JP2002058483A - グルタチオンｓ−転移酵素の測定方法、そのためのプローブ及びキット - Google Patents
グルタチオンｓ−転移酵素の測定方法、そのためのプローブ及びキットInfo
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Landscapes
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 ヒトにおけるグルタチオン抱合に関与するグ
ルタチオンＳ−転移酵素を分別して定量する新しい測定
技術及びそのためのプローブ及びキットを提供する。 【解決手段】上記グルタチオンＳ−転移酵素の測定に用
いられるプローブであって、遺伝子の特定領域にハイブ
リダイズするオリゴヌクレオチドからなるプローブ；該
プローブ、及び遺伝子の特定領域にハイブリダイズする
オリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーとリ
バースプライマーとのプライマー対の組合せから選ばれ
る、グルタチオンＳ−転移酵素の測定キット；並びに該
測定キットを用いる、グルタチオンＳ−転移酵素の測定
方法である。
ルタチオンＳ−転移酵素を分別して定量する新しい測定
技術及びそのためのプローブ及びキットを提供する。 【解決手段】上記グルタチオンＳ−転移酵素の測定に用
いられるプローブであって、遺伝子の特定領域にハイブ
リダイズするオリゴヌクレオチドからなるプローブ；該
プローブ、及び遺伝子の特定領域にハイブリダイズする
オリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーとリ
バースプライマーとのプライマー対の組合せから選ばれ
る、グルタチオンＳ−転移酵素の測定キット；並びに該
測定キットを用いる、グルタチオンＳ−転移酵素の測定
方法である。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ヒトにおける第II
相反応の一種であるグルタチオン抱合に関与するグルタ
チオンＳ−転移酵素の測定方法及びそのためのプローブ
及びキットに関する。
相反応の一種であるグルタチオン抱合に関与するグルタ
チオンＳ−転移酵素の測定方法及びそのためのプローブ
及びキットに関する。
【０００２】
【従来の技術】第II相反応に関与する酵素には種々のも
のが知られている。このうち、下記に示すグルタチオン
Ｓ−転移酵素（glutathione S-transferase）はグルタ
チオン抱合に関与する酵素である。 (1) glutathione S-transferase pi（ＧＳＴＰ１) (2) glutathione S-transferase theta 1 (ＧＳＴＴ１) (3) glutathione S-transferase theta 2 (ＧＳＴＴ２) (4) glutathione S-transferase M1B (ＧＳＴＭ１Ｂ) (5) glutathione S-transferase M2 (ＧＳＴＭ２) (6) glutathione S-transferase M3 (ＧＳＴＭ３) (7) glutathione S-transferase M4 (ＧＳＴＭ４) (8) glutathione S-transferase M5 (ＧＳＴＭ５) (9) glutathione S-transferase A1-1 (ＧＳＴＡ１−
１) (10) glutathione S-transferase A2 (ＧＳＴＡ２) (11) glutathione S-transferase A3 (ＧＳＴＡ３) (12) glutathione S-transferase A4 (ＧＳＴＡ４) (13) microsomal glutathione S-transferase (ＭＧＳ
Ｔ１) (14) microsomal glutathione S-transferase 2 (ＭＧ
ＳＴ２) (15) microsomal glutathione S-transferase 3 (ＭＧ
ＳＴ３) (16) prostaglandin E synyhase (ＭＧＳＴ１Ｌ１) (17) glutathione S-transferase Zeta 1 (ＧＳＴＺ１)
のが知られている。このうち、下記に示すグルタチオン
Ｓ−転移酵素（glutathione S-transferase）はグルタ
チオン抱合に関与する酵素である。 (1) glutathione S-transferase pi（ＧＳＴＰ１) (2) glutathione S-transferase theta 1 (ＧＳＴＴ１) (3) glutathione S-transferase theta 2 (ＧＳＴＴ２) (4) glutathione S-transferase M1B (ＧＳＴＭ１Ｂ) (5) glutathione S-transferase M2 (ＧＳＴＭ２) (6) glutathione S-transferase M3 (ＧＳＴＭ３) (7) glutathione S-transferase M4 (ＧＳＴＭ４) (8) glutathione S-transferase M5 (ＧＳＴＭ５) (9) glutathione S-transferase A1-1 (ＧＳＴＡ１−
１) (10) glutathione S-transferase A2 (ＧＳＴＡ２) (11) glutathione S-transferase A3 (ＧＳＴＡ３) (12) glutathione S-transferase A4 (ＧＳＴＡ４) (13) microsomal glutathione S-transferase (ＭＧＳ
Ｔ１) (14) microsomal glutathione S-transferase 2 (ＭＧ
ＳＴ２) (15) microsomal glutathione S-transferase 3 (ＭＧ
ＳＴ３) (16) prostaglandin E synyhase (ＭＧＳＴ１Ｌ１) (17) glutathione S-transferase Zeta 1 (ＧＳＴＺ１)
【０００３】ところで、新薬を開発する上で、該新薬を
投与した際の第II相反応に関与する酵素の動き（発現量
の増減）を把握することは重要である。何故なら、第II
相反応に関与する酵素の変動が判らないと、該新薬と併
用される併用薬剤の効力や副作用の増減或いは併用薬剤
や他の摂取物による新薬の効力や副作用の増減が予測で
きず、該新薬の安全性を確認することができないからで
ある。
投与した際の第II相反応に関与する酵素の動き（発現量
の増減）を把握することは重要である。何故なら、第II
相反応に関与する酵素の変動が判らないと、該新薬と併
用される併用薬剤の効力や副作用の増減或いは併用薬剤
や他の摂取物による新薬の効力や副作用の増減が予測で
きず、該新薬の安全性を確認することができないからで
ある。
【０００４】そこで、上記新薬開発等の分野において
は、ヒトにおける第II相反応に関与する酵素に関する情
報、殊に之等各分子種を区別して測定できる測定技術の
開発が要望されている。かかる技術が開発できれば、例
えば、新薬の他剤との相互作用や特殊病態時における影
響等が容易に把握でき、該新薬の副作用に関する有用な
情報を得ることができ、新薬の安全性を確保することが
できる。一方、ポリメラーゼチェインリアクション（Ｐ
ＣＲ）は、核酸の増幅法として広く知られており、例え
ばＲＴ−ＰＣＲ（Reverse Transcription-PCR）、コン
ペティティブＲＴ−ＰＣＲ等が微量のｍＲＮＡの検出、
定量に威力を発揮している。
は、ヒトにおける第II相反応に関与する酵素に関する情
報、殊に之等各分子種を区別して測定できる測定技術の
開発が要望されている。かかる技術が開発できれば、例
えば、新薬の他剤との相互作用や特殊病態時における影
響等が容易に把握でき、該新薬の副作用に関する有用な
情報を得ることができ、新薬の安全性を確保することが
できる。一方、ポリメラーゼチェインリアクション（Ｐ
ＣＲ）は、核酸の増幅法として広く知られており、例え
ばＲＴ−ＰＣＲ（Reverse Transcription-PCR）、コン
ペティティブＲＴ−ＰＣＲ等が微量のｍＲＮＡの検出、
定量に威力を発揮している。
【０００５】近年、ＰＣＲを利用したリアルタイム定量
検出法が確立された（Taq Man PCR(Genome Res., 6(1
0), 986 (1996)), ABI PRISMTM Sequence Detection Sy
stem(Applied Biosystems社)）。これは、特定の蛍光標
識プローブ（TaqMan prove）を用いて核酸を測定する方
法である。より詳しくは、例えば５’末端にリポーター
色素及び３’末端にクエンチャー色素を付加して蛍光標
識したプローブをターゲットＤＮＡにアニールさせた状
態で、通常のＰＣＲ反応を行なわせると、伸長反応の進
行に伴って、ＤＮＡポリメラーゼの有する５′−３′エ
キソヌクレアーゼ活性により、上記プローブが５’末端
から加水分解される。その結果、５’末端のリポーター
色素が３’末端のクエンチャー色素から離れ、これによ
り、当初一定の空間的距離を保っていたことによるＦＲ
ＥＴ（Fluoresence Resonance Energy Transfer, 両蛍
光色素の共鳴によるリポーター色素のエネルギー順位の
低下に基づく蛍光強度の低下現象）効果がなくなり、ク
エンチャー色素により制御されていたリポーター色素の
蛍光強度が増加する。従って、この蛍光強度の増加を測
定することによって、ターゲット核酸をリアルタイムに
選択的に定量検出できるのである。この方法によれば、
ＰＣＲ反応後に増幅物を例えばアガロースゲル電気泳動
して、泳動パターンを解析する等の複雑な工程が不要と
なり、短時間で且つ同時に多種のサンプルを定量できる
利点がある。
検出法が確立された（Taq Man PCR(Genome Res., 6(1
0), 986 (1996)), ABI PRISMTM Sequence Detection Sy
stem(Applied Biosystems社)）。これは、特定の蛍光標
識プローブ（TaqMan prove）を用いて核酸を測定する方
法である。より詳しくは、例えば５’末端にリポーター
色素及び３’末端にクエンチャー色素を付加して蛍光標
識したプローブをターゲットＤＮＡにアニールさせた状
態で、通常のＰＣＲ反応を行なわせると、伸長反応の進
行に伴って、ＤＮＡポリメラーゼの有する５′−３′エ
キソヌクレアーゼ活性により、上記プローブが５’末端
から加水分解される。その結果、５’末端のリポーター
色素が３’末端のクエンチャー色素から離れ、これによ
り、当初一定の空間的距離を保っていたことによるＦＲ
ＥＴ（Fluoresence Resonance Energy Transfer, 両蛍
光色素の共鳴によるリポーター色素のエネルギー順位の
低下に基づく蛍光強度の低下現象）効果がなくなり、ク
エンチャー色素により制御されていたリポーター色素の
蛍光強度が増加する。従って、この蛍光強度の増加を測
定することによって、ターゲット核酸をリアルタイムに
選択的に定量検出できるのである。この方法によれば、
ＰＣＲ反応後に増幅物を例えばアガロースゲル電気泳動
して、泳動パターンを解析する等の複雑な工程が不要と
なり、短時間で且つ同時に多種のサンプルを定量できる
利点がある。
