JP2005006587A - 標的核酸の増幅及び/又は検出方法 - Google Patents
標的核酸の増幅及び/又は検出方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2005006587A JP2005006587A JP2003176160A JP2003176160A JP2005006587A JP 2005006587 A JP2005006587 A JP 2005006587A JP 2003176160 A JP2003176160 A JP 2003176160A JP 2003176160 A JP2003176160 A JP 2003176160A JP 2005006587 A JP2005006587 A JP 2005006587A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- iapp
- nucleic acid
- oligo
- target nucleic
- oligonucleotide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Abstract
【解決手段】抽出操作及び/又は精製操作をしない、あるいはこの操作が不十分である場合の生体試料中の標的核酸を増幅する方法、該標的核酸の検出方法ならびに未精製あるいは低純度の生体試料に対して使用可能なプライマーまたはプローブとして有用なキメラオリゴヌクレオチド、該オリゴヌクレオチドを用いた標的核酸の増幅及び/又は検出方法のためのキット。
【選択図】なし
Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、疾患等の遺伝子診断、病原菌あるいはウイルスの検出等の医学分野において有用な方法に関する。
【0002】
【従来の技術】
核酸を増幅、あるいは検出する技術は、遺伝子工学、分子生物学における実験手法としてのみならず、疾病の診断、微生物の検出等、医学、薬学、農林畜産分野においても必要不可欠な技術となっている。
【0003】
核酸の増幅、検出技術には、その原理を異にする種々の方法が知られているが、これらのいくつかはリボヌクレオチドを含有するキメラオリゴヌクレオチドをプライマーもしくはプローブとして使用するものである。前記方法としては、キメラオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用する方法としてバイオメリュー社の方法(例えば、特許文献1参照)やICAN法(例えば、特許文献2〜3参照)が例示される。また、キメラオリゴヌクレオチドをプローブとして使用する方法としては、サイクリングプローブ反応(cycling probe reaction)法(例えば、特許文献4〜5参照)が例示される。
【0004】
上記のキメラオリゴヌクレオチドを使用する核酸増幅、検出方法の多くは、増幅、検出反応中にリボヌクレオチド部分が特異的に切断される工程を含んでいる。キメラオリゴヌクレオチドに含有されるリボヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドに比べて酵素的、化学的に切断を受けやすいことが知られており、前記方法を実施するにあたってはキメラオリゴヌクレオチドの安定性に留意する必要がある。
【0005】
一方、核酸の増幅、検出に使用される試料中には、核酸の他に種々の生体由来の成分が含まれている場合がある。当該試料より核酸を抽出もしくは精製して反応に用いる場合には前記成分の影響を考慮する必要はないが、試料から核酸を抽出及び/又は精製しない、あるいはこの操作が不十分である場合には反応液中に混在する前記成分が反応の結果に影響を与えることがある。精製されていない試料には核酸分解酵素(DNase、RNase等)が混在している可能性があり、特にキメラオリゴヌクレオチドを使用する核酸の増幅、検出方法においてはプライマーの分解に起因する偽陰性、プローブの分解に起因する偽陽性の発生が懸念されている。
【0006】
生体試料中に含まれるもので上記キメラオリゴヌクレオチドに影響を与えるものとしては、特に限定はされないが例えばDNaseIが例示される。当該DNaseIは、一本鎖DNAあるいは二本鎖DNAに作用してオリゴヌクレオチド鎖を生成することが知られている(例えば、非特許文献1)。また、RNaseとしては、特に限定はされないが例えば、RNaseAが例示される。当該RNaseAは、ピリミジン特異的RNaseであることが知られている(例えば、非特許文献2)。
しかしながら、上記DNaseIならびにRNaseAに対して分解されず、その一方で当該キメラオリゴヌクレオチドがDNA鎖とハイブリッドを形成した時にRNaseHで分解されるようなキメラオリゴヌクレオチドについては知られていない。
【0007】
【特許文献1】
米国特許第5824517号
【0008】
【特許文献2】
国際公開第00/56877号パンフレット
【0009】
【特許文献3】
国際公開第02/07139号パンフレット
【0010】
【特許文献4】
米国特許第4876187号
【0011】
【特許文献5】
米国特許第5011769号
【0012】
【非特許文献1】
日本生化学会編 新生化学実験講座 第2巻、核酸III、第23〜25頁、1992年
【0013】
【非特許文献2】
