KR20210158679A - 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응(qRT-PCR) 분석용 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

정량적 역전사 중합효소 연쇄반응(qRT-PCR) 분석용 조성물 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응(qRT-PCR) 분석용 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

정량적 역전사 중합효소 연쇄반응(qRT-PCR) 분석용 조성물 및 이의 용도{Composition for qRT-PCR analysis and use thereof}
본 발명은 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응(qRT-PCR) 분석용 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.
백혈병(leukemia)은 백혈구가 종양성으로 증식하는 질환을 총칭한다. 백혈병의 종류는 백혈병이 기원하는 백혈구에 따라 골수성 백혈병과 림프성 백혈병으로 나눌 수 있고, 진행속도에 따라 급성 백혈병과 만성 백혈병으로 나뉜다.
백혈병의 임상학적 양상은 질환의 유형과 침범한 세포의 성질에 따라 다양하다. 림프성 백혈병은 림프계 혈액세포가, 골수성 백혈병은 골수계 혈액세포가, 그리고 만성 골수성 백혈병은 변이가 생긴 조혈모세포(hematopoietic stem cell; HSC)의 악성 클론들에 의해서 발생한다.
특히, 만성 골수성 백혈병(chronic myelogenous leukemia; CML)은 조혈모세포가 골수 내에서 대량 증식하여 비정상적으로 증가한 각종 혈구 세포가 말초 혈액이나 기타 장기를 침습하는 악성 혈액 질환으로 성인에서 주로 발병하는 악성 혈액암이다.
만성골수성백혈병의 진단을 위한 염색체 검사 중 가장 잘 알려진 방법은 BCR-ABL1 재배열(BCR-ABL1 rearrangement)을 확인하여 만성골수성백혈병을 진단하고 예후를 예측하는 것이다(국내출원특허 10-2012-002466 등). 그러나 BCR-ABL1 유전자에서 돌연변이가 발생하지 않은 백혈병들이 빈번히 발생하고 있다. 그럼에도, 특별히 만성골수성백혈병에서 급성백혈병(Acute myeloid leukemia; AML 및 Acute lymphoid leukemia; ALL)으로 전환되는 기작 및 이를 위한 진단 방법들에 대한 연구는 거의 없는 실정이다.
또한, 과거에는 만성골수성백혈병의 일차 치료법이 골수이식이라 불리는 조혈모세포이식이었지만 최근에는 각종 타이로신 카이네이즈 억제제(tyrosine kinase inhibitor; TKI)를 이용하여 BCR-ABL1 암 단백질을 억제하는 방법이 일반적인 치료 방법으로 사용된다. 그러나 일부 환자들은 처음부터 또는 치료 과정 중에 이에 대한 저항성을 가지게 된다. 이는 BCR-ABL1 카이네이즈 영역(domain)에 발생한 돌연변이가 타이로신 카이네이즈 억제제에 대한 저항성에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으나, 일부 환자들에게는 이에 대한 돌연변이가 관찰되지 않으며, 여전히 저항성을 가지는 기작에 대해서는 잘 알려져 있지 않은 이유로, 따라서 BCR-ABL1과는 독립적인 만성골수성백혈병의 진단, 진행, 약제 내성 및 예후를 예측할 수 있는 방법의 개발이 요구되고 있는 실정이다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 Cobll1(Cordon-bleu protein-like 1)이 만성 골수성 백혈병의 급성기로의 전환과 밀접한 관련이 있음을 확인하고, Cobll1 유전자를 정확하게 정량할 수 있는 구성을 개발하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열을 가지는 프라이머 세트; 및 이를 포함하는 만성 골수성 백혈병의 급성기 진단을 위한 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응(qRT-PCR) 분석용 조성물 및 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 (a) 개체로부터 분리된 생물학적 시료의 총 RNA 또는 mRNA와 상기 조성물을 이용하여 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응(qRT-PCR)으로 시료 내 Cobll1 유전자를 증폭하는 단계; 및 (b) 상기 Cobll1 유전자의 발현 정도를 정량하는 단계를 포함하는 만성 골수성 백혈병의 급성기 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 4의 380번 내지 457번 염기서열 혹은 이와 상보적인 염기서열 내의 15개 내지 30개 염기로 구성되는 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 만성 골수성 백혈병의 급성기 진단용 마커를 제공한다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 발명에 기재된 본 발명의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
본 발명의 하나의 양태는 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열을 가지는, 만성 골수성 백혈병의 급성기 진단을 위한 qRT-PCR용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열을 가지는 프라이머 세트를 포함하는, 만성 골수성 백혈병의 급성기 진단을 위한 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응(qRT-PCR) 분석용 조성물을 제공한다.
상기 프라이머 세트는 Cobll1 유전자를 증폭하기 위한 것일 수 있고, 상기 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응(qRT-PCR) 은 Cobll1 유전자를 정량하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 "역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)"은 mRNA로부터 역전사를 통해 만들어진 DNA인 cDNA를 주형으로 PCR 하는 것을 의미한다. 여기에서 RT(Reverse Transcription)는, 유전자 발현 양상의 분석연구를 위해 환경 변화 또는 특정 조건에 따라 세포 내 그 양이 달라지는 RNA를 타겟으로 하는 것으로, 실제 유전자의 발현 양상을 알 수 있는 mRNA를 타겟으로 하며, 단일가닥의 RNA가 이중가닥의 DNA보다 불안정한 물질이고, 시험관에서 RNA 자체를 증폭하여 사용할 수 없다는 한계점 때문에 보다 안정적인 DNA로 역전환하는 과정을 역전사(Reverse Transciption, RT)라 한다.
본 발명에서, "정량적 역전사 중합효소 연쇄반응"은 "실시간 역전사 중합효소 연쇄반응", "qRT-PCR" 혹은 "RT-qPCR"이라고도 하며, 총 RNA 또는 mRNA를 template로 하나의 튜브에서 cDNA 합성을 위한 역전사 반응과 실시간 중합효소 연쇄반응(Real-time PCR)을 연속적으로 수행할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 검출하고자 하는 타겟 핵산 서열의 증폭 반응을 시간에 따라 모니터링하여, 증폭 수준에 관련된 파라미터를 측정하여 실시간 중합효소 연쇄반응을 수행할 수 있다. 실시간 중합효소 연쇄반응은 타겟 핵산 서열의 증폭과 그 양의 측정을 동시에 하는 것을 특징으로 한다. 실시간으로 측정된 증폭값으로 수학적 regression을 수행하면 사이클 수에 따라 시료에 존재하였던 초기 주형 핵산량을 역으로 추정할 수 있다.