【０００６】一般に、臨床検査センター等で臨床検査を
行う場合には、非常に多数の検体について限られた時間
内に検査をする必要があるため、検査を効率良く行い得
る手法の開発が要望されている。上記リアルタイム検出
法は、このような要望に合致するものとして期待されて
いる。
行う場合には、非常に多数の検体について限られた時間
内に検査をする必要があるため、検査を効率良く行い得
る手法の開発が要望されている。上記リアルタイム検出
法は、このような要望に合致するものとして期待されて
いる。
【０００７】本発明者らは、上記ＰＣＲによるリアルタ
イム検出法に着目し、これがヒト第II相反応、とくにグ
ルタチオン抱合に関与するグルタチオンＳ−転移酵素の
検出に利用できるのではないかとの着想から、鋭意研究
を重ねた。
イム検出法に着目し、これがヒト第II相反応、とくにグ
ルタチオン抱合に関与するグルタチオンＳ−転移酵素の
検出に利用できるのではないかとの着想から、鋭意研究
を重ねた。
【０００８】しかるに、現在知られている化学物質を代
謝するヒトにおけるグルタチオン抱合に関与するグルタ
チオンＳ−転移酵素は、前述したとおり約１７種にも及
び、それぞれのｍＲＮＡの配列は知られているものの、
之等をターゲット遺伝子として、互いに重複する配列部
分を有さず、しかも同一ＰＣＲ条件で充分に増幅し得、
更に、該ターゲット遺伝子の特定位置にハイブリダイズ
し得る各プライマー対としてのオリゴヌクレオチドの検
索自体困難であると考えられた。また、かかるプライマ
ー対に挟まれた特定領域に、同一ＰＣＲ条件下に之等の
プライマーよりも早くハイブリダイズし得、しかもヒト
におけるグルタチオンＳ−転移酵素に対して特異的なプ
ローブの構築もまた、同様に困難であると考えられた。
謝するヒトにおけるグルタチオン抱合に関与するグルタ
チオンＳ−転移酵素は、前述したとおり約１７種にも及
び、それぞれのｍＲＮＡの配列は知られているものの、
之等をターゲット遺伝子として、互いに重複する配列部
分を有さず、しかも同一ＰＣＲ条件で充分に増幅し得、
更に、該ターゲット遺伝子の特定位置にハイブリダイズ
し得る各プライマー対としてのオリゴヌクレオチドの検
索自体困難であると考えられた。また、かかるプライマ
ー対に挟まれた特定領域に、同一ＰＣＲ条件下に之等の
プライマーよりも早くハイブリダイズし得、しかもヒト
におけるグルタチオンＳ−転移酵素に対して特異的なプ
ローブの構築もまた、同様に困難であると考えられた。
【０００９】特に、ヌクレオチド配列が既知の２つの核
酸のハイブリダイズのし易さは、融点（Ｔｍ）の計算に
よりある程度推定することはできるものの、この推定に
よって選択したプライマーとプローブとの組合せが、必
ずしもＤＮＡ測定において好結果をもたらすわけではな
いことが知られていることより、現在知られている全て
のヒトにおけるグルタチオンＳ−転移酵素について、之
等を同時に区別して測定可能な、上記ＰＣＲによるリア
ルタイム検出用の各プライマー対とプローブとの組合せ
の選択には、熟練者の試行錯誤による多大な実験等が必
要となると予想された。
酸のハイブリダイズのし易さは、融点（Ｔｍ）の計算に
よりある程度推定することはできるものの、この推定に
よって選択したプライマーとプローブとの組合せが、必
ずしもＤＮＡ測定において好結果をもたらすわけではな
いことが知られていることより、現在知られている全て
のヒトにおけるグルタチオンＳ−転移酵素について、之
等を同時に区別して測定可能な、上記ＰＣＲによるリア
ルタイム検出用の各プライマー対とプローブとの組合せ
の選択には、熟練者の試行錯誤による多大な実験等が必
要となると予想された。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、ヒト
におけるグルタチオン抱合に関与するグルタチオンＳ−
転移酵素のＰＣＲによる測定法、特にリアルタイム検出
法の確立と、そのためのプローブ及びプライマー対を提
供することにある。
におけるグルタチオン抱合に関与するグルタチオンＳ−
転移酵素のＰＣＲによる測定法、特にリアルタイム検出
法の確立と、そのためのプローブ及びプライマー対を提
供することにある。
【００１１】本発明者らは、上記目的よりグルタチオン
抱合に関与するグルタチオンＳ−転移酵素について、多
大な実験、研究を繰返し行った結果、当該酵素に対する
目的のプライマー対及びプローブの組合せを提供するこ
とに成功し、ここに下記要旨の本発明を完成するに至っ
た。
抱合に関与するグルタチオンＳ−転移酵素について、多
大な実験、研究を繰返し行った結果、当該酵素に対する
目的のプライマー対及びプローブの組合せを提供するこ
とに成功し、ここに下記要旨の本発明を完成するに至っ
た。
【００１２】
【課題を解決するための手段】本発明によれば、ヒトに
おけるグルタチオン抱合に関与するグルタチオンＳ−転
移酵素の測定に用いられるプローブであって、下記(1)
〜(17)の各領域のそれぞれにハイブリダイズするオリゴ
ヌクレオチドから選ばれることを特徴とするプローブ；
特にリポーター色素とクエンチャー色素とが結合してい
る該プローブ；塩基配列の長さが２０〜４０である該プ
ローブ；配列番号１〜配列番号１７に示される配列のい
ずれかを含む該プローブ；並びに配列番号１〜配列番号
１７に示される配列のいずれかである該プローブが提供
される。 (1)ＧＳＴＰ１遺伝子の２９３〜３１８の領域 (2)ＧＳＴＴ１遺伝子の４３６〜４６１の領域 (3)ＧＳＴＴ２遺伝子の８２〜１０７の領域 (4)ＧＳＴＭ１Ｂ遺伝子の３１０〜３４０の領域 (5)ＧＳＴＭ２遺伝子の３１０〜３３８の領域 (6)ＧＳＴＭ３遺伝子の３２３〜３５３の領域 (7)ＧＳＴＭ４遺伝子の３２２〜３５４の領域 (8)ＧＳＴＭ５遺伝子の３４２〜３１０の領域 (9)ＧＳＴＡ１−１遺伝子の３３１〜３６１の領域 (10)ＧＳＴＡ２遺伝子の３３３〜３６１の領域 (11)ＧＳＴＡ３遺伝子の３１６〜３４７の領域（ジーン
バンク（GenBank）の登録番号ＡＦ０２０９１９での位
置、開始コドンからの位置は未確認） (12)ＧＳＴＡ４遺伝子の２４６〜２７４の領域 (13)ＭＧＳＴ１遺伝子の２０２〜２３１の領域（ジーン
バンク（GenBank）の登録番号Ｕ４６４９８での位置、
開始コドンからの位置は未確認） (14)ＭＧＳＴ２遺伝子の４２〜６８の領域 (15)ＭＧＳＴ３遺伝子の１５４〜１７９の領域 (16)ＭＧＳＴ１Ｌ１遺伝子の２８４〜２５６の領域 (17)ＧＳＴＺ１遺伝子の５０〜７５の領域
おけるグルタチオン抱合に関与するグルタチオンＳ−転
移酵素の測定に用いられるプローブであって、下記(1)
〜(17)の各領域のそれぞれにハイブリダイズするオリゴ
ヌクレオチドから選ばれることを特徴とするプローブ；
特にリポーター色素とクエンチャー色素とが結合してい
る該プローブ；塩基配列の長さが２０〜４０である該プ
ローブ；配列番号１〜配列番号１７に示される配列のい
ずれかを含む該プローブ；並びに配列番号１〜配列番号
１７に示される配列のいずれかである該プローブが提供
される。 (1)ＧＳＴＰ１遺伝子の２９３〜３１８の領域 (2)ＧＳＴＴ１遺伝子の４３６〜４６１の領域 (3)ＧＳＴＴ２遺伝子の８２〜１０７の領域 (4)ＧＳＴＭ１Ｂ遺伝子の３１０〜３４０の領域 (5)ＧＳＴＭ２遺伝子の３１０〜３３８の領域 (6)ＧＳＴＭ３遺伝子の３２３〜３５３の領域 (7)ＧＳＴＭ４遺伝子の３２２〜３５４の領域 (8)ＧＳＴＭ５遺伝子の３４２〜３１０の領域 (9)ＧＳＴＡ１−１遺伝子の３３１〜３６１の領域 (10)ＧＳＴＡ２遺伝子の３３３〜３６１の領域 (11)ＧＳＴＡ３遺伝子の３１６〜３４７の領域（ジーン
バンク（GenBank）の登録番号ＡＦ０２０９１９での位
置、開始コドンからの位置は未確認） (12)ＧＳＴＡ４遺伝子の２４６〜２７４の領域 (13)ＭＧＳＴ１遺伝子の２０２〜２３１の領域（ジーン
バンク（GenBank）の登録番号Ｕ４６４９８での位置、
開始コドンからの位置は未確認） (14)ＭＧＳＴ２遺伝子の４２〜６８の領域 (15)ＭＧＳＴ３遺伝子の１５４〜１７９の領域 (16)ＭＧＳＴ１Ｌ１遺伝子の２８４〜２５６の領域 (17)ＧＳＴＺ１遺伝子の５０〜７５の領域
【００１３】また、本発明によれば、ヒトにおけるグル
タチオン抱合に関与するグルタチオンＳ−転移酵素をコ
ードする遺伝子の下記各領域にそれぞれハイブリダイズ
するオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマー
とリバースプライマーとのプライマー対、及び上記両プ
ライマーに挟まれた下記領域にハイブリダイズするオリ
ゴヌクレオチドからなるプローブの組合せから選ばれ
る、下記(1)〜(17)の、ヒトにおけるグルタチオン抱合
に関与するグルタチオンＳ−転移酵素の測定キット；特
にプローブが更にリポーター色素とクエンチャー色素と
を結合させたものである上記測定キットが提供される。 (1)プライマー対；ＧＳＴＰ１遺伝子の265-285領域及び
342-320領域、プローブ；293-318領域 (2)プライマー対；ＧＳＴＴ１遺伝子の414-434領域及び
500-478領域、プローブ；436-461領域 (3)プライマー対；ＧＳＴＴ２遺伝子の62-80領域及び12
8-110領域、プローブ；82-107領域 (4)プライマー対；ＧＳＴＭ１Ｂ遺伝子の217-237領域及
び505-484領域、プローブ；310-340領域 (5)プライマー対；ＧＳＴＭ２遺伝子の220-240領域及び
434-413領域、プローブ；310-338領域 (6)プライマー対；ＧＳＴＭ３遺伝子の298-320領域及び
404-382領域、プローブ；323-353領域 (7)プライマー対；ＧＳＴＭ４遺伝子の298-318領域及び
431-410領域、プローブ；322-354領域 (8)プライマー対；ＧＳＴＭ５遺伝子の170-190領域及び
388-367領域、プローブ；342-310領域 (9)プライマー対；ＧＳＴＡ１−１遺伝子の151-170領域
及び519-501領域、プローブ；331-361領域 (10)プライマー対；ＧＳＴＡ２遺伝子の199-220領域及
び522-500領域、プローブ；333-361領域 (11)プライマー対；ＧＳＴＡ３遺伝子の290-311領域及
び585-561領域、プローブ；316-347領域（ジーンバンク
（GenBank）の登録番号ＡＦ０２０９１９での位置、開
始コドンからの位置は未確認） (12)プライマー対；ＧＳＴＡ４遺伝子の191-211領域及
び314-293領域、プローブ；246-274領域 (13)プライマー対；ＭＧＳＴ１遺伝子の175-195領域及
び255-234領域、プローブ；202-231領域（ジーンバンク
（GenBank）の登録番号Ｕ４６４９８での位置、開始コ
ドンからの位置は未確認） (14)プライマー対；ＭＧＳＴ２遺伝子の19-40領域及び1
62-141領域、プローブ；42-68領域 (15)プライマー対；ＭＧＳＴ３遺伝子の130-150領域及
び200-180領域、プローブ；154-179領域 (16)プライマー対；ＭＧＳＴ１Ｌ１遺伝子の218-238領
域及び307-289領域、プローブ；284-256領域 (17)プライマー対；ＧＳＴＺ１遺伝子の28-48領域及び1
61-140領域、プローブ；50-75領域
タチオン抱合に関与するグルタチオンＳ−転移酵素をコ
ードする遺伝子の下記各領域にそれぞれハイブリダイズ
するオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマー
とリバースプライマーとのプライマー対、及び上記両プ
ライマーに挟まれた下記領域にハイブリダイズするオリ
ゴヌクレオチドからなるプローブの組合せから選ばれ
る、下記(1)〜(17)の、ヒトにおけるグルタチオン抱合
に関与するグルタチオンＳ−転移酵素の測定キット；特
にプローブが更にリポーター色素とクエンチャー色素と
を結合させたものである上記測定キットが提供される。 (1)プライマー対；ＧＳＴＰ１遺伝子の265-285領域及び
342-320領域、プローブ；293-318領域 (2)プライマー対；ＧＳＴＴ１遺伝子の414-434領域及び
500-478領域、プローブ；436-461領域 (3)プライマー対；ＧＳＴＴ２遺伝子の62-80領域及び12
8-110領域、プローブ；82-107領域 (4)プライマー対；ＧＳＴＭ１Ｂ遺伝子の217-237領域及
び505-484領域、プローブ；310-340領域 (5)プライマー対；ＧＳＴＭ２遺伝子の220-240領域及び
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404-382領域、プローブ；323-353領域 (7)プライマー対；ＧＳＴＭ４遺伝子の298-318領域及び
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及び519-501領域、プローブ；331-361領域 (10)プライマー対；ＧＳＴＡ２遺伝子の199-220領域及
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び585-561領域、プローブ；316-347領域（ジーンバンク
（GenBank）の登録番号ＡＦ０２０９１９での位置、開
始コドンからの位置は未確認） (12)プライマー対；ＧＳＴＡ４遺伝子の191-211領域及
び314-293領域、プローブ；246-274領域 (13)プライマー対；ＭＧＳＴ１遺伝子の175-195領域及
び255-234領域、プローブ；202-231領域（ジーンバンク
（GenBank）の登録番号Ｕ４６４９８での位置、開始コ
ドンからの位置は未確認） (14)プライマー対；ＭＧＳＴ２遺伝子の19-40領域及び1
62-141領域、プローブ；42-68領域 (15)プライマー対；ＭＧＳＴ３遺伝子の130-150領域及
び200-180領域、プローブ；154-179領域 (16)プライマー対；ＭＧＳＴ１Ｌ１遺伝子の218-238領
域及び307-289領域、プローブ；284-256領域 (17)プライマー対；ＧＳＴＺ１遺伝子の28-48領域及び1
61-140領域、プローブ；50-75領域
【００１４】上記キットを構成するプライマー対とプロ
ーブとの組合せ（セット）の好ましいものとしては、下
記(1)〜(8)から選ばれる各配列番号で示される配列を含
むもの、より好ましくは各配列番号で示される配列のも
のを挙げることができる。 (1)プライマー対；配列番号１８及び１９、プローブ；
配列番号１ (2)プライマー対；配列番号２０及び２１、プローブ；
配列番号２ (3)プライマー対；配列番号２２及び２３、プローブ；
配列番号３ (4)プライマー対；配列番号２４及び２５、プローブ；
配列番号４ (5)プライマー対；配列番号２６及び２７、プローブ；
配列番号５ (6)プライマー対；配列番号２８及び２９、プローブ；
配列番号６ (7)プライマー対；配列番号３０及び３１、プローブ；
配列番号７ (8)プライマー対；配列番号３２及び３３、プローブ；
配列番号８ (9)プライマー対；配列番号３４及び３５、プローブ；
配列番号９ (10)プライマー対；配列番号３６及び３７、プローブ；
配列番号１０ (11)プライマー対；配列番号３８及び３９、プローブ；
配列番号１１ (12)プライマー対；配列番号４０及び４１、プローブ；
配列番号１２ (13)プライマー対；配列番号４２及び４３、プローブ；
配列番号１３ (14)プライマー対；配列番号４４及び４５、プローブ；
配列番号１４ (15)プライマー対；配列番号４６及び４７、プローブ；
配列番号１５ (16)プライマー対；配列番号４８及び４９、プローブ；
配列番号１６ (17)プライマー対；配列番号５０及び５１、プローブ；
配列番号１７
ーブとの組合せ（セット）の好ましいものとしては、下
記(1)〜(8)から選ばれる各配列番号で示される配列を含
むもの、より好ましくは各配列番号で示される配列のも
のを挙げることができる。 (1)プライマー対；配列番号１８及び１９、プローブ；
配列番号１ (2)プライマー対；配列番号２０及び２１、プローブ；
配列番号２ (3)プライマー対；配列番号２２及び２３、プローブ；
配列番号３ (4)プライマー対；配列番号２４及び２５、プローブ；
配列番号４ (5)プライマー対；配列番号２６及び２７、プローブ；
配列番号５ (6)プライマー対；配列番号２８及び２９、プローブ；
配列番号６ (7)プライマー対；配列番号３０及び３１、プローブ；
配列番号７ (8)プライマー対；配列番号３２及び３３、プローブ；
配列番号８ (9)プライマー対；配列番号３４及び３５、プローブ；
配列番号９ (10)プライマー対；配列番号３６及び３７、プローブ；
配列番号１０ (11)プライマー対；配列番号３８及び３９、プローブ；
配列番号１１ (12)プライマー対；配列番号４０及び４１、プローブ；
配列番号１２ (13)プライマー対；配列番号４２及び４３、プローブ；
配列番号１３ (14)プライマー対；配列番号４４及び４５、プローブ；
配列番号１４ (15)プライマー対；配列番号４６及び４７、プローブ；
配列番号１５ (16)プライマー対；配列番号４８及び４９、プローブ；
配列番号１６ (17)プライマー対；配列番号５０及び５１、プローブ；
配列番号１７
【００１５】また、上記各セットはそれぞれ以下の酵素
の測定用であることができる。 (1)のセット；ＧＳＴＰ１測定用 (2)のセット；ＧＳＴＴ１測定用 (3)のセット；ＧＳＴＴ２測定用 (4)のセット；ＧＳＴＭ１Ｂ測定用 (5)のセット；ＧＳＴＭ２測定用 (6)のセット；ＧＳＴＭ３測定用 (7)のセット；ＧＳＴＭ４測定用 (8)のセット；ＧＳＴＭ５測定用 (9)のセット；ＧＳＴＡ１−１測定用 (10)のセット；ＧＳＴＡ２測定用 (11)のセット；ＧＳＴＡ３測定用 (12)のセット；ＧＳＴＡ４測定用 (13)のセット；ＭＧＳＴ１測定用 (14)のセット；ＭＧＳＴ２測定用 (15)のセット；ＭＧＳＴ３測定用 (16)のセット；ＭＧＳＴ１Ｌ１測定用 (17)のセット；ＧＳＴＺ１測定用 本発明によれば、更にヒトにおけるグルタチオン抱合に
関与するグルタチオンＳ−転移酵素の遺伝子を含む検体
について、上記いずれかに記載の測定キットを用いてポ
リメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲを含む）を
行い、用いたプローブの加水分解の有無を測定すること
を特徴とする、グルタチオン抱合に関与するグルタチオ
ンＳ−転移酵素の測定方法、特に上記加水分解の有無
が、励起光照射による蛍光の発色の有無によりなされる
上記測定方法が提供される。
の測定用であることができる。 (1)のセット；ＧＳＴＰ１測定用 (2)のセット；ＧＳＴＴ１測定用 (3)のセット；ＧＳＴＴ２測定用 (4)のセット；ＧＳＴＭ１Ｂ測定用 (5)のセット；ＧＳＴＭ２測定用 (6)のセット；ＧＳＴＭ３測定用 (7)のセット；ＧＳＴＭ４測定用 (8)のセット；ＧＳＴＭ５測定用 (9)のセット；ＧＳＴＡ１−１測定用 (10)のセット；ＧＳＴＡ２測定用 (11)のセット；ＧＳＴＡ３測定用 (12)のセット；ＧＳＴＡ４測定用 (13)のセット；ＭＧＳＴ１測定用 (14)のセット；ＭＧＳＴ２測定用 (15)のセット；ＭＧＳＴ３測定用 (16)のセット；ＭＧＳＴ１Ｌ１測定用 (17)のセット；ＧＳＴＺ１測定用 本発明によれば、更にヒトにおけるグルタチオン抱合に
関与するグルタチオンＳ−転移酵素の遺伝子を含む検体
について、上記いずれかに記載の測定キットを用いてポ
リメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲを含む）を
行い、用いたプローブの加水分解の有無を測定すること
を特徴とする、グルタチオン抱合に関与するグルタチオ
ンＳ−転移酵素の測定方法、特に上記加水分解の有無
が、励起光照射による蛍光の発色の有無によりなされる
上記測定方法が提供される。
【００１６】より詳しくは、フォーワードプライマー及
びリバースプライマーのプライマー対並びにレポーター
色素とクエンチャー色素を有し上記両プライマーに挟ま
れた領域内で鋳型核酸とハイブリダイズするプローブを
用いて、５′−３′エキソヌクレアーゼ活性を有するＤ
ＮＡポリメラーゼによりポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）を行うことによって、グルタチオンＳ−転移酵素の
遺伝子を測定するリアルタイム検出方法が提供される。
びリバースプライマーのプライマー対並びにレポーター
色素とクエンチャー色素を有し上記両プライマーに挟ま
れた領域内で鋳型核酸とハイブリダイズするプローブを
用いて、５′−３′エキソヌクレアーゼ活性を有するＤ
ＮＡポリメラーゼによりポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）を行うことによって、グルタチオンＳ−転移酵素の
遺伝子を測定するリアルタイム検出方法が提供される。
【００１７】本発明に係わるグルタチオンＳ−転移酵素
のリアルタイム検出方法は、同一ＰＣＲ乃至ＲＴ−ＰＣ
Ｒ反応条件下にリアルタイムで簡便且つ迅速に、当該酵
素を分別定量できるものであり、その確立は、臨床分
野、医薬品分野において非常に有益である。例えば、本
発明方法によって、医薬品開発における動態試験におい
て重要な位置を占める薬物代謝のグルタチオンＳ−転移
酵素のヒト試料中でのｍＲＮＡの発現を容易に定量する
ことができる。これによって、医薬品等の化学物質に曝
露された場合のグルタチオンＳ−転移酵素の変化を知る
ことができる。
のリアルタイム検出方法は、同一ＰＣＲ乃至ＲＴ−ＰＣ
Ｒ反応条件下にリアルタイムで簡便且つ迅速に、当該酵
素を分別定量できるものであり、その確立は、臨床分
野、医薬品分野において非常に有益である。例えば、本
発明方法によって、医薬品開発における動態試験におい
て重要な位置を占める薬物代謝のグルタチオンＳ−転移
酵素のヒト試料中でのｍＲＮＡの発現を容易に定量する
ことができる。これによって、医薬品等の化学物質に曝
露された場合のグルタチオンＳ−転移酵素の変化を知る
ことができる。
【００１８】また、手術で摘出した組織やバイオプシー
により摘出した組織中のグルタチオンＳ−転移酵素のｍ
ＲＮＡ発現を見る上で、迅速且つ多種の試料を処理で
き、また、僅かな組織片から抽出した全ＲＮＡで検出可
能である。
により摘出した組織中のグルタチオンＳ−転移酵素のｍ
ＲＮＡ発現を見る上で、迅速且つ多種の試料を処理で
き、また、僅かな組織片から抽出した全ＲＮＡで検出可
能である。
【００１９】更に、グルタチオンＳ−転移酵素は、肝
臓、腎臓等での酵素誘導などによる発現量の変化が血液
中（血液に含まれる核を有する細胞）の値の変化と相関
する可能性が考えられるが、この血液中の発現量は小さ
く、測定には多くの血液を必要とする。しかし、本発明
者の設計したプライマーとプローブを用いれば少ないサ
ンプルで測定が可能である機器での測定が可能であり、
