、或从例如可能被个体生物流体污染的材料获得的环境样品。

一种具体实施形式中，本发明提供以逆转录酶和切口扩增反应来扩增靶标多核苷酸的方法，该方法包括：

(a)在容许cDNA合成的条件下，令靶标RNA分子(如，埃博拉病毒基因组)与逆转录酶(RT)引物在逆转录酶和dNTPs的存在下接触，从而产生cDNA；以及

(b)在容许cDNA的恒温扩增的条件下，令该cDNA与正向引物和反向引物在切口酶、dNTPs、及链置换聚合酶的存在下接触，从而产生扩增子，其中，每一引物在其各自5’-末端区域内携带至少一个切口酶识别序列，并在其各自3’-末端区域内特异性结合该cDNA。

一种特别的具体实施形式中，本发明提供检测生物样品中埃博拉病毒的方法，该方法包括：

(a)令样品与能提取该样品中存在的埃博拉病毒RNA的剂(如，SDS、月桂基硫酸钠、异硫氰酸胍、盐酸胍)和能稳定化埃博拉病毒RNA以防止其降解的剂(如，SDS、RNA酶抑制剂、对抗RNAse的抗体、竞争性RNAse抑制剂)或能对RNA进行原位可逆化学改性的剂(如，乙酸酐)接触；

(b)在容许cDNA合成的条件下，令埃博拉病毒RNA与RT引物在逆转录酶和dNTPs的存在下接触，从而产生埃博拉病毒RNA的cDNA复本；

(c)在容许cDNA的恒温扩增的条件下，令该埃博拉病毒cDNA与正向引物和反向引物在切口酶、dNTPs、及链置换聚合酶的存在下接触，从而产生扩增子，其中，每一引物在其各自5’-末端区域内携带至少一个切口酶识别序列，并在其各自3’-末端区域内特异性结合该cDNA；以及

(d)检测该扩增子，其中，检测到埃博拉病毒扩增子的存在表明该样品中存在埃博拉病毒感染，而未检测到该扩增子则表明不存在埃博拉病毒感染。

一种具体实施形式中，本文中揭示的本发明的方法提供不超过5、7、10、15、20、25或30分钟内的结果。有利的是，本发明的方法可用于从粗制生物样品(如，唾液、汗液、泪液、体腔内蓄积的流体、尿液、精液、阴道分泌物、脑脊液、淋巴液、粪便、痰、液体消化物、呕吐物、汗液、乳汁、血液、血清和血浆)中提取而非纯化或分离的RNA。该测试是现场(如，医院、诊所、医生办公室、急救中心、家、社区活动中心、机场、舰船(如，游轮或用于运输人类或动物的其它船舶)、火车或火车站、或入境点(如，边境通道))进行的。有利的是，一种具体实施形式中，该测试是使用便携式电池供电装置(如，Amplifire)进行。

一种具体实施形式中，该RNA是使用离液序列高的盐(如，GITC、GHCL)或清洁剂(如，SDS、Tween和Triton)从生物样品提取的。若需要，在该提取步骤之前、之中或之后，加入RNA酶抑制剂。

另一具体实施形式中，该逆转录酶与该链置换DNA聚合酶是同一个。

另一具体实施形式中，不需要单独的引物或该RT引物与正向引物及/或反向引物相同。

另一具体实施形式中，本发明提供使用mRNA检测用Dual FRET分子信标(如，Santagelo,Nucleic Acids Res.2004；32(6):e57揭示)、从DNTPs和使用镁或钙进行沉淀释放的焦磷酸盐浊度进行的EBOV或其它病毒扩增子检测。

另一具体实施形式中，本发明提供使用横向流装置进行的埃博拉病毒扩增子检测，其中，该埃博拉病毒扩增子包含一对结合伙伴(如，生物素和链霉亲和素)的一个成员，且该横向流装置包含该成对伙伴的另一个成员；并提供检测该扩增子的手段(如，比色法)。

本发明的方法中使用的逆转录酶包括，但不限于，Maloney鼠白血病病毒逆转录酶(MMLV RT)及其包含相对于野生型MMLV RT突变的衍生物或变异型；禽成髓细胞瘤病毒(AMVRT)及其包含令它们相对热稳定的突变的衍生物或变异型；鲁斯氏肉瘤病毒(RSV)RT(如，Omniscript、Qiagen)及其衍生物或变异型；以及焦磷酸酯逆转录酶(pyroreversetranscriptase)(如，Pyroscript luceigen)及其衍生物或变异型，US 7,094,539中揭示的一种RT，该专利通过引用而以其整体并入本文，或用于RT PCR和转录组分析的商用高保真恒温逆转录酶(如，Lucigen)。

一种具体实施形式中，在56度，该引物与RNA或扩增子形成稳定的络合物。一种具体实施形式中，超过50％的引物序列必需与该靶标核酸分子互补。一种具体实施形式中，该RT引物长度约为18个碱基。一种具体实施形式中，该逆转录酶(RT)引物是随机引物(如，每个序列位置可能是四种碱基的任意一种，这些引物与该靶标杂交)。一种具体实施形式中，该RT引物是六聚体、七聚体、八聚体、或九聚体。

一种具体实施形式中，该RT源自嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geo嗜热脂肪芽孢杆菌)，是M-MLV RT(即，Superscript/LifeTech、Maxima/Thermo-Fisher)及/或其突变体/衍生物、AMV RT(即，Thermoscript/LifeTech)及/或其突变体/衍生物、RSV RT(即，OmniScript/Qiagen)及/或其突变体/衍生物。

本发明的方法提供高度敏感性。一种具体实施形式中，EBOV是以1x10³、1x10⁴、1x10⁵、1x10⁶、1x10⁷、或1x10⁹复本的EBOV RNA每毫升血液检测的。另一具体实施形式中，本发明提供每反应约1至10之间(如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)复本的RNA的检测。

通过从罹患或疑似罹患EBOV感染的个体获得样品(如，生物样品)或通过从家、病房、运输工具获得已经或疑似被埃博拉病毒或含有EBOV的生物流体污染的环境样品，检测EBOV(或其它病毒)。一种具体实施形式中，通过获得血液样品、黏液样品、粪便或通过擦拭被影响的组织而获得生物样品。可从鼻、咽、眼、或其它黏膜取得拭片。尸检中，可从死者的血液或组织收集样品。

有利的是，本发明的诊断方法适用于近乎任何情况。EBOV是包括利比里亚、尼日利亚、几内亚和塞拉利昂的西非大部分地区的流行病。西非的许多地区缺少基本的医疗设施和诊断实验室。本发明可用于电池供电的手持装置，这便于在不存在电力供应的地区测试生物样品。此外，本方法足够简单，它们能由接受有限的诊断技术使用训练的医务人员实施。

本发明提供使用恒温核酸扩增反应来快速鉴别EBOV或其它病毒感染的方法，该方法可对从粗制生物样品中提取的RNA进行检测。

在疾病过程的早期，个体的生物样品如血液样品中仅存在低水平的病毒。若需要，可使用该领域已知的方法，举例而言，通过加入PEG和NaCl令病毒体从样品中沉淀，随后使用纳米孔过滤器将病毒体从样品中滤出，富集样品中存在的病毒体，从而提供对病毒多核苷酸的早期检测。

可使用本发明的方法和组合物监控可能已经暴露于埃博拉病毒(或其它病毒)的个体的疾病状态和对该对象的治疗。一种具体实施形式中，监控对埃博拉病毒多核苷酸(或其它病毒多核苷酸)的检测，而该病毒多核苷酸存在于体液如唾液、汗液、泪液、体腔中的蓄积液、尿液、精液、阴道分泌物、脑脊液、淋巴液、粪便、痰、液体消化物、呕吐物、汗液、乳汁、血液、血清和血浆中。举例而言，该监控可用于诊断该试验对象罹患埃博拉病毒(或其它病毒)，或确定特定药物在个体或在评价疾病级数中的功效。

核酸扩增方法

核酸扩增技术已经提供了理解病原生物体如EBOV或其它RNA病毒的复杂生物过程、检测、鉴别和定量的手段。本发明提供对生物样品中EBOV反义RNA基因组的检测，包括使用逆转录酶从RNA基因组合成EBOV DNA分子，随后以恒温切口扩增反应来扩增该DNA。

聚合酶链反应(PCR)是常用来扩增DNA的热循环依赖性核酸扩增技术，由重复加热和冷却的循环组成，该循环用于以DNA聚合酶进行DNA解链和DNA的酶促复制反应。实时定量PCR(qPCR)是用来定量生物样品中给定核酸序列的复本数的技术。目前，qPCR使用贯穿该反应进行对反应产物的实时检测，并将该扩增概况与对照组的扩增比较，其中，该对照组在每一反应开始时含有已知量核酸(或相对比率已知的核酸与未知的被测试核酸)。使用对照组的结果，典型基于该标准反应扩增曲线的对数部分，构建标准曲线。基于其扩增曲线与标准对照数量的比较，使用这些数值对未知物的数量进行插值。

除PCR外，现有的非热循环依赖性扩增系统或恒温核酸扩增技术包括，而不限于：切口扩增反应、滚环扩增(RCA)、解旋酶依赖性扩增(HDA)、环圈介导的扩增(LAMP)、链置换扩增(SDA)、转录介导的扩增(TMA)、自我持续序列复制(3SR)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、单一引物恒温扩增(SPIA)、Q-β复制酶系统、及重组酶聚合酶扩增(RPA)。

恒温切口扩增反应具有与PCR热循环的相似性。类似PCR，切口扩增反应采用与靶标序列互补的寡核苷酸序列，指代为引物。此外，靶标序列的切口扩增反应导致靶标序列的对数增长，恰似标准PCR所为。与标准PCR不同，切口扩增反应是在恒温下进行的。标准PCR中，升温以允许DNA的两条链区隔开来。切口扩增反应中，在测试样品中存在的特异性切口位点将靶标核酸序列切口。聚合酶浸润该切口位点，并开始进行被切口的靶标核苷酸序列(所加入的外源性DNA)的互补链合成，同时进行现有互补DNA链的置换。该链置换复制过程不需要升温。此时，引物分子从所加入的外源性DNA退火为被置换的互补序列。现在，聚合酶从该模板的3’端延伸，创建与先前被置换链互补的链。随后，第二寡核苷酸引物退火为新合成的互补链并延伸，作成包括该切口酶识别序列的DNA双链。随后，该链容易被后续的通过该聚合酶进行的链置换延伸而被切口，导致DNA双链的生成，所生产的DNA双链在原始靶标DNA的另一侧具有切口位点。一旦被合成，继续通过复制被新模板分子置换的链而令该分子指数性扩增。此外，通过切口平移合成在模板引入的切口位点的重复动作，扩增也从每一产物分子线性前进。结果为非常迅速增长的靶标信号扩增；比PCR热循环迅速得多，扩增在不超过10分钟内完成。