日本生化学会編 生化学実験講座 第2巻、核酸の化学II、第88〜97頁、1976年
【0014】
【発明が解決しようとする課題】
遺伝子検査を実施している現場においては、検査担当者の安全かつ処理時間の短縮等が要望されており、操作が簡便な核酸の増幅、検出系を構築することが求められている。その際には、生体試料を前処理しない、もしくは簡素な前処理にとどめることが好ましい。
本発明の目的は、上記課題を解決するため、未精製あるいは低純度の生体試料に対して使用可能なプライマーまたはプローブとして有用なキメラオリゴヌクレオチド、該オリゴヌクレオチドを用いた標的核酸の増幅及び/又は検出方法を提供することにある。
【0015】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、抽出操作及び/又は精製操作をしない、あるいはこの操作が不十分である場合の生体試料中の標的核酸を増幅する技術と、増幅された標的核酸の検出方法を構築し、本発明を完成させた。
【0016】
本発明を概説すれば本発明の第1の発明は、少なくとも1以上のリボヌクレオチドを含有するオリゴヌクレオチドを用いる、生体試料中の標的核酸の増幅及び/又は検出方法であって、当該オリゴヌクレオチドが、少なくとも1つのプリン塩基を有するリボヌクレオチドを含有することを特徴とする生体試料中の標的核酸の増幅及び/又は検出方法に関する。
【0017】
本発明の第2の発明は、本発明の第1の発明の方法のためのキットであって、、少なくとも1つのプリン塩基を有するリボヌクレオチドを含有することを特徴とするキットに関する。
本発明の第1及び2の発明において当該キメラオリゴヌクレオチドは、複数個のプリン塩基を有するリボヌクレオチドを含有していても良い。また、リボヌクレオチド領域は複数であってもよく、該領域は連続的あるいは不連続的に存在していてもよい。さらに、該キメラオリゴヌクレオチドは、検出可能な標識物質を有していても良い。該標識物質は、複数個であってもよい。
【0018】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を具体的に説明する。
本明細書において生体試料とは、特に限定はなく、核酸、もしくは生物を含む可能性のあるあらゆる試料、例えば、細胞、組織(生検試料等)、全血、血清、脳脊髄液、精液、唾液、喀痰、尿、糞便、毛髪、細胞培養物等を使用することができる。上記の検体は、特に限定するものではないが、好ましくは適切な処理によって、例えばDNAポリメラーゼの反応を実施が可能な形態としたうえ、本発明の方法に供することができる。このような処理には細胞の溶解や試料からの核酸の抽出、精製が包含される。
【0019】
本明細書においてデオキシリボヌクレオチドとは、糖部分がD−2−デオキシリボースで構成されたヌクレオチドのことをいい、例えば、塩基部分にアデニン、シトシン、グアニン、チミンを有するものが挙げられる。さらに、7−デアザグアノシン等の修飾塩基を有するデオキシリボヌクレオチドやデオキシイノシンヌクレオチドのようなデオキシリボヌクレオチドアナログも上記のデオキシリボヌクレオチドに包含される。
【0020】
本明細書においてリボヌクレオチドとは、糖部分がD−リボースで構成されたヌクレオチドのことをいい、塩基部分にアデニン、シトシン、グアニン、ウラシルを有するものが挙げられる。さらに、当該リボヌクレオチドには修飾リボヌクレオチドが包含され、例えばα位のリン酸基の酸素原子を硫黄原子に置き換えた修飾リボヌクレオチド[(α−S)リボヌクレオチド、(α−S)Nとも記載する]やこの他の誘導体等も含まれる。
【0021】
本明細書においてキメラオリゴヌクレオチドとは、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含有するオリゴヌクレオチドのことを言う。該オリゴヌクレオチドはヌクレオチドアナログおよび/または修飾ヌクレオチドを含有していてもよい。
【0022】
本明細書において3’末端側とは、核酸、例えば、キメラオリゴヌクレオチドにおいてそのリボヌクレオチド部分より3’末端にかけての部分を指す。同様に5’末端側とは、核酸においてそのリボヌクレオチド部分より5’末端にかけての部分を指す。
【0023】
以下に本発明を詳細に説明する。
(1)本発明の標的核酸の増幅及び/又は検出方法及び該方法に用いるキメラオリゴヌクレオチド
本発明の標的核酸の増幅及び/又は検出方法は、少なくとも1以上のリボヌクレオチドを含有するオリゴヌクレオチドを用いる、生体試料中の標的核酸の増幅及び/又は検出方法であって、当該オリゴヌクレオチドが、少なくとも1つのプリン塩基を有するリボヌクレオチドを含有することを特徴とする。
【0024】
本発明の態様の一つとしては、標的核酸の増幅方法において、上記キメラオリゴヌクレオチドは標的核酸増幅用プライマーとして機能し得る。また、本発明の別態様としては、標的核酸の検出方法において、上記キメラオリゴヌクレオチドは標的核酸検出用プローブとして機能し得る。さらに、特に限定はないが例えば、リアルタイム検出の場合のような標的核酸の増幅及び検出方法を組み合わせた場合、上記キメラオリゴヌクレオチドは、標的核酸増幅及び/又は検出のためのプライマー及び/又はプローブとして機能し得る。
【0025】