血液中の発現量を測定することに有用である。また、グ
ルタチオンＳ−転移酵素においては、肝臓、腎臓等での
酵素誘導などによる発現量の変化が唾液中など分泌液中
に含まれる核を有する細胞の値の変化と相関する可能性
が考えられるが、この唾液中など分泌液中に含まれる核
を有する細胞中の発現量は小さく、測定には多くの唾液
などの分泌液を必要とする。しかし、本発明者の設計し
たプライマーとプローブを用いれば少ないサンプルで測
定が可能である機器での測定が可能であり、唾液中など
の発現量を測定することに有用である。
臓、腎臓等での酵素誘導などによる発現量の変化が血液
中（血液に含まれる核を有する細胞）の値の変化と相関
する可能性が考えられるが、この血液中の発現量は小さ
く、測定には多くの血液を必要とする。しかし、本発明
者の設計したプライマーとプローブを用いれば少ないサ
ンプルで測定が可能である機器での測定が可能であり、
血液中の発現量を測定することに有用である。また、グ
ルタチオンＳ−転移酵素においては、肝臓、腎臓等での
酵素誘導などによる発現量の変化が唾液中など分泌液中
に含まれる核を有する細胞の値の変化と相関する可能性
が考えられるが、この唾液中など分泌液中に含まれる核
を有する細胞中の発現量は小さく、測定には多くの唾液
などの分泌液を必要とする。しかし、本発明者の設計し
たプライマーとプローブを用いれば少ないサンプルで測
定が可能である機器での測定が可能であり、唾液中など
の発現量を測定することに有用である。
【００２０】以下、本発明方法に利用するプローブ及び
プライマー対につき詳述すれば、各プローブ及びプライ
マーは、上述した通り、グルタチオンＳ−転移酵素の遺
伝子の特定領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチ
ドから選択される。
プライマー対につき詳述すれば、各プローブ及びプライ
マーは、上述した通り、グルタチオンＳ−転移酵素の遺
伝子の特定領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチ
ドから選択される。
【００２１】ここで「ハイブリダイズする」とは、後述
するＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）の条件でハイブリダイズす
ることをいう。
するＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）の条件でハイブリダイズす
ることをいう。
【００２２】本発明に係わるプローブ及びプライマーに
共通する要件としては、増幅生成物が５０〜４００塩基
対の長さであること、プライマーとプローブができる限
り近接していること、配列に含まれるＧ（グアニン）及
びＣ（シトシン）の割合がなるべく５０％前後であるこ
と、Ｇ（グアニン）が４つ以上連続していないことを挙
げることができる。また、その他の本発明プローブにみ
られる要件としてはＴｍ値が７０℃前後であることを挙
げることができ、同様にプライマーにはＴｍ値が６０℃
前後であることを挙げることができる。
共通する要件としては、増幅生成物が５０〜４００塩基
対の長さであること、プライマーとプローブができる限
り近接していること、配列に含まれるＧ（グアニン）及
びＣ（シトシン）の割合がなるべく５０％前後であるこ
と、Ｇ（グアニン）が４つ以上連続していないことを挙
げることができる。また、その他の本発明プローブにみ
られる要件としてはＴｍ値が７０℃前後であることを挙
げることができ、同様にプライマーにはＴｍ値が６０℃
前後であることを挙げることができる。
【００２３】グルタチオン抱合に関与するグルタチオン
Ｓ−転移酵素のｍＲＮＡ配列は公知であり、それぞれジ
ーンバンク（GenBank）に以下の登録番号で登録されて
いる。 (1)ＧＳＴＰ１遺伝子；ＮＭ＿０００８５２ (2)ＧＳＴＴ１遺伝子；ＮＭ＿０００８５３ (3)ＧＳＴＴ２遺伝子；ＮＭ＿０００８５４ (4)ＧＳＴＭ１Ｂ遺伝子；Ｊ０３８１７ (5)ＧＳＴＭ２遺伝子；ＮＭ＿０００８４８ (6)ＧＳＴＭ３遺伝子；ＮＭ＿０００８４９ (7)ＧＳＴＭ４遺伝子；ＮＭ＿０００８５０ (8)ＧＳＴＭ５遺伝子；ＮＭ＿０００８５１ (9)ＧＳＴＡ１−１遺伝子；Ｓ４９９７５ (10)ＧＳＴＡ２遺伝子；Ｍ１６５９４ (11)ＧＳＴＡ３遺伝子；ＡＦ０２０９１９ (12)ＧＳＴＡ４遺伝子；ＮＭ＿００１５１２ (13)ＭＧＳＴ１遺伝子；Ｕ４６４９８ (14)ＭＧＳＴ２遺伝子；ＮＭ＿００２４１３ (15)ＭＧＳＴ３遺伝子；ＮＭ＿００４５２８ (16)ＭＧＳＴ１Ｌ１遺伝子；ＮＭ＿００４８７８。 (17)ＧＳＴＺ１遺伝子；ＮＭ＿００１５１３
Ｓ−転移酵素のｍＲＮＡ配列は公知であり、それぞれジ
ーンバンク（GenBank）に以下の登録番号で登録されて
いる。 (1)ＧＳＴＰ１遺伝子；ＮＭ＿０００８５２ (2)ＧＳＴＴ１遺伝子；ＮＭ＿０００８５３ (3)ＧＳＴＴ２遺伝子；ＮＭ＿０００８５４ (4)ＧＳＴＭ１Ｂ遺伝子；Ｊ０３８１７ (5)ＧＳＴＭ２遺伝子；ＮＭ＿０００８４８ (6)ＧＳＴＭ３遺伝子；ＮＭ＿０００８４９ (7)ＧＳＴＭ４遺伝子；ＮＭ＿０００８５０ (8)ＧＳＴＭ５遺伝子；ＮＭ＿０００８５１ (9)ＧＳＴＡ１−１遺伝子；Ｓ４９９７５ (10)ＧＳＴＡ２遺伝子；Ｍ１６５９４ (11)ＧＳＴＡ３遺伝子；ＡＦ０２０９１９ (12)ＧＳＴＡ４遺伝子；ＮＭ＿００１５１２ (13)ＭＧＳＴ１遺伝子；Ｕ４６４９８ (14)ＭＧＳＴ２遺伝子；ＮＭ＿００２４１３ (15)ＭＧＳＴ３遺伝子；ＮＭ＿００４５２８ (16)ＭＧＳＴ１Ｌ１遺伝子；ＮＭ＿００４８７８。 (17)ＧＳＴＺ１遺伝子；ＮＭ＿００１５１３
【００２４】本明細書において、各酵素の特定領域の表
示は、いずれも上記各登録番号で登録された遺伝子の配
列に従うものである。
示は、いずれも上記各登録番号で登録された遺伝子の配
列に従うものである。
【００２５】前記プライマー及びプローブ用のオリゴヌ
クレオチドのヌクレオチド数は、少なくとも１５個、通
常１５〜５０個、好ましくは２０〜４０個の範囲にある
のがよい。之等プライマー及びプローブのヌクレオチド
数が上記よりあまりに多くなりすぎると、１本鎖ＤＮＡ
にハイブリダイズしにくくなり、逆にあまりに小さすぎ
ると、ハイブリダイゼーションの特異性が低下する。
クレオチドのヌクレオチド数は、少なくとも１５個、通
常１５〜５０個、好ましくは２０〜４０個の範囲にある
のがよい。之等プライマー及びプローブのヌクレオチド
数が上記よりあまりに多くなりすぎると、１本鎖ＤＮＡ
にハイブリダイズしにくくなり、逆にあまりに小さすぎ
ると、ハイブリダイゼーションの特異性が低下する。
【００２６】プライマー及びプローブの特定のヌクレオ
チド配列の好ましい具体的配列の例は、前述したとお
り、各分子種に応じてそれぞれ、配列番号１〜１７（プ
ローブの場合）並びに配列番号１８〜５１（プライマー
の場合）に示されるとおりである。
チド配列の好ましい具体的配列の例は、前述したとお
り、各分子種に応じてそれぞれ、配列番号１〜１７（プ
ローブの場合）並びに配列番号１８〜５１（プライマー
の場合）に示されるとおりである。
【００２７】尚、例えば２０ヌクレオチドからなるプラ
イマー又はプローブは、鋳型鎖との間に少数のミスマッ
チが存在してもハイブリダイズし、ＰＣＲのプライマー
として又は検出用プローブとして機能し得ることが知ら
れている。従って本発明プライマー及びプローブもま
た、上記の特定のヌクレオチド配列を有するものに限定
されず、これをその一部として含むものや、この配列中
の例えば２個以下のヌクレオチドの置換、欠失及び／又
は付加による修飾のなされた配列を包含することができ
る。
イマー又はプローブは、鋳型鎖との間に少数のミスマッ
チが存在してもハイブリダイズし、ＰＣＲのプライマー
として又は検出用プローブとして機能し得ることが知ら
れている。従って本発明プライマー及びプローブもま
た、上記の特定のヌクレオチド配列を有するものに限定
されず、これをその一部として含むものや、この配列中
の例えば２個以下のヌクレオチドの置換、欠失及び／又
は付加による修飾のなされた配列を包含することができ
る。
【００２８】上記本発明プローブ及びプライマーとして
の前記オリゴヌクレオチドは、常法に従い、自動合成
機、例えばＤＮＡシンセサイザー（パーキンエルマー
社）等を用いて容易に合成することができ、得られるオ
リゴヌクレオチドは更に必要に応じて、市販の精製用カ
ートリッジ等を用いて精製することもできる。
の前記オリゴヌクレオチドは、常法に従い、自動合成
機、例えばＤＮＡシンセサイザー（パーキンエルマー
社）等を用いて容易に合成することができ、得られるオ
リゴヌクレオチドは更に必要に応じて、市販の精製用カ
ートリッジ等を用いて精製することもできる。
【００２９】本発明のリアルタイム検出用プローブは、
その一端、例えば５′−末端にレポーター色素を結合し
ており、そして他端、例えば３′−末端にクエンチャー
色素を結合している。レポーター色素は、例えば励起光
の照射によって蛍光を発する物質であり、クエンチャー
は、該レポーター色素に距離的に接近して存在する場合
レポーター色素に作用してその蛍光の発生を消去する作
用を有するものであることができる。該レポーター色素
の例としては、例えば６−カルボキシ−フルオレッセイ
ン（ＦＡＭ）、テトラクロロ−６−カルボキシフルオレ
ッセイン（ＴＥＴ）、２，７−ジメトキシ−４，５−ジ
クロロ−６−カルボキシフルオレッセイン（ＪＯＥ）、
ヘキソクロロ−６−カルボキシフルオレッセイン（ＨＥ
Ｘ）等が挙げられる。クエンチャー色素の例としては、
例えば６−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン（Ｔ
ＡＭＲＡ）等が挙げられる。
その一端、例えば５′−末端にレポーター色素を結合し
ており、そして他端、例えば３′−末端にクエンチャー
色素を結合している。レポーター色素は、例えば励起光
の照射によって蛍光を発する物質であり、クエンチャー
は、該レポーター色素に距離的に接近して存在する場合
レポーター色素に作用してその蛍光の発生を消去する作
用を有するものであることができる。該レポーター色素
の例としては、例えば６−カルボキシ−フルオレッセイ
ン（ＦＡＭ）、テトラクロロ−６−カルボキシフルオレ
ッセイン（ＴＥＴ）、２，７−ジメトキシ−４，５−ジ
クロロ−６−カルボキシフルオレッセイン（ＪＯＥ）、
ヘキソクロロ−６−カルボキシフルオレッセイン（ＨＥ
Ｘ）等が挙げられる。クエンチャー色素の例としては、
例えば６−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン（Ｔ
ＡＭＲＡ）等が挙げられる。
【００３０】本発明プローブは、前記特定配列のプロー
ブ用オリゴヌクレオチドにレポーター色素及びクエンチ
ャー色素を結合させることにより調製できる。例えばプ
ローブの５′側は、通常数個のメチレン鎖をリンカーと
し、末端のリン酸基にＦＡＭ分子をリン酸エステルの形
で結合させることができる。また、３′側には、下に示
す構造単位を介してアミド結合によりＴＡＭＲＡ分子を
結合させ得る。
ブ用オリゴヌクレオチドにレポーター色素及びクエンチ
ャー色素を結合させることにより調製できる。例えばプ
ローブの５′側は、通常数個のメチレン鎖をリンカーと
し、末端のリン酸基にＦＡＭ分子をリン酸エステルの形
で結合させることができる。また、３′側には、下に示
す構造単位を介してアミド結合によりＴＡＭＲＡ分子を
結合させ得る。
【００３１】
【化１】