증폭 반응을 모니터링하는 방법은, 이에 제한되지는 않으나 표적 유전자의 염기서열에 대해 상보적인 탐식유전자에 발광물질을 부착하고, 유전자 증폭의 초기에 유리되어 발광하는 형광을 측정함으로써 수행 될 수 있다. 예를 들어 SYBR Green과 같은 dsDNA-binding dye를 이용하거나, TaqMan probe, Beacons, Scorpions과 같은 Hydrolysis probe, 또는 Light Cycler와 같은 Hybridization probe를 이용해 형광 감도를 검출할 수 있다.
정량적 역전사 중합효소 연쇄반응에서 실험 결과를 계산하는 방법은 크게 절대 정량과 상대 정량으로 나눌 수 있다.
절대 정량 분석은 이미 농도를 알고 있는 표준 DNA의 Ct 값을 바탕으로 알고자 하는 target DNA의 Ct 값을 비교하여 정량하는 방법이다. 절대 정량에서는 먼저 표준 곡선을 만든 다음 미지의 양을 표준 곡선과 비교하여 값을 외삽하게 된다. "표준곡선"이란 게놈 카피수를 알고 있는 표준물질로부터 동일한 프라이머를 이용해서 Ct 값을 측정하고, 이 값을 회귀분석(regression analysis)하여 얻은 농도별 Ct 값의 선형의 관련성을 나타내는 함수식으로, 표준곡선을 작성하는 데에는 gDNA(genomic DNA) 또는 플라스미드를 이용할 수 있다.
상대 정량 분석은 대조군(control) 유전자 발현 대비 타겟 유전자의 발현율을 상대적으로 정량하는 방법으로, 표준 곡선을 만드는 것과 유사한 방법을 이용하지만 산술 공식을 달리 사용하며, 대조군 유전자의 PCR 효율이 타겟 유전자와 유사해야 한다.
본 발명의 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응은 만성 골수성 백혈병의 급성기 진단을 위한 것일 수 있으며, 예를 들어 Cobll1 유전자의 발현 수준을 확인하기 위한 것일 수 있다. Cobll1 유전자의 발현 수준은 mRNA를 정량하여 측정할 수 있다. 이 경우 mRNA는 PCR반응에 이용되기 위해 역전사 과정을 거쳐 cDNA 형태로 전환 될 수 있다.
본 발명에서 "Cobll1 유전자" 는 인간 뇌 cDNA library에서 발견 된 유전자로, 아폽토시스의 조절 인자이고 낮은 인슐린 저항성과 관련되어 있음이 알려져 있다. 본 발명의 일 구현예에서는 만성 골수성 백혈병 만성기(chronic phase; CP)의 환자와 급성기(blast crisis; BC)의 환자에서 Cobll1 유전자 발현 수준이 상이하며, 급성기로 전환되는 시기에 Cobll1 유전자의 발현 수준이 급증하는 것을 확인하였는바, Cobll1 유전자의 발현 수준을 측정함으로써 만성 골수성 백혈병이 급성기로 전환되는 것을 진단할 수 있다.
본 발명에서 "만성 골수성 백혈병(chronic myelogenous leukemia, CML)"은 골수구계 세포가 백혈구를 만드는 과정에서 생긴 악성질환으로, 혈액세포가 과다증식하여 만성적인 경과를 보이는 혈액암의 일종이다. 만성 골수성 백혈병은 천천히 진행되지만, 치료하지 않으면 급성 백혈병으로 진행될 수 있다. 만성 골수성 백혈병의 병기는 만성기(chronic phase; CP), 가속기(accelerate phase), 급성기(blast crisis; BC) 로 나눌 수 있다. 만성기 환자는 혈소판 증가, 빈혈, 백혈구 세포 증가 등을 통해 진단 될 수 있고, 비장비대, 간비대 등이 나타나는 경우가 있으나 특별히 뚜렷한 증상이 없는 경우도 있다. 만성기에서 급성기로의 전환은 가속기를 거칠 수 있다. 급성기에는 악성골수모세포와 전골수세포가 골수의 20% 이상을 차지하고, 급성 백혈병과 유사한 증상을 나타낸다.
만성 골수성 백혈병의 만성기 환자들은 표적항암제 등을 복용하여 치료하고 있으나, 만성기 환자가 표적항암제에 대한 저항성이 발생할 경우 만성골수백혈병은 가속기와 급성기로 진행될 수 있다. 약물저항성에 의해 급성기로 진행될 경우, 급성백혈병에 준한 치료를 받아야 하며, 만성백혈병으로 인한 사망률이 급격하게 증가하게 된다. 따라서 만성골수백혈병의 만성기에서 급성기로 진행되는 환자에 대한 정확한 분자진단을 통해서 급성기로 진행되는 환자에 대한 생존율을 증가시킬 필요가 있다.
한편, 만성 골수성 백혈병의 병기가 만성기에서 급성기로 전환되는 단계에서 환자의 표적항암제 내성이 나타나는 경향이 있는바, 표적항암제 내성의 발생 여부를 확인하기 위해 본 발명의 조성물을 이용하여 Cobll1 유전자의 발현 수준을 확인 할 수 있다.
본 발명의 조성물은 표준 플라스미드와 함께 사용되는 것일 수 있으며, 농도를 알고 있는 표준 플라스미드에 의해 절대 정량이 가능하다.
플라스미드(plasmid)는 세균의 세포 내에 염색체와는 별개로 존재하면서 독자적으로 증식할 수 있는 DNA로, 고리 모양을 띠고 있으며 세균의 생존에 필수적인 유전자는 아니다. 유전공학에서는 세균 내 플라스미드를 세포 밖으로 빼내고 제한효소로 끊은 뒤, 필요로 하는 유전자를 삽입하여 이를 다시 세균에 넣어 배양하는 유전자 재조합 기술을 사용한다.
