JP2002171991A - ヒトにおける有機アニオンおよびカチオントランスポーターの測定方法、そのためのプローブおよびキット - Google Patents
ヒトにおける有機アニオンおよびカチオントランスポーターの測定方法、そのためのプローブおよびキットInfo
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ヒトにおける有機アニオンおよびカチオント
ランスポーターを分別して定量する新しい測定技術およ
びそのためのプライマー対およびプローブを提供。 【解決手段】ヒトにおける有機アニオンおよびカチオン
トランスポーターの測定用プローブであって、例えばSL
C22A1遺伝子の426〜453の領域などの特定遺伝子の所定
領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなる
プローブ、該プローブと特定プライマー対との組合せか
らなる測定キット、及び該キットを用いてPCRを行い、
プローブの加水分解の有無を測定する上記トランスポー
ターの測定方法。
ランスポーターを分別して定量する新しい測定技術およ
びそのためのプライマー対およびプローブを提供。 【解決手段】ヒトにおける有機アニオンおよびカチオン
トランスポーターの測定用プローブであって、例えばSL
C22A1遺伝子の426〜453の領域などの特定遺伝子の所定
領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなる
プローブ、該プローブと特定プライマー対との組合せか
らなる測定キット、及び該キットを用いてPCRを行い、
プローブの加水分解の有無を測定する上記トランスポー
ターの測定方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ヒトにおける有機
アニオンおよびカチオントランスポーターの測定方法並
びにそのためのプローブおよび測定キットに関する。
アニオンおよびカチオントランスポーターの測定方法並
びにそのためのプローブおよび測定キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】生体には、正常な生理機能、細胞活動な
どを損なうおそれのある異物、薬物などが侵入した際、
これを速やかに体外に排除するための高度な生体防御シ
ステムが備わっている。この生体防御システムの一つが
肝臓、腎臓などの代謝・排泄を担う臓器であり、かかる
臓器では、異物、薬物などを認識し、これらおよびその
代謝物を排泄するための膜輸送担体としての異物、薬物
トランスポーター群が存在、発現している。
どを損なうおそれのある異物、薬物などが侵入した際、
これを速やかに体外に排除するための高度な生体防御シ
ステムが備わっている。この生体防御システムの一つが
肝臓、腎臓などの代謝・排泄を担う臓器であり、かかる
臓器では、異物、薬物などを認識し、これらおよびその
代謝物を排泄するための膜輸送担体としての異物、薬物
トランスポーター群が存在、発現している。
【０００３】上記異物、薬物トランスポーターとして
は、例えば有機アニオントランスポーター、有機カチオ
ントランスポーターなどの腎尿細管薬物トランスポータ
ー（乾賢一, BIO Clinica, 11: 22-25 (1996); Inui,
K., et al., Clin. Exper. Nephrol., 2, 100-108 (199
8)）、肝臓異物トランスポーター(Kobayashi, K., et a
l., J. Biol. Chem., 265, 7737-7741 (1990); Ishikaw
a, T., et al., J. Biol.Chem., 265, 19279-19286 (19
90); Hirohashi, T., et al., Mol. Pharmacol.,53, 10
68-1075 (1998))などが知られている。
は、例えば有機アニオントランスポーター、有機カチオ
ントランスポーターなどの腎尿細管薬物トランスポータ
ー（乾賢一, BIO Clinica, 11: 22-25 (1996); Inui,
K., et al., Clin. Exper. Nephrol., 2, 100-108 (199
8)）、肝臓異物トランスポーター(Kobayashi, K., et a
l., J. Biol. Chem., 265, 7737-7741 (1990); Ishikaw
a, T., et al., J. Biol.Chem., 265, 19279-19286 (19
90); Hirohashi, T., et al., Mol. Pharmacol.,53, 10
68-1075 (1998))などが知られている。
【０００４】有機アニオントランスポーターは、主に肝
細胞、尿細管上皮細胞に存在しており、イオン性薬物を
認識し能動的に細胞内に取り込む血液側側底膜トランス
ポーターと、細胞内の薬物やそれらの代謝産物を胆汁ま
たは尿中へ汲み出す胆管（管腔）側膜トランスポーター
とに大別できる。該有機アニオントランスポーターとし
ては、現在、Na+非依存性有機アニオントランスポータ
ー（oatp1, organic anion transporting polypeptid
e）の他、そのファミリーとして例えばoatp2、oatp3、O
AT-K1、OAT-K2、OAT1、OAT2などが知られている。一
方、有機カチオントランスポーターは、有機アニオン排
泄系とは機能的に独立した系として主に尿細管上皮細胞
に存在しており、これにはOCT1、OCT2、OCTN1などが含
まれる。
細胞、尿細管上皮細胞に存在しており、イオン性薬物を
認識し能動的に細胞内に取り込む血液側側底膜トランス
ポーターと、細胞内の薬物やそれらの代謝産物を胆汁ま
たは尿中へ汲み出す胆管（管腔）側膜トランスポーター
とに大別できる。該有機アニオントランスポーターとし
ては、現在、Na+非依存性有機アニオントランスポータ
ー（oatp1, organic anion transporting polypeptid
e）の他、そのファミリーとして例えばoatp2、oatp3、O
AT-K1、OAT-K2、OAT1、OAT2などが知られている。一
方、有機カチオントランスポーターは、有機アニオン排
泄系とは機能的に独立した系として主に尿細管上皮細胞
に存在しており、これにはOCT1、OCT2、OCTN1などが含
まれる。
【０００５】これらの有機アニオンおよびカチオントラ
ンスポーターの実体解明、即ち遺伝子の同定とそれに基
づく構造・機能の解析は近年急速に進行しており、これ
ら薬物トランスポーターの基質認識機構、これらのトラ
ンスポーターが直接ターゲットとする薬物間相互作用な
どに関して分子レベルでの知見が次第に蓄積されつつあ
り、薬物体内動態の予測、トランスポーター分子を標的
とする医薬分子設計、ドラッグデリバリー開発などに有
用な情報も提供されつつある。
ンスポーターの実体解明、即ち遺伝子の同定とそれに基
づく構造・機能の解析は近年急速に進行しており、これ
ら薬物トランスポーターの基質認識機構、これらのトラ
ンスポーターが直接ターゲットとする薬物間相互作用な
どに関して分子レベルでの知見が次第に蓄積されつつあ
り、薬物体内動態の予測、トランスポーター分子を標的
とする医薬分子設計、ドラッグデリバリー開発などに有
用な情報も提供されつつある。
【０００６】特に、新薬を開発する上で、該新薬を投与
した際の有機アニオンおよびカチオントランスポーター
の動き（発現量の増減）を把握することは重要である。
即ち、この有機アニオンおよびカチオントランスポータ
ーの変動が判ると、新薬と併用される併用薬剤の効力、
副作用の増減、かかる併用薬剤および他の摂取物による
新薬の効力、副作用の増減などを予測することができ、
該新薬の安全性を確認することができるからである。
した際の有機アニオンおよびカチオントランスポーター
の動き（発現量の増減）を把握することは重要である。
即ち、この有機アニオンおよびカチオントランスポータ