切口扩增检验

本发明提供对在恒温切口扩增检验中扩增的EBOV靶标核酸分子的检测。

可用于本文中揭示方法的聚合酶能催化核苷酸的并入，以延伸键结至靶标核酸分子的寡核苷酸(如，引物)的3'羟基端及/或位于具有链置换活性的双链DNA分子中切口位点的3'羟基端。该聚合酶也缺乏5'-3'核酸外切酶活性或该活性大幅度降低，且可包括那些嗜热性聚合酶。对于牵涉在引物区域具有2’-改性核苷酸且包含6个3’-端核苷酸的引物的方法，可使用的DNA聚合酶包括从嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophillus，也归类为Geobacillus stearothermophillus)分离、以及从密切相关的菌株、分离物和包含嗜热菌属的物种中分离的DNA聚合酶I的衍生物和变异型，其缺乏5'-3'核酸外切酶活性或该活性大幅度降低，且具有链置换活性。例示性聚合酶包括，但不限于，Bst DNA聚合酶I的大片段、Gst DNA聚合酶I的大片段、和Gka DNA聚合酶I的大片段。

可用于本文中揭示方法的切口剂是能识别并结合至双链核酸分子中的特定结构的化学整体，当结合至其所识别的特异性结构时，其破坏上部链上相邻核苷酸间磷酸二酯键的速率大幅高于破坏底部链上相邻核苷酸间磷酸二酯键的速率，从而在该切口位点之前的末端核苷酸上创建自由的3’-羟基，而该自由羟基可通过5’-3’-核酸外切酶不足的链置换聚合酶延伸。在本文中揭露方法的优选具体实施形式中，该“切口剂”裂解上部链磷酸二酯键的速率接近100％，而裂解底部链磷酸二酯键的速率接近0％。本文中揭示的方法中使用的切口剂，可以是酶，即传递多个底物分子的自我再生催化剂；或仅以等摩尔比方式传递单一底物分子的非再生性催化剂。

切口酶结合双链DNA并裂解该双链性双螺旋的一条链。本发明的方法中，该切口酶裂解上部链(包括该切口剂识别位点的5’-3’序列的链)。本文中揭露的本发明的一个特别的具体实施形式中，切口酶仅裂解上部链和该识别位点的3’下游。例示性具体实施形式中，该反应包含使用裂解或切口该结合位点下游的切口酶，因此，产物序列不含有该切口位点。使用裂解该结合位点下游的酶，使得该聚合酶更容易延伸而不必一定置换该切口酶。事实上，该切口酶在与聚合酶相同的反应条件下起作用。例示性切口酶包括，但不限于，N.Bst9I、N.BstSEI、Nb.BbvCI(NEB)、Nb.Bpu10I(Fermantas)、Nb.BsmI(NEB)、Nb.BsrDI(NEB)、Nb.BtsI(NEB)、Nt.AlwI(NEB)、Nt.BbvCI(NEB)、Nt.Bpu10I(Fermentas)、Nt.BsmAI、Nt.BspD6I、Nt.BspQI(NEB)、Nt.BstNBI(NEB)、和Nt.CviPII(NEB)。切口酶识别位点的序列提供于表1中。

表1.切口酶识别序列

切口酶也包括通过改性限制性核酸内切酶的裂解活性而创造的工程切口酶(NEBexpressions July 2006,vol 1.2)。当限制性核酸内切酶结合至它们在DNA中的识别序列时，每一酶中用于水解每一链的两个催化位点驱使两个平行进行的单独的水解反应。可加工改变的限制性酶，令其仅水解该双链中的一条链，以生产“被切口的”(3′-羟基,5′-磷酸酯)而非裂解的DNA分子。切口酶也可包括改性的CRISPR/Cas蛋白、转录活化子样效应子核酸酶(TALENs)、以及具有切口酶活性的锌指结构核酸酶。

切口扩增反应典型包含核苷酸如，举例而言，三磷酸二脱氧核糖核苷酸(dNTPs)。该反应也可在包括可检测部分的dNTPs的存在下进行，该可检测部分包括但不限于放射性标记(如，³²P、³³P、¹²⁵I、³⁵S)、酶(如，碱性磷酸酶)、荧光标记(如，异硫氰酸荧光素(FITC))、生物素、抗生物素蛋白、地高辛、抗原、半抗原、或荧光染料。该反应进一步包含某些供养该切口酶和聚合酶活性的盐和缓冲剂。

有利的是，该切口扩增反应在大体上恒温的条件下进行，其中，在扩增反应进程中，该反应的温度大于或小于恒定值。因为该温度不需要在较高温度与较低温度之间循环，切口扩增反应可在难以进行传统PCR的条件下进行。典型地，该反应在约35℃与90℃之间(如，约35、37、42、55、60、65、70、75、80、或85℃)进行。有利的是，以高精确度维持温度并不是必需的。温度的一些改变是可以接受的。

将用于扩增反应的引物集合选择为其ΔΔG’s≤-15、-16、17、-18、-19、-20、-25、-30kcal/mole或更低。可通过增加一种或多种寡核苷酸(如，一种或多种引物及/或探针)的浓度及/或其比例而改变扩增反应的运行特性。高浓度的引物也促进引物二聚体的形成。多种具体实施形式中，引物的浓度为100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000nM或更大。也可使用解链温度(Tm)修饰剂和反应速率修饰剂来降低该寡核苷酸的解链温度，该修饰剂为例如(但不限于)乙二醇和甘油。此外，DNA聚合酶反应速率修饰剂(如，dNTP和镁浓度)可用来改变反应速率，以导致更大的定量精确度。特别的具体实施形式中，该正向引物和反向引物的5’尾部序列具有相同的核酸序列。

本发明提供实时监控切口扩增反应的方法，包括，举例而言，使用本文中揭示的扩增策略。一种具体实施形式中，定量核酸扩增采用靶标核酸扩增以及并行的已知量的对照扩增。靶标核酸的量可计算为绝对定量或基于该对照来源(外源性对照或内源性对照)的相对定量(半定量)。

通过将未知的对数阈值扩增与一系列已知靶标序列在单独的一组反应中或在相同的反应中比较，可实现未知核苷酸序列的定量；或作为产生阈值的内部内源性或外源性共扩增产物，表明一阳性结果(如果未知物超过阈值)或一阴性结果(如果未知物不超过阈值)。

本发明也提供设计切口剂依赖性恒温链置换扩增检验而不进行大批候选正向引物及/或大批反向引物的实验筛选的方法。在具有Tm≥检验温度(如，～55℃)的中心部位，靶标序列内的35至70bp长的区域被鉴别为具有12至20bp序列。根据上述准则，鉴别该15至20bp长的中心部位上游和下游紧邻的12bp至20bp长的序列。所选择的上游和下游相邻双链序列的Tm彼此偏差小于±3℃。通过将用于形成稳定的二聚体的引物的5’-尾部区域与该12至20碱基的上游相邻序列的5’-末端和该12至20碱基的下游相邻序列的互补链的5’-端接合，创造正向引物和反向引物的靶标特异性配对。当将该正向引物、反向引物、以及探针组合时，驱动与探针互补的链的合成的引物相对于另一引物过量，两者的摩尔比为约1.1:1至10:1。该检验中引物的合并浓度不高于1000nM。该检验设计方法也可用来将用于扩增子≤70bp的预验证PCR检验转变为切口剂依赖性恒温链置换扩增检验。

引物设计

用于引物设计的传统方法已经聚焦在引物解链温度、引物退火温度、GC(鸟嘌呤和胞嘧啶)含量、引物长度、和最小化引物与除靶标核酸外全部物质的相互作用(见，如，www.premierbiosoft.com/tech_notes/PCR_Primer_Design.html)。与这些方法相反，已经发现，以术语生成自由能(ΔG)表达的形成稳定的引物/二聚体的引物，在核酸扩增反应中起的作用可预见。尽管自由能(ΔG)和解链温度(Tm)分担焓(ΔH)和熵(ΔS)的主要成分，ΔG值和Tm值以不同方式导出且不具有相关性，将给定ΔG与给定Tm值关联的唯一方法是明确知道导出这两个值的ΔH值和ΔS值(Manthey,“mFold,Delta G,and MeltingTemperature”and 2011Integrated DNA Technologies)。图1至11关于最佳引物的设计。

可使用该领域已知的公式计算分子间引物结构的生成自由能(ΔG)。大量程序可用于确定多种分子内和分子间引物结构的生成和计算其ΔG，包括，举例而言，mfold和UNAfold预测算法(见，如，Markham and Zuker.UNAFold:Software for Nucleic AcidFolding and Hybridization.Bioinformatics:Volume 2,Chapter 1,pp 3-31,HumanaPress Inc.,2008；Zuker et al.Algorithms and Thermodynamics for RNA SecondaryStructure Prediction:A Practical Guide In RNA Biochemistry and Biotechnology,11-43,NATO ASI Series,Kluwer Academic Publishers,1999；M.Zuker.Prediction ofRNA Secondary Structure by Energy Minimization.Methods in Molecular Biology,267-294,1994；Jaeger et al.Predicting Optimal and Suboptimal SecondaryStructure for RNA.In Molecular Evolution:Computer Analysis of Protein andNucleic Acid序列s,Methods in Enzymology 183,281-306,1990；Zuker.On Finding AllSuboptimal Foldings of an RNA分子.Science 244,48-52,1989)。OligoAnalyzer 3.1是用于引物设计的一种此类应用程序(www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/)。举例而言，参照OligoAnalyzer 3.1，可使用下列参数实施ΔG的计算：靶标类型：DNA；寡核苷酸浓度：0.25μM；Na⁺浓度：60mM；Mg⁺⁺浓度：15mM；以及，dNTPs浓度：0.3mM。