本発明で使用するキメラオリゴヌクレオチドは、プライマー及び/又はプローブとして使用することができる。特に限定はされないが、プライマーとして使用する場合には、当該オリゴヌクレオチドの3’末端又は3’末端側にリボヌクレオチドを配置することが好ましい。さらに好ましくは、当該リボヌクレオチドがプリン塩基を有するリボヌクレオチドになるように設計することが好ましい。
【0026】
また本発明で使用するキメラオリゴヌクレオチドをプローブとして使用する場合には、当該オリゴヌクレオチドの5’末端あるいは3’末端以外の部位にリボヌクレオチドを配置することが好ましい。さらに好ましくは、該オリゴヌクレオチドの中央部周辺にリボヌクレオチドを配置することが好ましい。さらに、当該リボヌクレオチドがプリン塩基を有するリボヌクレオチドになるように設計することが好ましい。また、本発明で用いるキメラオリゴヌクレオチドは、標的核酸との特異的なアニーリングを行う観点から、好ましくは10ヌクレオチド以上であり、更に好ましくは15ヌクレオチド以上であり、オリゴヌクレオチドの合成の観点から、好ましくは100ヌクレオチド以下であり、更に好ましくは30ヌクレオチド以下である。
【0027】
本発明の方法に用いる生体試料には、上記キメラオリゴヌクレオチドを不安定化あるいは分解するような夾雑物質、特に限定はされないがDNase及びRNaseが混在していることがある。さらに上記生体試料には、標的核酸の増幅を阻害するような夾雑物質が含まれていることがある。本発明の方法においては、このような夾雑物質の影響を受けることなく、標的核酸を増幅及び/又は検出することができる。
【0028】
すなわち、本発明で使用されるキメラオリゴヌクレオチドとしては、キメラオリゴヌクレオチドを不安定化あるいは分解するような生体試料中の夾雑物質、特に限定はされないがDNaseI及び/又はRNaseAの影響を受けないものが好適に使用できる。また、本発明のキメラオリゴヌクレオチドは、使用される増幅法及び/又は検出法の特徴に応じて、特定のエンドヌクレアーゼ、特に限定はされないがRNaseH等によってキメラオリゴヌクレオチドのリボヌクレオチド部分が選択的に切断されるものが好適に使用できる。
【0029】
本発明の方法において使用するキメラオリゴヌクレオチドは、1個あるいは複数個のプリン塩基を有するリボヌクレオチドを含有していても良い。特に限定はされないが、例えば、1個あるいは複数個のアデニンヌクレオチド及び/又はグアニンヌクレオチドを含有するものが好適に使用できる。好適にはキメラオリゴヌクレオチドのリボヌクレオチドの半数以上、特に好適にはリボヌクレオチドのすべてがプリン塩基を有するリボヌクレオチドである。すなわち、好適にはリボヌクレオチドがピリミジン塩基を有するリボヌクレオチドを含有しないものが例示される。また、上記1個あるいは複数個のリボヌクレオチドで構成されたリボヌクレオチド領域は、1箇所あるいは複数箇所であってもよい。該領域は、不連続的に存在していてもよい。さらに、本発明の方法で該キメラオリゴヌクレオチドは、検出可能な標識物質を有していても良い。該標識物質は、複数個であってもよい。
【0030】
本発明に利用できる標的核酸の増幅方法としては、鋳型核酸に相補的な配列を有するプライマーが使用される種々の方法が使用できる。例えばポリメラーゼ連鎖反応法(PCR;Polymerase Chain Reaction、米国特許第4,683,195号、第4,683,202号および第4,800,159号)、鎖置換型増幅法(SDA;Strand Displacement Amplification、特公平7−114718号)、ICAN法(Isothermal and Chimeric primer−initiated Amplification of Nucleic acids、国際公開第00/56877号或いは国際公開第02/07139号パンフレット)等の核酸増幅方法を使用することができる。これらの方法を前記キメラオリゴヌクレオチドをプライマーとして実施することができ、あるいはこれらの方法で増幅された核酸を本発明の方法で検出することができる。
【0031】
本発明の一つの態様としてキメラオリゴヌクレオチドをプライマーに用いる核酸増幅方法が挙げられる。例えば、上記のキメラオリゴヌクレオチド(プライマー)は、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼ、前記プライマーからのプライマー伸長物におけるプライマー部分に存在するリボヌクレオチドを切断しうるヌクレアーゼと組み合わせることにより、等温条件下に鋳型となる核酸を増幅することが可能である。この核酸増幅方法はICAN(Isothermal and Chimeric primer−initiated Amplification of Nucleic acids)法と称されており、その詳細は国際公開第00/56877号パンフレット、国際公開第02/16639号パンフレットに開示されている。プライマーの設計や反応条件の設定はこれらのパンフレットの開示をもとに、目的に応じて適宜決定すればよい。上記方法において2種のキメラオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用した場合には、これらのプライマーにはさまれた領域が特異的に増幅される。
【0032】
本発明の標的核酸の増幅方法に使用されるDNAポリメラーゼとしては、特に限定するものではないが、鎖置換活性を有するものが好適に使用できる。また、ヌクレアーゼにも特に限定はないが、キメラオリゴヌクレオチドプライマーのリボヌクレオチド部分を切断する観点からはリボヌクレアーゼHが本発明に好適である。
