CN114250286B - 用于核酸检测的组合、试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种用于核酸检测的组合、试剂盒及其应用。利用本发明核酸检测组合，在PCR反应中，第一引物以及第三引物可特异性的扩增靶核酸序列，扩增后的产物会新增一段与第一引物的信号检测区互补的序列，供后续的第二引物进行配对识别。随后第二引物以及第三引物可以与对应的预扩增模板进行配对并扩增，进一步地，第二引物上的二级结构区被线性化或解折叠，使第一检测基团与第二检测基团之间的距离产生变化而产生可检测信号，从而检测到相应的模板。该组合设计简单、且使用该组合进行核酸变异性检测的信噪比高，可大大降低荧光本底信号，同时本发明涉及的核酸检测灵敏度高，特异性好，成本低并且准确性高。

Description

用于核酸检测的组合、试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种用于核酸检测的组合、试剂盒及其应用。
背景技术
长期以来，组织病理学诊断是肿瘤诊断的金标准和临床治疗的基础。然而对组织学类型、分期相同的肿瘤患者采取相同的治疗方案，往往只有一部分肿瘤患者有反应。据统计，传统医疗在肿瘤治疗上用药无效率高达75％。恶性肿瘤的疗效不好在于难以从组织诊断水平上对其恶性特征和药效特征进行判断。研究表明，肿瘤病变的分子特征决定了其恶性特征，转移特征，复发特征和耐药特征，是肿瘤愈后判断和对化疗药物反映的基本依据。因此，基于分子差异的个体化治疗是肿瘤精准治疗的方向，分子分型是实现个体化精准治疗的基础。
通过检测患者外周血中的循环肿瘤DNA(ctDNA)可以实现对肿瘤患者的早期筛查、用药指导、预后判断以及复发监测。但由于外周血样本背景复杂，ctDNA含量稀少，对于低丰度以及稀有序列的检测，荧光定量PCR法、分子杂交法、毛细管电泳以及二代测序均容易受到背景DNA的干扰，使得检测灵敏度及精确度都达不到精确定量的要求。
目前现有的基因突变检测试剂，多采用TaqMan探针法，通常会采用分别针对突变型和野生型的竞争性探针。对于突变类型较多的基因突变，如EGFR基因19外显子缺失突变，突变种类可高达30～40种，若想实现单管多重检测，针对不同的突变类型需设计多条不同的突变型探针，费用较高，不利于大规模的推广使用。
另外，该种方法需要设计一对特异性的PCR引物和一条与模版互补的特异性探针，且探针的结合位点位于两条引物之间，探针上5'端和3'端分别标记了一个报告荧光基团(供体)和一个淬灭荧光基团(受体)，当TaqMan探针呈完整的游离状态时，荧光基团与荧光淬灭基团相聚较近，淬灭基团会吸收荧光基团在激发光作用下的激发荧光，发生荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)，从而导致仪器检测不到荧光信号；在PCR扩增过程中，Taq DNA聚合酶利用其5'-3'核酸外切酶活性切割与靶序列结合的探针，报告基团和淬灭基团相距较远，从而释放出荧光信号。为使探针达到较好的淬灭效果，对探针的长度要求会略高，探针较长会使得两端基团距离较远，导致荧光淬灭不彻底，而且淬灭基团也会产生不同波长的荧光，都会使得本底信号偏高。为解决本底信号较高的问题，通常会使用MGB探针(minor groove binding probe，MGB probe)，但MGB探针合成价格较高。以往的研究表明，将荧光基团与淬灭基团以共价键连接时，可以显著提升淬灭效果，大大降低荧光背景信号的干扰。尤其在数字PCR平台进行荧光信号检测中，过高的背景信号强度与阳性荧光信号强度难以区分，造成阈值界定不清晰，影响定性及定量结果的判读。因此需要一种能够降低背景信号，提高信噪比的方法应用于数字PCR平台的检测试剂中。
发明内容
为解决上述问题，本发明人对核酸检测的引物设计进行研究，提出新的核酸检测的解决方案，从而实现了本发明。
本发明的设计方案大大降低了荧光本底信号，并且，利用该引物组合可降低检测假阳性，进一步地可实现一管同时检测多种突变类型时，可尽可能的避免交叉反应，此外，本发明的设计方案提高了体系的特异性、检测灵敏度和准确性。
据此，一方面，本发明提供了一种用于核酸检测的组合，所述组合包括第一引物、第二引物和第三引物；其中，
所述第一引物从5’端至3’端依次包括信号检测区和靶序列结合区，所述信号检测区不与靶序列互补配对，所述靶序列结合区部分或全部与靶序列上扩增区域的3’端碱基互补配对；
其中，所述第一引物的信号检测区不与靶序列相同或互补配对或在高严格条件下杂交。
其中，所述第二引物从5’端至3’端依次包括二级结构区和检测结合区，所述第二引物上连接有第一检测基团和第二检测基团，当二级结构区线性化或解折叠时，第一检测基团与第二检测基团之间的距离发生变化，由于距离的变化而产生可检测信号；所述检测结合区的序列与第一引物上信号检测区的部分或全部序列相同；
可以理解，由于PCR扩增前，第二引物上，由于二级结构第一检测基团和第二检测基团在一个相对比较近的位置，从而使检测基团的荧光发生猝灭、荧光共振转移等无信号产生，因此反应体系本地信号低。
其中，所述第三引物与靶序列上扩增区域的5’端碱基序列相同。
其中，所述靶序列上有变异检测位点，所述第一引物与靶序列上的变异检测位点互补配对。
其中，所述第一引物的靶序列结合区的3’端具有扩增决定位点，所述扩增决定位点与靶序列上的变异检测位点互补配对。
其中，所述第一引物的靶序列结合区可添加1～5个错配碱基。所述第一引物的信号检测区为一段不与任何靶序列配对结合的自由设计序列；在一些具体实施方式中，所述第一引物的信号检测区与靶序列结合区之间有0～5个碱基的间隔。
其中，所述第一引物的信号检测区不与靶序列相同或互补配对或在高严格条件下杂交。
在一些具体实施方式中，所述第二引物的二级结构区选自发夹、茎环结构、假结和三螺旋。
在一些实施方式中，所述第二引物的二级结构区优选为茎环结构，所述茎环结构从5’端至3’端依次包括第一茎干区、环区和第二茎干区；所述第一茎干区与第二茎干区碱基互补；所述环区为核苷酸环结构或非核苷酸环结构；
在一些具体实施方式中，
