JP4276771B2 - ヒトにおけるグルクロン酸抱合に関与する酵素の測定方法、そのためのプローブ及びキット - Google Patents
ヒトにおけるグルクロン酸抱合に関与する酵素の測定方法、そのためのプローブ及びキット Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒトにおけるグルクロン酸抱合に関与する酵素の測定方法及びそのためのプローブ及びキットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
薬物代謝第II相反応の一種であるグルクロン酸抱合は、グルクロン酸転移酵素（UDP-glucuronosyltransferase，ＵＧＴ）によって触媒されることはよく知られている。
【０００３】
ところで、新薬を開発する上で、該新薬を投与した際のグルクロン酸抱合に関与する酵素の動き（発現量の増減）を把握することは重要である。何故なら、グルクロン酸抱合に関与する酵素の変動が判らないと、該新薬と併用される併用薬剤の効力や副作用の増減或いは併用薬剤や他の摂取物による新薬の効力や副作用の増減が予測できず、該新薬の安全性を確認することができないからである。
【０００４】
そこで、上記新薬開発等の分野においては、かかるヒトにおけるグルクロン酸抱合に関与する酵素に関する情報、殊に之等各分子種を区別して測定できる測定技術の開発が、要望されている。かかる技術が開発できれば、例えば、新薬の他剤との相互作用や特殊病態時における影響等が容易に把握でき、該新薬の副作用に関する有用な情報を得ることができ、かくして新薬の安全性を確保することができる。
【０００５】
一方、ポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）は、核酸の増幅法として広く知られており、例えばＲＴ−ＰＣＲ（Reverse Transcription-PCR）、コンペティティブＲＴ−ＰＣＲ等が微量のｍＲＮＡの検出、定量に威力を発揮している。
【０００６】
近年、ＰＣＲを利用したリアルタイム定量検出法が確立された（Taq Man PCR (Genome Res., 6(10), 986 (1996)), ABI PRISMTM Sequence Detection System (Applied Biosystems社)）。これは、特定の蛍光標識プローブ（TaqMan prove）を用いて核酸を測定する方法である。より詳しくは、例えば５’末端にリポーター色素及び３’末端にクエンチャー色素を付加して蛍光標識したプローブをターゲットＤＮＡにアニールさせた状態で、通常のＰＣＲ反応を行なわせると、伸長反応の進行に伴って、ＤＮＡポリメラーゼの有する５′−３′エキソヌクレアーゼ活性により、上記プローブが５’末端から加水分解される。その結果、５’末端のリポーター色素が３’末端のクエンチャー色素から離れ、これにより、当初一定の空間的距離を保っていたことによるＦＲＥＴ（Fluoresence Resonance Energy Transfer, 両蛍光色素の共鳴によるリポーター色素のエネルギー順位の低下に基づく蛍光強度の低下現象）効果がなくなり、クエンチャー色素により制御されていたリポーター色素の蛍光強度が増加し、かくして、該蛍光強度の増加を測定することによって、ターゲット核酸をリアルタイムに選択的に定量検出できるのである。この方法によれば、ＰＣＲ反応後に増幅物を例えばアガロースゲル電気泳動して、泳動パターンを解析する等の複雑な工程が不要となり、短時間で且つ同時に多種のサンプルを定量できる利点がある。
【０００７】
しかして、一般に、臨床検査センター等で臨床検査を行う場合には、非常に多数の検体について限られた時間内に検査をする必要があり、検査を効率良く行い得る手法の開発が要望されており、上記リアルタイム検出法は、この要望に合致するものとして期待できる。
【０００８】
本発明者らは、上記ＰＣＲによるリアルタイム検出法に着目し、これがヒトグルクロン酸抱合に関与する酵素の検出に利用できれば、同じ装置を用いて同時に同一のＰＣＲ条件で上記各酵素を区別して測定、検出できるとの着想から、鋭意研究を重ねた。
【０００９】
しかるに、現在知られている化学物質を代謝するヒトにおけるグルクロン酸抱合に関与する酵素は、前述したとおり約１５種にも及び、それぞれのｍＲＮＡの配列は知られているものの、之等をターゲット遺伝子として、互いに重複する配列部分を有さず、しかも同一ＰＣＲ条件で充分に増幅し得、更に、該ターゲット遺伝子の特定位置にハイブリダイズし得る各プライマー対としてのオリゴヌクレオチドの検索自体困難であると考えられた。また、かかるプライマー対に挟まれた特定領域に、同一ＰＣＲ条件下に之等のプライマーよりも早くハイブリダイズし得、しかもヒトにおけるグルクロン酸抱合に関与する各酵素に対して特異的なプローブの構築もまた、同様に困難であると考えられた。特に、ヌクレオチド配列が既知の２つの核酸のハイブリダイズのし易さは、融点（Ｔｍ）の計算によりある程度推定することはできるものの、この推定によって選択したプライマーとプローブとの組合せが、必ずしもＤＮＡ測定において好結果をもたらすわけではないことが知られていることより、現在知られている全てのヒトにおけるグルクロン酸抱合に関与する酵素について、之等を同時に区別して測定可能な、上記ＰＣＲによるリアルタイム検出用の各プライマー対とプローブとの組合せの選択には、熟練者の試行錯誤による多大な実験等が必要となると予想された。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、ヒトにおけるグルクロン酸抱合に関与する酵素のＰＣＲによる測定法、特にリアルタイム検出法の確立と、そのためのプローブ及びプライマー対を提供することにある。
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決すべくヒトにおけるグルクロン酸抱合に関与する酵素について多大な実験、研究を繰返し行った結果、１２種類の各酵素に対する目的のプライマー対及びプローブの組合せを提供することに成功し、ここに下記要旨の本発明を完成するに至った。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明によれば、ヒトにおけるグルクロン酸抱合に関与する酵素の測定に用いられるプローブであって、下記(1)〜(12)の各領域のそれぞれにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドから選ばれることを特徴とするプローブ；特にリポーター色素とクエンチャー色素とが結合している該プローブ；塩基配列の長さが２０〜４０である該プローブ；配列番号１〜配列番号１２に示される配列のいずれかを含む該プローブ並びに配列番号１〜配列番号１２に示される配列のいずれかである該プローブが提供される。
(1)ＵＧＴ１遺伝子の５６０〜５８７の領域
(2)ＵＧＴ１Ａ７遺伝子の２９０〜３１７の領域
(3)ＵＧＴ１Ａ９遺伝子の２３１〜２６０の領域
(4)ＵＧＴ１Ａ１０遺伝子の３０３〜３４１の領域
(5)ＵＧＴ２Ａ１遺伝子の１８２〜２１０の領域
(6)ＵＧＴ２Ｂ７遺伝子の７６〜４７の領域
(7)ＵＧＴ２Ｂ１０遺伝子の８３〜５７の領域
(8)ＵＧＴ２Ｂ１１遺伝子の２０１〜２３４の領域
(9)ＵＧＴ２Ｂ１５遺伝子の６３〜８９の領域
(10)ＵＧＴ２Ｂ１７遺伝子の７２〜９７の領域
(11)ＤＤＯＳＴ遺伝子の３１８〜３４３の領域