【0033】
また、本発明の別の態様は、標的核酸にハイブリダイズすることができるキメラオリゴヌクレオチドをプローブとして用いる標的核酸の検出方法を提供する。
ここで標的核酸は、増幅されたものであってもよいし、増幅されていないもののいずれであっても良い。特に好適な本発明の一態様において、標的核酸とハイブリダイズしたキメラオリゴヌクレオチドは、反応液中に添加されたエンドヌクレアーゼ、特に限定はされないがRNaseHにより切断される。切断されたキメラオリゴヌクレオチドが標的核酸とはもはやハイブリダイズできないように反応条件、当該オリゴヌクレオチドの鎖長を設定することにより、切断されたキメラオリゴヌクレオチドの断片は標的核酸から遊離し、次いで新たなキメラオリゴヌクレオチドが標的核酸とハイブリダイズして同様に切断される。このような工程が繰り返され、反応物中には切断された断片が蓄積してゆく。
以上のように、本発明に使用されるキメラオリゴヌクレオチドは、試料に由来する夾雑物質による不安定化あるいは分解は抑制されているが、標的核酸の増幅及び/又は検出反応において各方法の原理に従って切断されることができる。
【0034】
前記の態様において、本発明のキメラオリゴヌクレオチドを切断するヌクレアーゼには特に限定はないが、例えば、国際公開第02/22831号パンフレットに記載の方法で調製されたリボヌクレアーゼHが好適に使用できる。当該リボヌクレアーゼHとしては、例えばバチルス・カルドテナクス(Bacillus caldotenax)、ピロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus)、サーモトガ・マリチマ(Thermotoga maritima)、アルカエオグロバス・フルギダス(Archaeoglobus fulgidus)、メタノコッカス・ヤナシ(Methanococcus jannashi)、サーモコッカス・リトラリス(Thermococcus litoralis)由来のリボヌクレアーゼH等を使用することができる。
【0035】
また、本発明の標的核酸の増幅ならびに検出方法における反応の条件にも特に限定はなく、使用されるDNAポリメラーゼ、ヌクレアーゼが所望の活性を保持する条件を適宜選択すればよい。インキュベーションの温度も使用される酵素やプライマー、プローブの鎖長などを考慮して決定すればよい。特に、耐熱性の酵素を使用し、高温(例えば50℃〜65℃)で反応を行う態様が好適である。上記反応温度は、プローブとして使用するキメラオリゴヌクレオチドのTm値等によって調整することができる。特に限定はされないが、例えば、70℃以下、好ましくは65℃以下である。
【0036】
本発明の方法において標的核酸を検出する手段には特に限定はなく、公知の核酸分析手法を利用することができる。例えば、電気泳動法や高速液体クロマトグラフィー法により、プローブの鎖長の変化から切断を検出することができる。
【0037】
特に好適な態様としては、例えばキメラオリゴヌクレオチドを蛍光物質と該蛍光物質の発する蛍光を消光する作用を有する物質(クエンチング物質)の両者で、適当な間隔をとって標識したものが包含される。このようなキメラオリゴヌクレオチドはインタクトな状態ではほとんど蛍光を発することはないが、切断されて蛍光物質と消光物質との距離が離れた場合には蛍光を発するようになる。このようなキメラオリゴヌクレオチドを使用することにより、反応中の反応液を直接観察することによって標的核酸の有無を知ることができる。特に限定はされないが、上記蛍光物質とクエンチング物質の組み合わせとしては、蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)対あるいは非蛍光共鳴エネルギー転移(Non−FRET)対のいずれもが好適に使用できる。また、上記の態様においてはスマート サイクラー(タカラバイオ社製)のような反応チューブ中の増幅された核酸をチューブを閉じたままで検出できる装置を用いることによりリアルタイムで検出・定量することができる。
【0038】
本発明の方法に使用される標的核酸としては一本鎖、二本鎖の核酸、すなわちDNA、RNAを使用することができる。使用するヌクレアーゼによってはRNAを標的核酸とすることが困難な場合もあるが、その場合には当該RNAを鋳型として調製したcDNAを標的核酸として使用することにより、RNA上の塩基置換を検出することが可能である。
【0039】
(2)本発明の標的核酸の増幅及び/又は検出方法に使用されるキット
本発明は、上記(1)に記載の方法のためのキットを提供する。すなわち該キットは本発明の標的核酸の増幅及び/又は検出方法のための形態を有し、上記(1)記載のキメラオリゴヌクレオチドを含有することを特徴とする。該キメラオリゴヌクレオチドは、プライマー及び/又はプローブとして機能し得る。
すなわち、標的核酸の塩基配列に実質的に相補的であり、少なくとも1つのプリン塩基を有するリボヌクレオチドを含有するキメラオリゴヌクレオチドを少なくとも1種類、含有するキットが例示される。
【0040】
上記キメラオリゴヌクレオチドは検出のための標識を付されていてもよい。
さらに上記キットは、DNAポリメラーゼ、ヌクレアーゼ、DNAポリメラーゼの基質であるdNTPsや反応液の調製等に使用されるその他の成分を含有していてもよい。
【0041】