본 발명의 "표준 플라스미드"는 타겟 유전자의 농도를 정량적으로 산출할 수 있도록 제작된 물질이다. 이는 이의 농도를 알고 있는 표준 DNA로 이용되어 표준 CT값 상정에 이용될 수 있다. 구체적으로 본 발명의 표준 플라스미드는 타겟 유전자인 Cobll1 유전자의 mRNA로부터 제조한 cDNA가 도입된 것일 수 있다. 본 발명의 표준 플라스미드는 서열번호 5의 Cobll1 cDNA를 포함하는 것일 수 있으며, 구체적으로는 도 2의 개열지도를 가지는 것일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
표준 플라스미드를 이용한 정량 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 상기 도 2의 개열지도의 표준 플라스미드를 이용한 경우, 공지된 정량 정보를 제공하는 데이터베이스, 예를 들면 http://www.scienceprimer.com/copy-number-calculator-for-realtime-pcr 등을 이용하여 계산할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 플라스미드는 qPCR로 타겟 유전자를 정량하는 데 있어서 표준곡선을 작성하기 위해 이용 될 수 있다. 그러나 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 조성물은 ABL1 유전자를 대조군(control) 유전자로 하여, Cobll1의 상대적인 양을 분석할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어 "프라이머"란, 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다.
프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다. 상기 프라이머는 DNA 합성의 시발점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징이 혼입될 수 있다. 또한, 프라이머는 필요할 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역 화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소(알칼린 포스파타아제), 방사선동위원소(예: 32P), 형광성 분자, 화학그룹(예: 바이오틴) 등이 있다.
본 발명에서, "프라이머 세트"는 목적하는 유전자를 증폭시킬 수 있는 2개 이상의 PCR 프라이머의 조합을 의미한다. 각각의 영역에 상응하는 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머의 2개의 프라이머로 구성된 프라이머 세트는 프라이머 쌍으로 지칭할 수 있다.
본 발명의 프라이머는 핵산으로 구성되며, 핵산은 단일 가닥 핵산일 수 있다. 본 발명에서, 핵산은 뉴클레오티드 및 상기 뉴클레오티드와 동등한 기능을 갖는 분자가 중합되는 분자를 의미한다. 예를 들어, DNA, RNA, 및 RNA와 DNA의 중합체가 언급될 수 있다. RNA가 포함된 경우, DNA 서열에서 "T(티민)"은 염기 서열에서 "U(우라실)"로 지칭된다. 본 발명의 프라이머는 당업자에게 공지된 임의의 화학적 합성 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 뉴클레아제 등과 같은 효소를 사용하여 제조될 수 있거나, 또는 시판되는 DNA/RNA 자동 합성기(Applied Biosystems, Beckman Instruments 등)를 사용하여 제조될 수도 있다. 이러한 프라이머에서, 구성 핵산은 추가로 자유롭게 변형될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 프라이머에서, 5'- 말단 또는 3'- 말단은 표지 물질(labeling substance)(예컨대, 형광 분자, 염료 분자, 방사성 동위 원소, 디곡시제닌(digoxigenin) 또는 비오틴 등과 같은 유기 화합물 등) 및/또는 프라이머의 검출 또는 증폭을 용이하게 하기 위한 부가 서열 (LAMP 방법 등에 사용되는 루프(loop) 프라이머 부분)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응(qRT-PCR) 분석용 조성물은 프로브(probe)를 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 용어 "프로브"란, 유전자 또는 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미한다. 상기 프로브는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 길이를 가질 수 있다. 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다.
상기 프로브는 해당 염기서열의 5'과 3'말단에 각각 검출에 이용되는 표지를 포함할 수 있다. 일 예로, 본 발명의 프로브는 형광단 또는 소광제(quencher)가 각각 5'과 3' 말단에 표지된 것일 수 있다.
상기 5' 말단에 표지될 수 있는 형광단은 당해 분야에서 통상적으로 사용되는 형광 물질이 제한 없이 사용될 수 있으며, 예를 들면 플루오레세인, 5-카르복시플루오레세인(5-Carboxyfluorescein; 5'-FAM), 6-카르복시플루오레세인(6-Carboxyfluorescein), 핵사크로로-6-카르복시플루오레세인, 테트라크로로-6-카르복시플루오레세인, VIC, JOE, 5-(2'-아미노에틸)아미노 나프탈렌-1-술폰산, 쿠마린 및 이의 유도체, 시아닌-5, 루시퍼 옐로우, 텍사스 레드, 테트라메틸로다민, 야키마 옐로우, 칼 플루오르레드 610 등이 사용될 수 있다.
상기 3' 말단에 표지될 수 있는, 당해 분야에서 통상적으로 사용되는 소광제는 제한 없이 사용될 수 있으며, 예를 들면 비형광 소광제(nonfluorescent quencher), 예를 들어 minor groove binder (MGB), 테트라메틸 로다민(tetramethylrhodamine), 카르복시테트라메틸-로다민(Carboxytetramethylrhodamine), BHQ(Black Hole Quencher)1, BHQ2, BHQ3, 4'-벤조산, 4-다이메틸아미노페닐 아조페닐-4'-말레이미드 등이 사용될 수 있다.
표지된 프로브를 사용하여 실시간 중합효소 연쇄반응을 수행하는 경우 증폭된 산물을 실시간으로 모니터링 할 수 있어 DNA와 RNA의 정확한 정량이 가능하고, 전기영동이 필요 없어 신속하고 간편하며 정확한 진단이 가능하다.
본 발명에서 제공하는 프라이머 세트는 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있으며, 구체적으로 상기 프라이머 세트는 서열번호 1로 구성되는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 2로 구성되는 올리고뉴클레오티드일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에서 제공하는 프로브는 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있으며, 구체적으로는 서열번호 3으로 구성되는 올리고뉴클레오티드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
한편 본 발명에서 '특정 서열번호로 기재된 뉴클레오티드 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드', '특정 서열번호로 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드' 라고 기재되어 있다 하더라도, 해당 서열번호의 뉴클레오티드 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드도 본 발명에서 사용될 수 있음은 자명하다.