(12)ＵＧＴ８遺伝子の２０９〜２３７の領域
【００１３】
また、本発明によれば、ヒトにおけるグルクロン酸抱合に関与する酵素をコードする遺伝子の下記各領域にそれぞれハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーとリバースプライマーとのプライマー対、及び上記両プライマーに挟まれた下記領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるプローブの組合せから選ばれる、下記(1)〜(12)の、ヒトにおけるグルクロン酸抱合に関与する酵素の測定キット；特にプローブが更にリポーター色素とクエンチャー色素とを結合させたものである上記測定キットが提供される。
(1)プライマー対；ＵＧＴ１遺伝子の531-553領域及び639-619領域、プローブ；560-587領域
(2)プライマー対；ＵＧＴ１Ａ７遺伝子の265-286領域及び518-498領域、プローブ；290-317領域
(3)プライマー対；ＵＧＴ１Ａ９遺伝子の174-192領域及び352-327領域、プローブ；231-260領域
(4)プライマー対；ＵＧＴ１Ａ１０遺伝子の216-242領域及び455-430領域、プローブ；303-341領域
(5)プライマー対；ＵＧＴ２Ａ１遺伝子の159-180領域及び315-293領域、プローブ；182-210領域
(6)プライマー対；ＵＧＴ２Ｂ７遺伝子の14-42領域及び98-80領域、プローブ；76-47領域
(7)プライマー対；ＵＧＴ２Ｂ１０遺伝子の10-36領域及び106-87領域、プローブ；83-57領域
(8)プライマー対；ＵＧＴ２Ｂ１１遺伝子の17-43領域及び302-279領域、プローブ；201-234領域
(9)プライマー対；ＵＧＴ２Ｂ１５遺伝子の32-60領域及び299-271領域、プローブ；63-89領域
(10)プライマー対；ＵＧＴ２Ｂ１７遺伝子の40-66領域及び201-177領域、プローブ；72-97領域
(11)プライマー対；ＤＤＯＳＴ遺伝子の294-314領域及び447-427領域、プローブ；318-343領域
(12)プライマー対；ＵＧＴ８遺伝子の177-197領域及び358-338領域、プローブ；209-237領域
【００１４】
上記キットを構成するプライマー対とプローブとの組合せ（セット）の好ましいものとしては、下記(1)〜(12)から選ばれる各配列番号で示される配列を含むもの、より好ましくは各配列番号で示される配列のものを挙げることができる。(1)プライマー対；配列番号１３及び１４、プローブ；配列番号１
(2)プライマー対；配列番号１５及び１６、プローブ；配列番号２
(3)プライマー対；配列番号１７及び１８、プローブ；配列番号３
(4)プライマー対；配列番号１９及び２０、プローブ；配列番号４
(5)プライマー対；配列番号２１及び２２、プローブ；配列番号５
(6)プライマー対；配列番号２３及び２４、プローブ；配列番号６
(7)プライマー対；配列番号２５及び２６、プローブ；配列番号７
(8)プライマー対；配列番号２７及び２８、プローブ；配列番号８
(9)プライマー対；配列番号２９及び３０、プローブ；配列番号９
(10)プライマー対；配列番号３１及び３２、プローブ；配列番号１０
(11)プライマー対；配列番号３３及び３４、プローブ；配列番号１１
(12)プライマー対；配列番号３５及び３６、プローブ；配列番号１２
【００１５】
また、上記各セットはそれぞれ以下のグルクロン酸抱合に関与する酵素の測定用であることができる。
(1)のセット；ＵＧＴ１測定用
(2)のセット；ＵＧＴ１Ａ７測定用
(3)のセット；ＵＧＴ１Ａ９測定用
(4)のセット；ＵＧＴ１Ａ１０測定用
(5)のセット；ＵＧＴ２Ａ１測定用
(6)のセット；ＵＧＴ２Ｂ７測定用
(7)のセット；ＵＧＴ２Ｂ１０測定用
(8)のセット；ＵＧＴ２Ｂ１１測定用
(9)のセット；ＵＧＴ２Ｂ１５測定用
(10)のセット；ＵＧＴ２Ｂ１７測定用
(11)のセット；ＤＤＯＳＴ測定用
(12)のセット；ＵＧＴ８測定用
本発明によれば、更にヒトにおけるグルクロン酸抱合に関与する酵素の遺伝子を含む検体について、上記いずれかに記載の測定キットを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲを含む）を行い、用いたプローブの加水分解の有無を測定することを特徴とするヒトにおけるグルクロン酸抱合に関与する酵素の測定方法、特に上記加水分解の有無が、励起光照射による蛍光の発色の有無によりなされる上記測定方法が提供される。
【００１６】
より詳しくは、フォーワードプライマー及びリバースプライマーのプライマー対並びにレポーター色素とクエンチャー色素を有し上記両プライマーに挟まれた領域内で鋳型核酸とハイブリダイズするプローブを用いて、５′−３′エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼによりポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことによって、ヒトにおけるグルクロン酸抱合に関与する酵素の遺伝子を測定するリアルタイム検出方法が提供される。
【００１７】
本発明に係わるヒトにおける第II相反応に関与する酵素のリアルタイム検出方法は、同一ＰＣＲ乃至ＲＴ−ＰＣＲ反応条件下にリアルタイムで簡便且つ迅速に、各種酵素を分別定量できるものであり、その確立は、臨床分野、医薬品分野において非常に有益である。例えば、本発明方法によって、医薬品開発における動態試験において重要な位置を占める薬物代謝のグルクロン酸抱合に関与する酵素のヒト試料中でのｍＲＮＡの発現を容易に定量することができる。これによって、医薬品等の化学物質に曝露された場合のグルクロン酸抱合に関与する各酵素の変化を知ることができる。
【００１８】
また、手術で摘出した組織やバイオプシーにより摘出した組織中のグルクロン酸抱合に関与する酵素のｍＲＮＡ発現を見る上で、迅速且つ多種の試料を処理でき、また、僅かな組織片から抽出した全ＲＮＡで検出可能である。
【００１９】
更に、特定のグルクロン酸抱合に関与する酵素においては、肝臓、腎臓等での酵素誘導などによる発現量の変化が血液中（血液に含まれる核を有する細胞）の値の変化と相関する可能性が考えられるが、この血液中の発現量は小さく、測定には多くの血液を必要とする。しかし、本発明者の設計したプライマーとプローブを用いれば少ないサンプルで測定が可能である機器での測定が可能であり、血液中の発現量を測定することに有用である。また、特定のグルクロン酸抱合に関与する酵素においては、肝臓、腎臓等での酵素誘導などによる発現量の変化が唾液中など分泌液中に含まれる核を有する細胞の値の変化と相関する可能性が考えられるが、この唾液中など分泌液中に含まれる核を有する細胞中の発現量は小さく、測定には多くの唾液などの分泌液を必要とする。しかし、本発明者の設計したプライマーとプローブを用いれば少ないサンプルで測定が可能である機器での測定が可能であり、唾液中などの発現量を測定することに有用である。
【００２０】
以下、本発明方法に利用するプローブ及びプライマー対につき詳述すれば、之等各プローブ及びプライマーは、上述した通り、グルクロン酸抱合に関与する酵素の遺伝子の特定領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドから選択される。
【００２１】