上記のように、本発明の標的核酸の増幅及び/又は検出方法は、生体試料中に存在する夾雑物質の存在の有無にかかわらず、標的核酸を効率よく特異的に増幅及び/又は検出することができる。また、本発明の方法を用いることにより、生体試料の前処理が簡略化あるいは省略できるため、実際の現場で従事している者のバイオハザードに対する危険を回避することができる。また、生体試料の前処理が簡略化あるいは省略できるため、結果を得るための所要時間を大幅に短縮することができる。また、生体試料の前処理が簡略化あるいは省略できるため、フェノールあるいはクロロフォルムのような有毒物質を使用、廃棄する必要がなくなり、作業環境・自然環境に及ぼす影響を小さくすることができる。さらに、本発明により生体試料から標的核酸の検出までを自動化することが容易になり、小型でハイスループットな自動化装置を作製することができる。
【0042】
【実施例】
以下に実施例をもって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は実施例の範囲に限定されるものではない。
【0043】
参考例1
実施例における耐熱性RNaseHのunit数は、以下の方法により算出した。
ポリ(rA)及びポリ(dT)(ともにアマシャム ファルマシア バイオテク製)1mgをそれぞれ1mM EDTAを含む40mM トリス−HCl(pH7.7)1mlに溶解し、ポリ(rA)溶液及びポリ(dT)溶液を調製した。
次に、4mM MgCl2、1mM DTT、0.003%BSA、4%グリセロールを含む40mM トリス−HCl(pH7.7)に、終濃度20μg/mlとなるポリ(rA)溶液、終濃度30μg/mlとなるポリ(dT)溶液を加え、37℃で10分間反応後、4℃に冷却し、ポリ(rA)−ポリ(dT)溶液を調製した。このポリ(rA)−ポリ(dT)溶液100μlに任意に希釈した酵素液1μlを加え、40℃で10分間反応させ、0.5M EDTA 10μlを加えて反応を停止させた後、260nmの吸光度を測定した。対照として、上記反応液に0.5M EDTA 10μlを加えた後、40℃で10分間反応させ、吸光度を測定した。その後、EDTA非存在下で反応させ求めた吸光度から対照の吸光度を引いた値(吸光度差)を求めた。すなわち、酵素反応によってポリ(rA)−ポリ(dT)ハイブリッドから遊離したヌクレオチドの濃度を吸光度差から求めた。RNaseHの1単位は、1nmolのリボヌクレオチドが遊離したのに相当するA260を10分間に増加させる酵素量とし、下記の式に従って算出した。
単位(unit)=〔吸光度差×反応液量(ml)〕/0.0152×(110/100)×希釈率
【0044】
実施例1
本発明の方法で用いるキメラオリゴヌクレオチドを構築するための塩基配列のデザインについて検討した。
(1)RNaseの分解に耐性を有するキメラオリゴヌクレオチドの検討
まず、配列表の配列番号1〜10に記載の塩基配列を有する10種類のキメラオリゴヌクレオチドのIAPPオリゴ15A、IAPPオリゴ1U、IAPPオリゴ10G、IAPPオリゴ9C、IAPPオリゴ9U、IAPPオリゴ8C、IAPPオリゴAG、IAPPオリゴGG、IAPPオリゴ9A、並びにIAPPオリゴ9Gを合成した。当該オリゴヌクレオチドの構造について表1に示す。
【0045】
【表1】
【0046】
また、上記キメラオリゴヌクレオチドは、5’末端にFAM標識及び3’末端にTAMRA標識をそれぞれ付加させた。これらの標識キメラオリゴヌクレオチドについてRNaseによる影響を調べた。RNaseは、RNaseA(シグマ社製)を用いた。
反応は以下のとおり行った。すなわち、最終濃度32mM ヘペス−水酸化カリウムバッファー(pH7.8)、100mM 酢酸カリウム、1%DMSO、0.01%BSA、5pmolあるいは10pmol上記各種キメラオリゴヌクレオチド、10μgのRNaseAの添加と無添加の反応組成溶液を調製し、それぞれ滅菌水で最終容量を25μlにした。該反応液は、スマートサイクラー(タカラバイオ社製)にセットし、55℃、20分間保持した。RNaseAによる上記キメラオリゴヌクレオチドの分解の有無は、FAM標識の蛍光シグナルをモニタリングすることによって確認した。その結果、IAPPオリゴ15A、IAPPオリゴ10G、IAPPオリゴAG、IAPPオリゴGG、IAPPオリゴ9A、並びにIAPPオリゴ9Gのキメラオリゴヌクレオチドの場合、RNaseA添加と無添加の時に得られるFAM蛍光シグナル差は、ほとんど確認できなかった。すなわち、IAPPオリゴ15A、IAPPオリゴ10G、IAPPオリゴAG、IAPPオリゴGG、IAPPオリゴ9A、並びにIAPPオリゴ9GのキメラオリゴヌクレオチドがRNaseAの分解に対して耐性を有することが確認できた。
【0047】
(2)DNaseの分解に耐性を有するキメラオリゴヌクレオチドの検討
次に、表1記載のIAPPオリゴ15A、IAPPオリゴ1U、IAPPオリゴ10G、IAPPオリゴ9C、IAPPオリゴ9U、IAPPオリゴ8C、IAPPオリゴAG、IAPPオリゴGG、IAPPオリゴ9A、ならびにIAPPオリゴ9GについてDNaseによる影響を調べた。DNaseは、DNaseI(タカラバイオ社製)を用いた。