ーの変動が判ると、新薬と併用される併用薬剤の効力、
副作用の増減、かかる併用薬剤および他の摂取物による
新薬の効力、副作用の増減などを予測することができ、
該新薬の安全性を確認することができるからである。
【０００７】従って、新薬開発などの医薬品分野におい
ては、かかるヒトにおける有機アニオンおよびカチオン
トランスポーターに関する情報、殊にこれら各トランス
ポーターを区別して測定できる測定技術の開発が要望さ
れている。かかる技術が開発できれば、例えば、新薬の
他剤との相互作用、特殊病態時における影響などが容易
に把握でき、また新薬の副作用に関する有用な情報を得
ることもでき、かくして新薬の安全性を確保することが
できる。
ては、かかるヒトにおける有機アニオンおよびカチオン
トランスポーターに関する情報、殊にこれら各トランス
ポーターを区別して測定できる測定技術の開発が要望さ
れている。かかる技術が開発できれば、例えば、新薬の
他剤との相互作用、特殊病態時における影響などが容易
に把握でき、また新薬の副作用に関する有用な情報を得
ることもでき、かくして新薬の安全性を確保することが
できる。
【０００８】一方、ポリメラーゼチェインリアクション
(PCR)は、核酸の増幅法として広く知られており、例え
ばRT-PCR(Reverse Transcription-PCR）、コンペティテ
ィブRT-PCRなどが微量mRNAの検出、定量に威力を発揮し
ている。
(PCR)は、核酸の増幅法として広く知られており、例え
ばRT-PCR(Reverse Transcription-PCR）、コンペティテ
ィブRT-PCRなどが微量mRNAの検出、定量に威力を発揮し
ている。
【０００９】最近、PCRを利用したリアルタイム定量検
出法が確立された（TaqMan PCR (Genome Res., 6(10),
986 (1996)), ABI PRISMTM Sequence Detection System
(Applied Biosystems社)）。これは、特定の蛍光標識
プローブ（TaqMan prove）を用いて核酸を測定する方法
である。より詳しくは、例えば5'末端にリポーター色素
および3'末端にクエンチャー色素を付加して蛍光標識し
たプローブをターゲットDNAにアニールさせた状態で、
通常のPCR反応を行わせると、伸長反応の進行に伴っ
て、DNAポリメラーゼの有する5'-3'エキソヌクレアーゼ
活性により、上記プローブが5'末端から加水分解され
る。その結果、5'末端のリポーター色素が3'末端のクエ
ンチャー色素から離れ、これにより、当初一定の空間的
距離を保っていたことによるFRET（Fluoresence Resona
nce Energy Transfer, 両蛍光色素の共鳴によるリポー
ター色素のエネルギー順位の低下に基づく蛍光強度の低
下現象）効果がなくなり、クエンチャー色素により制御
されていたリポーター色素の蛍光強度が増加し、かくし
て、該蛍光強度の増加を測定することによって、ターゲ
ット核酸をリアルタイムに選択的に定量検出できるので
ある。この方法によれば、従来行われていたPCR反応後
に増幅物を例えばアガロースゲル電気泳動して、泳動パ
ターンを解析するなどの複雑な工程が不要となり、短時
間で且つ同時に多種のサンプルを定量できる利点があ
る。
出法が確立された（TaqMan PCR (Genome Res., 6(10),
986 (1996)), ABI PRISMTM Sequence Detection System
(Applied Biosystems社)）。これは、特定の蛍光標識
プローブ（TaqMan prove）を用いて核酸を測定する方法
である。より詳しくは、例えば5'末端にリポーター色素
および3'末端にクエンチャー色素を付加して蛍光標識し
たプローブをターゲットDNAにアニールさせた状態で、
通常のPCR反応を行わせると、伸長反応の進行に伴っ
て、DNAポリメラーゼの有する5'-3'エキソヌクレアーゼ
活性により、上記プローブが5'末端から加水分解され
る。その結果、5'末端のリポーター色素が3'末端のクエ
ンチャー色素から離れ、これにより、当初一定の空間的
距離を保っていたことによるFRET（Fluoresence Resona
nce Energy Transfer, 両蛍光色素の共鳴によるリポー
ター色素のエネルギー順位の低下に基づく蛍光強度の低
下現象）効果がなくなり、クエンチャー色素により制御
されていたリポーター色素の蛍光強度が増加し、かくし
て、該蛍光強度の増加を測定することによって、ターゲ
ット核酸をリアルタイムに選択的に定量検出できるので
ある。この方法によれば、従来行われていたPCR反応後
に増幅物を例えばアガロースゲル電気泳動して、泳動パ
ターンを解析するなどの複雑な工程が不要となり、短時
間で且つ同時に多種のサンプルを定量できる利点があ
る。
【００１０】しかして、一般に、臨床検査センターなど
で臨床検査を行う場合には、非常に多数の検体について
限られた時間内に検査をする必要があり、検査を効率よ
く行い得る手法の開発が要望されており、上記リアルタ
イム検出法は、この要望に合致するものとして期待でき
る。
で臨床検査を行う場合には、非常に多数の検体について
限られた時間内に検査をする必要があり、検査を効率よ
く行い得る手法の開発が要望されており、上記リアルタ
イム検出法は、この要望に合致するものとして期待でき
る。
【００１１】本発明者は、上記PCRによるリアルタイム
検出法に着目し、これがヒト有機アニオンおよびカチオ
ントランスポーターの検出に利用できれば、同じ装置を
用いて同時に同一のPCR条件で上記各トランスポーター
遺伝子を区別して測定、検出できるとの着想から、鋭意
研究を重ねた。
検出法に着目し、これがヒト有機アニオンおよびカチオ
ントランスポーターの検出に利用できれば、同じ装置を
用いて同時に同一のPCR条件で上記各トランスポーター
遺伝子を区別して測定、検出できるとの着想から、鋭意
研究を重ねた。
【００１２】しかるに、ヒトにおける有機アニオンおよ
びカチオントランスポーターは、前述したように種々知
られており、それぞれのmRNAの配列は既知であるが、こ
れらをターゲット遺伝子として、互いに重複する配列部
分を有さず、しかも同一PCR条件で充分に増幅し得、更
に、該ターゲット遺伝子の特定位置にハイブリダイズし
得る各プライマー対としてのオリゴヌクレオチドの検索
自体は困難であると考えられた。
びカチオントランスポーターは、前述したように種々知
られており、それぞれのmRNAの配列は既知であるが、こ
れらをターゲット遺伝子として、互いに重複する配列部
分を有さず、しかも同一PCR条件で充分に増幅し得、更
に、該ターゲット遺伝子の特定位置にハイブリダイズし
得る各プライマー対としてのオリゴヌクレオチドの検索
自体は困難であると考えられた。
【００１３】また、かかるプライマー対に挟まれた特定
領域に、同一PCR条件下にこれらのプライマーよりも早
くハイブリダイズし得、しかもヒトにおける有機アニオ
ンおよびカチオントランスポーターに対して特異的なプ
ローブの構築もまた、同様に困難であると考えられた。
即ち、ヌクレオチド配列が既知の2つの核酸のハイブリ
ダイズのし易さは、融点（Tm）の計算によりある程度推
定はできるものの、この推定によって選択したプライマ
ーとプローブとの組合せが、必ずしもDNA測定において
好結果をもたらすわけではないことが知られている。こ
のことより、現在知られているヒトにおける有機アニオ
ンおよびカチオントランスポーターのそれぞれについ
て、これらを同時に区別して測定可能な、上記PCRによ
るリアルタイム検出用の各プライマー対とプローブとの
組合せの選択には、熟練者の試行錯誤による過度の多大
な実験などが必要であると予想された。
領域に、同一PCR条件下にこれらのプライマーよりも早
くハイブリダイズし得、しかもヒトにおける有機アニオ
ンおよびカチオントランスポーターに対して特異的なプ
ローブの構築もまた、同様に困難であると考えられた。
即ち、ヌクレオチド配列が既知の2つの核酸のハイブリ