ここで「ハイブリダイズする」とは、後述するＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）の条件でハイブリダイズすることをいう。
【００２２】
本発明に係わるプローブ及びプライマーに共通する要件としては、増幅生成物が５０〜４００塩基対の長さであること、プライマーとプローブができる限り近接していること、配列に含まれるＧ（グアニン）及びＣ（シトシン）の割合がなるべく５０％前後であること、Ｇ（グアニン）が４つ以上連続していないことを挙げることができる。また、その他の本発明プローブにみられる要件としてはＴｍ値が７０℃前後であることを挙げることができ、同様にプライマーにはＴｍ値が６０℃前後であることを挙げることができる。
【００２３】
グルクロン酸抱合に関与する各酵素のｍＲＮＡ配列は公知であり、それぞれジーンバンク（GenBank）に以下の登録番号で登録されている。
(1)ＵＧＴ１遺伝子；ＮＭ＿００１０７２
(2)ＵＧＴ１Ａ７遺伝子；Ｕ８９５０７
(3)ＵＧＴ１Ａ９遺伝子；ＡＦ０５６１８８
(4)ＵＧＴ１Ａ１０遺伝子；Ｕ８９５０８
(5)ＵＧＴ２Ａ１遺伝子；ＮＭ＿００６７９８
(6)ＵＧＴ２Ｂ７遺伝子；ＮＭ＿００１０７４
(7)ＵＧＴ２Ｂ１０遺伝子；ＮＭ＿００１０７５
(8)ＵＧＴ２Ｂ１１遺伝子；ＮＭ＿００１０７３
(9)ＵＧＴ２Ｂ１５遺伝子；ＮＭ＿００１０７６
(10)ＵＧＴ２Ｂ１７遺伝子；ＮＭ＿００１０７７
(11)ＤＤＯＳＴ遺伝子；ＮＭ＿００５２１６
(12)ＵＧＴ８遺伝子；ＮＭ＿００３３６０
【００２４】
本明細書において、各酵素の特定領域の表示は、いずれも上記各登録番号で登録された遺伝子の配列に従うものである。
【００２５】
之等各プライマー及びプローブ用のオリゴヌクレオチドのヌクレオチド数は、少なくとも１５個、通常１５〜５０個、好ましくは２０〜４０個の範囲にあるのがよい。之等プライマー及びプローブのヌクレオチド数が上記よりあまりに多くなりすぎると、１本鎖ＤＮＡにハイブリダイズしにくくなり、逆にあまりに小さすぎると、ハイブリダイゼーションの特異性が低下する。
【００２６】
プライマー及びプローブの特定のヌクレオチド配列の好ましい具体的配列の例は、前述したとおり、各分子種に応じてそれぞれ、配列番号１〜２８（プローブの場合）並びに配列番号２９〜８４（プライマーの場合）に示されるとおりである。
【００２７】
尚、例えば２０ヌクレオチドからなるプライマー又はプローブは、鋳型鎖との間に少数のミスマッチが存在してもハイブリダイズし、ＰＣＲのプライマーとして又は検出用プローブとして機能し得ることが知られている。従って本発明プライマー及びプローブもまた、上記の特定のヌクレオチド配列を有するものに限定されず、これをその一部として含むものや、この配列中の例えば２個以下のヌクレオチドの置換、欠失及び／又は付加による修飾のなされた配列を包含することができる。
【００２８】
上記本発明プローブ及びプライマーとしての各オリゴヌクレオチドは、常法に従い、自動合成機、例えばＤＮＡシンセサイザー（パーキンエルマー社）等を用いて容易に合成することができ、得られるオリゴヌクレオチドは更に必要に応じて、市販の精製用カートリッジ等を用いて精製することもできる。
【００２９】
本発明のリアルタイム検出用プローブは、その一端、例えば５′−末端にレポーター色素を結合しており、そして他端、例えば３′−末端にクエンチャー色素を結合している。レポーター色素は、例えば励起光の照射によって蛍光を発する物質であり、クエンチャーは、該レポーター色素に距離的に接近して存在する場合レポーター色素に作用してその蛍光の発生を消去する作用を有するものであることができる。該レポーター色素の例としては、例えば６−カルボキシ−フルオレッセイン（ＦＡＭ）、テトラクロロ−６−カルボキシフルオレッセイン（ＴＥＴ）、２，７−ジメトキシ−４，５−ジクロロ−６−カルボキシフルオレッセイン（ＪＯＥ）、ヘキソクロロ−６−カルボキシフルオレッセイン（ＨＥＸ）等が挙げられる。クエンチャー色素の例としては、例えば６−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン（ＴＡＭＲＡ）等が挙げられる。
【００３０】
本発明プローブは、前記特定配列のプローブ用オリゴヌクレオチドにレポーター色素及びクエンチャー色素を結合させることにより調製できる。例えばプローブの５′側は、通常数個のメチレン鎖をリンカーとし、末端のリン酸基にＦＡＭ分子をリン酸エステルの形で結合させることができる。また、３′側には、下記に示す構造単位を介してアミド結合によりＴＡＭＲＡ分子を結合させ得る。
【００３１】
【化１】
【００３２】
以下、本発明プライマー対及びプローブを利用したＰＣＲによるリアルタイム検出法につき詳述する。
【００３３】
本発明方法は、前述した本発明プライマー対及びプローブを利用することを必須として、他は公知のＰＣＲ法（例えば、Science, 230, 1350 (1985)参照）、ＲＴ−ＰＣＲ（Genome Res., 6(10), 986 (1996)参照）等、特にリアルタイム検出法（例えばTaqMan PCR, ABI PRISMTM 7700 SEQUENCE DETECTION SYSTEM, Applied Biosystems, Ver1, June 1996参照）に従い実施することができる。
【００３４】
該方法は、特に本発明が対象とするグルクロン酸抱合に関与する各酵素の発現量の測定方法として、ｍＲＮＡを測定する場合に有用である。この場合、特定酵素を発現している生体組織を採取し、常法に従って全ＲＮＡを抽出し、次にそれに対して相補性のｃＤＮＡを常法に従って合成した後、本発明プライマー対とプローブとを用いて、ＰＣＲを行えばよい。また、常法に従って全ＲＮＡを抽出後、本発明プライマーとプローブとを用いて、直接ＲＴ−ＰＣＲを行なうこともできる。
【００３５】
ＰＣＲ反応、ＲＴ−ＰＣＲ反応は、基本的には公知の方法に従うことができる。それらの反応条件も公知の方法に準じて適宜決定することができ、特に異なるものではない。具体的には、後記実施例に示す条件を好ましく採用できる。
【００３６】
検出も、基本的には常法に従って、例えば、アルゴンレーザ光をＰＣＲ反応液に照射し、放射される蛍光をＣＣＤカメラを用いて検出することにより行なうことができる。
【００３７】
かくして、本発明方法の実施によって、所期のグルクロン酸抱合に関与する各酵素を容易且つ迅速に、しかも各酵素毎に区別して測定、検出することができる。
【００３８】
本発明は更に、上記方法の実施のためのキットをも提供する。このキットは上記プライマー対及びプローブを含んでなる。本発明キットには、対照として使用することのできる既知の核酸や、該核酸を測定するためのプライマー対及びプローブを更に含んでいてもよい。
【００３９】
本発明方法によれば、グルクロン酸抱合に関与する各酵素の遺伝子をその酵素毎に分別して測定、検出できるため、これによって、グルクロン酸抱合に関与する各酵素の定量が迅速に、精度よく行なうことができる。かくして、新薬の他剤との相互作用や配合禁忌等に関連する基礎データーを効率よく得ることができる。
【００４０】
【実施例】
以下、本発明を更に詳しく説明するため試験例を挙げる。
【００４１】
【試験例】
リアルタイム検出法による検量線の作成
(1)試験方法
本試験で採用したリアルタイムワンステップＲＴ−ＰＣＲ法は、９６ウエルを用いて、最大９６の異なった反応を同時に実施して、一度に最大９６の検体を測定できるものである。また、１チューブ内でＲＴ反応とＰＣＲ反応とを行なうことができる。