3’识别区域

本发明提供具有3’识别序列的引物，该3’识别序列的引物-靶标的生成是稳定的(ΔG≤约-20kcal/mol或更低)且具有提升核酸扩增反应效能的潜力。该3’识别区域特异性结合至核酸分子，例如该核酸分子的互补序列。某些具体实施形式中，该3’识别区域具有与核酸序列的12、13、14、15、16、17、18、19、或20个或更多碱基互补的序列。特别的具体实施形式中，该3’识别区域包含一种或多种肌苷碱基。特别的具体实施形式中，该3’识别区域包含不超过2/12肌苷。多种具体实施形式中，引物-靶标解链温度比该检验的扩展温度低大于或等于8°或6℃(Tm≥检验温度-8°)。特别的具体实施形式中，该3’识别序列包含12至20、12至17、或12至14个碱基。特别的具体实施形式中，引物-靶标的生成比自身二聚体的生成更稳定(如，ΔΔG≤约-15、-16、-17、-18、-19、-20kcal/mol或更低)。优选该3’识别序列不含有自互补序列、短的反向重复序列(如，>4个碱基/重复)、或反而促进分子内相互作用的序列，这些序列具有干扰引物-靶标退火的潜力。

一种具体实施形式中，引物被设计为具有56℃的Tm，且在引物的末端具有4个可能不对退火起作用的序列特异性碱基。一种具体实施形式中，该引物是16聚体、17聚体、18聚体、19聚体、20聚体、或21聚体。

特别地，本发明的具有3’识别序列的引物可用于切口扩增检验中。此外，该EBOV或其它病毒靶标特异性的3’识别区域包含一种或多种2’改性的核苷酸(如，2’-O-甲基、2'-甲氧基乙氧基、2'-氟、2’-烷基、2’-烯丙基、2'-O-[2-(甲基氨基)-2-氧代乙基]、2’-羟基(RNA)、4’-硫、4’-CH₂-O-2’-桥、4’-(CH₂)₂-O-2’-桥、及2'-O-(N-甲基氨基甲酸酯))。不欲受缚于理论，假定将一种或多种2’改性的核苷酸并入识别区域降低或消除引物/模板的分子间及/或分子内相互作用(如，引物二聚体的生成)，且因此降低或消除恒温控制中的背景信号。该2’改性的核苷酸优选具有与靶标序列配对的碱基。特别的具体实施形式中，该EBOV或其它病毒靶标特异性识别区域内的两个或更多个2’改性的核苷酸(如，2、3、4、5或更多个2’改性的核苷酸)是连续的(如，改性的核苷酸嵌段)。一些具体实施形式中，该2’改性的核苷酸嵌段位于该靶标特异性识别区域的3’端。其它具体实施形式中，该2’改性的核苷酸嵌段位于该EBOV或其它病毒靶标特异性识别区域的5’端。当该2’改性的核苷酸嵌段位于该靶标特异性识别区域的5’端时，该2’改性的核苷酸可通过一种或多种未改性的核苷酸(如，2、3、4、5或更多个2’未改性的核苷酸)与切口位点区隔。申请人已经发现，一种或多种2’改性核苷酸或2’改性核苷酸嵌段的定位改变了扩增的动力学。当一种或多种2’改性的核苷酸或2’改性的核苷酸嵌段位于或接近该识别区域的5’端或邻近该切口位点时，实时扩增反应显示检测时间缩短。此外，信号曲线收缩且该曲线的斜率变更。

相关的具体实施形式中，可使用具有一种或多种2’改性核苷酸的引物的比来改变检测所需时间及/或用于反应“调谐”的反应效率，导致对反应动力学的可预见控制。增加在该识别序列3’端具有一种或多种2’改性核苷酸的引物与在该识别序列5’端具有一种或多种2’改性核苷酸的引物的比，收缩了信号曲线并变更了该曲线的斜率。提供用来操纵检测时间以及反应效率的手段对于能够“调谐”反应是有利的。使用内部对照的相对定量需要符合两个重要条件。首先，创建非竞争性反应条件对于能够改变反应的检测时间是有益的。因此，通过影响对照反应以令其在较晚时间点(相对于感兴趣的靶标)可检测，甚至当感兴趣的靶标处于低初始丰度时，对照反应也未在与感兴趣的特异性靶标的竞争中具有优势。其次，为了确保真实的相对丰度计算，需要该对照反应和特异性靶标反应具有相匹配的效率。通过控制使用“调谐”条件控制每一反应的效率，令反应能被匹配，从而能够进行令人满意的相对定量计算。调谐该反应可用来匹配定量PCR(qPCR)中靶标核酸扩增及参考核酸扩增(如，内标)的效率。此外，可改变靶标核酸及内标的扩增曲线，因此，它们的扩增产物的检测时间被区隔开来，同时对靶标核酸扩增和内标扩增提供相同的效率。通过反应内寡核苷酸结构的特异性组合以及比率，可创造能调谐反应性能的条件。

5’尾部二聚作用区域

本发明提供具有能自体二聚体化的5’尾部区域的引物，它能提升EBOV或其它病毒核酸扩增反应性能。不欲受缚于理论，在核酸扩增反应中，该引物退火为靶标核酸作为引物二聚体。举例而言，切口扩增引物具有存在于5’端的切口剂识别位点，该位点与该引物对于靶标识别序列的结合特异性不相关。来自非特异性引物相互作用的非特异性背景产物，具有隔绝将会被该特异性产物的扩增所采用的反应组分。多种具体实施形式中，同源二聚体的生成是稳定的(如，ΔG≤约-30、-35、-40、-45、-50、-55、-60kcal/mol或更低)。多种具体实施形式中，该同源二聚体的解链温度高于扩展反应温度。特别的具体实施形式中，该5’尾部区域具有回文序列。进一步的具体实施形式中，该5’尾部区域的长度为至少12个碱基(如，12、13、14,15、16、17、18、19、20、21、22、23、24个碱基)。其它具体实施形式中，该5’尾部区域的GC含量为80至90％。某些具体实施形式中，二聚体的生成比其它较不稳定引物二聚体构型的生成更稳定(如，ΔΔG≤约-12、-13、-14、-15、-16、-17、-18、-19、-20、-25、-30、-35、-40kcal/mol或更低)。

特别地，本发明的具有5’尾部的引物可用于切口扩增反应。对于在切口扩增反应中的用途，该5’尾部区域包含一种或多种切口剂识别位点，且该5’尾部区域具有对称的逆序列。特别的具体实施形式中，该5’尾部区域含有偶数个核苷酸(如，22、24个核苷酸)。切口位点设计为定位在5’尾部区域的3’端核苷酸与3’识别区域的5’端核苷酸之间。不欲受缚于理论，当3’区域为单链时，切口酶并不在该切口位点裂解。然而，当该3’区域为双链时，裂解出现在该切口位点(如，当在核酸扩增反应进程中将该引物并入双链靶标核酸分子时)。

多种具体实施形式中，该5’尾部序列包含从5’至3’的逆切口酶识别序列，该识别序列可操作地链接至回文序列(或自互补序列)，而该回文序列可操作地链接至切口酶识别序列。某些具体实施形式中，该间隔区域是偶数个核苷酸(如，2、4、6等)。基于Nt.BstNBI切口酶识别序列(5’-GAGTC-3’)的具有2、4、及6个核苷酸间隔的例示性5’尾部包含根据下式的核酸序列：

5’‐GACTCN₁N_1’ GAGTC‐3’

5’‐GACTCN₂N₁N_1’N_2’ GAGTC‐3’

5’‐GACTCN₃N₂N₁N_1’N_2’N_3’ GAGTC‐3’

其中，“N”是任意核苷酸(如，具有腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、或鸟嘌呤(G)核糖碱基)，且N₁与N_1’完全互补，N₂与N_2’互补，以及，N₃与N_3’互补，以此类推。

可基于下述模板产生长度为24个核苷酸的具有Nt.BstNBI识别序列的例示性5’尾部区域序列：5’-NNNNGACTCNNNNNNGAGTCNNNN-3’。基于这一目标，存在537,824个具有下述性质的5’尾部序列：ΔG＝-48Kcal/mole至62kcal/mole；ΔΔG<-40kcal/mole；以及，GC含量为68％至84％。其中，提供1050个所选择的序列，代表了0.2％的整体序列空间(248,832)。可基于下述模板产生长度为22个核苷酸的具有Nt.BstNBI识别序列的例示性5’尾部区域序列：5’-NNNNGACTCNNNNGAGTCNNNN-3’。基于这一目标，存在248,832个具有下述性质的5’尾部序列：ΔG＝-47Kcal/mole至-55kcal/mole；ΔΔG<-40kcal/mole；以及，GC含量为72％至82％。其中，提供200个所选择的序列，代表了0.08％的整体序列空间(248,832)。

靶标核酸分子

本发明的方法和组合物可用于扩增及/或鉴别测试样品中的EBOV或其它病毒核酸分子。从保护病毒核酸分子，包括EBOV核酸分子的几乎任何样品扩增该靶标序列。特别地，本发明的方法和组合物可用于RNA病毒的扩增及/或鉴别。除EBOV外，可使用本发明的方法和组合物检测的例示性RNA病毒包括，而不限于，人免疫缺陷病毒(HIV)、登革热病毒、流感病毒(如，乙型流感病毒)、牛病毒性腹泻病毒(如，BVDV基因型1)、黄热病病毒、西尼罗河病毒、丙肝病毒、拉沙病毒、黄病毒、沙粒病毒、及单链RNA病毒。

例示性测试样品包括体液(如，唾液、汗液、泪液、体腔内蓄积液、尿液、精液、阴道分泌物、脑脊液、淋巴液、粪便、痰、液体消化物、呕吐物、汗液、乳汁、血液、血清和血浆)、组织提取物、培养基(如，其中已经生长有细胞如病原体细胞的液体)、环境样品、农产品或其它食品、及其提取物，以及DNA鉴别标签。若需要，该样品在加入切口扩增反应之前纯化，纯化方法为典型用于从生物样品分离核酸分子的任何标准方法。

一种具体实施形式中，引物扩增病原体的靶标核酸，以检测样品中EBOV或其它病毒的存在。对于环境应用，测试样品可包括水、可能已经暴露于EBOV感染者的建筑材料(如，干式墙、吊顶板、壁板、纺织品、壁纸、和地板覆盖物)的液体提取物、环境拭片、或任何其它样品。