ダイズのし易さは、融点（Tm）の計算によりある程度推
定はできるものの、この推定によって選択したプライマ
ーとプローブとの組合せが、必ずしもDNA測定において
好結果をもたらすわけではないことが知られている。こ
のことより、現在知られているヒトにおける有機アニオ
ンおよびカチオントランスポーターのそれぞれについ
て、これらを同時に区別して測定可能な、上記PCRによ
るリアルタイム検出用の各プライマー対とプローブとの
組合せの選択には、熟練者の試行錯誤による過度の多大
な実験などが必要であると予想された。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、ヒト
における有機アニオンおよびカチオントランスポーター
のPCRによる測定法、特にリアルタイム検出法の確立
と、そのためのプローブおよびプライマー対を提供する
ことにある。
における有機アニオンおよびカチオントランスポーター
のPCRによる測定法、特にリアルタイム検出法の確立
と、そのためのプローブおよびプライマー対を提供する
ことにある。
【００１５】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記目的よ
りヒトにおける有機アニオンおよびカチオントランスポ
ーターについて、更に多大な実験、研究を繰返し行った
結果、6種類の有機アニオンおよびカチオントランスポ
ーターに対する目的のプライマー対およびプローブの組
合せを提供するに成功し、ここに下記要旨の本発明を完
成するに至った。
りヒトにおける有機アニオンおよびカチオントランスポ
ーターについて、更に多大な実験、研究を繰返し行った
結果、6種類の有機アニオンおよびカチオントランスポ
ーターに対する目的のプライマー対およびプローブの組
合せを提供するに成功し、ここに下記要旨の本発明を完
成するに至った。
【００１６】本発明は、ヒトにおける有機アニオンおよ
びカチオントランスポーターの測定に用いられるプロー
ブであって、下記(1)〜(6)の各領域のいずれかにハイブ
リダイズするオリゴヌクレオチドからなる群から選ばれ
ることを特徴とするプローブを提供する。 (1)SLC22A1遺伝子の426〜453の領域 (2)SLC22A2遺伝子の1391〜1418の領域 (3)SLC22A3遺伝子の31〜60の領域(ジーンバンク(GenBan
k)の登録番号AF078749での位置） (4)SLC22A5遺伝子の1166〜1190の領域 (5)SLC22A6遺伝子の624〜650の領域 (6)OATP2遺伝子の1458〜1486の領域 本発明により提供されるブローブは、好ましくは以下の
ものである。 (a) 更にリポーター色素とクエンチャー色素とを結合
させたもの。 (b) 塩基配列の長さが20〜40の範囲にあるもの (c) 配列番号1〜配列番号6に示される配列のいずれか
を含むもの。 (d) 配列番号1〜配列番号6に示される配列のいずれか
であるもの。
びカチオントランスポーターの測定に用いられるプロー
ブであって、下記(1)〜(6)の各領域のいずれかにハイブ
リダイズするオリゴヌクレオチドからなる群から選ばれ
ることを特徴とするプローブを提供する。 (1)SLC22A1遺伝子の426〜453の領域 (2)SLC22A2遺伝子の1391〜1418の領域 (3)SLC22A3遺伝子の31〜60の領域(ジーンバンク(GenBan
k)の登録番号AF078749での位置） (4)SLC22A5遺伝子の1166〜1190の領域 (5)SLC22A6遺伝子の624〜650の領域 (6)OATP2遺伝子の1458〜1486の領域 本発明により提供されるブローブは、好ましくは以下の
ものである。 (a) 更にリポーター色素とクエンチャー色素とを結合
させたもの。 (b) 塩基配列の長さが20〜40の範囲にあるもの (c) 配列番号1〜配列番号6に示される配列のいずれか
を含むもの。 (d) 配列番号1〜配列番号6に示される配列のいずれか
であるもの。
【００１７】また本発明は、フォワードプライマーとリ
バースプライマーとのプライマー対およびプローブの組
合せを含む、ヒトにおける有機アニオンおよびカチオン
トランスポーターの測定キットであって、上記プライマ
ー対およびプローブが下記(1)〜(6)に示されるいずれか
の遺伝子のそれぞれの領域にハイブリダイズするオリゴ
ヌクレオチドからなるモノである測定キット；特にプロ
ーブが更にリポーター色素とクエンチャー色素とを結合
させたものである上記測定キットを提供する。 (1)プライマー対；SLC22A1遺伝子の395-417領域および4
81-461領域、プローブ；426-453領域 (2)プライマー対；SLC22A2遺伝子の1364-1384領域およ
び1510-1490領域、プローブ；1391-1418領域 (3)プライマー対；SLC22A3遺伝子の7-26領域および88-6
7領域、プローブ；31-60領域(ジーンバンク(GenBank)の
登録番号AF078749での位置） (4)プライマー対；SLC22A5遺伝子の1128-1148領域およ
び1262-1242領域、プローブ；1166-1190領域 (5)プライマー対；SLC22A6遺伝子の597-616領域および6
86-666領域、プローブ；624-650領域 (6)プライマー対；OATP2遺伝子の1431-1455領域および1
541-1519領域、プローブ；1458-1486領域 上記測定キットを構成するプライマー対とプローブとの
組合せ（セット）の好ましいものとしては、下記(1)〜
(6)のいずれかに記載の配列番号のそれぞれの配列を含
むか、または当該配列のオリゴヌクレオチドからなるプ
ライマー対とプローブとの組合せを挙げることができ
る。 (1)プライマー対；配列番号7および8、プローブ；配列
番号1 (2)プライマー対；配列番号9および10、プローブ；配列
番号2 (3)プライマー対；配列番号11および12、プローブ；配
列番号3 (4)プライマー対；配列番号13および14、プローブ；配
列番号4 (5)プライマー対；配列番号15および16、プローブ；配
列番号5 (6)プライマー対；配列番号17および18、プローブ；配
列番号6 上記各組合せはそれぞれ以下の有機アニオンおよびカチ
オントランスポーターの測定用である。 (1)の組合せ；SLC22A1測定用 (2)の組合せ；SLC22A2測定用 (3)の組合せ；SLC22A3測定用 (4)の組合せ；SLC22A5測定用 (5)の組合せ；SLC22A6測定用 (6)の組合せ；OATP2測定用 更に本発明は、ヒトにおける有機アニオンおよびカチオ
ントランスポーターのmRNAを含む検体について、前記の
いずれかに記載の測定キットを用いてポリメラーゼ連鎖
反応を行い、用いたプローブの加水分解の有無を測定す
ることを特徴とする、ヒトにおける有機アニオンおよび
カチオントランスポーターの測定方法；特に当該加水分
解の有無が、励起光照射による蛍光の発色の有無により
なされる測定方法を提供する。
バースプライマーとのプライマー対およびプローブの組
合せを含む、ヒトにおける有機アニオンおよびカチオン
トランスポーターの測定キットであって、上記プライマ
ー対およびプローブが下記(1)〜(6)に示されるいずれか
の遺伝子のそれぞれの領域にハイブリダイズするオリゴ
ヌクレオチドからなるモノである測定キット；特にプロ
ーブが更にリポーター色素とクエンチャー色素とを結合
させたものである上記測定キットを提供する。 (1)プライマー対；SLC22A1遺伝子の395-417領域および4
81-461領域、プローブ；426-453領域 (2)プライマー対；SLC22A2遺伝子の1364-1384領域およ
び1510-1490領域、プローブ；1391-1418領域 (3)プライマー対；SLC22A3遺伝子の7-26領域および88-6
7領域、プローブ；31-60領域(ジーンバンク(GenBank)の
登録番号AF078749での位置） (4)プライマー対；SLC22A5遺伝子の1128-1148領域およ