【００４２】
本定量の原理は、隣接した２種類の蛍光色素を用いて、一方の色素（リポーター色素）の蛍光波長と他方の色素（クエンチャー色素）の励起光波長との間で、波長領域が重なる場合に生じるＦＲＥＴを利用したものである。ＦＲＥＴを生じる２種の蛍光色素を両末端に結合させたプローブ（TaqMan probe）がＰＣＲで増幅した特定のＵＤＰ−グリコシル転移酵素由来のｃＤＮＡにハイブリダイゼーションし、この状態でＰＣＲの伸長反応が始まり、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの有する５’−３’エンドヌクレアーゼ活性によってＴａｑＭａｎプローブが加水分解され、リポーター色素が脱離し、クエンチャー色素との間の物理的距離が生じ、ＦＲＥＴによって抑制されていたリポーター色素の蛍光強度が増加し、この蛍光強度の増加はＰＣＲの増幅産物の増加量に比例するため、これをＰＣＲ反応毎に測定することによって、所望の定量が可能となる。
【００４３】
本試験では、プローブの５’末端側にはリポーター色素としてＦＡＭを、３’末端側にはクエンチャー色素としてＴＡＭＲＡを使用した。之等各色素の結合及びこれによるＴａｑＭａｎプローブの作成は、文献記載の方法（Genome Res., 6(10), 986 (1996)）に従って行なった。
【００４４】
また、各プライマー及びプローブとしてのオリゴヌクレオチドは、自動シンセサイザーとしてＡＢＩ社製のＤＮＡ／ＲＮＡ合成機を利用して、基質（ｄＮＴＰ）及び規定の試薬を用いて合成した。
【００４５】
検体ＲＮＡとしては、成人の脳、成人の腎臓、成人の肺、成人の小腸、胎児の肝臓、成人の肝臓プールより精製された全ＲＮＡを用いた。尚、之等の全ＲＮＡはいずれもクローンテック社（Clontech Laboratories, Inc.）より購入した。
【００４６】
成人の脳、成人の腎臓、成人の肺、成人の小腸、胎児の肝臓、成人の肝臓プールより精製された全ＲＮＡは、ＲＮａｓｅフリーの水で希釈し、２０μｇ／ｍＬとした。その後、これら６種類を等量ずつ混合し、検量線作成用とした。以後は、５０μｇ／ｍＬのイーストｔＲＮＡ（Yeast tRNA, GIBCO社製）を用いて、５倍公比で希釈した。測定には５μＬを使用した。
【００４７】
ＲＴ−ＰＣＲ反応は、３００ｎＭフォーワードプライマー、９００ｎＭリバースプライマー及び２００ｎＭ TaqManプローブを含むTaqMan One-Step RT-PCR Master Mix Reagents Kit (PE Applied Biosystems)を用いて、５０μＬ／チューブの系で、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭTM７７００ Sequence Detection System（PE Applied Biosystems）にて行なった。
温度条件は、４８℃で３０分間、９５℃で１０分間で保温した後、９５℃で１５秒間、６０℃で１分間のサイクルを５０回行い、各サイクルごとに蛍光強度を測定した。
【００４８】
(2)試験結果
下記表１に示す各酵素に対して各配列番号に示される配列のプライマー対及びプローブを用いて行なった上記試験の結果（検量線）を表２に示す。
【００４９】
【表１】
【００５０】
【表２】
【００５１】
上記表２より、１０００００ｐｇ全ＲＮＡ／５０μＬ反応液量から５倍公比で希釈された検量線を作成したところ、ＵＧＴ１については、３２ｐｇ全ＲＮＡ／５０μＬ反応液量まで定量性を有しており、他の酵素についても１．２８ｐｇから４０００ｐｇ全ＲＮＡを定量下限とした検量線の相関係数（ｒ）は０．９９以上であった。
【００５２】
【配列表】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒトにおけるグルクロン酸抱合に関与する酵素の測定方法及びそのためのプローブ及びキットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
薬物代謝第II相反応の一種であるグルクロン酸抱合は、グルクロン酸転移酵素（UDP-glucuronosyltransferase，ＵＧＴ）によって触媒されることはよく知られている。
【０００３】
ところで、新薬を開発する上で、該新薬を投与した際のグルクロン酸抱合に関与する酵素の動き（発現量の増減）を把握することは重要である。何故なら、グルクロン酸抱合に関与する酵素の変動が判らないと、該新薬と併用される併用薬剤の効力や副作用の増減或いは併用薬剤や他の摂取物による新薬の効力や副作用の増減が予測できず、該新薬の安全性を確認することができないからである。
【０００４】
そこで、上記新薬開発等の分野においては、かかるヒトにおけるグルクロン酸抱合に関与する酵素に関する情報、殊に之等各分子種を区別して測定できる測定技術の開発が、要望されている。かかる技術が開発できれば、例えば、新薬の他剤との相互作用や特殊病態時における影響等が容易に把握でき、該新薬の副作用に関する有用な情報を得ることができ、かくして新薬の安全性を確保することができる。
【０００５】
一方、ポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）は、核酸の増幅法として広く知られており、例えばＲＴ−ＰＣＲ（Reverse Transcription-PCR）、コンペティティブＲＴ−ＰＣＲ等が微量のｍＲＮＡの検出、定量に威力を発揮している。
【０００６】
近年、ＰＣＲを利用したリアルタイム定量検出法が確立された（Taq Man PCR (Genome Res., 6(10), 986 (1996)), ABI PRISMTM Sequence Detection System (Applied Biosystems社)）。これは、特定の蛍光標識プローブ（TaqMan prove）を用いて核酸を測定する方法である。より詳しくは、例えば５’末端にリポーター色素及び３’末端にクエンチャー色素を付加して蛍光標識したプローブをターゲットＤＮＡにアニールさせた状態で、通常のＰＣＲ反応を行なわせると、伸長反応の進行に伴って、ＤＮＡポリメラーゼの有する５′−３′エキソヌクレアーゼ活性により、上記プローブが５’末端から加水分解される。その結果、５’末端のリポーター色素が３’末端のクエンチャー色素から離れ、これにより、当初一定の空間的距離を保っていたことによるＦＲＥＴ（Fluoresence Resonance Energy Transfer, 両蛍光色素の共鳴によるリポーター色素のエネルギー順位の低下に基づく蛍光強度の低下現象）効果がなくなり、クエンチャー色素により制御されていたリポーター色素の蛍光強度が増加し、かくして、該蛍光強度の増加を測定することによって、ターゲット核酸をリアルタイムに選択的に定量検出できるのである。この方法によれば、ＰＣＲ反応後に増幅物を例えばアガロースゲル電気泳動して、泳動パターンを解析する等の複雑な工程が不要となり、短時間で且つ同時に多種のサンプルを定量できる利点がある。
【０００７】
しかして、一般に、臨床検査センター等で臨床検査を行う場合には、非常に多数の検体について限られた時間内に検査をする必要があり、検査を効率良く行い得る手法の開発が要望されており、上記リアルタイム検出法は、この要望に合致するものとして期待できる。
【０００８】