本发明的方法提供对1x10³、1x10⁴、1x10⁵、1x10⁶、1x10⁷、或1x10⁹复本EBOV RNA每毫升血液的检测。

应用

本发明的使用引物的靶标核酸扩增，具有可用于病毒(如，EBOV)核酸分子的快速检测的特征。本发明的组合物和方法可用于需要快速诊断应答(如，在20、15、10、9、8、7、6、5分钟或更短时间内的可检测扩增)的人类诊断。特别的具体实施形式中，本发明提供EBOV切口扩增反应检验在临床环境下或该领域中在人类诊断和兽医诊断中的用途。其它具体实施形式中，本发明提供切口扩增反应检验在热循环设备不可用或太过昂贵的地区的诊断领域工作中的用途。再其它的具体实施形式中，本发明提供切口扩增反应检验在需要快速定量应答的临床环境中的用途。

可检测的寡核苷酸探针

本发明提供使用不可扩增的可检测多核苷酸探针在切口扩增反应中对靶标核酸分子或其扩增子的检测，该探针包含至少一个聚合酶捕获分子(如，核苷酸改性或其它部分，其使得该寡核苷酸能结合靶标核酸分子但不能支持使用该可检测寡核苷酸探针作为靶标的聚合酶扩展)。不欲受缚于理论，一种或多种不允许聚合酶前进的部分的存在，似乎造成了聚合酶被捕捉入除该寡核苷酸外的非核酸骨架中，或通过复制聚合酶的停顿而捕获聚合酶(即，C3-间隔物、损坏的DNA碱基、其它间隔物部分、O-2-Me碱基)。这些构造因此防止或降低切口扩增反应进程中该探针的非法扩增。这将它们与传统检测探针区别开，而传统探针必需在切口扩增反应结束时加入以防止探针的扩增。

已经证实，传统检测探针不能实时检测切口扩增反应。若将传统检测探针并入切口扩增反应中，这些传统检测探针将与靶标同时扩增。由于反应开始时检测探针的起始分子数目，这些检测分子的扩增遮蔽了合法靶标扩增子的检测。

本发明提供不可扩增的可检测多核苷酸探针，其包含至少一个聚合酶捕获分子。本发明的聚合酶捕获分子包括，但不限于，核苷酸改性或其它部分，其阻断通过复制DNA聚合酶的扩展，从而防止检测分子的扩增；但可允许与靶标分子或该靶标分子的扩增复本间的适宜杂交或核苷酸间隔。一种具体实施形式中，本发明的可检测寡核苷酸探针包含防止或降低检测分子的非法扩增的3碳间隔物(C3-间隔物)。

一种具体实施形式中，可检测寡核苷酸探针包含一种或多种具有提升的与互补核苷酸亲和性的改性核苷酸碱基。改性碱基的实例包括，但不限于，2'氟酰胺化物和2'OMeRNA酰胺化物(也起聚合酶捕获分子的作用)。本发明的可检测寡核苷酸探针可合成为具有不同颜色的荧光团，且可设计为与几乎任何靶标序列杂交。就其卓越的特异性而言，本发明的不可扩增的可检测多核苷酸探针被用来检测样品中的单一靶标核酸分子，或与各自结合不同靶标核酸分子的可检测寡核苷酸探针合用。据此，本发明的不可扩增的可检测多核苷酸探针可用来检测相同反应中的一种或多种靶标核酸分子，允许这些靶标的同步检测。本发明涵盖此类荧光团与本文揭示的可检测寡核苷酸探针的协作用途。

硬件和/或软件的实现

本文揭示的方法可在多用途或特异性程序化的硬件或软件上实现。举例而言，该方法可通过计算机可读媒介实现。据此，本发明也提供配置为实施根据本发明任何具体实施形式的算法及/或方法的软件及/或计算机程序产品。如何配置可实施本发明所提供的算法及/或方法的软件，是该领域技术人员众所周知的。该计算机可读媒介可以是非瞬时的(non-transitory)及/或瞬时(tangible)的。举例而言，该计算机可读媒介可以是易失性存储器(如，随机存取存储器等)或非易失性存储器(如，只读存储器、硬盘、软盘、磁带、光碟、纸质表格、打孔卡(punchcard)等)。该计算机可执行指令可以适当的计算机语言或若干语言的组合写入。基本的计算生物学方法揭示于例如下述文献中：Setubal and Meidanis etal.,Introduction to Computational Biology Methods(PWS Publishing Company,Boston,1997)；Salzberg,Searles,Kasif,(Ed.),Computational Methods in MolecularBiology,(Elsevier,Amsterdam,1998)；Rashidi and Buehler,Bioinformatics Basics:Application in Biological Science and Medicine(CRC Press,London,2000)；以及Ouelette and Bzevanis Bioinformatics:A Practical Guide for Analysis of Geneand Proteins(Wiley&Sons,Inc.,2nd ed.,2001)。

本发明也可利用多种计算机程序产品和软件，该产品和软件用于各种目标，如探针设计、数据管理、分析、和仪器操作(见，US 5,593,839、US 5,795,716、US 5,733,729、US5,974,164、US 6,066,454、US 6,090,555、US 6,185,561、US 6,188,783、US 6,223,127、US6,229,911、及US 6,308,170)。据此，本发明可具有优选的具体实施形式，该具体实施形式包括用于提供在网络如Internet上提供基因信息的方法，如US 10/197,621、US 10/063,559(公开号US 20020183936)、US 10/065,856、US 10/065,868、US 10/328,818、US 10/328,872、US 10/423,403、及US 60/482,389中所示。

试剂盒

本发明也提供用于扩增EBOV或其它RNA病毒核酸分子的试剂盒。此类试剂盒可用于对从个体获得的生物样品中的EBOV或其它RNA核酸的检测或定量。本发明的试剂盒可包含，举例而言，一种或多种逆转录酶、DNA聚合酶、正向引物和反向引物、以及一种或多种本文中揭示的切口酶、以及可检测的探针。对于EBOV或其它RNA待扩增的应用，该试剂盒中可包括一种或两种切口酶。对于多种病原体序列待扩增的应用，设计用于那些靶标序列的模板包含用于相同切口酶的切口酶位点，则可包括一种或两种切口酶。对于模板被不同切口酶识别的应用，该试剂盒中可包括多种切口酶如，举例而言，3种或更多。

一方面，本发明提供用于核酸扩增的试剂盒，该试剂盒包含逆转录酶、DNA聚合酶、初级引物、二级引物、具有与该引物内切口酶结合位点的特异性的切口酶、以及三磷酸脱氧核苷酸(dNTP’s)(如，处于含有足以用于扩增的组分的缓冲溶液中)。多种具体实施形式中，该初级引物和二级引物各自具有与靶标序列互补或大体上互补的3’-端特异性识别区域序列，其中，该端特异性识别区域包含一种或多种2’改性核苷酸；含有位于3’端特异性识别区域序列上游的切口酶结合位点的5’端尾部区域，其可与自身二聚体化(如，自互补)。特别的具体实施形式中，一种或多种引物以引物二聚体构造存在(如，通过在Tm左右加热再缓慢冷却)。

本发明的试剂盒也可包含处于任何数目的单独容器、小包、管(如，<0.2ml、0.2ml、0.6ml、1.5ml、5.0ml、>5.0ml)、小瓶、微量滴定板(如，<96孔、96孔、384孔、1536孔、>1536孔)、阵列带(ArrayTape)等中的一种或多种组分或可在这些容器内以多种组合方式组合的组分。多种具体实施形式中，该试剂盒进一步包含一对能结合并扩增参考序列的引物。特别的具体实施形式中，该试剂盒包含以引物二聚体构型存在的一种或多种引物(如，通过在Tm作用加热并缓慢冷却而生产的)。又其它的具体实施形式中，该试剂盒包含无菌容器，该无菌容器含有该引物；这些容器可以是盒子、安瓿、瓶子、小瓶、管、包、袋、泡罩包装、或该领域中已知的其它适当容器。这些容器可由塑料、玻璃、层压板、金属箔、或其它适用于容纳核酸的材料制作。

该试剂盒的组分可存在于例如一种或多种容器中，举例而言，全部组分可处于一个容器内，或者，举例而言，酶可处于与引物隔离的容器内。举例而言，该组分可以是干燥的(如，粉末)或处于稳定缓冲液(如，经化学稳定化的、经热稳定化的)中。举例而言，干燥组分可通过冻干、真空和离心辅助干燥、及/或环境干燥制备。多种具体实施形式中，该聚合酶和切口酶为处于单一容器内的冻干形式；而该引物是处于不同容器内的或经冻干、冷冻干燥形式或处于缓冲液中。一些具体实施形式中，该聚合酶、切口酶、及引物是处于单一容器内的冻干形式。其它具体实施形式中，该聚合酶和切口酶可隔离处于不同的容器中。

试剂盒可进一步包含，举例而言，该反应中使用的dNTPs、或改性核苷酸、用于该反应的比色皿或其它容器、或装有用于将冻干组分再水合的水或缓冲液的小瓶。举例而言，该缓冲液可以适用于聚合酶和切口酶两者的活性。

本发明的试剂盒也可包含实施本文中揭示的一种或多种方法的使用指南，及/或本文中揭示的一种或多种组分或试剂的说明书。使用指南及/或说明书可以是印刷形式或可包括于试剂盒插页中。试剂盒也可包括提供这些使用指南或说明书的网址的书面说明。

除非明确排除，本发明的实践采用传统的分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学技术，这些技术处于该领域技术人员的知识范围内。这些技术在下述例示文献中具有完整解释：《分子克隆：实验室手册(第二版)》(“MolecularCloning:A Laboratory Manual”,second edition(Sambrook,1989))；《寡核苷酸合成》(“Oligonecleotide Synthesis”(Gait,1984))；《动物细胞培养》(“Animal Cell Culture”(Freshney,1987))；《酶学方法》《实验免疫学手册》(“Methods in Enzymology”“Handbookof Experimental Immunology”(Weir,1996))；《哺乳动物细胞的转基因载体》(“GeneTransfer Vectors for Mammalian Cells”(Miller and Calos,1987))；《分子生物学现代方法》(“Current Protocols in Molecular Biology”(Ausubel,1987))；《PCR：聚合酶链反应》(“PCR:The Polymaerase Chain Reaction”,(Mullis,1994))；《免疫学现代方法》(“Current Protocols in Immunology”(Coligan,1991))。这些技术可应用在本发明的多核苷酸和多肽的生产中，且就其本身而论，可考虑用于本发明的制作和实践中。特别有用于特别的具体实施形式的技术将在下文中讨论。