び1262-1242領域、プローブ；1166-1190領域 (5)プライマー対；SLC22A6遺伝子の597-616領域および6
86-666領域、プローブ；624-650領域 (6)プライマー対；OATP2遺伝子の1431-1455領域および1
541-1519領域、プローブ；1458-1486領域 上記測定キットを構成するプライマー対とプローブとの
組合せ（セット）の好ましいものとしては、下記(1)〜
(6)のいずれかに記載の配列番号のそれぞれの配列を含
むか、または当該配列のオリゴヌクレオチドからなるプ
ライマー対とプローブとの組合せを挙げることができ
る。 (1)プライマー対；配列番号7および8、プローブ；配列
番号1 (2)プライマー対；配列番号9および10、プローブ；配列
番号2 (3)プライマー対；配列番号11および12、プローブ；配
列番号3 (4)プライマー対；配列番号13および14、プローブ；配
列番号4 (5)プライマー対；配列番号15および16、プローブ；配
列番号5 (6)プライマー対；配列番号17および18、プローブ；配
列番号6 上記各組合せはそれぞれ以下の有機アニオンおよびカチ
オントランスポーターの測定用である。 (1)の組合せ；SLC22A1測定用 (2)の組合せ；SLC22A2測定用 (3)の組合せ；SLC22A3測定用 (4)の組合せ；SLC22A5測定用 (5)の組合せ；SLC22A6測定用 (6)の組合せ；OATP2測定用 更に本発明は、ヒトにおける有機アニオンおよびカチオ
ントランスポーターのmRNAを含む検体について、前記の
いずれかに記載の測定キットを用いてポリメラーゼ連鎖
反応を行い、用いたプローブの加水分解の有無を測定す
ることを特徴とする、ヒトにおける有機アニオンおよび
カチオントランスポーターの測定方法；特に当該加水分
解の有無が、励起光照射による蛍光の発色の有無により
なされる測定方法を提供する。
【００１８】該測定方法は、より好ましくは、レポータ
ー色素とクエンチャー色素とを有するプローブを用い
て、5'-3'エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラ
ーゼによりPCRを行う、リアルタイム検出法によって実
施される。
ー色素とクエンチャー色素とを有するプローブを用い
て、5'-3'エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラ
ーゼによりPCRを行う、リアルタイム検出法によって実
施される。
【００１９】このリアルタイム検出法は、同一PCR乃至R
T-PCR反応条件下にリアルタイムで簡便且つ迅速に、各
種有機アニオンおよびカチオントランスポーターを分別
定量できるものであり、その確立は、臨床分野、医薬品
分野において非常に有益である。例えば、本発明方法に
よって、医薬品開発における動態試験において重要な位
置を占める薬物輸送に関与する有機アニオンおよびカチ
オントランスポーターのヒト試料中でのmRNAの発現を容
易に定量することができる。これによって、医薬品など
の化学物質に曝露された場合の有機アニオンおよびカチ
オントランスポーターの変化を知ることができる。
T-PCR反応条件下にリアルタイムで簡便且つ迅速に、各
種有機アニオンおよびカチオントランスポーターを分別
定量できるものであり、その確立は、臨床分野、医薬品
分野において非常に有益である。例えば、本発明方法に
よって、医薬品開発における動態試験において重要な位
置を占める薬物輸送に関与する有機アニオンおよびカチ
オントランスポーターのヒト試料中でのmRNAの発現を容
易に定量することができる。これによって、医薬品など
の化学物質に曝露された場合の有機アニオンおよびカチ
オントランスポーターの変化を知ることができる。
【００２０】また、手術で摘出した組織やバイオプシー
により摘出した組織中の有機アニオンおよびカチオント
ランスポーターのmRNA発現を見る上で、迅速且つ多種の
試料を処理でき、また、僅かな組織片から抽出した全RN
Aで検出可能である。
により摘出した組織中の有機アニオンおよびカチオント
ランスポーターのmRNA発現を見る上で、迅速且つ多種の
試料を処理でき、また、僅かな組織片から抽出した全RN
Aで検出可能である。
【００２１】更に、特定の有機アニオンおよびカチオン
トランスポーターにおいては、肝臓、腎臓などでの誘導
などによる発現量の変化が、血液および唾液などの分泌
液中に含まれる核を有する細胞における存在量の変化と
相関する可能性が考えられるが、この血液および分泌液
中のトランスポーター量はごく僅かであり、その測定に
は多量のサンプルが必要となる。本発明に係るプライマ
ー対とプローブとからなる測定キットの利用によれば、
上記血液および分泌液をサンプルとする場合でも、少な
いサンプル量で、既知の測定機器を用いて容易に、有機
アニオンおよびカチオントランスポーターの測定が可能
である。
トランスポーターにおいては、肝臓、腎臓などでの誘導
などによる発現量の変化が、血液および唾液などの分泌
液中に含まれる核を有する細胞における存在量の変化と
相関する可能性が考えられるが、この血液および分泌液
中のトランスポーター量はごく僅かであり、その測定に
は多量のサンプルが必要となる。本発明に係るプライマ
ー対とプローブとからなる測定キットの利用によれば、
上記血液および分泌液をサンプルとする場合でも、少な
いサンプル量で、既知の測定機器を用いて容易に、有機
アニオンおよびカチオントランスポーターの測定が可能
である。
【００２２】以下、本発明方法に利用するプローブおよ
びプライマー対につき詳述すれば、これら各プローブお
よびプライマーは、上述した通り、有機アニオンおよび
カチオントランスポーター遺伝子の特定領域にハイブリ
ダイズするオリゴヌクレオチドから選択される。
びプライマー対につき詳述すれば、これら各プローブお
よびプライマーは、上述した通り、有機アニオンおよび
カチオントランスポーター遺伝子の特定領域にハイブリ
ダイズするオリゴヌクレオチドから選択される。
【００２３】ここで「ハイブリダイズする」とは、後述
するPCR(RT-PCR)の条件でハイブリダイズすることをい
う。
するPCR(RT-PCR)の条件でハイブリダイズすることをい
う。
【００２４】本発明に係わるプローブおよびプライマー
に共通する要件としては、増幅生成物が約50〜400塩基
対の長さであること、プライマーとプローブができる限
り近接していること、配列に含まれるG（グアニン）お
よびC（シトシン）の割合がなるべく50％前後であるこ
と、G（グアニン）が4つ以上連続していないことなどを
挙げることができる。また、その他の本発明プローブの
有する要件としてはTm値が70℃前後であることを挙げる
ことができ、プライマーの有する要件としてはTm値が60
℃前後であることを挙げることができる。
に共通する要件としては、増幅生成物が約50〜400塩基
対の長さであること、プライマーとプローブができる限
り近接していること、配列に含まれるG（グアニン）お
よびC（シトシン）の割合がなるべく50％前後であるこ
と、G（グアニン）が4つ以上連続していないことなどを
挙げることができる。また、その他の本発明プローブの
有する要件としてはTm値が70℃前後であることを挙げる
ことができ、プライマーの有する要件としてはTm値が60
℃前後であることを挙げることができる。
【００２５】有機アニオンおよびカチオントランスポー
ターのmRNA配列は公知であり、それぞれジーンバンク
（GenBank）に以下の登録番号で登録されている。 (1)SLC22A1遺伝子；NM#003057 (2)SLC22A1遺伝子；NM#003058 (3)SLC22A1遺伝子；AF078749 (4)SLC22A1遺伝子；NM#003060 (5)SLC22A1遺伝子；AF124373 (6)OATP2遺伝子；AF205071 本明細書において、各有機アニオンおよびカチオントラ
ンスポーターの特定領域の表示は、上記各登録番号で登
録された遺伝子の開始コドンからの位置にて表示するも