예를 들어, 상기 폴리뉴클레오티드와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면 해당 서열번호의 뉴클레오티드 서열 내부나 말단에 일부 서열이 부가되거나 혹은 해당 서열번호의 뉴클레오티드 서열 내부나 말단의 일부 서열이 결실된 폴리뉴클레오티드도 본 발명의 범위 내에 속하는 것이 자명하다.
상동성(homology) 및 동일성(identity)은 두 개의 주어진 염기 서열과 관련된 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다.
용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.
보존된 (conserved) 폴리뉴클레오티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나 (homologous) 또는 동일한 (identical) 서열은 일반적으로 서열 전체 또는 전체-길이의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%를 따라 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 하이브리드할 수 있다.
폴리뉴클레오티드 서열에 대한 상동성 또는 동일성은 예를 들면, 문헌에 의한 알고리즘 BLAST[참조: Karlin 및 Altschul, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)]나 Pearson에 의한 FASTA(참조: Methods Enzymol., 183, 63, 1990)을 사용하여 결정할 수 있다. 이러한 알고리즘 BLAST에 기초하여, BLASTN이나 BLASTX라고 불리는 프로그램이 개발되어 있다(참조: http://www.ncbi.nlm.nih.gov). 또한, 임의의 아미노산 또는 폴리뉴클레오티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고, 당업자에게 잘 알려진 방법(예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York)으로 결정될 수 있다.
본 발명에서 제공하는 프라이머와 프로브는, 상기 언급된 각각의 서열번호로 구성되는 올리고뉴클레오티드에 제한되지 않으며, 엄격한 조건 하에서 각각의 서열 번호에 나타낸 염기 서열에 상보적인 염기 서열에 혼성화한 염기 서열을 갖고, 유사하게 프라이머 또는 프로브로서의 기능을 갖는 이의 변이체 역시 본 발명의 범위에 포함된다.
상기 프라이머 또는 프로브는 기본 성질을 변화시키지 않은 추가의 특징의 혼입이 가능하다. 즉, 본 발명에서 목적으로 하는 Cobll1 유전자를 검출할 수 있는 효과를 나타내는 한, 당해 분야에 공지된 통상적인 수단을 이용하여 올리고뉴클레오티드 서열 상의 변형이 이루어질 수 있다.
이러한 변형의 비 제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 뉴클레오티드의 하나 이상의 동족체로의 치환 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면 하전되지 않은 연결체(예 메틸포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 가능하다. 또한, 핵산은 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그널 펩티드, 폴리 L 리신등의 단백질, 아크리딘 또는 프소랄렌 등의 삽입제, 금속, 방사성 금속, 철 산화성 금속 의 킬레이트화제 및 망칼리화제 등의 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기를 가질 수 있다.
본 발명의 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응(qRT-PCR) 분석용 조성물은, 유전자를 증폭, 검출하기 위하여 필요한 임의의 구성요소를 더 포함할 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 조성물은 역전사 효소, 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, DNA 중합효소 조인자(예를 들어, 마그네슘이온 등), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), 중합효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수, MgCl2, 버퍼 등을 포함할 수 있다.
상기 효소는 PCR 반응을 수행하는 온도에서 안정한 효소일 수 있고, 예를 들어 내열성을 가지는 것일 수 있으며, 그 예로 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermusfiliformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 수득한 열 안정성 효소일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 조성물은 마스터 믹스(master mix) 형태로 제공될 수 있다.
마스터 믹스란 PCR 반응에 필요한 성분 중 샘플(시료) 특이적이지 않은 성분을 미리 혼합한 형태로 포함하고 있는 조성물이다. 예를 들면 DNA polymerase, dNTPs, MgCl2를 포함하는 reaction mixture가 포함된 것일 수 있다.
본 발명의 Cobll1 유전자를 증폭하기 위한 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응 마스터 믹스에는, 본 발명에서 제공하는 프라이머 세트가 포함될 수 있다.
상기 마스터 믹스에는, 추가로 본 발명에서 제공하는 프로브가 포함된 것일 수 있다.
본 발명의 마스터 믹스 내에 존재하는 본 발명의 프라이머는, 정방향 프라이머: 역방향 프라이머의 농도비가 1-10:1, 1:1-10, 또는 1:1 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 마스터 믹스에 본 발명에서 제공하는 프라이머 세트와 프로브가 모두 포함되는 경우, 프로브: 프라이머의 농도비는 1: 1-8일 수 있고, 구체적으로는 1: 2-6, 1: 2.5-5.5, 1:3-5, 1:1-5, 1:1-4, 1:1.5-3.5, 1:1-3, 1:1.5-2.5, 보다 구체적으로는 1:2의 농도비로 존재할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 한편 상기 농도비에서 프라이머의 농도는 정방향 또는 역방향 프라이머 중 어느 하나의 농도일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 전술한 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응(qRT-PCR) 분석용 조성물을 포함하는 만성 골수성 백혈병의 급성기 진단용 키트를 제공한다.
상기 키트는 qRT-PCR에 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. 구체적으로, 본 발명에서 제공하는 프라이머 세트 외에, 본 발명에서 제공하는 프로브가 포함될 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 키트는 그 외에 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
한편 본 발명의 키트는 전술한 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응(qRT-PCR) 분석용 조성물을 제1구성으로 포함하고, 상기 구성에 추가로 본 발명에서 제공하는 표준 플라스미드를 포함하는 조성물을 제2구성으로 포함하는 것일 수 있다. 상기 표준 플라스미드는 단계적으로 희석되어 포함될 수 있으며, 샘플과 동시에 증폭 될 수 있는 형태로 포함될 수 있다. 예를 들면 상기 키트는 도 10과 같은 형태일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 (a) 개체로부터 분리된 생물학적 시료의 총 RNA 또는 mRNA와, 본 발명에서 제공하는 조성물을 이용하여 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응(qRT-PCR)으로 시료 내 Cobll1 유전자를 증폭하는 단계; 및
(b) 상기 Cobll1 유전자의 발현 정도를 정량하는 단계를 포함하는, 만성 골수성 백혈병의 급성기 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 "생물학적 시료" 는 체내에서 Cobll1 유전자 혹은 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현을 확인할 수 있는 모든 시료를 의미하며, 예를 들어 혈액, 혈장, 혈청, 골수, 조직, 세포, 타액, 객담, 머리카락, 소변 등일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 생물학적 시료에서 총 RNA 또는 mRNA를 분리하는 과정은 공지의 공정을 이용하여 수행할 수 있다.