【００３２】以下、本発明プライマー対及びプローブを
利用したＰＣＲによるリアルタイム検出法につき詳述す
る。
利用したＰＣＲによるリアルタイム検出法につき詳述す
る。
【００３３】本発明方法は、前述した本発明プライマー
対及びプローブを利用することを必須として、他は公知
のＰＣＲ法（例えば、Science, 230, 1350 (1985)参
照）、ＲＴ−ＰＣＲ（Genome Res., 6(10), 986 (1996)
参照）等、特にリアルタイム検出法（例えばTaqMan PC
R, ABI PRISMTM 7700 SEQUENCE DETECTION SYSTEM, App
lied Biosystems, Ver1, June 1996参照）に従い実施す
ることができる。
対及びプローブを利用することを必須として、他は公知
のＰＣＲ法（例えば、Science, 230, 1350 (1985)参
照）、ＲＴ−ＰＣＲ（Genome Res., 6(10), 986 (1996)
参照）等、特にリアルタイム検出法（例えばTaqMan PC
R, ABI PRISMTM 7700 SEQUENCE DETECTION SYSTEM, App
lied Biosystems, Ver1, June 1996参照）に従い実施す
ることができる。
【００３４】該方法は、特に本発明が対象とするグルタ
チオンＳ−転移酵素の発現量の測定方法として、ｍＲＮ
Ａを測定する場合に有用である。この場合、グルタチオ
ンＳ−転移酵素を発現している生体組織を採取し、常法
に従って全ＲＮＡを抽出し、次にそれに対して相補性の
ｃＤＮＡを常法に従って合成した後、本発明プライマー
対とプローブとを用いて、ＰＣＲを行えばよい。また、
常法に従って全ＲＮＡを抽出後、本発明プライマーとプ
ローブとを用いて、直接ＲＴ−ＰＣＲを行なうこともで
きる。
チオンＳ−転移酵素の発現量の測定方法として、ｍＲＮ
Ａを測定する場合に有用である。この場合、グルタチオ
ンＳ−転移酵素を発現している生体組織を採取し、常法
に従って全ＲＮＡを抽出し、次にそれに対して相補性の
ｃＤＮＡを常法に従って合成した後、本発明プライマー
対とプローブとを用いて、ＰＣＲを行えばよい。また、
常法に従って全ＲＮＡを抽出後、本発明プライマーとプ
ローブとを用いて、直接ＲＴ−ＰＣＲを行なうこともで
きる。
【００３５】ＰＣＲ反応、ＲＴ−ＰＣＲ反応は、基本的
には公知の方法に従うことができる。それらの反応条件
も公知の方法に準じて適宜決定することができ、特に異
なるものではない。具体的には、後記実施例に示す条件
を好ましく採用できる。
には公知の方法に従うことができる。それらの反応条件
も公知の方法に準じて適宜決定することができ、特に異
なるものではない。具体的には、後記実施例に示す条件
を好ましく採用できる。
【００３６】検出も、基本的には常法に従って、例え
ば、アルゴンレーザ光をＰＣＲ反応液に照射し、放射さ
れる蛍光をＣＣＤカメラを用いて検出することにより行
なうことができる。
ば、アルゴンレーザ光をＰＣＲ反応液に照射し、放射さ
れる蛍光をＣＣＤカメラを用いて検出することにより行
なうことができる。
【００３７】かくして、本発明方法の実施によって、所
期のグルタチオン抱合に関与するグルタチオンＳ−転移
酵素を容易且つ迅速に検出することができる。
期のグルタチオン抱合に関与するグルタチオンＳ−転移
酵素を容易且つ迅速に検出することができる。
【００３８】本発明は更に、上記方法の実施のためのキ
ットをも提供する。このキットは上記プライマー対及び
プローブを含んでなる。本発明キットには、対照として
使用することのできる既知の核酸や、該核酸を測定する
ためのプライマー対及びプローブを更に含んでいてもよ
い。
ットをも提供する。このキットは上記プライマー対及び
プローブを含んでなる。本発明キットには、対照として
使用することのできる既知の核酸や、該核酸を測定する
ためのプライマー対及びプローブを更に含んでいてもよ
い。
【００３９】本発明方法によれば、グルタチオンＳ−転
移酵素の遺伝子を測定、検出できるため、これによって
グルタチオンＳ−転移酵素の定量を迅速に精度よく行な
うことができる。かくして、新薬の他剤との相互作用や
配合禁忌等に関連する基礎データーを効率よく得ること
ができる。
移酵素の遺伝子を測定、検出できるため、これによって
グルタチオンＳ−転移酵素の定量を迅速に精度よく行な
うことができる。かくして、新薬の他剤との相互作用や
配合禁忌等に関連する基礎データーを効率よく得ること
ができる。
【００４０】
【実施例】以下、試験例を挙げて本発明をより詳細に説
明する。
明する。
【００４１】
【試験例１】リアルタイム検出法による検量線の作成 本試験で採用したリアルタイムワンステップＲＴ−ＰＣ
Ｒ法は、９６ウエルを用いて、最大９６の異なった反応
を同時に実施して、一度に最大９６の検体を測定できる
ものである。また、１チューブ内でＲＴ反応とＰＣＲ反
応とを行なうことができる。
Ｒ法は、９６ウエルを用いて、最大９６の異なった反応
を同時に実施して、一度に最大９６の検体を測定できる
ものである。また、１チューブ内でＲＴ反応とＰＣＲ反
応とを行なうことができる。
【００４２】本定量の原理は、隣接した２種類の蛍光色
素を用いて、一方の色素（リポーター色素）の蛍光波長
と他方の色素（クエンチャー色素）の励起光波長との間
で、波長領域が重なる場合に生じるＦＲＥＴを利用した
ものである。ＦＲＥＴを生じる２種の蛍光色素を両末端
に結合させたプローブ（TaqMan probe）がＰＣＲで増幅
した特定のグルタチオンＳ−転移酵素由来のｃＤＮＡに
ハイブリダイゼーションし、この状態でＰＣＲの伸長反
応が始まり、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの有する５’
−３’エンドヌクレアーゼ活性によってＴａｑＭａｎプ
ローブが加水分解され、リポーター色素が脱離し、クエ
ンチャー色素との間の物理的距離が生じ、ＦＲＥＴによ
って抑制されていたリポーター色素の蛍光強度が増加
し、この蛍光強度の増加はＰＣＲの増幅産物の増加量に
比例するため、これをＰＣＲ反応毎に測定することによ
って、所望の定量が可能となる。
素を用いて、一方の色素（リポーター色素）の蛍光波長
と他方の色素（クエンチャー色素）の励起光波長との間
で、波長領域が重なる場合に生じるＦＲＥＴを利用した
ものである。ＦＲＥＴを生じる２種の蛍光色素を両末端
に結合させたプローブ（TaqMan probe）がＰＣＲで増幅
した特定のグルタチオンＳ−転移酵素由来のｃＤＮＡに
ハイブリダイゼーションし、この状態でＰＣＲの伸長反
応が始まり、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの有する５’
−３’エンドヌクレアーゼ活性によってＴａｑＭａｎプ
ローブが加水分解され、リポーター色素が脱離し、クエ
ンチャー色素との間の物理的距離が生じ、ＦＲＥＴによ
って抑制されていたリポーター色素の蛍光強度が増加
し、この蛍光強度の増加はＰＣＲの増幅産物の増加量に
比例するため、これをＰＣＲ反応毎に測定することによ
って、所望の定量が可能となる。
【００４３】本試験では、プローブの５’末端側にはリ
ポーター色素としてＦＡＭを、３’末端側にはクエンチ
ャー色素としてＴＡＭＲＡを使用した。之等各色素の結
合及びこれによるＴａｑＭａｎプローブの作成は、文献
記載の方法（Genome Res., 6(10), 986 (1996)）に従っ
て行なった。
ポーター色素としてＦＡＭを、３’末端側にはクエンチ
ャー色素としてＴＡＭＲＡを使用した。之等各色素の結
合及びこれによるＴａｑＭａｎプローブの作成は、文献
記載の方法（Genome Res., 6(10), 986 (1996)）に従っ
て行なった。
【００４４】また、各プライマー及びプローブとしての
オリゴヌクレオチドは、自動シンセサイザーとしてＡＢ
Ｉ社製のＤＮＡ／ＲＮＡ合成機を利用して、基質（ｄＮ
ＴＰ）及び規定の試薬を用いて合成した。
オリゴヌクレオチドは、自動シンセサイザーとしてＡＢ
Ｉ社製のＤＮＡ／ＲＮＡ合成機を利用して、基質（ｄＮ
ＴＰ）及び規定の試薬を用いて合成した。
【００４５】検体ＲＮＡとしては、成人の脳、成人の腎
臓、成人の肺、成人の小腸、胎児の肝臓、成人の肝臓プ
ールより精製された全ＲＮＡを用いた。尚、之等の全Ｒ
ＮＡはいずれもクローンテック社（Clontech Laborator
ies, Inc.）より購入した。
臓、成人の肺、成人の小腸、胎児の肝臓、成人の肝臓プ
ールより精製された全ＲＮＡを用いた。尚、之等の全Ｒ
ＮＡはいずれもクローンテック社（Clontech Laborator
ies, Inc.）より購入した。
【００４６】成人の脳、成人の腎臓、成人の肺、成人の
小腸、胎児の肝臓、成人の肝臓プールより精製された全
ＲＮＡは、ＲＮａｓｅフリーの水で希釈し、２０μｇ／
ｍＬとした。その後、これら６種類を等量ずつ混合し、
検量線作成用とした。以後は、５０μｇ／ｍＬのイース
トｔＲＮＡ（Yeast tRNA, GIBCO社製）を用いて、５倍
公比で希釈した。測定には５μＬを使用した。
小腸、胎児の肝臓、成人の肝臓プールより精製された全
ＲＮＡは、ＲＮａｓｅフリーの水で希釈し、２０μｇ／
ｍＬとした。その後、これら６種類を等量ずつ混合し、
検量線作成用とした。以後は、５０μｇ／ｍＬのイース
トｔＲＮＡ（Yeast tRNA, GIBCO社製）を用いて、５倍
公比で希釈した。測定には５μＬを使用した。
【００４７】ＲＴ−ＰＣＲ反応は、３００ｎＭフォーワ
ードプライマー、９００ｎＭリバースプライマー及び２
００ｎＭ TaqManプローブを含むTaqMan One-Step RT-PC
R Master Mix Reagents Kit (PE Applied Biosystems)
を用いて、５０μＬ／チューブの系で、ＡＢＩ ＰＲＩ
ＳＭTM７７００ Sequence Detection System（PE Appl
ied Biosystems）にて行なった。
ードプライマー、９００ｎＭリバースプライマー及び２
００ｎＭ TaqManプローブを含むTaqMan One-Step RT-PC
R Master Mix Reagents Kit (PE Applied Biosystems)
を用いて、５０μＬ／チューブの系で、ＡＢＩ ＰＲＩ
ＳＭTM７７００ Sequence Detection System（PE Appl
ied Biosystems）にて行なった。
【００４８】温度条件は、４８℃で３０分間、９５℃で
１０分間で保温した後、９５℃で１５秒間、６０℃で１
分間のサイクルを５０回行い、各サイクルごとに蛍光強
度を測定した。
１０分間で保温した後、９５℃で１５秒間、６０℃で１
分間のサイクルを５０回行い、各サイクルごとに蛍光強
度を測定した。
【００４９】前記した各酵素に対して各配列番号に示さ
れる配列のプライマー対及びプローブを用いて行なった
上記試験の結果（検量線）を表１に示す。
れる配列のプライマー対及びプローブを用いて行なった
上記試験の結果（検量線）を表１に示す。
【００５０】
【表１】
【００５１】表１から、１０００００ｐｇ全ＲＮＡ／５
０μＬ反応液量から５倍公比で希釈された検量線を作成
したところ、ＧＳＴＰ１については、１．２８ｐｇ全Ｒ
ＮＡ／５０μＬ反応液量まで定量性を有しており、他の
酵素についても１．２８ｐｇから４０００ｐｇ全ＲＮＡ
を定量限界とした検量線の相関係数（ｒ）は０．９９以
上であった。