のである。但し、SLC22A1については登録されているAF0
78749での位置（開始コドンからの位置ではない）とす
る。
ターのmRNA配列は公知であり、それぞれジーンバンク
（GenBank）に以下の登録番号で登録されている。 (1)SLC22A1遺伝子；NM#003057 (2)SLC22A1遺伝子；NM#003058 (3)SLC22A1遺伝子；AF078749 (4)SLC22A1遺伝子；NM#003060 (5)SLC22A1遺伝子；AF124373 (6)OATP2遺伝子；AF205071 本明細書において、各有機アニオンおよびカチオントラ
ンスポーターの特定領域の表示は、上記各登録番号で登
録された遺伝子の開始コドンからの位置にて表示するも
のである。但し、SLC22A1については登録されているAF0
78749での位置（開始コドンからの位置ではない）とす
る。
【００２６】本発明に係る各プライマーおよびプローブ
用のオリゴヌクレオチドのヌクレオチド数は、少なくと
も15、通常15〜50、好ましくは約20〜40の範囲にあるの
がよい。該ヌクレオチド数が上記よりあまりに多くなり
すぎると、1本鎖DNAにハイブリダイズしにくくなり、逆
にあまりに小さすぎると、ハイブリダイゼーションの特
異性が低下する。
用のオリゴヌクレオチドのヌクレオチド数は、少なくと
も15、通常15〜50、好ましくは約20〜40の範囲にあるの
がよい。該ヌクレオチド数が上記よりあまりに多くなり
すぎると、1本鎖DNAにハイブリダイズしにくくなり、逆
にあまりに小さすぎると、ハイブリダイゼーションの特
異性が低下する。
【００２７】プライマーおよびプローブの特定ヌクレオ
チド配列の好ましい具体的配列の例は、前述したとおり
であり、各トランスポーター（分子種）に応じてそれぞ
れ配列番号1〜6（プローブの場合）並びに配列番号7〜1
8（プライマーの場合）に示される。
チド配列の好ましい具体的配列の例は、前述したとおり
であり、各トランスポーター（分子種）に応じてそれぞ
れ配列番号1〜6（プローブの場合）並びに配列番号7〜1
8（プライマーの場合）に示される。
【００２８】尚、当業界では例えば20ヌクレオチドから
なるプライマーまたはプローブは、鋳型鎖との間に少数
のミスマッチが存在してもハイブリダイズし得、PCRの
プライマーとしてまたは検出用プローブとして機能し得
ることが知られている。従って、本発明におけるプライ
マーおよびプローブも、上記特定のヌクレオチド配列を
有するもの（各配列番号で示されるもの）に限定され
ず、該配列をその一部として含むものや該配列中の一部
を修飾されたものであることができる。この一部の修飾
は、例えば、上記配列中の2個以下、特に1個のヌクレオ
チドの置換、欠失および／または付加による修飾を包含
する。
なるプライマーまたはプローブは、鋳型鎖との間に少数
のミスマッチが存在してもハイブリダイズし得、PCRの
プライマーとしてまたは検出用プローブとして機能し得
ることが知られている。従って、本発明におけるプライ
マーおよびプローブも、上記特定のヌクレオチド配列を
有するもの（各配列番号で示されるもの）に限定され
ず、該配列をその一部として含むものや該配列中の一部
を修飾されたものであることができる。この一部の修飾
は、例えば、上記配列中の2個以下、特に1個のヌクレオ
チドの置換、欠失および／または付加による修飾を包含
する。
【００２９】本発明に係るプローブおよびプライマーと
しての各オリゴヌクレオチドは、常法に従い、自動合成
機、例えばDNAシンセサイザー（パーキンエルマー社）
などを用いて容易に合成することができる。得られるオ
リゴヌクレオチドは、更に必要に応じて、市販の精製用
カートリッジなどを用いて精製することもできる。
しての各オリゴヌクレオチドは、常法に従い、自動合成
機、例えばDNAシンセサイザー（パーキンエルマー社）
などを用いて容易に合成することができる。得られるオ
リゴヌクレオチドは、更に必要に応じて、市販の精製用
カートリッジなどを用いて精製することもできる。
【００３０】本発明のリアルタイム検出用プローブは、
その一端、例えば5'末端にレポーター色素を結合してお
り且つ他端、即ち3'末端にクエンチャー色素を結合して
いる。レポーター色素は、例えば励起光の照射によって
蛍光を発する物質であり、クエンチャー色素は、該レポ
ーター色素に距離的に接近して存在する場合レポーター
色素に作用してその蛍光の発生を消去する作用を有する
ものである。レポーター色素としては、従来知られてい
るもの、例えば6-カルボキシ-フルオレッセイン(FAM)、
テトラクロロ-6-カルボキシフルオレッセイン(TET)、2,
7-ジメトキシ-4,5-ジクロロ-6-カルボキシフルオレッセ
イン(JOE)、ヘキソクロロ-6-カルボキシフルオレッセイ
ン(HEX)などが挙げられる。クエンチャー色素としても
公知のもの、例えば6-カルボキシ-テトラメチル-ローダ
ミン(TAMRA)などが挙げられる。
その一端、例えば5'末端にレポーター色素を結合してお
り且つ他端、即ち3'末端にクエンチャー色素を結合して
いる。レポーター色素は、例えば励起光の照射によって
蛍光を発する物質であり、クエンチャー色素は、該レポ
ーター色素に距離的に接近して存在する場合レポーター
色素に作用してその蛍光の発生を消去する作用を有する
ものである。レポーター色素としては、従来知られてい
るもの、例えば6-カルボキシ-フルオレッセイン(FAM)、
テトラクロロ-6-カルボキシフルオレッセイン(TET)、2,
7-ジメトキシ-4,5-ジクロロ-6-カルボキシフルオレッセ
イン(JOE)、ヘキソクロロ-6-カルボキシフルオレッセイ
ン(HEX)などが挙げられる。クエンチャー色素としても
公知のもの、例えば6-カルボキシ-テトラメチル-ローダ
ミン(TAMRA)などが挙げられる。
【００３１】本発明に係るリアルタイム検出法に用いら
れるプローブは、前記特定配列のプローブ用オリゴヌク
レオチドにレポーター色素およびクエンチャー色素を結
合させたものである。これは、例えばプローブの5'側に
通常数個のメチレン鎖（リンカー）を介して、その末端
リン酸基にFAM分子をリン酸エステルの形で結合させ、
また、3'側に下に示す構造単位を介してアミド結合によ
りTAMRA分子を結合させることにより調製できる。
れるプローブは、前記特定配列のプローブ用オリゴヌク
レオチドにレポーター色素およびクエンチャー色素を結
合させたものである。これは、例えばプローブの5'側に
通常数個のメチレン鎖（リンカー）を介して、その末端
リン酸基にFAM分子をリン酸エステルの形で結合させ、
また、3'側に下に示す構造単位を介してアミド結合によ
りTAMRA分子を結合させることにより調製できる。
【００３２】
【化１】
【００３３】以下、本発明プローブおよびプライマー対
を利用したPCRによる有機アニオンおよびカチオントラ
ンスポーターリアルタイム検出法につき詳述する。
を利用したPCRによる有機アニオンおよびカチオントラ
ンスポーターリアルタイム検出法につき詳述する。
【００３４】本発明方法は、前述した本発明プローブお
よびプライマー対を利用することを必須として、他は公
知のPCR法（例えば、Science, 230, 1350 (1985)参
照）、RT-PCR（Genome Res., 6(10), 986 (1996)参照）
など、特にリアルタイム検出法（例えばTaqMan PCR, AB
I PRISMTM 7700 SEQUENCE DETECTION SYSTEM, Applied
Biosystems, Ver1, June 1996参照）に従い実施するこ
とができる。
よびプライマー対を利用することを必須として、他は公
知のPCR法（例えば、Science, 230, 1350 (1985)参
照）、RT-PCR（Genome Res., 6(10), 986 (1996)参照）
など、特にリアルタイム検出法（例えばTaqMan PCR, AB
I PRISMTM 7700 SEQUENCE DETECTION SYSTEM, Applied