反応は、以下のようにして行った。すなわち、最終濃度32mM ヘペス−水酸化カリウムバッファー(pH7.8)、100mM 酢酸カリウム、1%DMSO、0.01%BSA、5pmolあるいは10pmol上記各種キメラオリゴヌクレオチド、70UのDNaseIの添加・無添加の反応組成溶液を調製し、滅菌水で最終容量を25μlにした。該反応液は、スマートサイクラー(タカラバイオ)にセットし、55℃、20分間保持した。DNaseIによる上記キメラオリゴヌクレオチドの分解の有無は、FAM標識の蛍光シグナルをモニタリングすることによって確認した。その結果、IAPPオリゴ15A、IAPPオリゴ1U、IAPPオリゴ10G、IAPPオリゴ8C、IAPPオリゴAg、IAPPオリゴGG、IAPPオリゴ9A、IAPPオリゴ9Gのプローブについては、DNaseI無添加時のFAM蛍光シグナル値と添加時の蛍光シグナル値に顕著な差がみとめられなかった。すなわち、IAPPオリゴ15A、IAPPオリゴ1U、IAPPオリゴ10G、IAPPオリゴ8C、IAPPオリゴAg、IAPPオリゴGG、IAPPオリゴ9A、IAPPオリゴ9GのキメラオリゴヌクレオチドがDNaseの分解に対して耐性を有することが確認できた。
【0048】
以上のことから、表1記載のIAPPオリゴ15A、IAPPオリゴ10G、IAPPオリゴAG、IAPPオリゴGG、IAPPオリゴ9A並びにIAPPオリゴ9Gのプローブは、RNaseAとDNaseIの両方の分解に耐性を示すことが確認できた。これらのキメラオリゴヌクレオチドの特徴は、RNA部分がプリン骨格をもつ塩基から構成されていることである。
【0049】
(3)キメラオリゴヌクレオチドのプライマー及び/又はプローブとしての利用についての検討
上記(2)でRNaseAおよびDNaseIの分解に耐性を示したIAPPオリゴ15A、IAPPオリゴ10G、IAPPオリゴAG、IAPPオリゴGG、IAPPオリゴ9A、並びにIAPPオリゴ9Gキメラオリゴヌクレオチドについて、プライマー及び/又はプローブとしての利用可能性を検討するためにThermococcus litoralis(Tli)由来のRNaseHIIによる影響を調べた。まず、上記キメラオリゴヌクレオチドのIAPPオリゴ15A、IAPPオリゴ10G、IAPPオリゴAG、並びにIAPPオリゴ9Aに相補的な塩基配列を有する配列表の配列番号11記載のTemplateAとIAPPオリゴGG、IAPPオリゴ9Gに相補的な塩基配列を有する配列表の配列番号12記載のTemplate gに記載されている38塩基のDNAを合成した。
反応は以下のようにして行った。すなわち、最終濃度32mM ヘペスー水酸化カリウムバッファー(pH7.8)、100mM 酢酸カリウム、1%DMSO、0.01%BSA、4mM酢酸マグネシウム、5pmolの上記キメラオリゴヌクレオチド、25pmolのTemplate DNA(TemplateAあるいはTemplate g)、国際公開第02/22831号パンフレットに記載の方法で調製したTli由来RNaseH 5Uを添加あるいは無添加の反応溶液を調製し、滅菌水で25μlにした。反応液は、スマートサイクラーにセットし、55℃、20分間保持した。その結果、いずれのキメラオリゴヌクレオチドの場合においても、RNaseH無添加時のFAM蛍光シグナル値と添加時の蛍光シグナル値に顕著な差が認められた。
なお、国際公開第02/22831号パンフレットに記載のTli由来RNaseHを発現する、プラスミドpTLI204で形質転換された大腸菌は、Escherichia coli HMS174(DE3)/pTLI204と命名、表示され、FERM P−18223として平成13年2月22日(原寄託日)より日本国〒305−8566茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託され、平成13年8月2日(移管日)より受託番号FERM BP−7693として寄託されている。
以上のことから上記キメラオリゴヌクレオチドは、DNaseIとRNaseAの分解に耐性であるが、Tli由来RNaseHにより分解されることが確認できた。すなわち、キメラオリゴヌクレオチド中にプリン骨格の塩基のRNA部分を有するようにデザインすることによりDNaseIとRNaseAの分解に耐性であるが、RNaseHにより分解されるキメラオリゴヌクレオチドを構築できることを確認した。
【0050】
実施例2
(1)生体試料中の夾雑物質の影響
実施例1で構築したキメラオリゴヌクレオチドが、生体試料中の夾雑物質の影響を受けるかどうかについて検討した。生体試料としては、インフォームドコンセントの得られた健常人の尿を用いた。反応は以下のようにして行った。すなわち、健常人の尿を滅菌蒸留水で10倍、100倍、1000倍、10000倍に希釈したものをサンプルとして使用した。反応系として、スマートサイクラー(タカラバイオ社)専用反応チューブに、氷上にて最終濃度32mM ヘペス−水酸化カリウムバッファー(pH7.8)、100mM 酢酸カリウム、1%DMSO、0.01%BSA、4mM 酢酸マグネシウム、実施例1の表1記載のIAPPオリゴ10G、IAPPオリゴAG、IAPPオリゴGG、IAPPオリゴ9A、またはIAPPオリゴ9Gの5’FAM標識及び3’TAMRA標識のキメラオリゴヌクレオチドを5pmolあるいは10pmolを含む反応液を調製し、ここに上記希釈尿サンプル、あるいは対照として滅菌蒸留水を10μl加え、全量を25μlとした。この反応チューブをスマートサイクラーにセットし、60℃で1時間保持した。生体試料中の夾雑物質による上記キメラオリゴヌクレオチドの分解の有無は、FAM標識の蛍光シグナルをモニターリングし、対照の滅菌蒸留水の場合と比較して確認した。60℃ 1時間経過した後の対照である滅菌蒸留水での(FAM)蛍光シグナル強度と、尿サンプルを加えた場合の蛍光シグナル強度を比較した。その結果、いずれのキメラオリゴヌクレオチドにおいても、尿サンプルの希釈濃度にかかわらず分解されなかった。すなわち、本発明のキメラオリゴヌクレオチドが生体試料中の夾雑物質の影響を受けないことが確認できた。