０μＬ反応液量から５倍公比で希釈された検量線を作成
したところ、ＧＳＴＰ１については、１．２８ｐｇ全Ｒ
ＮＡ／５０μＬ反応液量まで定量性を有しており、他の
酵素についても１．２８ｐｇから４０００ｐｇ全ＲＮＡ
を定量限界とした検量線の相関係数（ｒ）は０．９９以
上であった。
【００５２】
【配列表】SEQUENCE LISTING <110> Ostuka Pharmaceutical Factory Inc. <120> グルタチオンＳ−転移酵素の測定方法、そのため
のプローブ及びキット <130> 00P1072 <160> 51 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> human GSTP1 gene <400> 1 aggacctccg ctgcaaatac atctcc 26 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> human GSTT1 gene <400> 2 ttgctcgagg acaagttcct ccagaa 26 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> human GSTT2 gene <400> 3 ttagagctgc gcaccgtgga tttggt 26 <210> 4 <211> 31 <212> DNA <213> human GSTM1B gene <400> 4 accatggaca accatatgca gctgggcatg a 31 <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> human GSTM2 gene <400> 5 tttatggaca gccgtatgca gctggccaa 29 <210> 6 <211> 31 <212> DNA <213> human GSTM3 gene <400> 6 taatggattt ccgcacacaa ctgataaggc t 31 <210> 7 <211> 33 <212> DNA <213> human GSTM4 gene <400> 7 tccaatcagc tggccagagt ctgctacagc cct 33 <210> 8 <211> 33 <212> DNA <213> human GSTM5 gene <400> 8 cagtctgacc agctccatgt ggttatccat aac 33 <210> 9 <211> 31 <212> DNA <213> human GSTA1-1 gene <400> 9 gtatgtccac ctgaggaaaa agatgccaag c 31 <210> 10 <211> 29 <212> DNA <213> human GSTA2 gene <400> 10 tactcaacct gaggaacaag atgccaagc 29 <210> 11 <211> 32 <212> DNA <213> human GSTA3 gene <400> 11 agaaaacaaa aagtcgctat ttccctgcct tc 32 <210> 12 <211> 29 <212> DNA <213> human GSTA4 gene <400> 12 tggcaagaac ctcaaggaga gaaccctga 29 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> human MGST1 gene <400> 13 acagccatcc tgcacttcag actatttgtc 30 <210> 14 <211> 27 <212> DNA <213> human MGST2 gene <400> 14 ctcggcctgt cagcaaagtt attttgc 27 <210> 15 <211> 26 <212> DNA <213> human MGST3 gene <400> 15 cacatcttca actgcattca gcgagc 26 <210> 16 <211> 29 <212> DNA <213> human MGST1L1 gene <400> 16 ttaggaccca gaaaggagta gacgaagcc 29 <210> 17 <211> 26 <212> DNA <213> human GSTZ1 gene <400> 17 catggagagt tcgaattgct ctggcc 26 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> human GSTP1 gene <400> 18 ctggtggaca tggtgaatga c 21 <210> 19 <211> 23 <212> DNA <213> human GSTP1 gene <400> 19 cgcctcatag ttggtgtaga tga 23 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> human GSTT1 gene <400> 20 agagttggat gtgaccctgc a 21 <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> human GSTT1 gene <400> 21 tcagctaagg agatgtgagg acc 23 <210> 22 <211> 19 <212> DNA <213> human GSTT2 gene <400> 22 ccaagaagaa tggcatccc 19 <210> 23 <211> 19 <212> DNA <213> human GSTT2 gene <400> 23 ttgctcttgt gctgccctt 19 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> human GSTM1B gene <400> 24 agcaacgcca tcttgtgcta c 21 <210> 25 <211> 22 <212> DNA <213> human GSTM1B gene <400> 25 tacggtggag gtcaaggaca tc 22 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> human GSTM2 gene <400> 26 aatgccatcc tgcggtacat t 21 <210> 27 <211> 22 <212> DNA <213> human GSTM2 gene <400> 27 tgcttcccca gaaactgtga gt 22 <210> 28 <211> 23 <212> DNA <213> human GSTM3 gene <400> 28 cgagtggaca tcatagagaa cca 23 <210> 29 <211> 23 <212> DNA <213> human GSTM3 gene <400> 29 agctcttcca agtactgagg ctt 23 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> human GSTM4 gene <400> 30 ttggagaacc aggctatgga c 21 <210> 31 <211> 22 <212> DNA <213> human GSTM4 gene <400> 31 ttccccagga actgtgagaa gt 22 <210> 32 <211> 21 <212> DNA <213> human GSTM5 gene <400> 32 ttcccaatct gccctacttg a 21 <210> 33 <211> 22 <212> DNA <213> human GSTM5 gene <400> 33 cctccaagta ttttggcttc ag 22 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> human GSTA1-1 gene <400> 34 atgttccagc aagtgccaat 20 <210> 35 <211> 19 <212> DNA <213> human GSTA1-1 gene <400> 35 actggagtca agctcctcg 19 <210> 36 <211> 22 <212> DNA <213> human GSTA2 gene <400> 36 cagaccagag ccattctcaa ct 22 <210> 37 <211> 23 <212> DNA <213> human GSTA2 gene <400> 37 aaggctagag tcaagctctt cca 23 <210> 38 <211> 22 <212> DNA <213> human GSTA3 gene <400> 38 agatgccaag attgccttga tc 22 <210> 39 <211> 25 <212> DNA <213> human GSTA3 gene <400> 39 cttcttctaa agcttttgca tctgc 25 <210> 40 <211> 21 <212> DNA <213> human GSTA4 gene <400> 40 agttggtaca gacccgaagc a 21 <210> 41 <211> 22 <212> DNA <213> human GSTA4 gene <400> 41 agttccagca gatccagtgt cc 22 <210> 42 <211> 21 <212> DNA <213> human MGST1 gene <400> 42 tattccttga gtggtcccga c 21 <210> 43 <211> 22 <212> DNA <213> human MGST1 gene <400> 43 aatggtgtgg tagatccgtg ct 22 <210> 44 <211> 22 <212> DNA <213> human MGST2 gene <400> 44 ctgctggctg ctgtctctat tc 22 <210> 45 <211> 22 <212> DNA <213> human MGST2 gene <400> 45 ttgttgtgcc cgaaatactc tc 22 <210> 46 <211> 21 <212> DNA <213> human MGST3 gene <400> 46 tacagcacgg accctgaaaa t 21 <210> 47 <211> 21 <212> DNA <213> human MGST3 gene <400> 47 acttccaacg tgttctggtg g 21 <210> 48 <211> 21 <212> DNA <213> human MGST1L1 gene <400> 48 ggaacgacat ggagaccatc t 21 <210> 49 <211> 19 <212> DNA <213> human MGST1L1 gene <400> 49 agtgcatcca ggcgacaaa 19 <210> 50 <211> 21 <212> DNA <213> human GSTZ1 gene <400> 50 tcctatttcc gaagctcctg c 21 <210> 51 <211> 22 <212> DNA <213> human GSTZ1 gene <400> 51 ttcagtgcct ggaagtcctt ag 22