Biosystems, Ver1, June 1996参照）に従い実施するこ
とができる。
【００３５】該方法は、特に本発明が対象とする有機ア
ニオンおよびカチオントランスポーターの発現量の測定
方法として、mRNAを測定する場合に有用である。この場
合、特定の有機アニオンおよびカチオントランスポータ
ーを発現している生体組織を採取し、常法に従って全RN
Aを抽出し、次にそれに対して相補性のcDNAを常法に従
って合成した後、本発明プローブとプライマー対とを用
いて、PCRを行えばよい。また、常法に従って全RNAを抽
出後、本発明プローブとプライマー対とを用いて、直接
RT-PCRを行うこともできる。
ニオンおよびカチオントランスポーターの発現量の測定
方法として、mRNAを測定する場合に有用である。この場
合、特定の有機アニオンおよびカチオントランスポータ
ーを発現している生体組織を採取し、常法に従って全RN
Aを抽出し、次にそれに対して相補性のcDNAを常法に従
って合成した後、本発明プローブとプライマー対とを用
いて、PCRを行えばよい。また、常法に従って全RNAを抽
出後、本発明プローブとプライマー対とを用いて、直接
RT-PCRを行うこともできる。
【００３６】PCRおよびRT-PCRは、基本的には公知の方
法に従うことができる。それらの反応条件も公知の方法
に準じて適宜決定することができる。具体的には、後記
実施例に示す条件を好ましく採用できる。
法に従うことができる。それらの反応条件も公知の方法
に準じて適宜決定することができる。具体的には、後記
実施例に示す条件を好ましく採用できる。
【００３７】検出も、基本的には常法に従って、例え
ば、アルゴンレーザ光をPCR反応液に照射し、放射され
る蛍光をCCDカメラを用いて検出することにより行うこ
とができる。かくして、有機アニオンおよびカチオント
ランスポーター遺伝子を容易且つ迅速に、しかも各トラ
ンスポーター毎に区別して測定、検出することができ
る。
ば、アルゴンレーザ光をPCR反応液に照射し、放射され
る蛍光をCCDカメラを用いて検出することにより行うこ
とができる。かくして、有機アニオンおよびカチオント
ランスポーター遺伝子を容易且つ迅速に、しかも各トラ
ンスポーター毎に区別して測定、検出することができ
る。
【００３８】本発明は更に、上記方法の実施のための測
定キットをも提供する。このキットは上記プローブおよ
びプライマー対を含むことを必須として、更に対照とし
て使用することのできる既知の核酸、該核酸を測定する
ためのプローブおよびプライマー対を含むこともでき
る。
定キットをも提供する。このキットは上記プローブおよ
びプライマー対を含むことを必須として、更に対照とし
て使用することのできる既知の核酸、該核酸を測定する
ためのプローブおよびプライマー対を含むこともでき
る。
【００３９】本発明方法によれば、個々の有機アニオン
およびカチオントランスポーター遺伝子を分別して測
定、検出できる。また、個々の有機アニオンおよびカチ
オントランスポーターの定量を、同時に、迅速に且つ精
度よく行うことができる。かくして、新薬の他剤との相
互作用、配合禁忌などに関連する基礎データーを効率よ
く得ることができる。
およびカチオントランスポーター遺伝子を分別して測
定、検出できる。また、個々の有機アニオンおよびカチ
オントランスポーターの定量を、同時に、迅速に且つ精
度よく行うことができる。かくして、新薬の他剤との相
互作用、配合禁忌などに関連する基礎データーを効率よ
く得ることができる。
【００４０】
【実施例】以下、本発明を更に詳しく説明するため試験
例および実施例を挙げる。
例および実施例を挙げる。
【００４１】
【試験例１】リアルタイム検出法による検量線の作成 (1)試験方法 本試験で採用したリアルタイムワンステップRT-PCR法
は、96ウエルを用いて、最大96の異なった反応を同時に
実施して、一度に最大96の検体を測定できるものであ
る。また、1チューブ内でRT反応とPCR反応とを行うこと
ができる。
は、96ウエルを用いて、最大96の異なった反応を同時に
実施して、一度に最大96の検体を測定できるものであ
る。また、1チューブ内でRT反応とPCR反応とを行うこと
ができる。
【００４２】本定量の原理は、隣接した2種類の蛍光色
素を用いて、一方の色素（リポーター色素）の蛍光波長
と他方の色素（クエンチャー色素）の励起光波長との間
で、波長領域が重なる場合に生じるFRETの現象を利用し
たものである。より詳しくは、この原理は次の通り説明
できる。即ち、FRETを生じる2種の蛍光色素を両末端に
結合させたプローブ（TaqMan probe）は、PCRで増幅し
た特定の有機アニオンおよびカチオントランスポーター
由来のcDNAにハイブリダイズし、この状態でPCRの伸長
反応が始まる。この系にTaq DNAポリメラーゼを存在さ
せると、該ポリメラーゼの有する5'-3'エンドヌクレア
ーゼ活性によって、Taq Manプローブは加水分解され、
該プローブに結合していたリポーター色素が脱離し、ク
エンチャー色素との間の物理的距離が生じ、FRETによっ
て抑制されていたリポーター色素の蛍光強度が増加す
る。この蛍光強度の増加は、PCRの増幅産物の増加量に
比例するため、この蛍光強度の増加をPCR反応毎に測定
すれば、各PCR反応による有機アニオンおよびカチオン
トランスポーター遺伝子の定量が可能となる。
素を用いて、一方の色素（リポーター色素）の蛍光波長
と他方の色素（クエンチャー色素）の励起光波長との間
で、波長領域が重なる場合に生じるFRETの現象を利用し
たものである。より詳しくは、この原理は次の通り説明
できる。即ち、FRETを生じる2種の蛍光色素を両末端に
結合させたプローブ（TaqMan probe）は、PCRで増幅し
た特定の有機アニオンおよびカチオントランスポーター
由来のcDNAにハイブリダイズし、この状態でPCRの伸長
反応が始まる。この系にTaq DNAポリメラーゼを存在さ
せると、該ポリメラーゼの有する5'-3'エンドヌクレア
ーゼ活性によって、Taq Manプローブは加水分解され、
該プローブに結合していたリポーター色素が脱離し、ク
エンチャー色素との間の物理的距離が生じ、FRETによっ
て抑制されていたリポーター色素の蛍光強度が増加す
る。この蛍光強度の増加は、PCRの増幅産物の増加量に
比例するため、この蛍光強度の増加をPCR反応毎に測定
すれば、各PCR反応による有機アニオンおよびカチオン
トランスポーター遺伝子の定量が可能となる。
【００４３】本試験では、プローブの5'末端側にリポー
ター色素としてFAMを、3'末端側にクエンチャー色素と
してTAMRAを結合させたTaqManプローブを使用した。こ
れら各色素の結合およびこれによるTaqManプローブの作
成は、文献記載の方法（Genome Res., 6(10), 986 (199
6)）に従った。
ター色素としてFAMを、3'末端側にクエンチャー色素と
してTAMRAを結合させたTaqManプローブを使用した。こ
れら各色素の結合およびこれによるTaqManプローブの作
成は、文献記載の方法（Genome Res., 6(10), 986 (199
6)）に従った。
【００４４】また、各プローブおよびプライマーとして
のオリゴヌクレオチドは、自動シンセサイザーとしてAB
I社製のDNA/RNA合成機を利用して、基質（dNTP）および
規定の試薬を用いて合成した。
のオリゴヌクレオチドは、自動シンセサイザーとしてAB
I社製のDNA/RNA合成機を利用して、基質（dNTP）および
規定の試薬を用いて合成した。
【００４５】検体RNAとしては、成人の脳、成人の腎
臓、成人の肺、成人の小腸、胎児の肝臓および成人の肝
臓プールより精製された全RNAを用いた。尚、これらの
全RNAはいずれもクローンテック社（Clontech Laborato
ries, Inc.）より購入した。
臓、成人の肺、成人の小腸、胎児の肝臓および成人の肝
臓プールより精製された全RNAを用いた。尚、これらの
全RNAはいずれもクローンテック社（Clontech Laborato