【0051】
実施例3
標的核酸の検出方法において、本発明のキメラオリゴヌクレオチドをプローブとして用いた場合について検討した。本実施例においては、国際公開第00/56877号パンフレット或いは国際公開第02/07139号パンフレット記載のICAN法と組み合わせて検討した。生体試料としては、実施例2で調製した尿検体を使用した。
反応は以下のようにして行った。すなわち、スマートサイクラー専用反応チューブに、氷上にて最終濃度32mM ヘペス−水酸化カリウムバッファー(pH7.8)、100mM 酢酸カリウム、1%DMSO、0.01%BSA、4mM 酢酸マグネシウム、配列表の配列番号13及び14に示す各50pmolのIAPPプライマーF2、IAPPプライマーR1、100UのTli RNaseHII、2UのBcaBEST DNA polymerase(タカラバイオ社製)、0.04%プロピレンジアミン、実施例1で調製したIAPPオリゴ10G、IAPPオリゴAG、IAPPオリゴGG、IAPPオリゴ9A、またはIAPPオリゴ9Gの5’末端FAM標識及び3’末端TAMRA標識のキメラオリゴヌクレオチドを5pmolあるいは10pmol含む反応液を調製し、ここに鋳型となるIAPP陽性コントロール106コピーと、滅菌蒸留水で10倍、100倍、500倍及び1000倍に希釈した健常人の尿サンプル、あるいは対照として滅菌蒸留水を5μl加え、全量を25μlとした。この反応チューブをスマートサイクラーにセットし、60℃で75分保持した。上記キメラオリゴヌクレオチドによるICAN産物の検出は、反応により得られてくる増幅産物に上記キメラオリゴヌクレオチドがハイブリダイズし、その際のDNA−RNAハイブリッドがRNaseHにより切断されることによるFAM標識の蛍光シグナルが上昇することをモニターすることで行った。各反応直後の蛍光シグナル値を0とし、反応終了後のシグナル値の変化を求めて算出した。
その結果、IAPPオリゴ10G、IAPPオリゴAG、IAPPオリゴ9A、IAPPオリゴGG、IAPPオリゴ9Gは、対照の滅菌蒸留水の場合も、尿サンプルを加えた場合もどちらも尿サンプルの希釈倍率にかかわらず検出シグナルの変化が確認され、リアルタイム検出のプローブとして使用することができることが確認できた。すなわち、これらのキメラオリゴヌクレオチドは、生体試料中の夾雑物質による分解に対して耐性を有しているが、ICAN反応物検出の際のRNaseHによるDNA−RNAハイブリッドのRNAの切断は行われていることが示唆される。
【0052】
【発明の効果】
本発明により生体試料中の夾雑物質に影響されない標的核酸の増幅及び/又は検出方法が提供される。また、本発明は、プライマーの分解に起因する偽陰性及び/又はプローブの分解に起因する偽陽性を抑制することができるため、正確な標的核酸の正確な検出を行うことができる。
【0053】
【0054】
【配列表】
【0055】
【0056】
【0057】
【0058】
【0059】
【0060】
【0061】
【0062】
【0063】
【0064】
【0065】
【0066】
【0067】
【0068】
Claims (1)
- 少なくとも1以上のリボヌクレオチドを含有するオリゴヌクレオチドを用いる、生体試料中の標的核酸の増幅及び/又は検出方法であって、当該オリゴヌクレオチドが、少なくとも1つのプリン塩基を有するリボヌクレオチドを含有することを特徴とする生体試料中の標的核酸の増幅及び/又は検出方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2003176160A JP2005006587A (ja) | 2003-06-20 | 2003-06-20 | 標的核酸の増幅及び/又は検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2003176160A JP2005006587A (ja) | 2003-06-20 | 2003-06-20 | 標的核酸の増幅及び/又は検出方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2005006587A true JP2005006587A (ja) | 2005-01-13 |
Family
ID=34099116
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2003176160A Pending JP2005006587A (ja) | 2003-06-20 | 2003-06-20 | 標的核酸の増幅及び/又は検出方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2005006587A (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2013505723A (ja) * | 2009-09-25 | 2013-02-21 | アリーア サン ディエゴ, インコーポレイテッド | 粗製のマトリックスにおける核酸の検出 |