当环区为核苷酸环结构时，所述环区为3～25bp的碱基序列；
当环区为非核苷酸环结构时，所述环区选自d Spacer、C3 Spacer、C6 Spacer、C9Spacer、C12 Spacer、Spacer 9、Spacer 18中的一种。
在一些具体实施方式中，所述第一茎干区和第二茎干区长5～20bp；因第一茎干区与第二茎干区互补，构成茎环结构的茎部；所述第二引物的检测结合区长15～30bp。在一些具体实施方式中，所述第二引物的二级结构区和检测结合区之间有0～5个碱基间隔。
在一些具体实施方式中，所述第一检测基团连接在第二引物的第一茎干区时，所述第二检测基团连接在第二茎干区上、第二茎干区与检测结合区之间或检测结合区非3’端上。
在一些具体实施方式中，所述第一检测基团和第二检测基团分别为荧光基团和猝灭基团时，所述荧光基团选自FAM、TET、JOE、HEX、TAMRA、ROX、Cy3、Cy5和Cy5.5等，所述猝灭基团选自BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3、TAMRA、DABYCL和QSY-7等。。
所述第一检测基团和第二检测基团为可通过荧光共振能量转移(FRET)产生信号变化的一对染料。当第二引物呈完整的二级结构区如“茎环结构”时，第一检测基团和第二检测基团距离较近，荧光共振能量转移效率较高；当第二引物的二级结构区线性化或解折叠时，比如第一茎干区被DNA聚合酶的5’-3’外切酶活性水解或者茎环结构被打开时，第一检测基团和第二检测基团距离发生变化，荧光共振能量转移效率降低，导致荧光信号发生变化，从而被仪器检测到。
所述第二引物不与靶序列配对结合。
本发明中，所述靶序列的扩增区域为1～200bp以内的核酸序列。即第一引物与第三引物的设计为扩增1～200bp以内的核酸序列。
在一些实施方式中，所述组合还包括第四引物，所述第四引物从5’端至3’端依次包括信号检测区和第二靶序列结合区，所述第四引物上的信号检测区与第一引物上的信号检测区相同；所述第二靶序列结合区与第一引物上的靶序列结合区不同，并且所述第二靶序列结合区部分或全部与第二靶序列3’端的碱基互补配对。
可以理解，采用以上方式可以在一个检测通道中，同时检测多种核酸，实现一管同时检测的功能；并且由于多种核酸的扩增共用一条第二引物，因此引物设计难度低。
在一些具体实施方式中，所述靶序列与第二靶序列仅变异检测位点不同，使用第四引物，可以保证一管同时检测多种突变类型。
在一些具体实施方式中，所述组合还包括第五引物、第六引物等，所述第五引物与第六引物的结构同第一引物，均包括信号检测区和靶序列结合区。但是不同引物的靶序列结合区不同。更进一步地，可保证一管同时检测多种突变类型。
在第二方面，本发明提供了一种核酸检测的试剂盒，所述试剂盒包括上述所定义的引物。
其中，所述试剂盒还包括物dNTP、DNA聚合酶。
在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包含反应缓冲液、阴性对照、阴性对照和/或空白对照。在一些实施方案中，所述反应缓冲液含有KCl、MgCl2、Tris-HCl、二硫苏糖醇(DTT)、多种dNTP以及DNA聚合酶。
在一些具体实施方式中，所述组合还包括阻断引物；在进行核酸序列变异检测时，所述阻断引物用于与野生型序列进行互补配对，竞争性地抑制第一引物或第四引物非特异性结合在野生型模板上。进一步地可以提高检测准确性。
在一些具体实施方式中，所述组合还包括参考引物组，所述参考引物组是由参考上游引物、参考下游引物和参考探针组成，所述参考探针上标记可检测基团，参考引物组检测样本核酸序列的保守区域，从而用于检查样本(变异序列和野生型序列)的总量。优选地，所述参考探针上的可检测信号与第二引物上的可检测信号不同。
在一些实施方式中，所述组合还包括第四引物，所述第四引物从5’端至3’端依次包括信号检测区和第二靶序列结合区，所述第四引物上的信号检测区与第一引物上的信号检测区相同；所述第二靶序列结合区与第一引物上的靶序列结合区不同，并且所述第二靶序列结合区部分或全部与第二靶序列3’端的碱基互补配对。
在一些具体实施方式中，所述第一引物长度为30～70bp，其靶序列结合区的Tm值50℃～80℃，GC含量40％～80％。所述第二引物上的二级结构区的第一茎干区和第二茎干区长6～20bp，GC含量50％～80％，两者序列互补；环区可以是6～20的碱基序列，或者是一种spacer修饰，可以选自C3，C6，C9，C12等中的一种，或者是其它连接修饰；检测结合区长15～30bp，Tm值50℃～80℃，GC含量40％～80％。所述第三引物长度15～30bp，Tm值55℃～75℃，GC含量40％～80％。第四引物与第一引物的长度、Tm和GC含量基本相同。
在一些具体实施方式中，所述第一引物的浓度为15～150nM、所述第二引物的浓度为150～1500nM、所述第三引物的浓度为150～1800nM；优选地，所述第一引物的浓度为30～90nM、所述第二引物的浓度为300～600nM、所述第三引物的浓度为300～900nM。优选地，还包括第四引物，第四引物的浓度与第一引物一致。
数字PCR(digital PCR,dPCR)技术是一种核酸分子绝对定量技术，其利用极限稀释的原理将一个荧光定量PCR反应体系分配到成千上万份单独的纳升级微反应器中，使得每个微反应器中包含或不包含1个或多个拷贝的目标核酸分子(DNA靶标)，再同时进行单分子模板PCR扩增。不同于荧光定量PCR在每个扩增循环进行时采集荧光的方法，数字PCR在扩增结束后对每个反应单元的荧光信号进行独立采集，最后通过泊松分布的原理及阳性/阴性的反应单元的比例得出目标分子的原始拷贝数或浓度。
相较于荧光定量PCR，数字PCR不依靠Ct值和标准曲线就可以进行精确的绝对定量检测，具有灵敏度高以及精确度高的优势。由于数字PCR在进行结果判读时仅判断“有/无“两种扩增状态，因此也不需要检测荧光信号与设定阈值线的交点，完全不依赖于Ct值的鉴定，所以数字PCR反应和结果判读受扩增效率的影响大大降低，对PCR反应抑制物的耐受能力大大提高。此外，数字PCR实验中对反应体系进行分配的过程可以极大程度上在局部降低与靶标序列有竞争作用的背景序列浓度，因此，数字PCR特别适合在复杂背景中检测稀有突变，目前多应用在液体活检中，实现在肿瘤患者外周血中检测稀有突变标志物。