ries, Inc.）より購入した。
【００４６】成人の脳、成人の腎臓、成人の肺、成人の
小腸、胎児の肝臓、成人の肝臓プールより精製された全
RNAは、RNaseフリーの水で希釈し、20μg/mLに調整し
た。その後、これら6種類を等量ずつ混合し、検量線作
成用とした。以後は、50μg/mLのイーストtRNA（Yeast
tRNA, GIBCO社製）を用いて、5倍公比で希釈した。測定
には5μLを使用した。
小腸、胎児の肝臓、成人の肝臓プールより精製された全
RNAは、RNaseフリーの水で希釈し、20μg/mLに調整し
た。その後、これら6種類を等量ずつ混合し、検量線作
成用とした。以後は、50μg/mLのイーストtRNA（Yeast
tRNA, GIBCO社製）を用いて、5倍公比で希釈した。測定
には5μLを使用した。
【００４７】RT-PCR反応は、300nMフォーワードプライ
マー、900nMリバースプライマーおよび200nM TaqManプ
ローブを含むキット（TaqMan One-Step RT-PCR Master
Mix Reagents Kit , Applied Biosystems)を用いて、50
μL/チューブの系で、配列検出システム(ABI PRISMTM77
00 Sequence Detection System, Applied Biosystems）
を用いて行った。
マー、900nMリバースプライマーおよび200nM TaqManプ
ローブを含むキット（TaqMan One-Step RT-PCR Master
Mix Reagents Kit , Applied Biosystems)を用いて、50
μL/チューブの系で、配列検出システム(ABI PRISMTM77
00 Sequence Detection System, Applied Biosystems）
を用いて行った。
【００４８】48℃−30分間および95℃−10分間保温、そ
の後、95℃−15秒間および60℃−1分間保温のサイクル
を50回行い、各サイクルごとに蛍光強度を測定した。
の後、95℃−15秒間および60℃−1分間保温のサイクル
を50回行い、各サイクルごとに蛍光強度を測定した。
【００４９】下記表1に示す各有機アニオンおよびカチ
オントランスポーターに対して、各配列番号に示される
配列のプローブおよびプライマー対を用いて行った上記
試験の結果（検量線）を表2に示す。
オントランスポーターに対して、各配列番号に示される
配列のプローブおよびプライマー対を用いて行った上記
試験の結果（検量線）を表2に示す。
【００５０】
【表１】
【００５１】
【表２】
【００５２】上記表2より、100000pg全RNA/50μL反応液
量から5倍公比で希釈された検量線を作成したところ、S
LC22A1については、1.28pg全RNA/50μL反応液量まで定
量性を有しており、他の有機アニオンおよびカチオント
ランスポーターについても6.4pgから800pg全RNAを定量
下限とした検量線の相関係数(r)は1.00であった。
量から5倍公比で希釈された検量線を作成したところ、S
LC22A1については、1.28pg全RNA/50μL反応液量まで定
量性を有しており、他の有機アニオンおよびカチオント
ランスポーターについても6.4pgから800pg全RNAを定量
下限とした検量線の相関係数(r)は1.00であった。
【００５３】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Ostuka Pharmaceutical Factory Inc. <120> A method for detection of human organic anion and cation transport er mRNA and a prove and a kit therefor <130> 3DF00JP <160> 18 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 28 <212> DNA <213> human SLC22A1 gene <400> 1 tgctgactcc tggaagctgg acctcttt 28 <210> 2 <211> 28 <212> DNA <213> human SLC22A2 gene <400> 2 atcttggcgt ccacatctgt tcctcaat 28 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> human SLC22A3 gene <400> 3 tattgccttg ccagagacag tggatgatgt 30 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> human SLC22A5 gene <400> 4 tggcctggct gctgctgcaa tattt 25 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> human SLC22A6 gene <400> 5 actgaatgtg gagtggatgc ccattca 27 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> human OATP2 gene <400> 6 agcaggttgc aaatcttcaa gtggcaata 29 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> human SLC22A1 gene <400> 7 cttccatcgt cactgagttc aac 23 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> human SLC22A1 gene <400> 8 acaagaagcc cgcattcaaa c 21 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> human SLC22A2 gene <400> 9 ctgagctgta ccccacattc a 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> human SLC22A2 gene <400> 10 caagtacgcc gaaaaccatc a 21 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> human SLC22A3 gene <400> 11 gatgcttttg cctgaaacca 20 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> human SLC22A3 gene <400> 12 acaggaatgt ggactgccaa gt 22 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> human SLC22A5 gene <400> 13 cttcctttca gcgatggttg a 21 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> human SLC22A5 gene <400> 14 ggtaccagct gcatgaagag a 21 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> human SLC22A6 gene <400>15 ggctggcatc tccctcaact 20 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> human SLC22A6 gene <400> 16 acatagccaa tcaaggtgcc c 21 <210> 17 <211> 25 <212> DNA <213> human OATP2 gene <400> 17 tggaataact tacatctcac cctgt 25 <210> 18 <211> 23 <212> DNA <213> human OATP2 gene <400> 18 ttctggagac cagttacttc caa 23