本発明者らは、上記ＰＣＲによるリアルタイム検出法に着目し、これがヒトグルクロン酸抱合に関与する酵素の検出に利用できれば、同じ装置を用いて同時に同一のＰＣＲ条件で上記各酵素を区別して測定、検出できるとの着想から、鋭意研究を重ねた。
【０００９】
しかるに、現在知られている化学物質を代謝するヒトにおけるグルクロン酸抱合に関与する酵素は、前述したとおり約１５種にも及び、それぞれのｍＲＮＡの配列は知られているものの、之等をターゲット遺伝子として、互いに重複する配列部分を有さず、しかも同一ＰＣＲ条件で充分に増幅し得、更に、該ターゲット遺伝子の特定位置にハイブリダイズし得る各プライマー対としてのオリゴヌクレオチドの検索自体困難であると考えられた。また、かかるプライマー対に挟まれた特定領域に、同一ＰＣＲ条件下に之等のプライマーよりも早くハイブリダイズし得、しかもヒトにおけるグルクロン酸抱合に関与する各酵素に対して特異的なプローブの構築もまた、同様に困難であると考えられた。特に、ヌクレオチド配列が既知の２つの核酸のハイブリダイズのし易さは、融点（Ｔｍ）の計算によりある程度推定することはできるものの、この推定によって選択したプライマーとプローブとの組合せが、必ずしもＤＮＡ測定において好結果をもたらすわけではないことが知られていることより、現在知られている全てのヒトにおけるグルクロン酸抱合に関与する酵素について、之等を同時に区別して測定可能な、上記ＰＣＲによるリアルタイム検出用の各プライマー対とプローブとの組合せの選択には、熟練者の試行錯誤による多大な実験等が必要となると予想された。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、ヒトにおけるグルクロン酸抱合に関与する酵素のＰＣＲによる測定法、特にリアルタイム検出法の確立と、そのためのプローブ及びプライマー対を提供することにある。
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決すべくヒトにおけるグルクロン酸抱合に関与する酵素について多大な実験、研究を繰返し行った結果、１２種類の各酵素に対する目的のプライマー対及びプローブの組合せを提供することに成功し、ここに下記要旨の本発明を完成するに至った。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明によれば、ヒトにおけるグルクロン酸抱合に関与する酵素の測定に用いられるプローブであって、下記(1)〜(12)の各領域のそれぞれにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドから選ばれることを特徴とするプローブ；特にリポーター色素とクエンチャー色素とが結合している該プローブ；塩基配列の長さが２０〜４０である該プローブ；配列番号１〜配列番号１２に示される配列のいずれかを含む該プローブ並びに配列番号１〜配列番号１２に示される配列のいずれかである該プローブが提供される。
(1)ＵＧＴ１遺伝子の５６０〜５８７の領域
(2)ＵＧＴ１Ａ７遺伝子の２９０〜３１７の領域
(3)ＵＧＴ１Ａ９遺伝子の２３１〜２６０の領域
(4)ＵＧＴ１Ａ１０遺伝子の３０３〜３４１の領域
(5)ＵＧＴ２Ａ１遺伝子の１８２〜２１０の領域
(6)ＵＧＴ２Ｂ７遺伝子の７６〜４７の領域
(7)ＵＧＴ２Ｂ１０遺伝子の８３〜５７の領域
(8)ＵＧＴ２Ｂ１１遺伝子の２０１〜２３４の領域
(9)ＵＧＴ２Ｂ１５遺伝子の６３〜８９の領域
(10)ＵＧＴ２Ｂ１７遺伝子の７２〜９７の領域
(11)ＤＤＯＳＴ遺伝子の３１８〜３４３の領域
(12)ＵＧＴ８遺伝子の２０９〜２３７の領域
【００１３】
また、本発明によれば、ヒトにおけるグルクロン酸抱合に関与する酵素をコードする遺伝子の下記各領域にそれぞれハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーとリバースプライマーとのプライマー対、及び上記両プライマーに挟まれた下記領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるプローブの組合せから選ばれる、下記(1)〜(12)の、ヒトにおけるグルクロン酸抱合に関与する酵素の測定キット；特にプローブが更にリポーター色素とクエンチャー色素とを結合させたものである上記測定キットが提供される。
(1)プライマー対；ＵＧＴ１遺伝子の531-553領域及び639-619領域、プローブ；560-587領域
(2)プライマー対；ＵＧＴ１Ａ７遺伝子の265-286領域及び518-498領域、プローブ；290-317領域
(3)プライマー対；ＵＧＴ１Ａ９遺伝子の174-192領域及び352-327領域、プローブ；231-260領域
(4)プライマー対；ＵＧＴ１Ａ１０遺伝子の216-242領域及び455-430領域、プローブ；303-341領域
(5)プライマー対；ＵＧＴ２Ａ１遺伝子の159-180領域及び315-293領域、プローブ；182-210領域
(6)プライマー対；ＵＧＴ２Ｂ７遺伝子の14-42領域及び98-80領域、プローブ；76-47領域
(7)プライマー対；ＵＧＴ２Ｂ１０遺伝子の10-36領域及び106-87領域、プローブ；83-57領域
(8)プライマー対；ＵＧＴ２Ｂ１１遺伝子の17-43領域及び302-279領域、プローブ；201-234領域
(9)プライマー対；ＵＧＴ２Ｂ１５遺伝子の32-60領域及び299-271領域、プローブ；63-89領域
(10)プライマー対；ＵＧＴ２Ｂ１７遺伝子の40-66領域及び201-177領域、プローブ；72-97領域
(11)プライマー対；ＤＤＯＳＴ遺伝子の294-314領域及び447-427領域、プローブ；318-343領域
(12)プライマー対；ＵＧＴ８遺伝子の177-197領域及び358-338領域、プローブ；209-237領域
【００１４】
上記キットを構成するプライマー対とプローブとの組合せ（セット）の好ましいものとしては、下記(1)〜(12)から選ばれる各配列番号で示される配列を含むもの、より好ましくは各配列番号で示される配列のものを挙げることができる。(1)プライマー対；配列番号１３及び１４、プローブ；配列番号１
(2)プライマー対；配列番号１５及び１６、プローブ；配列番号２
(3)プライマー対；配列番号１７及び１８、プローブ；配列番号３
(4)プライマー対；配列番号１９及び２０、プローブ；配列番号４
(5)プライマー対；配列番号２１及び２２、プローブ；配列番号５
(6)プライマー対；配列番号２３及び２４、プローブ；配列番号６
(7)プライマー対；配列番号２５及び２６、プローブ；配列番号７
(8)プライマー対；配列番号２７及び２８、プローブ；配列番号８
(9)プライマー対；配列番号２９及び３０、プローブ；配列番号９
(10)プライマー対；配列番号３１及び３２、プローブ；配列番号１０
(11)プライマー対；配列番号３３及び３４、プローブ；配列番号１１
(12)プライマー対；配列番号３５及び３６、プローブ；配列番号１２
【００１５】
また、上記各セットはそれぞれ以下のグルクロン酸抱合に関与する酵素の測定用であることができる。
(1)のセット；ＵＧＴ１測定用
(2)のセット；ＵＧＴ１Ａ７測定用
(3)のセット；ＵＧＴ１Ａ９測定用
(4)のセット；ＵＧＴ１Ａ１０測定用
(5)のセット；ＵＧＴ２Ａ１測定用
(6)のセット；ＵＧＴ２Ｂ７測定用
(7)のセット；ＵＧＴ２Ｂ１０測定用
(8)のセット；ＵＧＴ２Ｂ１１測定用
(9)のセット；ＵＧＴ２Ｂ１５測定用
(10)のセット；ＵＧＴ２Ｂ１７測定用