정량적 역전사 중합효소 연쇄반응(qRT-PCR)에 대해서는 전술한 바와 같다.
상기 생물학적 시료는, 만성 골수성 백혈병 혹은 이의 발병이 의심되는 개체로부터 분리된 것일 수 있다. 그러나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 "개체"는 만성 골수성 백혈병의 병기를 진단하거나, 표적항암제 내성 발생 여부를 진단하고자 하는 대상을 의미한다. 이때, 상기 개체는 포유동물 일 수 있고, 예를 들어 인간, 소, 말, 돼지, 개, 양, 염소, 또는 고양이 등 만성 골수성 백혈병이 발병할 수 있는 동물이라면 제한없이 포함될 수 있다.
본 발명의 정보제공방법은 만성 골수성 백혈병의 급성기로의 전환을 진단하거나, 표적항암제 내성의 발생 여부를 진단하거나, 만성골수성백혈병 환자의 예후를 예측하거나, 만성 골수성 백혈병 환자의 치료전략을 수립하기 위한 정보를 제공하는 방법일 수 있다.
본 발명의 정보제공방법은 개체의 Cobll1 발현 수준이 정상 대조군에 비해 높거나, 만성기 환자의 중앙치 값 이상일 경우, 만성 골수성 백혈병이 급성기로 전환될 가능성이 크고, 해당 환자에게 표적항암제 내성이 생겼다고 판단할 수 있다. 예를 들어, 개체의 Cobll1 발현 수준이 만성기 환자의 Cobll1 발현 수준에 비해 2배, 3배, 4배 또는 5배 이상 차이나는 경우; 다른 예로, Cobll1 발현 정도를 정량하여 카피수가 31,730 이상, 32,000 이상, 40,000 이상, 50,000 이상, 104.70이상, 104.8 이상, 104.86 이상, 104.88 이상, 104.95 이상, 105 이상, 105.05이상, 105.09 이상, 105.2 이상 또는 162,055 이상인 경우, 만성 골수성 백혈병이 급성기로 전환될 것이거나, 개체에 표적항암제 내성이 생겼다고 판단할 수 있다. 다만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 정보를 제공하는 방법에서, 상기 (a) 단계는 상기 총 RNA 또는 mRNA로부터 cDNA를 역전사하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
cDNA의 합성에는 전술한 RT-PCR을 이용할 수 있고, 이 과정에서 random primer, oligo dT primer 또는 서열 특이적 프라이머를 이용할 수 있다. 추가로, cDNA 합성에 앞서 DNase를 처리하여 타겟 mRNA이외에 혼입한 genome DNA 를 제거하는 단계 등을 포함할 수 있다. 그러나 이에 제한되지 않고, 당업계에 알려진 방법을 이용하여 mRNA로부터 cDNA를 합성 할 수 있다.
상기 (a) 단계에서 조성물은 키트 형태로 사용되는 것일 수 있다. 그러나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 정보를 제공하는 방법에서, 상기 (b) 단계는 표준 곡선(standard curve)을 이용하여 유전자의 발현 정도를 정량하는 것일 수 있다.
상기 (b) 단계는 개체로부터 분리된 생물학적 시료 내 Cobll1 유전자 증폭 곡선과 표준 플라스미드를 비교하는 것을 포함할 수 있다.
표준 곡선에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 서열번호 4의 380번 내지 457번 염기서열 혹은 이와 상보적인 염기서열 내의 15개 내지 30개 염기로 구성되는 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 만성 골수성 백혈병의 급성기 진단용 마커를 제공한다.
상기 마커는 Cobll1 유전자 일부 또는 그 상보적 염기서열의 일부를 포함하는 것으로, 구체적으로는 서열번호 4의 380번 내지 457번 염기서열 혹은 이와 상보적인 염기서열 내의 15개 내지 30개 염기로 구성되는 올리고뉴클레오티드는 2개의 프라이머(정방향 1개, 역방향 1개)일 수 있다. 추가적으로, 2개의 프라이머(정방향 1개, 역방향 1개)에 더하여 1개의 프로브를 더 포함하는 것일 수 있다.
보다 구체적으로는, 상기 마커는 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
서열번호 1 내지 3 중 어느 하나 이상의 올리고뉴클레오티드, 만성 골수성 백혈병의 급성기 진단에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 발명에서 제공하는 프라이머 세트, qRT-PCR용 조성물 및 키트, 이를 이용한 정량 방법을 통해 Cobll1 유전자를 정확하게 정량할 수 있는 바, CML의 병기 진단 및 치료제에 내성을 보이는 세포를 진단하고 환자의 병기를 예측하는 데 유용하게 사용될 수 있으며, 만성골수성백혈병 예후 진단 및 치료 전략 수립에도 유용하게 사용 될 수 있다.
도 1은 만성기(CP)와 급성기(BC) 병기의 환자 검체에서 control 유전자(GADPH) 대비 Cobll1 mRNA의 상대적 수준을 비교한 것이다.
도 2는 본 발명의 qRT-PCR에서 사용한 표준 플라스미드의 개열지도이다.
도 3은 본 발명의 qRT-PCR 에서 사용한 프라이머와 프로브에 관한 정보이다.
도 4는 RT4, K562, NB4 세포주에서 타겟 유전자(Cobll1)와 대조군(control) 유전자(ABL1) 발현수준을 확인한 것이다.
도 5는 Cobll1 표준 곡선 및 RT4+NB4 세포를 단계적으로 희석하여 qRT-PCR을 수행한 결과이다.
도 6은 본 발명에서 디자인한 진단 키트를 나타낸 것이다.
도 7은 도 6의 키트의 각 cell에 첨가한 조성(대응되는 색으로 표시)을 나타낸 것이다.
도 8-도 9는 디자인한 master mix를 이용하여 Cobll1 유전자에 대해 qRT-PCR을 수행한 것으로 도 8은 바이오세움(BS mix), 도 9는 Applied bioscience(AB mix)를 사용한 경우의 형광 측정 결과이다.