在第三方面，本发明提供了一种利用数字PCR测定核酸序列变异的方法，包括以下步骤：
(i)提供包含靶核酸的待测定样品，对样品进行极限稀释并随机分配至770-10,000,000个反应单元中，随后对所有反应单元进行统一的热循环扩增；
(ii)首先，以第一引物(简称F1)和第三引物(简称R)作为引物对进行靶核酸序列的预扩增；
(iii)其次，以第二引物(简称F2)和第三引物继续扩增步骤(ii)中所得的预扩增产物和
(iv)在步骤(iii)后检测反应体系中因第二引物上二级结构区线性化或被解折叠所发出的信号，根据信号对样品中的靶核酸进行定量；
其中，第一引物从5’端至3’端依次包括信号检测区和靶序列结合区，所述信号检测区不与靶序列互补配对，所述靶序列结合区部分或全部与靶序列3’端的碱基互补配对；
所述第二引物从5’端至3’端依次包括二级结构区和检测结合区，所述第二引物上连接有第一检测基团和第二检测基团，当二级结构区线性化或解折叠时，第一检测基团与第二检测基团之间的距离发生变化，由于距离的变化而产生可检测信号；所述检测结合区的序列与第一引物上信号检测区的部分或全部序列相同；
在一些实施方案中，所述第三引物可以是与靶序列变异检测位点下游的序列相同的常规引物，例如根据碱基互补配对原理以本领域公知的常规技术手段设计的引物。在一些优选实施方式中，第三引物与靶序列的相同序列区位于第一引物与靶序列互补区的下游1～200bp区域内。
在一些具体实施方式中，所述第一引物的浓度为15～150nM、所述第二引物的浓度为150～1500nM、所述第三引物的浓度为150～1800nM；优选地，所述第一引物的浓度为30～60nM、所述第二引物的浓度为300～600nM、所述第三引物的浓度为300～900nM。
在一些具体实施方式中，所述第一检测基团连接在第二引物的第一茎干区时，所述第二检测基团连接在第二茎干区上、第二茎干区与检测结合区之间或检测结合区非3’端上。
在一些具体实施方式中，所述第一检测基团和第二检测基团分别为荧光基团和猝灭基团时，所述荧光基团选自FAM、TET、JOE、HEX、TAMRA、ROX、Cy3、Cy5和Cy5.5等，所述猝灭基团选自BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3、TAMRA、DABYCL和QSY-7等。
在一些具体实施方式中，所述数字PCR测定核酸序列变异的方法中，还包括使用第四引物。
所述第一引物和第四引物均为第一正向引物，第三引物为反向引物。在一些实施方案中，同一反应体系中仅使用一种第一正向引物。例如，同一反应体系仅测定一种突变型靶序列，或仅测定野生型靶序列。在另一些实施方案中，同一反应体系中使用多种(例如2种或更多种)第一正向引物(例如同一反应单元中具有第一引物、第四引物，或者与第一引物结构相近的第五引物、第六引物等)。
或者所示第一引物和第四引物均为第一反向引物，第三引物为正向引物。
在一些实施方案中，所述核酸序列变异可以是选自下组的一项或多项：碱基置换突变、插入突变、缺失突变、和倒位突变。在一些实施方案中，所述核酸序列变异是缺失突变，即待检测的两种靶序列(例如野生型和突变型)之间存在碱基数目的差别，例如突变型的一个或多个碱基的缺失。在一些实施方案中，所述核酸序列变异是点突变，即只有1个碱基的类型不同。
在一些具体实施方式中，所述第一引物长度为30～70bp，其靶序列结合区的Tm值50℃～80℃，GC含量40％～80％。所述第二引物上的二级结构区的第一茎干区和第二茎干区长6～20bp，GC含量50％～80％，两者序列互补；环区可以是6～20的碱基序列，或者是一种spacer修饰，可以选自C3，C6，C9，C12等中的一种，或者是其它连接修饰；检测结合区长15～30bp，Tm值50℃～80℃，GC含量40％～80％。所述第三引物长度15～30bp，Tm值55℃～75℃，GC含量40％～80％。第四引物与第一引物的长度、Tm和GC含量基本相同。
数字PCR扩增所适用的程序及常用反应条件(如变性温度、时间等)是本领域所熟知的。例如，在一些示例性的实施方案中，步骤(ii)和步骤(iii)中的具体扩增反应条件可以是：92℃～96℃预变性5～15分钟；92℃～95℃变性10～60秒，55℃～75℃退火及延伸30～90秒，共进行35-50个循环；94℃～98℃灭活5～15分钟；4℃～15℃终止反应。
在一些实施方案中，提供靶序列的样品可以是生物样品，例如生物体液、活体组织、冷冻组织、石蜡切片等。在一些优选的实施方案中，所述样品是，例如外周血、尿液、灌洗液、脑脊液、粪便、唾液等。
在一些实施方案中，提供了本发明任一实施方案所述的组合在制备用于诊断基因变异相关疾病的试剂盒中的用途。在又一些实施方案中，提供了本发明任一实施方案所述的组合在制备用于检测核酸序列变异的试剂盒中的用途。
在第四方面，本发明提供了一种用于数字PCR检测的组合，所述组合包括第一引物SEQ ID NO:1、第二引物SEQ ID NO:2和第三引物SEQ ID NO:4。
在一些具体实施方式中，所述组合还包括阻断引物SEQ ID NO:3。
在一些具体实施方式中，所述组合还包括第四引物SEQ ID NO:8和/或第五引物SEQ ID NO:9。
在第五方面，本发明提供了一种基于数字PCR检测的试剂盒，所述试剂盒包括上述组合、dNTP和DNA聚合酶；所述组合包括第一引物SEQ ID NO:1、第二引物SEQ ID NO:2和第三引物SEQ ID NO:4。
在一些具体实施方式中，所述第一引物的浓度为15～150nM、所述第二引物的浓度为150～1500nM、所述第三引物的浓度为150～1800nM；优选地，所述第一引物的浓度为30～60nM、所述第二引物的浓度为300～600nM、所述第三引物的浓度为300～900nM。