のプローブ及びキット <130> 00P1072 <160> 51 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> human GSTP1 gene <400> 1 aggacctccg ctgcaaatac atctcc 26 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> human GSTT1 gene <400> 2 ttgctcgagg acaagttcct ccagaa 26 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> human GSTT2 gene <400> 3 ttagagctgc gcaccgtgga tttggt 26 <210> 4 <211> 31 <212> DNA <213> human GSTM1B gene <400> 4 accatggaca accatatgca gctgggcatg a 31 <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> human GSTM2 gene <400> 5 tttatggaca gccgtatgca gctggccaa 29 <210> 6 <211> 31 <212> DNA <213> human GSTM3 gene <400> 6 taatggattt ccgcacacaa ctgataaggc t 31 <210> 7 <211> 33 <212> DNA <213> human GSTM4 gene <400> 7 tccaatcagc tggccagagt ctgctacagc cct 33 <210> 8 <211> 33 <212> DNA <213> human GSTM5 gene <400> 8 cagtctgacc agctccatgt ggttatccat aac 33 <210> 9 <211> 31 <212> DNA <213> human GSTA1-1 gene <400> 9 gtatgtccac ctgaggaaaa agatgccaag c 31 <210> 10 <211> 29 <212> DNA <213> human GSTA2 gene <400> 10 tactcaacct gaggaacaag atgccaagc 29 <210> 11 <211> 32 <212> DNA <213> human GSTA3 gene <400> 11 agaaaacaaa aagtcgctat ttccctgcct tc 32 <210> 12 <211> 29 <212> DNA <213> human GSTA4 gene <400> 12 tggcaagaac ctcaaggaga gaaccctga 29 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> human MGST1 gene <400> 13 acagccatcc tgcacttcag actatttgtc 30 <210> 14 <211> 27 <212> DNA <213> human MGST2 gene <400> 14 ctcggcctgt cagcaaagtt attttgc 27 <210> 15 <211> 26 <212> DNA <213> human MGST3 gene <400> 15 cacatcttca actgcattca gcgagc 26 <210> 16 <211> 29 <212> DNA <213> human MGST1L1 gene <400> 16 ttaggaccca gaaaggagta gacgaagcc 29 <210> 17 <211> 26 <212> DNA <213> human GSTZ1 gene <400> 17 catggagagt tcgaattgct ctggcc 26 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> human GSTP1 gene <400> 18 ctggtggaca tggtgaatga c 21 <210> 19 <211> 23 <212> DNA <213> human GSTP1 gene <400> 19 cgcctcatag ttggtgtaga tga 23 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> human GSTT1 gene <400> 20 agagttggat gtgaccctgc a 21 <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> human GSTT1 gene <400> 21 tcagctaagg agatgtgagg acc 23 <210> 22 <211> 19 <212> DNA <213> human GSTT2 gene <400> 22 ccaagaagaa tggcatccc 19 <210> 23 <211> 19 <212> DNA <213> human GSTT2 gene <400> 23 ttgctcttgt gctgccctt 19 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> human GSTM1B gene <400> 24 agcaacgcca tcttgtgcta c 21 <210> 25 <211> 22 <212> DNA <213> human GSTM1B gene <400> 25 tacggtggag gtcaaggaca tc 22 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> human GSTM2 gene <400> 26 aatgccatcc tgcggtacat t 21 <210> 27 <211> 22 <212> DNA <213> human GSTM2 gene <400> 27 tgcttcccca gaaactgtga gt 22 <210> 28 <211> 23 <212> DNA <213> human GSTM3 gene <400> 28 cgagtggaca tcatagagaa cca 23 <210> 29 <211> 23 <212> DNA <213> human GSTM3 gene <400> 29 agctcttcca agtactgagg ctt 23 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> human GSTM4 gene <400> 30 ttggagaacc aggctatgga c 21 <210> 31 <211> 22 <212> DNA <213> human GSTM4 gene <400> 31 ttccccagga actgtgagaa gt 22 <210> 32 <211> 21 <212> DNA <213> human GSTM5 gene <400> 32 ttcccaatct gccctacttg a 21 <210> 33 <211> 22 <212> DNA <213> human GSTM5 gene <400> 33 cctccaagta ttttggcttc ag 22 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> human GSTA1-1 gene <400> 34 atgttccagc aagtgccaat 20 <210> 35 <211> 19 <212> DNA <213> human GSTA1-1 gene <400> 35 actggagtca agctcctcg 19 <210> 36 <211> 22 <212> DNA <213> human GSTA2 gene <400> 36 cagaccagag ccattctcaa ct 22 <210> 37 <211> 23 <212> DNA <213> human GSTA2 gene <400> 37 aaggctagag tcaagctctt cca 23 <210> 38 <211> 22 <212> DNA <213> human GSTA3 gene <400> 38 agatgccaag attgccttga tc 22 <210> 39 <211> 25 <212> DNA <213> human GSTA3 gene <400> 39 cttcttctaa agcttttgca tctgc 25 <210> 40 <211> 21 <212> DNA <213> human GSTA4 gene <400> 40 agttggtaca gacccgaagc a 21 <210> 41 <211> 22 <212> DNA <213> human GSTA4 gene <400> 41 agttccagca gatccagtgt cc 22 <210> 42 <211> 21 <212> DNA <213> human MGST1 gene <400> 42 tattccttga gtggtcccga c 21 <210> 43 <211> 22 <212> DNA <213> human MGST1 gene <400> 43 aatggtgtgg tagatccgtg ct 22 <210> 44 <211> 22 <212> DNA <213> human MGST2 gene <400> 44 ctgctggctg ctgtctctat tc 22 <210> 45 <211> 22 <212> DNA <213> human MGST2 gene <400> 45 ttgttgtgcc cgaaatactc tc 22 <210> 46 <211> 21 <212> DNA <213> human MGST3 gene <400> 46 tacagcacgg accctgaaaa t 21 <210> 47 <211> 21 <212> DNA <213> human MGST3 gene <400> 47 acttccaacg tgttctggtg g 21 <210> 48 <211> 21 <212> DNA <213> human MGST1L1 gene <400> 48 ggaacgacat ggagaccatc t 21 <210> 49 <211> 19 <212> DNA <213> human MGST1L1 gene <400> 49 agtgcatcca ggcgacaaa 19 <210> 50 <211> 21 <212> DNA <213> human GSTZ1 gene <400> 50 tcctatttcc gaagctcctg c 21 <210> 51 <211> 22 <212> DNA <213> human GSTZ1 gene <400> 51 ttcagtgcct ggaagtcctt ag 22
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｆターム(参考） 2G043 AA06 BA16 DA02 EA01 2G054 CA22 EA03 GA04 4B024 AA11 AA20 CA09 HA11 4B063 QA01 QA13 QA18 QQ02 QQ42 QQ53 QR08 QR32 QR55 QR62 QR66 QS02 QS25 QS34 QX02