도 10은 실시예를 통해 디자인한 본 발명의 qRT-PCR plate 정보이다. P-1~ P-7로 기재된 것은 도 2의 플라스미드를 100-106 희석한 것이고, S는 환자 샘플, NB4+RT4(10-4) 은 RT4 cell을 NB4 cell로 104배 dilution 한 것으로 Cobll1/ABL1 %는 0.09532 수준이다.
도 11은 본 발명의 qRT-PCR 키트를 이용해 환자 검체의 Cobll1 발현 수준을 측정한 결과이다.
이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 만성골수성백혈병의 병기에 따른 Cobll1 유전자 발현양상 확인
만성골수성백혈병의 병기에 따른 Cobll1 유전자 발현양상을 분석하기 위하여 만성기(CP)와 급성기(BC) 병기의 환자 검체에서 Cobll1 유전자의 발현을 qRT-PCR 을 통해 비교하였다.
절대정량을 위한 standard plasmid가 없으므로 Threshold cycle (Ct)를 기준으로 control gene(GADPH)과 target gene을 상대적으로 정량하여 비교하였다. 그 결과 급성기(BC) 병기의 환자 검체에서 Cobll1 유전자의 발현이 증가하는 것을 확인하였다(도 1).
이를 토대로 Cobll1 유전자가 만성 골수성 백혈병의 병기가 급성기로 전환되는 시기에 발현이 증가하는 것을 확인하였다.
실시예 2: Cobll1 qRT-PCR kit의 표준 plasmid 제작
실시예 1에서 Cobll1 유전자가 만성골수성백혈병의 병기와 밀접한 관련이 있음을 확인하고, Cobll1 전사체를 정량적으로 측정하기 위하여 qRT-PCR 키트에 필요한 standard plasmid를 구축하였다.
Cobll1 cDNA(547bp; 서열번호 5)를 pCR2.1-TOPO 벡터내로 도입하여 도 2의 개열지도를 갖는 플라스미드를 제작하고, 이를 qRT-PCR kit의 절대정량 분석을 위한 표준 플라스미드로 사용하였다.
하기의 사용한 플라스미드 정보와 수학식 1을 토대로, 구축한 플라스미드로부터 DNA copy number를 계산하였다.
pCR2.1_TOPO vector = 3931 base pairs
Cobll1 ligation fragment = 547 base pairs
Total size of Cobll1 plasmid = 4478 base pairs
[수학식 1]
Figure pat00001
(X = amount of amplicon (ng)
N = length of dsDNA amplicon
660 g/mole = average mass of 1 bp dsDNA)
계산 결과, 플라스미드 1.0 uL = 2.078 × 1010 카피수임을 확인하고 이후 정량 분석에 이용하였다.
실시예 3: Cobll1 유전자 발현 세포주 확보, 세포주 희석 비율에 따른 정량 시스템 구축 및 primer, probe 디자인
qRT-PCR kit를 디자인하고 이의 정확도 및 정량 효능을 검증하기 위한 실험을 수행하였다.
디자인한 프라이머와 프로브 정보는 도 3에 나타내었다. 구체적으로, qRT-PCR에 사용한 Cobll1 F1 primer는 서열번호 1, R1 primer는 서열번호 2, Cobll1 probe 서열은 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드를 디자인하였으며 서열번호 3의 TaqMan 프로브는 5'말단에 FAM(5-Carboxyfluorescein), 3'말단에 NFQ(Non-Fluorescent Quencher)-MGB(Minor Groove Binder)가 연결되도록 디자인하였다.
다음으로 Cobll1 유전자의 발현량이 높은 RT4 cell line과 Cobll1 유전자를 발현하지 않는 NB4 cell line 과 Cobll1을 일부 발현하는 K562 세포주를 사용하였다. Cobll1 유전자의 발현이 관찰되는 cell line RT4를 Cobll1을 발현하지 않는 세포주인 NB4로 10 fold cell dilution sample (100~107)로 제작하였다.
Cobll1과 ABL(control 유전자)의 상대적인 발현량을 측정한 결과와 세포를 단계적으로 희석하여 분석을 수행한 결과를 표 1 및 도 4,5에 나타내었다.
Figure pat00002
실험 결과, RT4 cell을 NB4 cell로 10배씩 serial dilution하여 제작한 cell dilution sample이 키트의 정확도 및 정량 효능 검증에 가장 적합함을 확인하였다.
실시예 4: Cobll1 qRT-PCR 키트 구성 최적화
qRT-PCR kit를 디자인하여 이의 정확도 및 정량 효능을 검증하기 위한 실험을 수행하였다.
바이오세움(Biosewoom)과 Applied biosystem(AB)의 2종류의 master mix를 사용하였다. 구체적인 조성과 반응 volume은 하기 표 2 및 3에 나타낸 바와 같고 프로브, 프라이머는 실시예 3에서 디자인한 대로 사용하였다.
Figure pat00003
Figure pat00004
도 6과 같이 plate를 디자인하여 각각의 master mix, 프라이머 mix, 프로브 mix 조합을 이용해 Cobll1 유전자 증폭을 수행하였다. 도 6의 plate에 첨가한 반응물은 도 7에 표시하였다.
qRT-PCR 반응 조건은 하기 표 4와 같다.
qRT-PCR
condition		 50℃ 2min 　
95℃ 10min 　
95℃ 15sec 45 cycle
60℃ 1min
40℃ 2min 　
형광 측정 결과를 도 8-도 9에 표시하였다.
실험 결과, 바이오세움 master mix 의 효율성이 더 우수한 것으로 확인되었다. 이를 토대로 바이오세움 reaction mixture를 qRT-PCR kit에 사용하였으며 최적 프라이머, 프로브의 비율을 도출하였다.
실시예 5: 환자 검체를 이용한 Cobll1 qRT-PCR 키트의 검증 실험
실시예 2 내지 4의 결과를 토대로 도 10과 같이 구성한 Cobll1 qRT-PCR 키트를 환자 검체를 이용하여 검증하였다.
구체적으로 만성 골수성 백혈병의 만성기 환자 10명, 급성기 환자 10명의 말초 혈액과 3종의 세포주 (NB4, K562, RT4)로부터 RNA를 분리하여 cDNA를 합성하였다. 구체적인 cDNA 합성 조건은 다음 표 5 및 표 6과 같다.