提出下述实施例以向该领域技术人员提供如何制作并使用本发明的检验、筛查和治疗方法的完整揭露和说明，且并非意欲限制发明人所认为的发明范畴。

[实施例]

实施例1.用于EBOV的一步和两步实时逆转录-恒温扩增检验

一步反应指代逆转录和扩增出现在单一反应方法中的逆转录酶(RT)反应。两步反应指代逆转录酶反应，于该反应中，首先进行逆转录，之后转移至第二扩增反应。

测试检验1和检验2对于检测EBOV多核苷酸EBOV的能力(图1)。用于这些检验的引物显示于图2中。

图3A至3X显示使用检验1和检验2获得的扩增结果。使用这些检验来检测人cDNA背景中的EBOV gBlock复本。反应条件指定。

图4显示使用一步检验对人总RNA背景中EBOV的检测。

图5显示使用一步检验对人总RNA背景中合成性EBOV RNA的检测。

图6A至6C提供例示性说明用于扩增和检测仪器的样品处理的流程图。

图7A和7B分别显示从拭片和血液制备样品的方法。

一个工作实施例中，使用下述引物和探针序列检测埃博拉病毒：

正向引物	GACTCGATATCGAGTCGCTTCCA[MeOC]AGTTATC[MeOU][MeOA][MeOC][MeOC][MeOG]
		反向引物	GACTCGATATCGAGTCGAAATGC[MeOA]ACGA[MeOC][MeOA][MeOC][MeOC][MeOU]
探针	gctacACGACTTTYGCTGAAGgtagc
		外部引物	CTTCTTAGCTTGGGGCAGTATCA

引物：[MeON]表明甲氧基碱基

探针序列：小写字母为干序列，大写字母为识别序列

1:5 1000nM 0.3U/ul切口酶

上述序列中，GAGTC是切口酶识别位点。

嘧啶提供对埃博拉病毒株包括扎伊尔型病毒株的简并检测。

合成性DNA靶标：

AAGATGACTGCAGGAGTCAATGCGCAGTTGGTCCCGGCAGACCAGGCGAACATTACCGAATTTTACAACAAGTCCCTTTCATCCTACAAGGAGAATGAGGAGAACATCCAGTGTGGGGAGAACTTCATGGACATGGAGTGCTTCATGATTCTGAACCCCAGTCAGCAGCTGGCAATTGCCGTCTTGTCTCTCACACTGGGCACCTTCACAGTTCTGGAGAACTTGCTGGTGCTGTGTGTCACCACAGTTATCTACCGAGGAACGACTTTCGCTGAAGGTGTCGTTGCATTTCTGATTCCTTCACTCCCGCAGCCTCCGCTGCCGGCCCTCTTACCACTTCATCATTAGCCTGGCCGTGGCCGACCTTCTGGGGAGTGTCATTTTTGTCTACAGCTTTGTTGACTTTCATGTGTTCCACCGCAAGGACAGCCCCAACGTCTTTCTCTTCAAATTGGGTGGGGTCACCGCCTCCTTCACGGCCTCTGTAGGCAGCCTCTTCC

合成性RNA靶标：

rGrArCrUrGrCrArGrGrArGrUrCrUrGrCrUrGrCrUrUrCrCrArCrArGrUrUrArUrCrUrArCrCrGrArGrGrArArCrGrArCrUrUrUrCrGrCrUrGrArArGrGrUrGrUrCrGrUrUrGrCrArUrUrUrCrUrGrArUrUrC rCrUrUrC rArCrUrCrCrCrG

一步反应和两步反应都含有最终浓度为166.7nM的正向引物和最终浓度为833.3nM的反向引物，以及浓度为200nM的探针和0.1X的SYBR绿(最终浓度)。此外，一步反应和两步反应都含有最终浓度为1x的提取缓冲液2，该缓冲液包含Tris pH 8.0、NH₄ ⁺、Na⁺、和Mg²⁺；dNTPs；0.4U/ul BST聚合酶；以及0.3U/ul Nt.BSTnbi切口酶。除这些组分外，该一步反应含有10U/ul的Maxima逆转录酶；1.0U/ul的RNA酶抑制剂(SUBERase IN，由lifetechnologies生产)。合成性RNA中还加入了1.0U/ul的RNA酶抑制剂，以防止降解。所使用的全部水均为购买的不含核酸酶的水。

反应在冰上混合并保持寒冷，直至在Roche LC480上运行位置。Roche LC480在双色检测下运行，以检测calfluor红610信标信号(Abs590nm/Em 610nm)和SYBR绿信号(Abs495nm/Em 520nm)。

一步反应在56℃下进行20分钟。结果显示在图8中。

两步反应如下进行：遵循新英格兰生物实验室(New England Biolabs)概述的设置条件(https://www.neb.com/protocols/2012/10/03/first-strand-cdna-synthesis-kit-using-protoscript-ii-reverse-transcriptase-m0368)，逆转录酶步骤在56℃进行5分钟(隔热)或在室温进行5分钟(图9)。两个RT温度都产生了1x10⁵复本靶标每反应的信号。该逆转录酶步骤之后，在LC480上于56℃进行15分钟的扩增步骤。这一检验的结果在图10中显示。使用供应商的计算法测定每反应中表明的复本数。

实施例2.复杂RNA混合物中靶标RNA的检测

为了确定一步反应和两步反应能否检测RNA分子的复杂混合物中的靶标RNA，将检验设计为用于检测人总RNA中的RPPH1(RNA酶P RNA组分)。一个工作实施例中，使用下述引物序列和探针序列检测RPPH1。

引物：mN表示甲氧基碱基

两步反应中，使用随机六聚体引物将人RNA(10ng)转化为cDNA，通过靶标特异性序列的扩增来检测RPPH1(图11A)。一步反应中，使用特异性逆转录引物通过靶标特异性序列的扩增来检测人RNA(20ng)(图11B)。

实施例3.生物样品中埃博拉病毒的检测

另一工作实施例中，使用一步检验来检测与粗制血液制剂混合时的埃博拉病毒RNA靶标。通过下述制备粗制血液制剂：将全血(20μl)与十二烷基硫酸钠(0.5％SDS；20μl)混合，将该混合物在室温孵化(3min)。孵化后，加入牛血清白蛋白(2％BSA；20μl)，所得混合物在室温孵化(1min)。向该粗制血液制剂(1μl)加入合成性埃博拉病毒RNA靶标(1000复本)。反应在Roche LC480上以一式三份在56℃运行。结果显示在图12中。

其它实验中，一步检验能区别扎伊尔型埃博拉病毒Mayinga株RNA分子与苏丹型埃博拉病毒Boniface株RNA分子间。以扎伊尔型埃博拉病毒Mayinga株或苏丹型埃博拉病毒Boniface株感染Vero E6细胞，并纯化病毒RNA。使用经纯化的扎伊尔型埃博拉病毒Mayinga株RNA(683复本)或苏丹型埃博拉病毒Boniface株RNA(650复本)运行反应集合。对于每一集合，在Roche LC480上运行四个平行反应(10μl)。这些检验检测了扎伊尔型埃博拉病毒Mayinga株RNA(图13；曲线集合A)，且不检测苏丹型埃博拉病毒Boniface株RNA(图13；曲线集合B)。因此，扎伊尔型埃博拉病毒检验对于扎伊尔型埃博拉病毒Mayinga株是特异性的。

使用从10¹至10⁷复本靶标RNA的扎伊尔型埃博拉病毒Mayinga株RNA多级稀释和无靶标的对照(NTC)样品进行仪器比较。所测试的仪器包括Roche Lightcycler 480II、Axxin检测器、及Douglas Scientific Amplifire扩增和检测仪器。尽管观察到一些仪器变化性，这些仪器全部可检测EBOV RNA的宽范围复本(图14)。

为了确定一步EBOV检验的检出下限，测试含有100、50、25、及12复本扎伊尔型埃博拉病毒Mayinga株RNA的无菌稀释样品。该一步反应(10μl)在Roche LightCycler 480上运行，每一级稀释至少进行10次平行测试。对于100和500复本的反应，进行二十(20)次平行测试。对于25复本的反应，进行四十(40)次平行测试。对于100和50复本每反应的检测，观察到了100％(20/20)检出率(图15A和15B)。对于25复本每反应的检测，观察到了95％(38/40)的检出率(图15C)。因此，这些结果显示了甚至当作为一步检验实施时的EBOV检验的敏感性和特异性。

实施例4.生物样品中人免疫缺陷病毒(HIV)的检测

一个工作实施例中，在以gag蛋白质序列为靶标的一步检验中检测人免疫缺陷病毒(HIV)。获得纯化的HIV RNA(亚型C)(SeraCare)，且使用一步HIV检验来测试通过COBAS TaqMan HIV-1 v2.0测试进行定量的已知数量的HIV RNA。使用下述引物和探针序列：

Hgag(HIV gag靶标)

引物	序列
		Hgag.F2a	GACTCGATATCGAGTCTGACTAGmCGGAGGmCmTmAmGmAmAmG
Hgag.F2b	GACTCGATATCGAGTCTGACTAGmCAGAGGmCmTmAmGmAmAmG
		Hgag.R1a	GACTCGATATCGAGTCTATTGACmGCTCmTmCmGmCmAmC
Hgag.R1b	GACTCGATATCGAGTCTACTGACmGCTCmTmCmGmCmAmC
		Hgag.rt3.subC*	GCATCTAATTTTTCGCC(外部引物)
Hgag.probe.T	cgcaagGGAGAGAGATGGGTGcttgcg

引物：mN表示甲氧基碱基

探针序列：小写字母＝干序列，大写字母＝识别序列

*外部引物序列对于HIV亚型C(所使用的纯化RNA样品)具有特异性

图16A是显示所使用序列的定位的扩增地图。该外部引物的序列对于HIV亚型C(所使用的纯化RNA样品)具有特异性。该一步HIV检验设计为具有两组正向引物和反向引物，以负责群体中的序列变种。上述序列中，GAGTC是切口酶识别位点。