Claims (12)
- 【請求項１】 ヒトにおけるグルタチオン抱合に関与す
るグルタチオンＳ−転移酵素の測定に用いられるプロー
ブであって、下記(1)〜(17)の各領域のそれぞれにハイ
ブリダイズするオリゴヌクレオチドから選ばれることを
特徴とするプローブ。 (1)ＧＳＴＰ１遺伝子の２９３〜３１８の領域 (2)ＧＳＴＴ１遺伝子の４３６〜４６１の領域 (3)ＧＳＴＴ２遺伝子の８２〜１０７の領域 (4)ＧＳＴＭ１Ｂ遺伝子の３１０〜３４０の領域 (5)ＧＳＴＭ２遺伝子の３１０〜３３８の領域 (6)ＧＳＴＭ３遺伝子の３２３〜３５３の領域 (7)ＧＳＴＭ４遺伝子の３２２〜３５４の領域 (8)ＧＳＴＭ５遺伝子の３４２〜３１０の領域 (9)ＧＳＴＡ１−１遺伝子の３３１〜３６１の領域 (10)ＧＳＴＡ２遺伝子の３３３〜３６１の領域 (11)ＧＳＴＡ３遺伝子の３１６〜３４７の領域（ジーン
バンク（GenBank）の登録番号ＡＦ０２０９１９での位
置、開始コドンからの位置は未確認） (12)ＧＳＴＡ４遺伝子の２４６〜２７４の領域 (13)ＭＧＳＴ１遺伝子の２０２〜２３１の領域（ジーン
バンク（GenBank）の登録番号Ｕ４６４９８での位置、
開始コドンからの位置は未確認） (14)ＭＧＳＴ２遺伝子の４２〜６８の領域 (15)ＭＧＳＴ３遺伝子の１５４〜１７９の領域 (16)ＭＧＳＴ１Ｌ１遺伝子の２８４〜２５６の領域 (17)ＧＳＴＺ１遺伝子の５０〜７５の領域 - 【請求項２】リポーター色素とクエンチャー色素とが結
合している請求項１記載のプローブ。 - 【請求項３】 塩基配列の長さが２０〜４０である請求
項１記載のプローブ。 - 【請求項４】 配列番号１〜配列番号１７に示される配
列のいずれかを含むものである請求項１〜３のいずれか
に記載のプローブ。 - 【請求項５】 配列番号１〜配列番号１７に示される配
列のいずれかである請求項１〜３のいずれかに記載のプ
ローブ。 - 【請求項６】下記(1)〜(17)の、ヒトにおけるグルタチ
オン抱合に関与するグルタチオンＳ−転移酵素をコード
する遺伝子の下記各領域にそれぞれハイブリダイズする
オリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーとリ
バースプライマーとのプライマー対、及び上記両プライ
マーに挟まれた下記領域にハイブリダイズするオリゴヌ
クレオチドからなるプローブの組合せから選ばれる、グ
ルタチオンＳ−転移酵素の測定キット。 (1)プライマー対；ＧＳＴＰ１遺伝子の265-285領域及び
342-320領域、プローブ；293-318領域 (2)プライマー対；ＧＳＴＴ１遺伝子の414-434領域及び
500-478領域、プローブ；436-461領域 (3)プライマー対；ＧＳＴＴ２遺伝子の62-80領域及び12
8-110領域、プローブ；82-107領域 (4)プライマー対；ＧＳＴＭ１Ｂ遺伝子の217-237領域及
び505-484領域、プローブ；310-340領域 (5)プライマー対；ＧＳＴＭ２遺伝子の220-240領域及び
434-413領域、プローブ；310-338領域 (6)プライマー対；ＧＳＴＭ３遺伝子の298-320領域及び
404-382領域、プローブ；323-353領域 (7)プライマー対；ＧＳＴＭ４遺伝子の298-318領域及び
431-410領域、プローブ；322-354領域 (8)プライマー対；ＧＳＴＭ５遺伝子の170-190領域及び
388-367領域、プローブ；342-310領域 (9)プライマー対；ＧＳＴＡ１−１遺伝子の151-170領域
及び519-501領域、プローブ；331-361領域 (10)プライマー対；ＧＳＴＡ２遺伝子の199-220領域及
び522-500領域、プローブ；333-361領域 (11)プライマー対；ＧＳＴＡ３遺伝子の290-311領域及
び585-561領域、プローブ；316-347領域（ジーンバンク
（GenBank）の登録番号ＡＦ０２０９１９での位置、開
始コドンからの位置は未確認） (12)プライマー対；ＧＳＴＡ４遺伝子の191-211領域及
び314-293領域、プローブ；246-274領域 (13)プライマー対；ＭＧＳＴ１遺伝子の175-195領域及
び255-234領域、プローブ；202-231領域（ジーンバンク
（GenBank）の登録番号Ｕ４６４９８での位置、開始コ
ドンからの位置は未確認） (14)プライマー対；ＭＧＳＴ２遺伝子の19-40領域及び1
62-141領域、プローブ；42-68領域 (15)プライマー対；ＭＧＳＴ３遺伝子の130-150領域及
び200-180領域、プローブ；154-179領域 (16)プライマー対；ＭＧＳＴ１Ｌ１遺伝子の218-238領
域及び307-289領域、プローブ；284-256領域 (17)プライマー対；ＧＳＴＺ１遺伝子の28-48領域及び1
61-140領域、プローブ；50-75領域 - 【請求項７】 プローブが、更にリポーター色素とクエ
ンチャー色素とを結合させたものである請求項６記載の
測定キット。 - 【請求項８】下記(1)〜(17)に示されるセットの、各配
列番号で示される配列を含むオリゴヌクレオチドからな
るプライマー対とプローブとの組合せから選ばれる、請
求項７記載の測定キット。 (1)プライマー対；配列番号１８及び１９、プローブ；
配列番号１ (2)プライマー対；配列番号２０及び２１、プローブ；
配列番号２ (3)プライマー対；配列番号２２及び２３、プローブ；
配列番号３ (4)プライマー対；配列番号２４及び２５、プローブ；
配列番号４ (5)プライマー対；配列番号２６及び２７、プローブ；
配列番号５ (6)プライマー対；配列番号２８及び２９、プローブ；
配列番号６ (7)プライマー対；配列番号３０及び３１、プローブ；
配列番号７ (8)プライマー対；配列番号３２及び３３、プローブ；
配列番号８ (9)プライマー対；配列番号３４及び３５、プローブ；
配列番号９ (10)プライマー対；配列番号３６及び３７、プローブ；
配列番号１０ (11)プライマー対；配列番号３８及び３９、プローブ；
配列番号１１ (12)プライマー対；配列番号４０及び４１、プローブ；
配列番号１２ (13)プライマー対；配列番号４２及び４３、プローブ；
配列番号１３ (14)プライマー対；配列番号４４及び４５、プローブ；
配列番号１４ (15)プライマー対；配列番号４６及び４７、プローブ；
配列番号１５ (16)プライマー対；配列番号４８及び４９、プローブ；
配列番号１６ (17)プライマー対；配列番号５０及び５１、プローブ；
配列番号１７ - 【請求項９】 請求項８に記載の測定キットであって、
(1)のセットがＧＳＴＰ１の測定用で、(2)のセットがＧ
ＳＴＴ１の測定用で、(3)のセットがＧＳＴＴ２の測定
用で、(4)のセットがＧＳＴＭ１Ｂの測定用で、(5)のセ
ットがＧＳＴＭ２の測定用で、(6)のセットがＧＳＴＭ
３の測定用で、(7)のセットがＧＳＴＭ４の測定用で、
(8)のセットがＧＳＴＭ５の測定用で、(9)のセットがＧ
ＳＴＡ１−１の測定用で、(10)のセットがＧＳＴＡ２の
測定用で、(11)のセットがＧＳＴＡ３の測定用で、(12)
のセットがＧＳＴＡ４の測定用で、(13)のセットがＭＧ
ＳＴ１の測定用で、(14)のセットがＭＧＳＴ２の測定用
で、(15)のセットがＭＧＳＴ３の測定用で、(16)のセッ
トがＭＧＳＴ１Ｌ１の測定用で、(17)のセットがＧＳＴ
Ｚ１の測定用である測定キット。 - 【請求項１０】 請求項８に記載の(1)〜(17)に示される
セットの、各配列番号で示される配列を有するオリゴヌ
クレオチドからなるプライマー対とプローブとの組合せ
から選ばれる、請求項９に記載の測定キット。 - 【請求項１１】 ヒトにおけるグルタチオン抱合に関与
するグルタチオンＳ−転移酵素を含む検体について、請
求項６〜１０のいずれかに記載の測定キットを用いてポ
リメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、用いたプローブ
の加水分解の有無を測定することを特徴とする、グルタ
チオンＳ−転移酵素の測定方法。 - 【請求項１２】加水分解の有無が、励起光照射による蛍
光の発色の有無によりなされる請求項１１記載の測定方
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000245951A JP2002058483A (ja) | 2000-08-14 | 2000-08-14 | グルタチオンｓ−転移酵素の測定方法、そのためのプローブ及びキット |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000245951A JP2002058483A (ja) | 2000-08-14 | 2000-08-14 | グルタチオンｓ−転移酵素の測定方法、そのためのプローブ及びキット |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002058483A true JP2002058483A (ja) | 2002-02-26 |
Family
ID=18736375
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000245951A Pending JP2002058483A (ja) | 2000-08-14 | 2000-08-14 | グルタチオンｓ−転移酵素の測定方法、そのためのプローブ及びキット |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2002058483A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003102178A1 (fr) * | 2002-05-31 | 2003-12-11 | Takara Bio Inc. | Procede de typage de polymorphismes genetiques |
| JP2010540921A (ja) * | 2007-09-27 | 2010-12-24 | フンダシオン レイナ メルセデス パラ ラ インベスティガシオン サニタリア | ヒトｇｓｔｔ１に対する抗体（抗−ｈｇｓｔｔ１）の検出のための免疫学的分析方法 |
-
2000
- 2000-08-14 JP JP2000245951A patent/JP2002058483A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003102178A1 (fr) * | 2002-05-31 | 2003-12-11 | Takara Bio Inc. | Procede de typage de polymorphismes genetiques |
| JP2010540921A (ja) * | 2007-09-27 | 2010-12-24 | フンダシオン レイナ メルセデス パラ ラ インベスティガシオン サニタリア | ヒトｇｓｔｔ１に対する抗体（抗−ｈｇｓｔｔ１）の検出のための免疫学的分析方法 |
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|
| A02 | Decision of refusal |
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