Reagent Volume
5X reaction buffer 4 ul
dNTP mix 2 ul
Random primer p(dN)6 2 ul
RNase inhibitor 0.5 ul
Transcriptor reverse transcriptase 0.5 ul
Sterile water variable(11.00㎕ - vol. of RNA sample) - ul
RNA volume - ul
Total reaction volume 20 ul
Step Temperature Time Cycles
Primer annealing 25 ℃ 10 min 1
cDNA synthesis 42 ℃ 60 min 1
Transcriptor reverse transcriptase denatured 99℃ 5 min 1
Cooling 4℃ 5 min 1
실험 결과는 하기 표 7에 나타내었다.
Figure pat00005
이를 다양한 control 유전자로 정량을 한 후 만성기와 급성기 환자의 Cobll1 발현량을 측정하였다. 구체적인 qRT-PCR 조건은 하기 표 8 및 표 9와 같으며, 사용한 프라이머 및 프로브는 실시예 3에서 사용한 것과 동일하다.
Target gene reagent Volume
2X Biosewoom reaction mixture 12.5 ul
10pmole Cobll1 probe 0.5 ul
10pmole Cobll1 Forward primer 1 ul
10pmole Cobll1 Reverse primer 1 ul
Distilled Water 6
cDNA volume 4 ul
Total reaction volume 25 ul
Step Temperature Time Cycles
Incubation 50 ℃ 2 min 1
Pre-denaturation 95 ℃ 10 min 1
Denaturation 95 ℃ 15 sec 45
Annealing/ Extension 60℃ 1 min
Cobll1 유전자 발현량 측정 결과를 표 10에, 로그 Copy 수와 Ct 값으로 표현한 결과를 도 11에 나타내었다.
COBLL1_1st COBLL1_2nd MEAN ABL GAPDH
Ct Quantity (copies) Ct Quantity (copies) Ct Quantity (copies) Ct Quantity (copies) Ct
CP 27.70 2.67E+04 27.80 2.57E+04 27.75 2.62E+04 26.52 2.32E+04 22.07
27.47 3.13E+04 27.48 3.19E+04 27.48 3.16E+04 24.66 8.14E+04 19.19
26.79 4.98E+04 26.93 4.60E+04 26.86 4.79E+04 25.08 6.13E+04 21.66
27.79 2.50E+04 27.77 2.62E+04 27.78 2.56E+04 23.80 1.45E+05 17.98
27.28 3.56E+04 27.94 2.34E+04 27.61 2.95E+04 26.82 1.89E+04 26.14
27.95 2.24E+04 27.96 2.30E+04 27.96 2.27E+04 24.88 7.03E+04 19.52
26.67 5.44E+04 26.53 6.04E+04 26.60 5.74E+04 24.00 1.27E+05 17.9
28.35 1.70E+04 28.28 1.87E+04 28.32 1.79E+04 23.86 1.40E+05 17.76
26.87 4.72E+04 26.90 4.72E+04 26.89 4.72E+04 24.33 1.02E+05 19
28.93 1.14E+04 29.02 1.13E+04 28.98 1.14E+04 26.32 2.64E+04 21.67
BC 25.99 8.65E+04 25.89 9.24E+04 25.94 8.95E+04 23.75 1.51E+05 18.33
23.65 4.36E+05 23.56 4.44E+05 23.61 4.40E+05 23.48 1.81E+05 19.33
23.89 3.71E+05 23.78 3.83E+05 23.84 3.77E+05 21.96 5.05E+05 17.16
26.47 6.22E+04 26.47 6.29E+04 26.47 6.26E+04 22.20 4.29E+05 18.68
26.22 7.43E+04 26.13 7.88E+04 26.18 7.66E+04 22.29 4.04E+05 17.38
25.59 1.14E+05 25.61 1.12E+05 25.60 1.13E+05 21.93 5.17E+05 17.95
26.28 7.08E+04 26.20 7.55E+04 26.24 7.32E+04 21.66 6.20E+05 17.61
24.80 1.97E+05 24.79 1.94E+05 24.80 1.96E+05 21.47 7.03E+05 17.35
26.83 4.85E+04 26.66 5.52E+04 26.75 5.19E+04 21.81 5.59E+05 18.32
25.32 1.38E+05 25.22 1.45E+05 25.27 1.42E+05 21.09 9.09E+05 16.99
실험 결과, 만성기(CP) 환자와 급성기(BC) 환자에서 유전자의 절대적인 발현량이 차이가 있음을 확인하였으며, 로그 copy양 또는 Ct 값으로 표현하는 경우 이와 같은 차이가 더욱 명확함을 확인할 수 있었다.
또한, 본 발명의 실시예 2 내지 4의 결과를 토대로 구성한 Cobll1 qRT-PCR 키트가 Cobll1 유전자 발현 수준을 정확하게 측정할 수 있음을 확인하여, 만성 골수성 백혈병 환자가 급성기로 전환되는 것을 예측하고 이의 진단 및 치료 방법을 위한 정보제공에 유용하게 사용할 수 있음을 확인하였다.
비교예 1: 다른 프라이머를 이용한 유전자 정량 결과
비교를 위해 AB (Applied Biosystems) TaqMan® Universal Master Mix II, with UNG (4440038)와 TaqMan® Gene Expression Assay (Hs01117513_m1,4331182)를 사용하여 Cobll1 유전자의 정량을 시도하였으며, 그 결과를 하기 표 11에 나타냈다.