(11)のセット；ＤＤＯＳＴ測定用
(12)のセット；ＵＧＴ８測定用
本発明によれば、更にヒトにおけるグルクロン酸抱合に関与する酵素の遺伝子を含む検体について、上記いずれかに記載の測定キットを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲを含む）を行い、用いたプローブの加水分解の有無を測定することを特徴とするヒトにおけるグルクロン酸抱合に関与する酵素の測定方法、特に上記加水分解の有無が、励起光照射による蛍光の発色の有無によりなされる上記測定方法が提供される。
【００１６】
より詳しくは、フォーワードプライマー及びリバースプライマーのプライマー対並びにレポーター色素とクエンチャー色素を有し上記両プライマーに挟まれた領域内で鋳型核酸とハイブリダイズするプローブを用いて、５′−３′エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼによりポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことによって、ヒトにおけるグルクロン酸抱合に関与する酵素の遺伝子を測定するリアルタイム検出方法が提供される。
【００１７】
本発明に係わるヒトにおける第II相反応に関与する酵素のリアルタイム検出方法は、同一ＰＣＲ乃至ＲＴ−ＰＣＲ反応条件下にリアルタイムで簡便且つ迅速に、各種酵素を分別定量できるものであり、その確立は、臨床分野、医薬品分野において非常に有益である。例えば、本発明方法によって、医薬品開発における動態試験において重要な位置を占める薬物代謝のグルクロン酸抱合に関与する酵素のヒト試料中でのｍＲＮＡの発現を容易に定量することができる。これによって、医薬品等の化学物質に曝露された場合のグルクロン酸抱合に関与する各酵素の変化を知ることができる。
【００１８】
また、手術で摘出した組織やバイオプシーにより摘出した組織中のグルクロン酸抱合に関与する酵素のｍＲＮＡ発現を見る上で、迅速且つ多種の試料を処理でき、また、僅かな組織片から抽出した全ＲＮＡで検出可能である。
【００１９】
更に、特定のグルクロン酸抱合に関与する酵素においては、肝臓、腎臓等での酵素誘導などによる発現量の変化が血液中（血液に含まれる核を有する細胞）の値の変化と相関する可能性が考えられるが、この血液中の発現量は小さく、測定には多くの血液を必要とする。しかし、本発明者の設計したプライマーとプローブを用いれば少ないサンプルで測定が可能である機器での測定が可能であり、血液中の発現量を測定することに有用である。また、特定のグルクロン酸抱合に関与する酵素においては、肝臓、腎臓等での酵素誘導などによる発現量の変化が唾液中など分泌液中に含まれる核を有する細胞の値の変化と相関する可能性が考えられるが、この唾液中など分泌液中に含まれる核を有する細胞中の発現量は小さく、測定には多くの唾液などの分泌液を必要とする。しかし、本発明者の設計したプライマーとプローブを用いれば少ないサンプルで測定が可能である機器での測定が可能であり、唾液中などの発現量を測定することに有用である。
【００２０】
以下、本発明方法に利用するプローブ及びプライマー対につき詳述すれば、之等各プローブ及びプライマーは、上述した通り、グルクロン酸抱合に関与する酵素の遺伝子の特定領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドから選択される。
【００２１】
ここで「ハイブリダイズする」とは、後述するＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）の条件でハイブリダイズすることをいう。
【００２２】
本発明に係わるプローブ及びプライマーに共通する要件としては、増幅生成物が５０〜４００塩基対の長さであること、プライマーとプローブができる限り近接していること、配列に含まれるＧ（グアニン）及びＣ（シトシン）の割合がなるべく５０％前後であること、Ｇ（グアニン）が４つ以上連続していないことを挙げることができる。また、その他の本発明プローブにみられる要件としてはＴｍ値が７０℃前後であることを挙げることができ、同様にプライマーにはＴｍ値が６０℃前後であることを挙げることができる。
【００２３】
グルクロン酸抱合に関与する各酵素のｍＲＮＡ配列は公知であり、それぞれジーンバンク（GenBank）に以下の登録番号で登録されている。
(1)ＵＧＴ１遺伝子；ＮＭ＿００１０７２
(2)ＵＧＴ１Ａ７遺伝子；Ｕ８９５０７
(3)ＵＧＴ１Ａ９遺伝子；ＡＦ０５６１８８
(4)ＵＧＴ１Ａ１０遺伝子；Ｕ８９５０８
(5)ＵＧＴ２Ａ１遺伝子；ＮＭ＿００６７９８
(6)ＵＧＴ２Ｂ７遺伝子；ＮＭ＿００１０７４
(7)ＵＧＴ２Ｂ１０遺伝子；ＮＭ＿００１０７５
(8)ＵＧＴ２Ｂ１１遺伝子；ＮＭ＿００１０７３
(9)ＵＧＴ２Ｂ１５遺伝子；ＮＭ＿００１０７６
(10)ＵＧＴ２Ｂ１７遺伝子；ＮＭ＿００１０７７
(11)ＤＤＯＳＴ遺伝子；ＮＭ＿００５２１６
(12)ＵＧＴ８遺伝子；ＮＭ＿００３３６０
【００２４】
本明細書において、各酵素の特定領域の表示は、いずれも上記各登録番号で登録された遺伝子の配列に従うものである。
【００２５】
之等各プライマー及びプローブ用のオリゴヌクレオチドのヌクレオチド数は、少なくとも１５個、通常１５〜５０個、好ましくは２０〜４０個の範囲にあるのがよい。之等プライマー及びプローブのヌクレオチド数が上記よりあまりに多くなりすぎると、１本鎖ＤＮＡにハイブリダイズしにくくなり、逆にあまりに小さすぎると、ハイブリダイゼーションの特異性が低下する。
【００２６】
プライマー及びプローブの特定のヌクレオチド配列の好ましい具体的配列の例は、前述したとおり、各分子種に応じてそれぞれ、配列番号１〜２８（プローブの場合）並びに配列番号２９〜８４（プライマーの場合）に示されるとおりである。
【００２７】
尚、例えば２０ヌクレオチドからなるプライマー又はプローブは、鋳型鎖との間に少数のミスマッチが存在してもハイブリダイズし、ＰＣＲのプライマーとして又は検出用プローブとして機能し得ることが知られている。従って本発明プライマー及びプローブもまた、上記の特定のヌクレオチド配列を有するものに限定されず、これをその一部として含むものや、この配列中の例えば２個以下のヌクレオチドの置換、欠失及び／又は付加による修飾のなされた配列を包含することができる。
【００２８】
上記本発明プローブ及びプライマーとしての各オリゴヌクレオチドは、常法に従い、自動合成機、例えばＤＮＡシンセサイザー（パーキンエルマー社）等を用いて容易に合成することができ、得られるオリゴヌクレオチドは更に必要に応じて、市販の精製用カートリッジ等を用いて精製することもできる。
【００２９】
本発明のリアルタイム検出用プローブは、その一端、例えば５′−末端にレポーター色素を結合しており、そして他端、例えば３′−末端にクエンチャー色素を結合している。レポーター色素は、例えば励起光の照射によって蛍光を発する物質であり、クエンチャーは、該レポーター色素に距離的に接近して存在する場合レポーター色素に作用してその蛍光の発生を消去する作用を有するものであることができる。該レポーター色素の例としては、例えば６−カルボキシ−フルオレッセイン（ＦＡＭ）、テトラクロロ−６−カルボキシフルオレッセイン（ＴＥＴ）、２，７−ジメトキシ−４，５−ジクロロ−６−カルボキシフルオレッセイン（ＪＯＥ）、ヘキソクロロ−６−カルボキシフルオレッセイン（ＨＥＸ）等が挙げられる。クエンチャー色素の例としては、例えば６−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン（ＴＡＭＲＡ）等が挙げられる。