更进一步地，所述试剂盒还包括阻断引物SEQ ID NO:3。优选地，所述阻断引物浓度为300～600nM。
更进一步地，所述试剂盒还包括参考引物组，所述参考引物组是由参考引物rFSEQ ID NO:5、参考引物rR SEQ ID NO:6、参考探针rP SEQ ID NO:7组成。优选地，参考引物rF，rR的浓度为300～900nM；所述参考探针rP的浓度为150～400nM。在一些优选实施方式中，所述第一引物(F1)的浓度为90nM，第二引物(F2)的浓度为450nM，第三引物(R)的浓度为450nM，参考探针rP的浓度为250nM，参考引物rF，rR的浓度为450nM，阻断引物(blocker)的浓度为450nM。
更进一步地，所述组合还包括第四引物SEQ ID NO:8和/或第五引物SEQ ID NO:9。
在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包含反应缓冲液、阳性对照、阴性对照和/或空白对照。在一些实施方案中，所述反应缓冲液含有KCl、MgCl2、Tris-HCl、二硫苏糖醇(DTT)、多种dNTP以及DNA聚合酶。
在一些具体实施方式中，所述试剂盒的扩增反应条件可以是：92℃～96℃预变性5～15分钟；92℃～95℃变性10～60秒，55℃～75℃退火及延伸30～90秒，共进行35-50个循环；94℃～98℃灭活5～15分钟；4℃～15℃终止反应。优选地，本发明扩增反应条件是：95℃预变性10分钟；94℃变性30秒，65℃退火延伸60秒，共进行45个循环；98℃灭活10分钟；10℃终止反应。
在第六方面，上述组合在制备用于检测EGFR基因19外显子缺失突变的检测试剂盒的应用。
通过采用这样的设计，本发明取得了以下有益效果：
本发明的设计方式中，第一检测基团和第二检测基团标记在具有二级结构的引物(如“茎环”引物)两端及两端附近或以共价结合的形式存在，与TaqMan探针法相比，两种染料的空间距离显著降低，淬灭效率大大提升，从而显著降低本底荧光信号，提高信噪比；
本发明的设计方式中，仅引物与靶序列互补配对，因此在靶序列存在较多高变异区时，如病毒或细菌基因组，本发明的包容性更好，设计难度更低；
本发明的组合以及反应体系可以良好地避免交叉反应，例如，在检测突变型靶核酸序列时，无野生型或其它相近或具有同源性的靶核酸交叉反应。尤其在同时检测野生型与突变型时，两者交叉反应小，更有利于稀有突变的检测。
本发明的组合可用于检测小于200bp的短片段DNA，可以适用于多种样本类型的核酸检测；
本发明对靶序列的长度要求非常低，从而能够提高短片段核酸检测时的灵敏度；
本发明的组合以及反应体系可以良好地避免交叉反应，例如，在检测突变型靶核酸序列时，无野生型或其它相近或具有同源性的靶核酸交叉反应。尤其在同时检测野生型与突变型时，两者交叉反应小，更有利于稀有突变的检测。
本发明的组合可在一个反应管中同时检测突变型与野生型靶核酸序列，无需分管定性检测或定量检测野生型和突变型基因，特别适合用于稀少样本，如外周血ctDNA样本的检测。
附图说明
图1为本发明实施例1在基因突变单重检测中的效果图。可以看出，利用本发明方案检测EGFR基因19外显子缺失突变(E746_A750del(1))时，特异性良好，阈值划分清晰。
图2为本发明实施例2在基因突变多重检测中的效果图。可以看出，利用本发明方案进行EGFR基因19外显子缺失多重突变检测时，特异性良好，阈值划分清晰。
图3为实施例3和对比例1在检测EGFR基因19外显子缺失突变(L747_P753>S)时突变型荧光强度与荧光本底强度对比图。从图3可以看出，本发明方案荧光本底强度显著降低，具有较高的信噪比。
具体实施方式
为了使本领域技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合下面结合实施例对本发明作进一步说明，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。
定义
如本文中所用，术语“核酸”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”可互换地使用，并且是指核苷酸单体的单链和/或双链聚合物，包括(但不限于)通过核苷酸间磷酸二酯键连接或核苷酸间类似物连接的2'-脱氧核糖核苷酸(DNA)和核糖核苷酸(RNA)。核酸中的核苷酸单体可称为“核苷酸残基”。核酸可以完全由脱氧核糖核苷酸构成、完全由核糖核苷酸构成或由其嵌合混合物构成，并且可以包括核苷酸类似物。核苷酸单体单元可以包含本文中所述的核苷酸中的任一个，包括(但不限于)核苷酸和/或核苷酸类似物。核酸的大小通常从几个核苷酸残基到几千个核苷酸残基不等。其中“寡核苷酸”通常指长度相对较短的核苷酸聚合物，例如1～80个。除非另外指出，否则每当呈现核酸序列时，都应了解，核苷酸从左到右是按5'到3'的顺序。非另行指出，否则“A”表示脱氧腺苷，“C”表示脱氧胞苷，“G”表示脱氧鸟苷，“T”表示脱氧胸苷，并且“U”表示脱氧尿苷。
根据本领域习惯用语，核酸的长度可表示为碱基、碱基对(缩写“bp”)、核苷酸/核苷酸残基(缩写为“nt”)或千碱基(“kb”)。在上下文允许的情况下，术语“碱基”、“核苷酸”、“核苷酸残基”可以描述单链或双链的多核苷酸。当该术语应用于双链分子时，其用于指整个长度，并且应理解为相当于术语“碱基对”。
术语“引物”表示这样的寡核苷酸：其与靶核酸中的序列杂交，且能够充当沿着核酸的互补链合成(在适合于这样的合成的条件下)的起始点。本文中使用的术语“探针”表示这样的寡核苷酸：其与靶核酸中的序列杂交，且通常被可检测地标记。探针可以具有修饰(诸如3’-端修饰和/或5’-端修饰，其使探针可以被检测到或是被核酸聚合酶水解等)，所述修饰也可包括一个或多个生色团。
本文中使用的术语“靶序列”、“靶核酸”或“靶标”可互换使用且意指要扩增、检测或扩增并检测的核酸序列部分，具体地，所述靶序列为DNA中的一条链、RNA、cDNA的等单链，其可在杂交、退火或扩增条件下与探针或引物进行退火或杂交。本发明中，“靶序列”可以为DNA的正义链或反义链，RNA、cDNA的等单链。