　 Cobll1
Name Cp Concentration
Standard 1 22.79 2.04E+06
Standard 2 26.21 1.71E+05
Standard 3 28.87 2.48E+04
Standard 4 32.45 1.85E+03
Standard 5 35.02 2.00E+02
Standard error 0.0240
Standard efficiency 2.065
K562 30.79 6.13E+03
K562+NB4 10-1 33.25 9.98E+02
K562+NB4 10-2 36.46 4.20E+01
K562+NB4 10-3 39.53 7.20E-01
K562+NB4 10-4 40.00 3.53E-01
K562+NB4 10-5 40.00 3.53E-01
NB4 40.00 3.53E-01
Negative control 　 0.00E+00
상기 비교예의 결과를 통해 본 발명의 프라이머 세트 및 이를 포함하는 qRT-PCR용 조성물이 기존의 프라이머, 프로브의 조성에 의한 결과와 비교해 볼 때 Cobll1 유전자를 특이적으로 정량하는 데 유용한 것임을 알 수 있다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> DAEWOONG PHARMACEUTICAL CO., LTD. CATHOLIC UNIVERSITY OF KOREA INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Composition for qRT-PCR analysis and use thereof <130> KPA200297-KR <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer <400> 1 catcccacag cttggtgtgt 20 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer <400> 2 gttggtattt gggaattctg ttcat 25 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 3 tgataaggaa aataactctg cacat 25 <210> 4 <211> 960 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens COBLL1 <400> 4 cagaaaggga tatgctgcct tctccggagc agactctttc tcccttaagt aaaatgcctc 60 actctgttcc acaacccctt gttgaaaaaa ctgatgatga tgtcatcggt caggctcctg 120 ctgaagcctc ccctcctccc atagctccaa aacctgtgac aattcctgct agtcaggtat 180 ccacacaaaa tctgaagact ttgaaaactt ttggtgcccc acgaccatac tcaagttctg 240 gtccttcacc gtttgctctt gctgtagtga aaaggtcaca gtctttcagt aaagagcgca 300 ccgagtcacc tagtgccagt gcattggtcc aacctccagc caacacagag gaagggaaga 360 ctcattctgt aaataaattt gtggacatcc cacagcttgg tgtgtctgat aaggaaaata 420 actctgcaca taatgaacag aattcccaaa taccaactcc aactgatggc ccatcattca 480 ctgttatgag acaaagttct ttaacattcc aaagctctga cccagaacag atgcgacaga 540 gtttgctgac tgcaatccgt tcgggagagg ctgctgccaa attgaaaagg gttaccattc 600 catcaaatac aatatctgtg aatggaaggt caagactcag ccattccatg tcccctgatg 660 cccaggacgg ccattaaatg ttaccctgcc acaccactgc acttcacttc cacttcagac 720 caacttcata ctaatggaac attttggcaa atgtatattc agatgtacac taatatatta 780 tctattaaaa tattagaatt tgtgttgtgg cttttaatgc cagaagaaaa gttaccagaa 840 tttataattt atagtaattt tttgatcttt tttttgcctt aagagttgaa tatgctgctt 900 tagaacttta aaacaaggtg taaatgattt tcatttttta caaatgaaaa ataattcctt 960 960 <210> 5 <211> 547 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cobll1 ligation fragement <400> 5 ccctcctccc atagctccaa aacctgtgac aattcctgct agtcaggtat ccacacaaaa 60 tctgaagact ttggaaactt ttggtgcccc acgaccatac tcaagttctg gtccttcacc 120 gtttgctctt gctgtagtga aaaggtcaca gtctttcagt aaagagcgca ccgagtcacc 180 tagtgccagt gcattggtcc aacctccagc caacacagag gaagggaaga ctcattctgt 240 aaataaattt gtggacatcc cacagcttgg tgtgtctgat aaggaaaata actctgcaca 300 taatgaacag aattcccaaa taccaactcc aactgatggc ccatcattca ctgttatgag 360 acaaagttct ttaacattcc aaagctctga cccagaacag atgcgacaga gtttgctgac 420 tgcaatccgt tcgggagagg ctgctgccaa attgaaaagg gttaccattc catcaaatac 480 aatatctgtg aatggaaggt caagactcag ccattccatg tcccctgatg cccaggacgg 540 ccattaa 547

Claims (17)

  1. 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열을 가지는 프라이머 세트를 포함하는, 만성 골수성 백혈병의 급성기 진단을 위한 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응(qRT-PCR) 분석용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 서열번호 3의 프로브를 추가로 포함하는, 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 서열번호 1 및 2의 프라이머; 서열번호 3의 프로브; 역전사효소; dNTP; 및 중합효소를 포함하는 마스터 믹스(master mix)형태로 구성된 것인, 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 마스터 믹스는 프로브: 프라이머의 농도비가 1 : 1-3 인 것인, 조성물.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 마스터 믹스는 정방향 프라이머 : 역방향 프라이머의 농도비가 1:1인 것인, 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 만성 골수성 백혈병의 급성기 진단용 키트.
  7. 제6항에 있어서, 상기 키트는
    (i) 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 제1구성; 및
    (ii) 상기 조성물에 추가로 서열번호 5의 Cobll1 cDNA를 포함하는 플라스미드를 표준 플라스미드로 포함하는 조성물을 제2구성으로 포함하는 것인, 만성 골수성 백혈병의 급성기 진단용 키트.
  8. (a) 개체로부터 분리된 생물학적 시료의 총 RNA 또는 mRNA와, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 조성물을 이용하여 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응(qRT-PCR)으로 시료 내 Cobll1 유전자를 증폭하는 단계; 및
    (b) 상기 Cobll1 유전자의 발현 정도를 정량하는 단계를 포함하는 만성 골수성 백혈병의 급성기 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 (a) 단계는 상기 mRNA로부터 cDNA를 역전사하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 (b) 단계는 표준 곡선(standard curve)을 이용하여 유전자의 발현 정도를 정량하는 것인, 방법.
  11. 제8항에 있어서, 상기 방법은 상기 개체의 표적항암제 내성 발생 여부를 확인하는 것인, 방법.
  12. 제8항에 있어서, 상기 조성물은 키트 형태인 것인, 방법.
  13. 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열을 가지는, 만성 골수성 백혈병의 급성기 진단을 위한 qRT-PCR용 프라이머 세트.
  14. 제13항에 있어서, 상기 프라이머는 Cobll1 유전자를 증폭하는 것인, qRT-PCR용 프라이머 세트.
  15. 제13항에 있어서, 상기 프라이머는 시그널을 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형된 것인, qRT-PCR용 프라이머 세트.
  16. 서열번호 4의 380번 내지 457번 염기서열 혹은 이와 상보적인 염기서열 내의 15개 내지 30개 염기로 구성되는 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 만성 골수성 백혈병의 급성기 진단용 마커.
  17. 제16항에 있어서, 상기 마커는 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것인, 만성 골수성 백혈병의 급성기 진단용 마커.
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