【００３０】
本発明プローブは、前記特定配列のプローブ用オリゴヌクレオチドにレポーター色素及びクエンチャー色素を結合させることにより調製できる。例えばプローブの５′側は、通常数個のメチレン鎖をリンカーとし、末端のリン酸基にＦＡＭ分子をリン酸エステルの形で結合させることができる。また、３′側には、下記に示す構造単位を介してアミド結合によりＴＡＭＲＡ分子を結合させ得る。
【００３１】
【化１】
以下、本発明プライマー対及びプローブを利用したＰＣＲによるリアルタイム検出法につき詳述する。
【００３３】
本発明方法は、前述した本発明プライマー対及びプローブを利用することを必須として、他は公知のＰＣＲ法（例えば、Science, 230, 1350 (1985)参照）、ＲＴ−ＰＣＲ（Genome Res., 6(10), 986 (1996)参照）等、特にリアルタイム検出法（例えばTaqMan PCR, ABI PRISMTM 7700 SEQUENCE DETECTION SYSTEM, Applied Biosystems, Ver1, June 1996参照）に従い実施することができる。
【００３４】
該方法は、特に本発明が対象とするグルクロン酸抱合に関与する各酵素の発現量の測定方法として、ｍＲＮＡを測定する場合に有用である。この場合、特定酵素を発現している生体組織を採取し、常法に従って全ＲＮＡを抽出し、次にそれに対して相補性のｃＤＮＡを常法に従って合成した後、本発明プライマー対とプローブとを用いて、ＰＣＲを行えばよい。また、常法に従って全ＲＮＡを抽出後、本発明プライマーとプローブとを用いて、直接ＲＴ−ＰＣＲを行なうこともできる。
【００３５】
ＰＣＲ反応、ＲＴ−ＰＣＲ反応は、基本的には公知の方法に従うことができる。それらの反応条件も公知の方法に準じて適宜決定することができ、特に異なるものではない。具体的には、後記実施例に示す条件を好ましく採用できる。
【００３６】
検出も、基本的には常法に従って、例えば、アルゴンレーザ光をＰＣＲ反応液に照射し、放射される蛍光をＣＣＤカメラを用いて検出することにより行なうことができる。
【００３７】
かくして、本発明方法の実施によって、所期のグルクロン酸抱合に関与する各酵素を容易且つ迅速に、しかも各酵素毎に区別して測定、検出することができる。
【００３８】
本発明は更に、上記方法の実施のためのキットをも提供する。このキットは上記プライマー対及びプローブを含んでなる。本発明キットには、対照として使用することのできる既知の核酸や、該核酸を測定するためのプライマー対及びプローブを更に含んでいてもよい。
【００３９】
本発明方法によれば、グルクロン酸抱合に関与する各酵素の遺伝子をその酵素毎に分別して測定、検出できるため、これによって、グルクロン酸抱合に関与する各酵素の定量が迅速に、精度よく行なうことができる。かくして、新薬の他剤との相互作用や配合禁忌等に関連する基礎データーを効率よく得ることができる。
【００４０】
【実施例】
以下、本発明を更に詳しく説明するため試験例を挙げる。
【００４１】
【試験例】
リアルタイム検出法による検量線の作成
(1)試験方法
本試験で採用したリアルタイムワンステップＲＴ−ＰＣＲ法は、９６ウエルを用いて、最大９６の異なった反応を同時に実施して、一度に最大９６の検体を測定できるものである。また、１チューブ内でＲＴ反応とＰＣＲ反応とを行なうことができる。
【００４２】
本定量の原理は、隣接した２種類の蛍光色素を用いて、一方の色素（リポーター色素）の蛍光波長と他方の色素（クエンチャー色素）の励起光波長との間で、波長領域が重なる場合に生じるＦＲＥＴを利用したものである。ＦＲＥＴを生じる２種の蛍光色素を両末端に結合させたプローブ（TaqMan probe）がＰＣＲで増幅した特定のＵＤＰ−グリコシル転移酵素由来のｃＤＮＡにハイブリダイゼーションし、この状態でＰＣＲの伸長反応が始まり、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの有する５’−３’エンドヌクレアーゼ活性によってＴａｑＭａｎプローブが加水分解され、リポーター色素が脱離し、クエンチャー色素との間の物理的距離が生じ、ＦＲＥＴによって抑制されていたリポーター色素の蛍光強度が増加し、この蛍光強度の増加はＰＣＲの増幅産物の増加量に比例するため、これをＰＣＲ反応毎に測定することによって、所望の定量が可能となる。
【００４３】
本試験では、プローブの５’末端側にはリポーター色素としてＦＡＭを、３’末端側にはクエンチャー色素としてＴＡＭＲＡを使用した。之等各色素の結合及びこれによるＴａｑＭａｎプローブの作成は、文献記載の方法（Genome Res., 6(10), 986 (1996)）に従って行なった。
【００４４】
また、各プライマー及びプローブとしてのオリゴヌクレオチドは、自動シンセサイザーとしてＡＢＩ社製のＤＮＡ／ＲＮＡ合成機を利用して、基質（ｄＮＴＰ）及び規定の試薬を用いて合成した。
【００４５】
検体ＲＮＡとしては、成人の脳、成人の腎臓、成人の肺、成人の小腸、胎児の肝臓、成人の肝臓プールより精製された全ＲＮＡを用いた。尚、之等の全ＲＮＡはいずれもクローンテック社（Clontech Laboratories, Inc.）より購入した。
【００４６】
成人の脳、成人の腎臓、成人の肺、成人の小腸、胎児の肝臓、成人の肝臓プールより精製された全ＲＮＡは、ＲＮａｓｅフリーの水で希釈し、２０μｇ／ｍＬとした。その後、これら６種類を等量ずつ混合し、検量線作成用とした。以後は、５０μｇ／ｍＬのイーストｔＲＮＡ（Yeast tRNA, GIBCO社製）を用いて、５倍公比で希釈した。測定には５μＬを使用した。
【００４７】
ＲＴ−ＰＣＲ反応は、３００ｎＭフォーワードプライマー、９００ｎＭリバースプライマー及び２００ｎＭ TaqManプローブを含むTaqMan One-Step RT-PCR Master Mix Reagents Kit (PE Applied Biosystems)を用いて、５０μＬ／チューブの系で、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭTM７７００ Sequence Detection System（PE Applied Biosystems）にて行なった。
温度条件は、４８℃で３０分間、９５℃で１０分間で保温した後、９５℃で１５秒間、６０℃で１分間のサイクルを５０回行い、各サイクルごとに蛍光強度を測定した。
【００４８】
(2)試験結果
下記表１に示す各酵素に対して各配列番号に示される配列のプライマー対及びプローブを用いて行なった上記試験の結果（検量線）を表２に示す。
【００４９】
【表１】
【表２】
上記表２より、１０００００ｐｇ全ＲＮＡ／５０μＬ反応液量から５倍公比で希釈された検量線を作成したところ、ＵＧＴ１については、３２ｐｇ全ＲＮＡ／５０μＬ反応液量まで定量性を有しており、他の酵素についても１．２８ｐｇから４０００ｐｇ全ＲＮＡを定量下限とした検量線の相関係数（ｒ）は０．９９以上であった。
【００５２】
【配列表】
Claims (7)