术语“杂交”、“互补配对”、“碱基互补”表示两个核酸之间的碱基配对相互作用，其导致双链体的形成。不要求2个核酸在它们的全长上具有100％互补性才可实现杂交。
本文所用的术语“上游”、“位于/在……上游”、“上游具有……”等，在描述核酸序列的语境下是表示在同一核酸序列上比指代区域更靠近5’端的部分，例如可以是紧邻指代区域，也可以与指代区域有一个或多个碱基的间隔。本文所用的术语“下游”、“位于/在……下游”、“下游具有……”等，在描述核酸序列的语境下是表示在同一核酸序列上比指代区域更靠近3’端的部分，例如可以是紧邻指代区域，也可以与指代区域有一个或多个碱基的间隔。应了解，除另有说明外，在描述的核酸为双链核酸时，“上游”和“下游”的表示方法通常以正义链的5’端和3’端为准。
本文所用的术语“靶序列结合区”、“信号检测区”、“扩增决定位点”、“错配区”是位于第一引物(第四引物等、第五引物)上的不同区段，其中扩增决定位点和错配区位于靶序列结合区内。应了解，所述靶序列结合区表示该区域用于与靶序列杂交或退火，而并不意指该区域必然与靶序列能实现100％碱基互补配对，且靶序列结合区内可以存在错配区。术语“变异检测位点”位于靶序列上，在本文中是指待检测的不同靶序列之间存在差异的区段，例如野生型和突变型之间具有序列差异的区段。变异检测位点的长度可以是一个或多个碱基对。常见地，所述变异可以是例如(与野生型相比的)点突变、缺失突变、插入突变、碱基倒置突变等等。本文中术语“Taqman探针(TaqMan probe)”与“水解探针(hydrolysis probe)”可互换使用。Taqman探针是在Real-time PCR技术平台发展出的荧光检测技术，探针的5’端含有荧光报告基团，3’端含有荧光淬灭基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，当进行PCR扩增时，Taq DNA聚合酶的5’端到3’端的外切酶活性将探针酶切降解，使得报告基团和淬灭基团分离，发出荧光信号，从而达到荧光信号的积累与PCR产物形成完全同步。
术语“荧光共振能量转移(FRET)”，是能量在供体分子和受体分子之间非辐射地传递的过程。FRET源于某些化合物的特性；当通过暴露于特定波长的光激发时，它们以不同的波长发光(即，它们发荧光)。这些化合物称为荧光团。在FRET中，能量在作为荧光团的供体分子和受体分子之间长距离(10-100nm)非辐射地通过。供体吸收光子并将该能量非辐射地转移到受体，当激发和发射光谱重叠的两个荧光团非常接近时，一个荧光团的激发将使其发射波长的光，该波长被第二荧光团吸收并刺激第二荧光团，从而使其发荧光。换句话说，第一(供体)荧光团的激发态能量通过共振诱导的偶极-偶极相互作用转移到相邻的第二(受体)荧光团。结果，供体分子的寿命减少并且其荧光被猝灭，同时受体分子的荧光强度增强并且去极化。当供体的激发态能量转移到非荧光团受体时，供体的荧光被猝灭，而受体不随后发射荧光。在这种情况下，受体起淬灭剂的作用。
可以参与荧光共振能量转移(FRET)的成对分子被称为FRET对。FRET中常用的分子包括荧光素，5-羧基荧光素(FAM)，2'7'-二甲氧基-4'5'-二氯-6-羧基荧光素(JOE)，罗丹明，6-羧基罗丹明(R6G)，N，N，N'，N'-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)，6-羧基-X-罗丹明(ROX)，4-(4'-二甲基氨基苯基偶氮)苯甲酸(DABCYL)和5-(2'-氨基乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)等。荧光团是供体还是受体是由其激发和发射光谱以及与之配对的荧光团决定的。例如，FAM被波长为488nm的光最有效地激发，并且发射具有500至650nm的光谱的光，并且发射最大值为525nm。FAM是适用于JOE，TAMRA和ROX的供体荧光团(所有这些都在514nm处具有其最大激发)。
本发明中第一检测基团和第二检测基团优选为FRET对、荧光基团和猝灭基团。当第一检测基团和第二检测基团分别为荧光基团和猝灭基团时，所述荧光基团选自FAM、TET、JOE、HEX、TAMRA、ROX、Cy3、Cy5和Cy5.5，所述猝灭基团选自BHQ-1、BHQ-2和BHQ-3。
在本发明的上下文中，简称“F1”和“第一正向引物”可互换使用，“F2”和“第二引物”可互换使用，“R”和“反向引物”可互换使用，“P”和“探针”可互换使用。
本说明书所述的“严格条件”，可以为低严格条件、中严格条件、高严格条件中的任一种。“低严格条件”，如为5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、32℃的条件；此外，“中严格条件”，如为5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、42℃的条件；“高严格条件”，如为5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、50℃的条件。在这些条件下，预期温度越高越能有效得到同源性高的多核苷酸，如DNA。虽然影响杂交的严格度的因素有多种，如温度、探针浓度、探针长度、离子强度、时间、盐浓度等，但本领域技术人员可通过适当选择这些要素得到类似的严格度。
本文所用术语“样品”表示含有核酸或推测含有核酸的任何组合物。样品可来源于生物来源(“生物样品”)，例如组织(例如活组织检查样品)、提取物或培养物和生物或生理流体等。例如，样品可包括皮肤、血浆、血清、脊髓液、淋巴液、滑液、尿、泪水、血细胞、器官和肿瘤。并且，样品还可包括从取自个体的细胞建立的体外培养物的样品或经固定化的样品，例如福尔马林固定的石蜡包埋组织(FFPET)和从其分离的核酸分离物。
下面，本发明以于检测EGFR基因19外显子缺失突变组合及其试剂盒为例，解释说明本发明的实施方案。应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。