该一步反应含有最终浓度为9nM的正向引物(Hgag.F2a+Hgag.F2b的1:1混合物)和最终浓度为91nM的反向引物(Hgag.R1a+Hgag.R1b的1:1混合物)，正向引物与反向引物的引物比约为1:10。使用最终浓度为200nM的探针和最终浓度为100nM的外部引物。此外，该一步反应含有最终浓度为1x的运行缓冲液(Run Buffer)，该缓冲液包含Tris、K⁺、及Mg²⁺；硫氰酸胍(GITC)；dNTPs；0.4U/ul BST聚合酶；和0.3U/ul Nt.BSTnbi切口酶。除了这些组分之外，该一步反应含有0.2U/μl的AMV逆转录酶高光谱活性XL(Life Sciences AdvancedTechnologies)和0.5U/μl的RNA酶抑制剂(Superasin；Thermo Fisher)。所使用的水全部不含核酸酶。

使用calfluor红610信标信号(Abs 590nm/Em 610nm)的实时检测来运行反应。使用125、250、500、和1000复本的HIV RNA在56℃进行20分钟的一步反应。使用一步HIV检验来演示全复本数的HIV RNA的特异性检测(图16B)。

实施例5.生物样品中4型登革热病毒(DENV-4)的检测

一个工作实施例中，在以3’UTR序列为靶标的一步检验中检测4型登革热病毒(DENV-4)。从包括病毒和宿主细胞RNA两者的细胞培养物中分离总RNA，并用于该一步DENV-4检验中。因此，总复本数未知。使用下述引物和探针序列：

Den4(4型登革热病毒)

引物	序列
		Den4.F2	GACTCGATATCGAGTCCAAAAACmAGCATATTmGmAmCmGmC
Den4.R1a	GACTCGATATCGAGTCAGACAGCmAGGATCmTmCmTmGmG
		Den4.R1b	GACTCGATATCGAGTCAGACAGCmAGGATCmTmGmTmGmG
Den4.extRT1	TCTGTGCCTGGATTGAT(外部引物)
		Den4.probe.B	cgcatcTGGTCTTTCCCAGCgatgcg
Den4.F2	GACTCGATATCGAGTCCAAAAACmAGCATATTmGmAmCmGmC

引物：mN表示甲氧基碱基

探针序列：小写字母＝干序列；大写字母＝识别序列

图17A是显示所使用序列的定位的扩增地图。该一步DENV-4检验设计为具有两组正向引物和反向引物，以负责群体中的序列变种。上述序列中，GAGTC是切口酶识别位点。

该一步反应含有最终浓度为83nM的正向引物和最终浓度为17nM的反向引物(Den4.R1a+Den4.R1b的1:1混合物)，正向引物与反向引物的引物比约为5:1。使用最终浓度为200nM的探针和最终浓度为100nM的外部引物。此外，该一步反应含有最终浓度为1x的运行缓冲液，该缓冲液包含Tris、K⁺、及Mg²⁺；dNTPs；0.4U/ul BST聚合酶；和0.3U/ulNt.BSTnbi切口酶。除了这些组分之外，该一步反应含有0.2U/μl的AMV逆转录酶高光谱活性XL(Life Sciences Advanced Technologies)和0.5U/μl的RNA酶抑制剂(Superasin；Thermo Fisher)。所使用的水全部不含核酸酶。

使用calfluor红610信标信号(Abs 590nm/Em 610nm)的实时检测来运行反应。使用20pg总RNA在56℃进行20分钟的一步反应。使用一步DENV-4检验来演示4型登革热病毒RNA的特异性检测(图17B)。

实施例6.生物样品中乙型流感病毒的检测

一个工作实施例中，在以流感病毒片段7序列为靶标的一步检验中检测乙型流感病毒。从包括病毒和宿主细胞RNA两者的细胞培养物中分离总RNA，并用于该一步乙型流感病毒检验中。因此，总复本数未知。使用下述引物和探针序列：

FluB(乙型流感病毒)

引物	序列
		FluB.F2a	GACTCGATATCGAGTCAAATGCAmGATGGTCTCmAmGmCmTmA
FluB.F2b	GACTCGATATCGAGTCAAATGCAmAATGGTCTCmAmGmCmTmA
		FluB.F2c	GACTCGATATCGAGTCAAATGCAmGATGGTTTCmAmGmCmTmA
FluB.R3a	GACTCGATATCGAGTCCTCCTTTmTCCCATTCCATmTmCmAmTmT
		FluB.R3b	GACTCGATATCGAGTCCTCCCTTmTCCCATTCCATmTmCmAmTmT
FluB.R3c	GACTCGATATCGAGTCCTCCTTTmCCCCATTCCATmTmCmAmTmT
		FluB.extRT1a	TTTTGGACGTCTTCTCC(外部引物)
FluB.extRT1b	TTTTGAACGTCTTCTCC(外部引物)
		FluB.probe.T	gccaaGCTATGAACACAGCAAActtggc

引物：mN表示甲氧基碱基

探针序列：小写字母＝干序列；大写字母＝识别序列

图18A是显示所使用序列的定位的扩增地图。该一步乙型流感病毒检验设计为具有三组正向引物和反向引物以及两种外部引物，以负责群体中的序列变种。上述序列中，GAGTC是切口酶识别位点。

该一步反应含有最终浓度为9nM的正向引物(FluB.F2a+FluB.F2b+FluB.F2c的1:1:1混合物)和最终浓度为91nM的反向引物(FluB.R3a+FluB.R3b+FluB.R3c的1:1:1混合物)，正向引物与反向引物的引物比约为1:10。使用最终浓度为200nM的探针和最终浓度为100nM的外部引物。此外，该一步反应含有最终浓度为1x的运行缓冲液，该缓冲液包含Tris、K⁺、及Mg²⁺；dNTPs；0.4U/ul BST聚合酶；和0.3U/ul Nt.BSTnbi切口酶。除了这些组分之外，该一步反应含有0.2U/μl的AMV逆转录酶高光谱活性XL(Life Sciences AdvancedTechnologies)和0.5U/μl的RNA酶抑制剂(Superasin；Thermo Fisher)。所使用的水全部不含核酸酶。

使用calfluor红610信标信号(Abs 590nm/Em 610nm)的实时检测来运行反应。使用来自不同分离物的总RNA在56℃进行20分钟的一步反应。使用一步乙型流感病毒检验来演示全部分离物中乙型流感病毒RNA的特异性检测(图18B)。

实施例7.生物样品中牛病毒性腹泻病毒基因型1(BVDV1)的检测

一个工作实施例中，在以流感病毒片段7序列为靶标的一步检验中检测牛病毒性腹泻病毒基因型1(BVDV1)。从包括病毒和宿主细胞RNA两者的细胞培养物中分离总RNA，并用于该一步BVDV1检验中。因此，总复本数未知。使用下述引物和探针序列：

1型牛病毒性腹泻病毒(BVDV1)

引物	序列
		BVDV1.F1a	GACTCGATATCGAGTCGGCCCACmTGTATTGCTmAmCmTmGmAmAmA
BVDV1.F1b	GACTCGATATCGAGTCGGCCCACmTGCACTGCTmAmCmTmAmAmAmA
		BVDV1.R1	GACTCGATATCGAGTCTGTGATCmAACTCCmAmTmGmTmGmCmC
BVDV1.RT1v	TATGTTTTGTATAAAAGTTCATTTG(外部引物)
		BVDV1.探针T	cgctacATCTCTGCTGTACATGgtagcg

引物：mN表示甲氧基碱基

探针序列：小写字母＝干序列；大写字母＝识别序列

图19A是显示所使用序列的定位的扩增地图。该一步BVDV1检验设计为具有两组正向引物和反向引物，以负责群体中的序列变种。上述序列中，GAGTC是切口酶识别位点。

该一步反应含有最终浓度为9 nM正向引物的(BVDV1.F1a+BVDV1.F1b的1:1混合物)和最终浓度为91 nM的反向引物，正向引物与反向引物的引物比约为1:10。使用最终浓度为200nM的探针和最终浓度为100nM的外部引物。此外，该一步反应含有最终浓度为1x的运行缓冲液，该缓冲液包含Tris、K⁺、及Mg²⁺；dNTPs；0.4 U/ul BST聚合酶；和0.3 U/ulNt.BSTnbi切口酶。除了这些组分之外，该一步反应含有0.2U/μl的AMV逆转录酶高光谱活性XL(Life Sciences Advanced Technologies)和0.5U/μl的RNA酶抑制剂(Superasin；Thermo Fisher)。所使用的水全部不含核酸酶。

使用calfluor红610信标信号(Abs 590nm/Em 610nm)的实时检测来运行反应。使用来自BVDV1病毒培养物(牛宿主细胞RNA与病毒的混合物)及细胞培养物粗制裂解液(未稀释和1:100稀释)的纯化RNA(20pg/技术重复样本)在56℃进行20分钟的一步反应。使用一步BVDV1检验来演示全部样品中BVDV1RNA的特异性检测(图19B)。

实施例8：埃博拉病毒株的分子信标识别

例示性信标BLAST对其输出和病毒株列表：

仅有信标的病毒株列表：

埃博拉病毒株间的扩增子相似性分析

例示性BLAST对齐输出和病毒株列表：

病毒株列表：

其它实施形式

从前述说明书可见，可对本文中揭示的本发明做出变更和修改，以令其适应多种用法和条件。这些具体实施形式也处于权利要求书范畴内。

对本文中变量的任何定义中元件清单的描述，包括该变量作为任何单一元件或所列元件组合(或次级组合)的定义。对本文中具体实施形式的描述，包括该具体实施形式作为单一具体实施形式或与任何其它具体实施形式或其部分的组合。

本申请可与2013年4月9日提交的国际专利申请案PCT/US 2013/035750关联，该申请案主张2012年4月9日提交的美国临时申请案US 61/621,975的权益，上述两份申请通过的整体内容通过引用而并入本文。

本申请可与2011年8月9日提交的国际专利申请案PCT/US 2011/047049关联，该申请案主张2010年8月13日提交的美国临时申请案US 61/373,695的权益，上述两份申请通过的整体内容通过引用而并入本文。

本说明书中提及的全部专利和出版物通过引用而并入本文，引用程度与每一独立专利和出版物具体且个别地指明为通过引用而并入本文相同。

Claims

1.一种将恒温扩增反应与逆转录耦合来检测具体靶标多核苷酸的方法，该方法包含：

(b)在容许cDNA的恒温扩增的条件下，令该cDNA与正向引物和反向引物在切口酶、dNTP、可检测的寡核苷酸探针、及链置换聚合酶的存在下接触，每一引物在其各自5’-末端区域内携带至少一个切口酶识别序列，并在其各自3’-末端区域内特异性结合该cDNA；以及