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA80 CA09 HA11 4B063 QA01 QA18 QQ42 QR08 QR32 QR42 QR55 QR62 QR66 QS03 QS25 QS32 QX02 4H045 AA50 CA40
Claims (12)
- 【請求項１】 ヒトにおける有機アニオンおよびカチオ
ントランスポーターの測定に用いられるプローブであっ
て、下記(1)〜(6)の各領域のいずれかにハイブリダイズ
するオリゴヌクレオチドからなる群から選ばれることを
特徴とするプローブ。 (1)SLC22A1遺伝子の426〜453の領域 (2)SLC22A2遺伝子の1391〜1418の領域 (3)SLC22A3遺伝子の31〜60の領域(ジーンバンク(GenBan
k)の登録番号AF078749での位置） (4)SLC22A5遺伝子の1166〜1190の領域 (5)SLC22A6遺伝子の624〜650の領域 (6)OATP2遺伝子の1458〜1486の領域 - 【請求項２】 更にリポーター色素とクエンチャー色素
とを結合させたものである請求項1に記載のプローブ。 - 【請求項３】 塩基配列の長さが20〜40の範囲にある請
求項1に記載のプローブ。 - 【請求項４】 配列番号1〜配列番号6に示される配列の
いずれかを含むものである請求項1〜3のいずれかに記載
のプローブ。 - 【請求項５】 配列番号1〜配列番号6に示される配列の
いずれかである請求項1〜3のいずれかに記載のプロー
ブ。 - 【請求項６】 フォワードプライマーとリバースプライ
マーとのプライマー対およびプローブの組合せを含むヒ
トにおける有機アニオンおよびカチオントランスポータ
ーの測定キットであって、上記プライマー対およびプロ
ーブが下記(1)〜(6)に示されるいずれかの遺伝子のそれ
ぞれの領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドか
らなるものである測定キット。 (1)プライマー対；SLC22A1遺伝子の395-417領域および4
81-461領域、プローブ；426-453領域 (2)プライマー対；SLC22A2遺伝子の1364-1384領域およ
び1510-1490領域、プローブ；1391-1418領域 (3)プライマー対；SLC22A3遺伝子の7-26領域および88-6
7領域、プローブ；31-60領域(ジーンバンク(GenBank)の
登録番号AF078749での位置） (4)プライマー対；SLC22A5遺伝子の1128-1148領域およ
び1262-1242領域、プローブ；1166-1190領域 (5)プライマー対；SLC22A6遺伝子の597-616領域および6
86-666領域、プローブ；624-650領域 (6)プライマー対；OATP2遺伝子の1431-1455領域および1
541-1519領域、プローブ；1458-1486領域 - 【請求項７】 プローブが、更にリポーター色素とクエ
ンチャー色素とを結合させたものである請求項6に記載
の測定キット。 - 【請求項８】 下記(1)〜(6)のいずれかに記載の配列番
号のそれぞれの配列を含むオリゴヌクレオチドからなる
プライマー対とプローブとの組合せから選ばれる請求項
7に記載の測定キット。 (1)プライマー対；配列番号7および8、プローブ；配列
番号1 (2)プライマー対；配列番号9および10、プローブ；配列
番号2 (3)プライマー対；配列番号11および12、プローブ；配
列番号3 (4)プライマー対；配列番号13および14、プローブ；配
列番号4 (5)プライマー対；配列番号15および16、プローブ；配
列番号5 (6)プライマー対；配列番号17および18、プローブ；配
列番号6 - 【請求項９】 請求項8に記載の測定キットであって、
(1)の組合せがSLC22A1の測定用で、(2)の組合せがSLC22
A2の測定用で、(3)の組合せがSLC22A3の測定用で、(4)
の組合せがSLC22A5の測定用で、(5)の組合せがSLC22A6
の測定用で、(6)の組合せがOATP2の測定用である測定キ
ット。 - 【請求項１０】 請求項8の(1)〜(6)のいずれかに記載の
配列番号のそれぞれの配列を有するオリゴヌクレオチド
からなるプライマー対とプローブとの組合せから選ばれ
る請求項9に記載の測定キット。 - 【請求項１１】 ヒトにおける有機アニオンおよびカチ
オントランスポーターのmRNAを含む検体について、請求
項6〜10のいずれかに記載の測定キットを用いてポリメ
ラーゼ連鎖反応を行い、用いたプローブの加水分解の有
無を測定することを特徴とする、ヒトにおける有機アニ
オンおよびカチオントランスポーターの測定方法。 - 【請求項１２】加水分解の有無が、励起光照射による蛍
光の発色の有無によりなされる請求項11に記載の測定方
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000375596A JP2002171991A (ja) | 2000-12-11 | 2000-12-11 | ヒトにおける有機アニオンおよびカチオントランスポーターの測定方法、そのためのプローブおよびキット |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000375596A JP2002171991A (ja) | 2000-12-11 | 2000-12-11 | ヒトにおける有機アニオンおよびカチオントランスポーターの測定方法、そのためのプローブおよびキット |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002171991A true JP2002171991A (ja) | 2002-06-18 |
Family
ID=18844587
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000375596A Pending JP2002171991A (ja) | 2000-12-11 | 2000-12-11 | ヒトにおける有機アニオンおよびカチオントランスポーターの測定方法、そのためのプローブおよびキット |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2002171991A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007016161A2 (en) * | 2005-07-29 | 2007-02-08 | Xenoport, Inc. | Oct3 transporters expressed in blood brain barrier cells |
-
2000
- 2000-12-11 JP JP2000375596A patent/JP2002171991A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007016161A2 (en) * | 2005-07-29 | 2007-02-08 | Xenoport, Inc. | Oct3 transporters expressed in blood brain barrier cells |
| WO2007016161A3 (en) * | 2005-07-29 | 2007-05-10 | Xenoport Inc | Oct3 transporters expressed in blood brain barrier cells |
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