在数字PCR技术的应用中，由于其不依靠Ct值和标准曲线，仅通过终点荧光信号强度进行结果判读，因此对荧光本底信号及阳性荧光信号的信噪比要求较高，信噪比越高，越利于阈值的划分。尤其在检测突变丰度较低的突变时，为避免造成假阳性或假阴性的结果，高信噪比尤为重要。本发明提供一种可以大大降低荧光本底信号，同时灵敏度高，特异性好，成本低的引物探针设计方法来满足临床使用数字PCR技术检测的需要。
本发明的一种用于检测EGFR基因19外显子缺失突变的试剂盒，包括上述引物、样本DNA、dNTP、DNA聚合酶以及缓冲液，依次进行靶核酸序列的特异性富集、富集后模板的特异性扩增以及荧光信号的检测。该反应体系包含以下步骤：
首先，在PCR反应的前几个循环，第一引物(F1)以及第三引物(R)可以特异性的扩增靶核酸序列，野生型blocker寡核苷酸(阻断引物)与野生型模板结合，竞争性地抑制第一引物非特异性结合野生型模板。扩增后，会新增一段与第一引物上“信号检测区”互补的序列，供后续的第二引物(F2)进行配对识别。
在上述反应完成后，第二引物以及第三引物可以与对应的富集后模板进行配对并进行扩增，第三引物扩增至第二引物环区时，其上的二级结构被线性化或解折叠，从而使荧光基团与淬灭基团因此发出荧光信号，被仪器检测到。
在整个PCR反应过程中，参考引物rF，rR扩增相应的靶序列，并利用DNA聚合酶的5’核酸外切酶活性切割与模板结合的水解探针rP，检测体系内的模板总量。
本发明中所述的反应条件为：92℃～96℃预变性5～15分钟；92℃～95℃变性10～60秒，55℃～75℃退火及延伸30～90秒，35～50个循环；94℃～98℃灭活5～15分钟；4℃～15℃终止反应。
更优选的，本发明中所述的反应条件为：95℃预变性10分钟；94℃变性30秒，65℃退火延伸60秒，共进行45个循环；98℃灭活10分钟；10℃终止反应。
优选的，本发明中所述的反应体系中引物探针浓度分别是：F1引物的浓度为15nM～150nM，F2引物的浓度为150nM～1500nM，参考探针rP的浓度为50nM～800nM，下游引物R及参考引物rF，rR的浓度为150nM～1800nM，blocker寡核苷酸的浓度为150nM～1500nM。
更优选的，本发明中所述的反应体系中引物探针浓度分别是：F1引物的浓度为30nM～60nM，F2引物的浓度为300nM～600nM，参考探针rP的浓度为150nM～400nM，下游引物R的浓度为300nM～900nM，参考引物rF，rR的浓度为300nM～900nM，blocker寡核苷酸的浓度为300nM～600nM。
更进一步优选的，F1引物的浓度为90nM，F2引物的浓度为450nM，参考探针rP的浓度为250nM，下游引物R的浓度为450nM，参考引物rF，rR的浓度为450nM，blocker寡核苷酸的浓度为450nM。
在一个实施方案中，本发明中所述的EGFR基因19外显子缺失突变检测反应体系包含以下组分：
表1
其中，根据本发明所述的具体实施方案，DNA样本是来自于癌症患者外周血浆中提取的游离DNA样本，或来自于片段化的细胞系DNA样本，或来自于人工合成的质粒DNA样本。由于该反应体系中，用于特异性富集靶核酸的上游引物F1与下游引物R之间的长度不超过200bp，因此特别适用于检测短片段的DNA样本。
在本发明所述的具体实施方案，将反应缓冲液和引物探针预混液按照表1所述的反应体系混合，以合适的方法从待测样本中提取DNA并加入到配制完成的反应体系中，然后进行数字PCR微反应器(微滴)分区、PCR扩增以及荧光信号检测。根据荧光信号的有无，判断阴性/阳性微滴所占比例，得到靶核酸突变型样本以及野生型样本浓度(总核酸样本浓度)，进而计算出该样本中靶核酸序列的突变丰度。
[(突变型浓度)/(突变型浓度+野生型浓度)]*100％
例如在待测样本中突变型探针(FAM荧光信号)检出EGFR基因19外显子突变型靶核酸浓度为50拷贝/μL，同时参考探针(HEX荧光信号)检出体系内DNA总量(突变型+野生型)为10000拷贝/μL，则该待测样本中EGFR基因19外显子突变的丰度为:
[(50拷贝/μL)/(10000拷贝/μL)]*100％＝0.5％
本发明的实验设备及材料如下表
表2
设备/材料 厂家/型号
2X ddPCR Supermix for Probes Bio-Rad，货号1863010
微滴发生卡 Bio-Rad，货号1864008
ddPCR微滴发生油 Bio-Rad，货号1863005
密封条 Bio-Rad，货号1863009
微滴分析油 Bio-Rad，货号1863004
半裙边96孔板 Eppendorf，货号30128575
微滴发生仪 Bio-Rad，货号1864002
封膜仪 Bio-Rad，货号1814000
PCR热循环仪 Bio-Rad，货号1851197
微滴分析仪 Bio-Rad，货号1864003
HEK-293T细胞系 科佰生物，货号CBP-60026
NCI-H1650细胞系 科佰生物，货号：CBP60114
HCC-827细胞系 科佰生物，货号：CBP60101
引物 由生工生物合成
探针 由生工生物合成
分析软件 Bio-Rad，QuantaSoft数字PCR分析软件
EGFR基因19外显子缺失突变有4种临床常见的缺失突变类型。具体如下表所示。
表3
实施例1:
在本实施例中，本发明针对基因突变单重检测进行引物的设计。
1、样本制备：
使用QIAGEN公司QIAamp DNA Mini and Blood Mini Kit按照该试剂盒的操作说明书提取HEK-293T细胞DNA，NCI-H1650细胞系DNA，将两种细胞系DNA分别进行超声打断并经磁珠筛选纯化，分别得到野生型模板(HEK-293T细胞系DNA)与突变型模板(NCI-H1650细胞系DNA)，将两种模板按照一定的比例混合，得到含EGFR基因19外显子缺失突变(E746_A750del(1)，M1)的模拟临床样本。
同时使用片段化野生型DNA，制备成阴性对照(Neg)，使用TE Buffer作为无模板对照(NTC)。
2、引物的设计
具体如下表所示
表4(5’→3’)