(c)检测该可检测寡核苷酸探针杂交至扩增子的特异性信号，其中检测到该信号表明该样品中靶标多核苷酸的存在或数量，且未检测到该信号则表明该样品中不存在靶标多核苷酸。

2.一种检测样品中RNA病毒的方法，该方法包含：

(a)在容许cDNA合成的条件下，令样品中的RNA病毒靶标多核苷酸分子与引物在逆转录酶和dNTP的存在下接触，从而产生cDNA；

(c)检测该可检测寡核苷酸探针杂交至扩增子的特异性信号，其中检测到该信号表明该样品中靶标RNA病毒多核苷酸分子的存在或数量，未检测到该信号则表明不存在靶标RNA病毒。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中，该多核苷酸分子是埃博拉病毒、HIV、登革热病毒、流感病毒、牛腹泻病毒、黄热病病毒、西尼罗河病毒、丙肝病毒、拉沙病毒、黄病病毒、或沙粒病毒多核苷酸。

4.一种检测样品中埃博拉病毒的方法，该方法包含：

(a)在容许cDNA合成的条件下，令样品中的埃博拉病毒多核苷酸与引物在逆转录酶和dNTP的存在下接触，从而产生cDNA；

(c)检测该可检测寡核苷酸探针杂交至扩增子的特异性信号，其中检测到该信号表明该样品中埃博拉病毒多核苷酸的存在或数量，且未检测到该信号则表明该样品中不存在埃博拉病毒多核苷酸。

5.一种检测样品中埃博拉病毒的方法，该方法包含：

(b)在容许cDNA合成的条件下，令所提取并稳定化的埃博拉病毒RNA与引物在逆转录酶和dNTP的存在下接触，从而产生埃博拉病毒cDNA；

(c)在容许cDNA的恒温扩增的条件下，令该埃博拉病毒cDNA与正向引物和反向引物在切口酶、dNTP、可检测的寡核苷酸探针、及链置换聚合酶的存在下接触，从而产生扩增子，每一引物在其各自5’-末端区域内携带至少一个切口酶识别序列，并在其各自3’-末端区域内特异性结合该埃博拉病毒cDNA；以及

(d)检测该扩增子，其中检测到埃博拉病毒扩增子的存在表明该样品中存在埃博拉病毒多核苷酸分子，且未检测到该扩增子则表明该样品中不存在埃博拉病毒多核苷酸。

6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，通过令该样品与一种或多种能提取该样品中存在的RNA分子的剂和能稳定RNA分子以防止其降解的剂接触而获得该多核苷酸分子。

7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中，在缺少靶标多核苷酸的对照检验中，在检验开始后第7、10和/或15分钟无可检测信号。

8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中，步骤(a)中所用引物具有与步骤(b)中所用引物相同或不同的序列。

9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中，步骤(a)至(c)是在单一反应中进行的。

10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中，该逆转录酶和链置换DNA聚合酶是相同或不同的酶。

11.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中，步骤(a)的cDNA在第一反应容器中产生，并随后转移至第二反应容器，并在该第二反应容器内进行步骤(b)。

12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中，该样品是体液。

13.如权利要求12所述的方法，其中，该体液选自由唾液、汗液、泪液、体腔内蓄积的液体、尿液、精液、阴道分泌物、脑脊髓液、淋巴液、粪便、痰、液体消化物、呕吐物、乳汁、血液、血清和血浆所组成的组。

14.如权利要求13所述的方法，其中，该体腔是腹腔或心包腔。

15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中，检出限是每反应10个或20个复本。

16.如权利要求1-15任一项所述的方法，其中，该方法进行约5、7、10、15、20、25或30分钟。

17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中，步骤(a)至(d)是对生物样品进行的。

18.如权利要求3-17中任一项所述的方法，其中，埃博拉病毒RNA并未从该生物样品纯化或分离。

19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中，该方法使用便携式电池供电装置在护理或诊断点进行。

20.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中，不需要单独的逆转录酶引物，但使用正向引物和/或反向引物。

21.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其中，该样品是生物样品或环境样品。

22.如权利要求21所述的方法，其中，该生物样品是从个体、蝙蝠、丛林肉或家畜获得的。

23.如权利要求21所述的方法，其中，该生物样品是选自由颊、鼻、眼、直肠及阴道黏膜所组成组的黏膜拭片或皮肤。

24.如权利要求21所述的方法，其中，该生物样品是从个体、尸体、或培养基获得的组织样品。

25.如权利要求24所述的方法，其中，该尸体是人类、灵长类、蝙蝠或其它哺乳动物的尸体。

26.如权利要求21所述的方法，其中，该环境样品是可能被患有埃博拉病毒感染或具有埃博拉病毒感染发展倾向的个体的生物体液污染的材料。

27.如权利要求26所述的方法，其中，该环境样品是寝具、坐垫、地毯、空调过滤器或其它材料。

28.如权利要求1-27中任一项所述的方法，其中，该聚合酶是Bst DNA聚合酶I、Gst DNA聚合酶I、Gka DNA聚合酶I、Gca DNA聚合酶I、Gan DNA聚合酶I、Gbo DNA聚合酶I、Gsp70 DNA聚合酶I、GspT3 DNA聚合酶I、Gsp52 DNA聚合酶I及/或其片段的5’-exo^-衍生物。

29.如权利要求1-28中任一项所述的方法，其中，该切口酶是Nt.BstNBI、Nt.BspD6I、Nt.BspQI、Nt.BsmAI、Nt.AlwI、N.Bst9I、或N.BstSEI的一种或多种。

30.如权利要求1-29中任一项所述的方法，其中，该逆转录酶是M-MLV RT、AMV RT、RSVRT、及/或其突变体/衍生物。

31.如权利要求1-30中任一项所述的方法，其中，该可检测的探针包含分子信标。

32.如权利要求3-31中任一项所述的方法，其中，该用于检测EBOV的正向引物和反向引物分别包含下述序列：

正向引物：

GACTCGATATCGAGTCGCTTCCA[MeOC]AGTTATC[MeOU][MeOA][MeOC][MeOC][MeOG]

反向引物：

GACTCGATATCGAGTCGAAATGC[MeOA]ACGA[MeOC][MeOA][MeOC][MeOC][MeOU]。

33.如权利要求3-32中任一项所述的方法，其中，使用具有下述序列的探针检测EBOV：gctacACGACTTTYGCTGAAGgtagc。

34.如权利要求33所述的方法，其中，该探针在5’端具有荧光染料且在3’端具有淬灭剂，或在3’端具有荧光染料且在5’端具有淬灭剂。

35.如权利要求34所述的方法，其中，该探针是

5‘-CALRed_610nm-gctacACGACTTTYGCTGAAGgtagc-BHQ2-3’或

5’-FAM或FITC‐gctacACGACTTTYGCTGAAGgtagc-BHQ1-3’。

36.如权利要求35所述的方法，其中，该3’淬灭剂被DABsyl替换。

37.如权利要求3-31中任一项所述的方法，其中，该用于检测HIV的正向引物和反向引物分别包含一种或多种下述序列：

正向引物：

GACTCGATATCGAGTCTGACTAGmCGGAGGmCmTmAmGmAmAmG、

GACTCGATATCGAGTCTGACTAGmCAGAGGmCmTmAmGmAmAmG；以及

反向引物：

GACTCGATATCGAGTCTATTGACmGCTCmTmCmGmCmAmC、

GACTCGATATCGAGTCTACTGACmGCTCmTmCmGmCmAmC。

38.如权利要求3-31和37中任一项所述的方法，其中，使用具有下述序列的探针检测HIV的扩增：cgcaagGGAGAGAGATGGGTGcttgcg。

39.如权利要求3-31中任一项所述的方法，其中，用于检测登革热病毒的正向引物和反向引物分别包含一种或多种下述序列：

正向引物：

GACTCGATATCGAGTCCAAAAACmAGCATATTmGmAmCmGmC；以及

反向引物：

GACTCGATATCGAGTCAGACAGCmAGGATCmTmCmTmGmG、

GACTCGATATCGAGTCAGACAGCmAGGATCmTmGmTmGmG。

40.如权利要求3-31和39中任一项所述的方法，其中，使用具有下述序列的探针检测登革热病毒的扩增：cgcatcTGGTCTTTCCCAGCgatgcg。

41.如权利要求3-31中任一项所述的方法，其中，用于检测乙型流感病毒的正向引物和反向引物分别包含一种或多种下述序列：

正向引物：

GACTCGATATCGAGTCAAATGCAmGATGGTCTCmAmGmCmTmA、

GACTCGATATCGAGTCAAATGCAmAATGGTCTCmAmGmCmTmA、

GACTCGATATCGAGTCAAATGCAmGATGGTTTCmAmGmCmTmA；以及

反向引物：

GACTCGATATCGAGTCCTCCTTTmTCCCATTCCATmTmCmAmTmT、

GACTCGATATCGAGTCCTCCCTTmTCCCATTCCATmTmCmAmTmT、

GACTCGATATCGAGTCCTCCTTTmCCCCATTCCATmTmCmAmTmT。

42.如权利要求3-31和41中任一项所述的方法，其中，使用具有下述序列的探针检测乙型流感病毒的扩增：gccaaGCTATGAACACAGCAAActtggc。

43.如权利要求3-31中任一项所述的方法，其中，用于检测BVDV1的正向引物和反向引物分别包含一种或多种下述序列：

正向引物：

GACTCGATATCGAGTCGGCCCACmTGTATTGCTmAmCmTmGmAmAmA、

GACTCGATATCGAGTCGGCCCACmTGCACTGCTmAmCmTmAmAmAmA；以及

反向引物：

GACTCGATATCGAGTCTGTGATCmAACTCCmAmTmGmTmGmCmC。

44.如权利要求3-31和43中任一项所述的方法，其中，使用具有下述序列的探针检测BVDV1的扩增：cgctacATCTCTGCTGTACATGgtagcg。

45.如权利要求1-44中任一项所述的方法，其中，该探针在5’端具有荧光染料且在3’端具有淬灭剂，或在3’端具有荧光染料且在5’端具有淬灭剂。

46.如权利要求45所述的方法，其中，该荧光染料是CALRed_610nm，且该淬灭剂是BHQ2或DABsyl。

47.如权利要求45所述的方法，其中，该荧光染料是FAM或FITC，且该淬灭剂是BHQ1或DABsyl。

48.如权利要求1-47中任一项所述的方法，其中，正向引物或反向引物在3’端包含一种或多种2’-改性的核苷酸。

49.如权利要求48所述的方法，其中，该一种或多种2’-改性的核苷酸是2’-O-甲基、2'-甲氧基乙氧基、2'-氟、2’-羟基、2’-烷基、2'-烯丙基、2'-O-[2-(甲基氨基)-2-氧代乙基]、4'-硫、4'-CH₂-O-2'-桥、4'-(CH₂)₂-O-2'-桥、2'-LNA、及2'-O-(N-甲基氨基甲酸酯)的一种或多种。