- 下記(1)〜(12)の、ヒトにおけるグルクロン酸抱合に関与する酵素をコードする遺伝子の下記各領域にそれぞれハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーとリバースプライマーとのプライマー対、及び上記両プライマーに挟まれた下記領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるプローブの組合せから選ばれる、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法に使用するための、ヒトにおけるグルクロン酸抱合に関与する酵素の測定キット。
(1)プライマー対；ＵＧＴ１遺伝子の531-553領域に特異的にハイブリダイズする塩基数 23 のオリゴヌクレオチド及び639-619領域に特異的にハイブリダイズする塩基数 21 のオリゴヌクレオチド、プローブ；560-587領域に特異的にハイブリダイズする塩基数 28 のオリゴヌクレオチド
(2)プライマー対；ＵＧＴ１Ａ７遺伝子の265-286領域に特異的にハイブリダイズする塩基数 22 のオリゴヌクレオチド及び518-498領域に特異的にハイブリダイズする塩基数 21 のオリゴヌクレオチド、プローブ；290-317領域に特異的にハイブリダイズする塩基数 28 のオリゴヌクレオチド
(3)プライマー対；ＵＧＴ１Ａ９遺伝子の174-192領域に特異的にハイブリダイズする塩基数 19 のオリゴヌクレオチド及び352-327領域に特異的にハイブリダイズする塩基数 26 のオリゴヌクレオチド、プローブ；231-260領域に特異的にハイブリダイズする塩基数 30 のオリゴヌクレオチド
(4)プライマー対；ＵＧＴ１Ａ１０遺伝子の216-242領域に特異的にハイブリダイズする塩基数 27 のオリゴヌクレオチド及び455-430領域に特異的にハイブリダイズする塩基数 26 のオリゴヌクレオチド、プローブ；303-341領域に特異的にハイブリダイズする塩基数 39 のオリゴヌクレオチド
(5)プライマー対；ＵＧＴ２Ａ１遺伝子の159-180領域に特異的にハイブリダイズする塩基数 22 のオリゴヌクレオチド及び315-293領域に特異的にハイブリダイズする塩基数 23 のオリゴヌクレオチド、プローブ；182-210領域に特異的にハイブリダイズする塩基数 29 のオリゴヌクレオチド
(6)プライマー対；ＵＧＴ２Ｂ７遺伝子の14-42領域に特異的にハイブリダイズする塩基数 29 のオリゴヌクレオチド及び98-80領域に特異的にハイブリダイズする塩基数 19 のオリゴヌクレオチド、プローブ；76-47領域に特異的にハイブリダイズする塩基数 30 のオリゴヌクレオチド
(7)プライマー対；ＵＧＴ２Ｂ１０遺伝子の10-36領域に特異的にハイブリダイズする塩基数 27 のオリゴヌクレオチド及び106-87領域に特異的にハイブリダイズする塩基数 20 のオリゴヌクレオチド、プローブ；83-57領域に特異的にハイブリダイズする塩基数 27 のオリゴヌクレオチド
(8)プライマー対；ＵＧＴ２Ｂ１１遺伝子の17-43領域に特異的にハイブリダイズする塩基数 27 のオリゴヌクレオチド及び302-279領域に特異的にハイブリダイズする塩基数 24 のオリゴヌクレオチド、プローブ；201-234領域に特異的にハイブリダイズする塩基数 34 のオリゴヌクレオチド
(9)プライマー対；ＵＧＴ２Ｂ１５遺伝子の32-60領域に特異的にハイブリダイズする塩基数 29 のオリゴヌクレオチド及び299-271領域に特異的にハイブリダイズする塩基数 29 のオリゴヌクレオチド、プローブ；63-89領域に特異的にハイブリダイズする塩基数 27 のオリゴヌクレオチド
(10)プライマー対；ＵＧＴ２Ｂ１７遺伝子の40-66領域に特異的にハイブリダイズする塩基数 27 のオリゴヌクレオチド及び201-177領域に特異的にハイブリダイズする塩基数 25 のオリゴヌクレオチド、プローブ；72-97領域に特異的にハイブリダイズする塩基数 26 のオリゴヌクレオチド
(11)プライマー対；ＤＤＯＳＴ遺伝子の294-314領域に特異的にハイブリダイズする塩基数 21 のオリゴヌクレオチド及び447-427領域に特異的にハイブリダイズする塩基数 21 のオ リゴヌクレオチド、プローブ；318-343領域に特異的にハイブリダイズする塩基数 26 のオリゴヌクレオチド
(12)プライマー対；ＵＧＴ８遺伝子の177-197領域に特異的にハイブリダイズする塩基数 21 のオリゴヌクレオチド及び358-338領域に特異的にハイブリダイズする塩基数 21 のオリゴヌクレオチド、プローブ；209-237領域に特異的にハイブリダイズする塩基数 29 のオリゴヌクレオチド
（但し、前記オリゴヌクレオチドは、４８℃で３０分間、９５℃で１０分間保温後、９５℃で１５秒間、６０℃で１分間のサイクルでＲＴ−ＰＣＲ反応を行ったときに、前記ハイブリダイズする）。 - プローブが、更にリポーター色素とクエンチャー色素とを結合させたものである請求項１に記載の測定キット。
- 下記(1)〜(12)に示されるセットの、各配列番号で示される配列のオリゴヌクレオチドからなるプライマー対とプローブとの組合せから選ばれる、請求項１または２に記載の測定キット。
(1)プライマー対；配列番号１３及び１４、プローブ；配列番号１
(2)プライマー対；配列番号１５及び１６、プローブ；配列番号２
(3)プライマー対；配列番号１７及び１８、プローブ；配列番号３
(4)プライマー対；配列番号１９及び２０、プローブ；配列番号４
(5)プライマー対；配列番号２１及び２２、プローブ；配列番号５
(6)プライマー対；配列番号２３及び２４、プローブ；配列番号６
(7)プライマー対；配列番号２５及び２６、プローブ；配列番号７
(8)プライマー対；配列番号２７及び２８、プローブ；配列番号８
(9)プライマー対；配列番号２９及び３０、プローブ；配列番号９
(10)プライマー対；配列番号３１及び３２、プローブ；配列番号１０
(11)プライマー対；配列番号３３及び３４、プローブ；配列番号１１
(12)プライマー対；配列番号３５及び３６、プローブ；配列番号１２ - 請求項３に記載の測定キットであって、(1)のセットがＵＧＴ１の測定用で、(2)のセットがＵＧＴ１Ａ７の測定用で、(3)のセットがＵＧＴ１Ａ９の測定用で、(4)のセットがＵＧＴ１Ａ１０の測定用で、(5)のセットがＵＧＴ２Ａ１の測定用で、(6)のセットがＵＧＴ２Ｂ７の測定用で、(7)のセットがＵＧＴ２Ｂ１０の測定用で、(8)のセットがＵＧＴ２Ｂ１１の測定用で、(9)のセットがＵＧＴ２Ｂ１５の測定用で、(10)のセットがＵＧＴ２Ｂ１７の測定用で、(11)のセットがＤＤＯＳＴの測定用で、(12)のセットがＵＧＴ８の測定用である測定キット。
- 請求項３に記載の(1)〜(12)に示されるセットの、各配列番号で示される配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマー対とプローブとの組合せから選ばれる、請求項３または４に記載の測定キット。
- ヒトにおけるグルクロン酸抱合に関与する酵素を含む検体について、請求項１〜５のいずれかに記載の測定キットを用いてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ反応を行い、用いたプローブの加水分解の有無を測定することを特徴とするヒトにおけるグルクロン酸抱合に関与する酵素の測定方法。
- 加水分解の有無が、励起光照射による蛍光の発色の有無によりなされる請求項６に記載の測定方法。
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