JP2015221036A (ja) * | 2008-04-30 | 2015-12-10 | インテグレイテツド・デイー・エヌ・エイ・テクノロジーズ・インコーポレイテツド | 修飾されたrna単量体を用いるrnアーゼhを基礎とするアッセイ |
-
2003
- 2003-06-20 JP JP2003176160A patent/JP2005006587A/ja active Pending
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2015221036A (ja) * | 2008-04-30 | 2015-12-10 | インテグレイテツド・デイー・エヌ・エイ・テクノロジーズ・インコーポレイテツド | 修飾されたrna単量体を用いるrnアーゼhを基礎とするアッセイ |
JP2018110590A (ja) * | 2008-04-30 | 2018-07-19 | インテグレイテツド・デイー・エヌ・エイ・テクノロジーズ・インコーポレイテツド | 修飾されたrna単量体を用いるrnアーゼhを基礎とするアッセイ |
JP2013505723A (ja) * | 2009-09-25 | 2013-02-21 | アリーア サン ディエゴ, インコーポレイテッド | 粗製のマトリックスにおける核酸の検出 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP3814527B1 (en) | Crispr effector system based amplification methods, systems, and diagnostics | |
EP3094753B1 (en) | Covered sequence conversion dna and detection methods | |
KR20230116944A (ko) | 고온 내성 Cas 단백질의 용도, 표적 핵산 분자의 검출방법 및 시약 키트 | |
JP2019528726A (ja) | マルチプレックスリアルタイムpcrを実施する方法 | |
US9714448B2 (en) | Lysis and reverse transcription for MRNA quantification | |
CN107208137A (zh) | 检测rna病毒的组合物和方法 | |
CN106434857A (zh) | 靶区分性探针及其用途 | |
JP6773651B2 (ja) | ポリdnaスペーサー配列を有する配列変換およびシグナル増幅dnaならびにそれらを用いた検出方法 | |
JP2020150948A (ja) | 等温増幅の成分およびプロセス | |
JP2012080871A (ja) | Rnaの直接検出法 | |
CN101835905B (zh) | 靶rna的检测、定量方法和试剂盒 | |
JPWO2012077819A1 (ja) | 標的核酸の検出方法及びキット | |
US20070298415A1 (en) | Method of Amplifying Nucleic Acid | |
CN108350492A (zh) | 连接酶辅助的核酸环化和扩增 | |
CN107002146A (zh) | 用于检测耐药性结核分枝杆菌的组合物和方法 | |
JP2005006587A (ja) | 標的核酸の増幅及び/又は検出方法 | |
JP2011103827A (ja) | Rna上の2’−o−メチル化部位の検出方法 | |
CN107109480A (zh) | 使用重叠水解探针检测单核苷酸多态性 | |
JP2024506277A (ja) | 脱塩基核酸を有する配列変換及びシグナル増幅dna、並びにそれを使用する検出方法 | |
JP5537940B2 (ja) | 新規な標識化オリゴヌクレオチド | |
Hollister et al. | Nucleic Acid-Based Methods of Analysis | |
CA3193888A1 (en) | Rapid identification and typing of vibrio parahaemolyticus | |
KR20210158679A (ko) | 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응(qRT-PCR) 분석용 조성물 및 이의 용도 | |
CN105247076A (zh) | 使用拼装序列扩增片段化的目标核酸的方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20060524 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090317 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090513 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090625 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20091023 |