50.一种用于检测RNA病毒多核苷酸的试剂盒，包含特异性结合RNA病毒序列的引物、特异性结合RNA病毒扩增子的可检测的探针、逆转录酶、切口酶、和链置换聚合酶。

51.如权利要求50所述的试剂盒，用于检测EBOV，其中，该引物包含下述序列：

正向引物：

GACTCGATATCGAGTCGCTTCCA[MeOC]AGTTATC[MeOU][MeOA][MeOC][MeOC][MeOG]

反向引物：

GACTCGATATCGAGTCGAAATGC[MeOA]ACGA[MeOC][MeOA][MeOC][MeOC][MeOU]。

52.如权利要求50所述的试剂盒，其中，该探针包含下述序列：gctacACGACTTTYGCTGAAGgtagc。

53.如权利要求52所述的试剂盒，其中，该探针在5’端具有荧光染料且在3’端具有淬灭剂，或在3’端具有荧光染料且在5’端具有淬灭剂。

54.如权利要求53所述的试剂盒，其中，该探针是

5’-CALRed_610nm‐gctacACGACTTTYGCTGAAGgtagc BHQ2-3’或

5’-FAM或FITC‐gctacACGACTTTYGCTGAAGgtagc-BHQ1-3’。

55.如权利要求54所述的试剂盒，其中，该3’淬灭剂被DABsyl替换。

56.如权利要求50所述的试剂盒，用于检测HIV，其中，该引物分别包含下述序列：

正向引物：

GACTCGATATCGAGTCTGACTAGmCGGAGGmCmTmAmGmAmAmG、

GACTCGATATCGAGTCTGACTAGmCAGAGGmCmTmAmGmAmAmG；以及

反向引物：

GACTCGATATCGAGTCTATTGACmGCTCmTmCmGmCmAmC、

GACTCGATATCGAGTCTACTGACmGCTCmTmCmGmCmAmC。

57.如权利要求50所述的试剂盒，其中，该探针包含下述序列：cgcaagGGAGAGAGATGGGTGcttgcg。

58.如权利要求50所述的试剂盒，用于检测登革热病毒，其中，该引物分别包含下述序列：

正向引物：

GACTCGATATCGAGTCCAAAAACmAGCATATTmGmAmCmGmC；以及

反向引物：

GACTCGATATCGAGTCAGACAGCmAGGATCmTmCmTmGmG、

GACTCGATATCGAGTCAGACAGCmAGGATCmTmGmTmGmG。

59.如权利要求50所述的试剂盒，用于检测登革热病毒，其中，该探针包含下述序列：cgcatcTGGTCTTTCCCAGCgatgcg。

60.如权利要求50所述的试剂盒，用于检测乙型流感病毒，其中，该引物分别包含一种或多种下述序列：

正向引物：

GACTCGATATCGAGTCAAATGCAmGATGGTCTCmAmGmCmTmA、

GACTCGATATCGAGTCAAATGCAmAATGGTCTCmAmGmCmTmA、

GACTCGATATCGAGTCAAATGCAmGATGGTTTCmAmGmCmTmA；以及

反向引物：

GACTCGATATCGAGTCCTCCTTTmTCCCATTCCATmTmCmAmTmT、

GACTCGATATCGAGTCCTCCCTTmTCCCATTCCATmTmCmAmTmT、

GACTCGATATCGAGTCCTCCTTTmCCCCATTCCATmTmCmAmTmT。

61.如权利要求50所述的试剂盒，用于检测乙型流感病毒，其中，该探针包含下述序列：gccaaGCTATGAACACAGCAAActtggc。

62.如权利要求50所述的试剂盒，用于检测BVDV1，其中，该引物分别包含下述序列：

正向引物：

GACTCGATATCGAGTCGGCCCACmTGTATTGCTmAmCmTmGmAmAmA、

GACTCGATATCGAGTCGGCCCACmTGCACTGCTmAmCmTmAmAmAmA；以及

反向引物：

GACTCGATATCGAGTCTGTGATCmAACTCCmAmTmGmTmGmCmC。

63.如权利要求50所述的试剂盒，用于检测BVDV1，其中，该探针包含下述序列：cgctacATCTCTGCTGTACATGgtagcg。

64.如权利要求50、57、59、61和63中任一项所述的试剂盒，其中，该探针在5’端具有荧光染料且在3’端具有淬灭剂，或在3’端具有荧光染料且在5’端具有淬灭剂。

65.如权利要求64所述的试剂盒，其中，该荧光染料是CALRed_610nm，且该淬灭剂是BHQ2或DABsyl。

66.如权利要求65所述的试剂盒，其中，该荧光染料是FAM或FITC，且该淬灭剂是BHQ1或DABsyl。

67.一种试剂盒，用于在逆转录酶切口扩增反应中扩增埃博拉病毒多核苷酸分子，该试剂盒包含下述引物：

正向引物：

GACTCGATATCGAGTCGCTTCCA[MeOC]AGTTATC[MeOU][MeOA][MeOC][MeOC][MeOG]

反向引物：

GACTCGATATCGAGTCGAAATGC[MeOA]ACGA[MeOC][MeOA][MeOC][MeOC][MeOU]；

下述探针：

gctacACGACTTTYGCTGAAGgtagc；

68.一种试剂盒，用于在逆转录酶切口扩增反应中扩增HIV多核苷酸分子，该试剂盒包含一种或多种下述引物：

GACTCGATATCGAGTCTGACTAGmCGGAGGmCmTmAmGmAmAmG、

GACTCGATATCGAGTCTGACTAGmCAGAGGmCmTmAmGmAmAmG；以及

反向引物：

GACTCGATATCGAGTCTATTGACmGCTCmTmCmGmCmAmC、

GACTCGATATCGAGTCTACTGACmGCTCmTmCmGmCmAmC；

下述探针：

cgcaagGGAGAGAGATGGGTGcttgcg；

逆转录酶、切口酶、链置换聚合酶、以及使用前述引物、探针和酶检测HIV多核苷酸分子的使用说明。

69.一种试剂盒，用于在逆转录酶切口扩增反应中扩增登革热病毒多核苷酸分子，该试剂盒包含一种或多种下述引物：

正向引物：

GACTCGATATCGAGTCCAAAAACmAGCATATTmGmAmCmGmC；以及

反向引物：

GACTCGATATCGAGTCAGACAGCmAGGATCmTmCmTmGmG、

GACTCGATATCGAGTCAGACAGCmAGGATCmTmGmTmGmG；

下述探针：

cgcatcTGGTCTTTCCCAGCgatgcg；

逆转录酶、切口酶、链置换聚合酶、以及使用前述引物、探针和酶检测登革热病毒多核苷酸分子的使用说明。

70.一种试剂盒，用于在逆转录酶切口扩增反应中扩增乙型流感病毒多核苷酸分子，该试剂盒包含一种或多种下述引物：

正向引物：

GACTCGATATCGAGTCAAATGCAmGATGGTCTCmAmGmCmTmA、

GACTCGATATCGAGTCAAATGCAmAATGGTCTCmAmGmCmTmA、

GACTCGATATCGAGTCAAATGCAmGATGGTTTCmAmGmCmTmA；以及

反向引物：

GACTCGATATCGAGTCCTCCTTTmTCCCATTCCATmTmCmAmTmT、

GACTCGATATCGAGTCCTCCCTTmTCCCATTCCATmTmCmAmTmT、

GACTCGATATCGAGTCCTCCTTTmCCCCATTCCATmTmCmAmTmT；

下述探针：

gccaaGCTATGAACACAGCAAActtggc；

逆转录酶、切口酶、链置换聚合酶、以及使用前述引物、探针和酶检测乙型流感病毒多核苷酸分子的使用说明。

71.一种试剂盒，用于在逆转录酶切口扩增反应中扩增BVDV1多核苷酸分子，该试剂盒包含一种或多种下述引物：

正向引物：

GACTCGATATCGAGTCGGCCCACmTGTATTGCTmAmCmTmGmAmAmA、

GACTCGATATCGAGTCGGCCCACmTGCACTGCTmAmCmTmAmAmAmA；以及

反向引物：

GACTCGATATCGAGTCTGTGATCmAACTCCmAmTmGmTmGmCmC；

下述探针：

gctacACGACTTTYGCTGAAGgtagc；

逆转录酶、切口酶、链置换聚合酶、以及使用前述引物、探针和酶检测BVDV1多核苷酸分子的使用说明。

72.如权利要求50-71中任一项所述的试剂盒，其中，该试剂盒还包含毛细管，且该毛细管可包含或不包含用于病毒多核苷酸提取的冻干细胞裂解液或RNA稳定化试剂。

73.如权利要求50-72中任一项所述的试剂盒，其中，该试剂盒还包含一种或多种容器，该容器包含适用于进行逆转录酶和/或扩增反应的缓冲液。

74.如权利要求50-73中任一项所述的试剂盒，其中，该试剂盒还包含多个容器，该容器包含冻干形式的逆转录酶、切口酶、和链置换聚合酶。

75.一种诊断人类或动物个体具有RNA病毒的方法，该方法包含

76.如权利要求75所述的方法，其中，该RNA病毒是埃博拉病毒、HIV、登革热病毒、流感病毒、牛腹泻病毒、黄热病病毒、西尼罗河病毒、丙肝病毒、拉沙病毒、黄病病毒、沙粒病毒、或单链RNA病毒。

77.如权利要求75或76所述的方法，其中，该能提取病毒的剂是十二烷基硫酸钠、月桂基硫酸钠、硫氰酸胍、和/或盐酸胍的一种或组合。

78.如权利要求75-77中任一项所述的方法，其中，该方法用于医护人员的日常筛查。

79.如权利要求77-78中任一项所述的方法，其中，汇集该样品并对人类或动物集群进行筛查。