其中，所述第一引物F1为针对EGFR19外显子缺失突变(p.E746_A750del(1)，Cosmic ID：6223)的引物，序列为SEQ ID NO:1，所述第二引物F2的序列为SEQ ID NO:2，所述blocker寡核苷酸序列(阻断引物)为SEQ ID NO:3，所述第三引物R的序列为SEQ ID NO:4；所述参考引物rF的序列为SEQ ID NO:5，所述参考引物rR的序列为SEQ ID NO:6，参考探针rP的序列为SEQ ID NO:7。其中，由SEQ ID NO:2所示的F2引物在5’端标记有FAM，第二引物上的第二茎干区的3’端与检测结合区的5’端之间标记有BHQ1。由SEQ ID NO:7所示的参考探针在5’端标记有HEX，3’端标记有BHQ1。
上述引物探针中，F1引物(SEQ ID NO:1)全长42bp，其3’端第1至第21个碱基为靶序列结合区，其5’端的第1至第20个碱基与F2(SEQ ID NO:2)引物的3’端的第1至第20个碱基(检测结合区)完全相同。F2(SEQ ID NO:3)引物全长37bp，其3’端第1至第20个碱基为其检测结合区，5’端8个碱基为其第一茎干区，5’端第9个碱基至第16个碱基为其第二茎干区。野生型blocker寡核苷酸(SEQ ID NO:3)全长27bp，与野生型模板配对结合。F1引物、第三引物R首先与突变型靶核酸进行特异性结合，进行突变型模板的富集扩增，生成的扩增产物会被添加一段来自F1引物5’端的碱基序列及其互补序列，然后F2引物、第三引物R与富集的突变型模板进行配对结合与扩增，F2引物上的二级结构区被线性化或解折叠，从而使荧光基团与淬灭基团分离，发出荧光信号并被检测到。在靶核酸模板的其它保守区域，rF与rR扩增模板并水解荧光标记探针rP，从而检测模板总量。
3、反应配制
样本准备完成后，按照表1中所述配比进行反应体系的配置。
在微滴生成之前，将配制完成的含有待测模板的20μL反应液放置于金属浴中，95℃变性1min后，立即放置2～8℃冰箱2～3min。
将冷却后的20μL PCR反应液加入到微滴发生卡的样本孔中，然后加入70μL微滴发生油至微滴发生卡的油孔中，最后使用密封条对微滴发生卡进行密封。
将制备好的微滴发生卡放入微滴发生器中，开始微滴生成。大约2min后，微滴制备完成，取出卡槽，从最上排孔中小心地转移出约40μL的微滴至96孔PCR板。
4、扩增读取
将96孔板进行封膜处理后，放置于PCR热循环仪中进行PCR扩增。所使用程序为：95℃预变性10分钟；94℃变性30秒，55℃退火延伸60秒，共进行48个循环；98℃灭活10分钟；10℃终止反应。
待PCR扩增结束，将96孔板放置于微滴分析仪中选择FAM/HEX通道进行信号读取。
使用QuantaSoft分析软件对荧光信号的强度、数目进行分析，得到EGFR基因19外显子突变型与野生型的拷贝数及浓度，并计算出突变丰度。
结果如图1所述，本发明方案特异性良好，在空白对照NTC反应(D09)及阴性对照Neg反应(E09)中均无假阳性荧光信号，在检测模拟临床样本(F09)时，突变型阳性荧光信号在7000左右，荧光本底信号在800左右，阈值划分清晰。并且，在检测NTC(D09)反应时，突变型及野生型浓度均为0；在检测Neg反应(E09)时，未检测到突变型浓度。
实施例2:
在本实施例中，本发明针对基因突变多重检测进行引物的设计。
1、样本制备
使用QIAGEN公司QIAamp DNA Mini and Blood Mini Kit按照该试剂盒的操作说明书分别提取HEK-293T细胞、HCC-827细胞的DNA(p.E746_A750del突变(2))，分别得到野生型模板(HEK-293T细胞系DNA)及突变型模板(HCC-827细胞的DNA)。
将野生型模板与突变型模板分别进行超声打断处理，并经磁珠筛选纯化后按照一定比例配制M2(p.E746_A750del突变(2))的模拟临床样本。
分别人工合成2种表3所示的突变型质粒(M3，M4)，作为对应的纯突变型模板，将质粒超声打断并经磁珠筛选纯化后分别与片段化的HEK-293T细胞系DNA(野生型模板)按照一定比例配制M3(L747_P753>S突变)、M4(E746_S752>V突变)的模拟临床样本。
多重检测体系中涉及的引物如表5所示，针对4种突变类型，设计3条引物(第一引物F1、第四引物F1-2、第五引物F1-3，该3条引物的结构相近，具有相同的信号检测区)，共用一条F2引物(第二引物，SEQ ID NO:2)进行单管检测。引物设计具体如下表所示。
表5
样本准备完成后，按照下表进行反应体系的配置。微滴生成及PCR反应过程，扩增读取过程同实施例1。
表6
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结果如图2所示，本发明方案在进行多重检测时特异性良好，在NTC反应(F01)及Neg反应(F03)中均无假阳性荧光信号，在检测模拟临床样本(M1、M2、M3、M4)(F05、F06、F07、F08)时，突变型阳性荧光信号在5000左右，荧光本底信号在800左右，阈值划分清晰。
实施例3
在本实施例中，本发明针对基因突变单重检测进行引物的设计。检测EGFR基因19外显子缺失突变(L747_P753>S，M3)。
具体的引物设计如下表：
表7
样本准备完成后，按照下表进行反应体系的配置。微滴生成及PCR反应过程，扩增读取过程同实施例1。
表8
试剂 浓度
2X ddPCR Supermix for Probes 1X
突变型F1-2 90nM
突变型F2 450nM
blocker寡核苷酸 450nM
下游引物R 450nM
参考引物rF 450nM
参考引物rR 450nM
参考探针rP 250nM
DNA样本 0.1ng～60ng
超纯水 加至20μL
对比例1
在本对比例中，针对基因突变单重检测进行引物探针的设计。检测EGFR基因19外显子缺失突变(L747_P753>S，M3)。
本对比例的检测原理为：首先利用第一正向引物F1和反向引物R特异性地富集待检测的靶核酸序列，扩增后，会新增一段与第一正向引物“信号信号检测区”互补的序列，供后续的第二正向引物F2及探针P进行配对识别。靶核酸模板富集后，利用退火温度的变化，使得第二正向引物F2及探针P识别预扩增产物上与第一正向引物“信号信号检测区”互补的序列，然后与反向引物R形成引物对并进行模板扩增，通过TaqMan水解探针原理释放荧光信号。
本对比例中的引物探针设计为TaqMan水解探针法设计引物探针，具体的如下表：
表9
样本准备完成后，按照下表进行反应体系的配置。微滴生成及PCR反应过程，扩增读取过程同实施例1。
表10
将实施例3与对比例1的结果进行比对，如图3和表11所示，两种方案在检测M3模板时，本发明方案(实施例3)在检测突变型模板时，荧光背景信号单一，且荧光背景强度显著降低，阈值划分清晰。
本发明方案在检测M3模板时，背景荧光信号强度均值为452，阳性荧光信号强度均值为7220；
信噪比：7220/452＝15.97；
而水解探针法(对比例1)检测M3模板时，背景荧光信号强度均值为2379，阳性荧光信号强度均值为8943；
信噪比：8943/2379＝3.76；
表11
因此本发明方案的信噪比可较水解探针法提升4.25倍，更利于阈值划分，检测结果更精确。
应该理解到，本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可在不悖离本发明主旨的情况下变化。还应理解本文所述的实施例仅仅是出于描述具体实施方案的目的，而非意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅由所附的权利要求限定。
本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。
序列表
<110> 迈克生物股份有限公司
<120> 用于核酸检测的组合、试剂盒及其应用
<130> MB2020
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
actcgtactc agtcaactct acgtcgctat caaaacatct cc 42
<210> 2
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 2
ccgcctgtac aggcggtact cgtactcagt caactct 37
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 3
ctatcaagga attaagagaa gcaacat 27
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 4
agcagaaact cacatcgag 19
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 5
cctccagagg atgttcaa 18
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 6
gcacataggt aatttccaaa 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tcccaaggac cacctcacag 20
<210> 8
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
actcgtactc agtcaactct aatcgctatc aaggaatcga aagcc 45
<210> 9
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
actcgtactc agtcaactct caacgctatc aaggttccga aagc 44
<210> 10
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
actcgtactc agtcaactct cctaaccgtt ccgcctgttc caatcgctat caaggaatcg 60
aaagcc 66
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
actcgtactc agtcaactct 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ctaaccgttc cgcctgttcc 20

Claims (4)

1.用于检测EGFR基因19外显子缺失突变的引物组合，其特征在于：包括第一引物，序列如SEQ ID NO:1所示；第二引物，序列如SEQ ID NO:2所示；阻断引物，序列如SEQ ID NO:3所示；第三引物，序列如SEQ ID NO:4所示；参考引物rF，序列如SEQ ID NO:5所示；参考引物rR，序列如SEQ ID NO:6所示；参考探针，序列如SEQ ID NO:7所示；第四引物，序列如SEQ IDNO:8所示；和第五引物，序列如SEQ ID NO:9所示。
2.根据权利要求1所述的引物组合，其特征在于：所述第一引物的浓度为90nM，所述第二引物的浓度为450nM，所述阻断引物的浓度为450nM，所述第三引物的浓度为450nM，所述参考引物rF的浓度为450nM，所述参考引物rR的浓度为450nM，所述参考探针的浓度为250nM。
3.一种用于检测EGFR基因19外显子缺失突变的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的引物组合，还包括反应缓冲液、阳性对照、阴性对照和/或空白对照。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述反应缓冲液含有KCl、MgCl2、Tris-HCl、二硫苏糖醇、dNTP和DNA聚合酶。
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