CN110592215A

CN110592215A - 检测核酸序列的组合物及检测方法

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Publication number: CN110592215A
Application number: CN201910925651.4A
Authority: CN
Inventors: 赵雨航; 王书芳; 葛志琪; 何辉煌; 李锦�
Original assignee: Mike Biological Ltd By Share Ltd
Current assignee: Mike Biological Ltd By Share Ltd
Priority date: 2019-09-27
Filing date: 2019-09-27
Publication date: 2019-12-20

Abstract

本发明公开一种高灵敏度的检测核酸序列的组合物及检测方法。该组合物包括：第一上游引物、第二上游引物、探针和下游引物；第一上游引物从5’端至3’端依次由下述两部分组成：(1)不匹配区：与靶核酸序列不发生互补配对；该不匹配区的序列从5’端至3’端包括与第二上游引物相同的序列，和与探针相同的序列；(2)匹配区：与靶核酸序列发生互补配对。与现有技术相比，本发明提供的引物探针组合物具有灵敏度高、特异性好、成本低等显著优势，适用于多种样本类型的核酸检测，具有极高的应用价值。

Description

检测核酸序列的组合物及检测方法

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种在核酸序列检测中提高检测灵敏度的方法。

背景技术

聚合酶链式反应(PCR)是不采用活的生物体而对DNA进行酶复制的分子生物学技术。PCR通常用于医学和生物研究实验室以承担多种任务，例如基因克隆、实验动物表型鉴定、转录组研究、遗传疾病的检测、基因指纹的鉴定、感染性疾病的诊断、亲子鉴定等等。由于其无可比拟的复制和精确能力，PCR被分子生物学家认为是核酸检测的首选方法。上世纪90年代后期，美国ABI公司推出的实时荧光定量PCR(Real Time Quantitative PCR，qPCR)技术及相关产品更是将PCR发展成为一种高灵敏、高特异性和精确定量的核酸序列分析技术。

但是，在PCR扩增过程中影响其扩增效率的因素有很多，不能保证在反应过程中扩增效率保持不变和实际样品与标准样品以及不同样品之间的扩增效率是相同的，由此导致其定量分析所依赖的基础——循环阈值(Ct)不是恒定不变的。因此qPCR的定量只是“相对定量”，其准确度和重现性依然不能够满足分子生物学定量分析的要求。

数字PCR(digital PCR,dPCR)技术是一种核酸分子绝对定量技术，其利用极限稀释的原理将一个荧光定量PCR反应体系分配到成千上万份单独的纳升级微反应器中，使得每个微反应器中包含或不包含1个或多个拷贝的目标核酸分子(DNA靶标)，再同时进行单分子模板PCR扩增。不同于荧光定量PCR在每个扩增循环进行时采集荧光的方法，数字PCR在扩增结束后对每个反应单元的荧光信号进行独立采集，最后通过泊松分布的原理及阳性/阴性的反应单元的比例得出目标分子的原始拷贝数或浓度。

相较于荧光定量PCR，数字PCR不依靠Ct值和标准曲线就可以进行精确的绝对定量检测，具有灵敏度高以及精确度高的优势。由于数字PCR在进行结果判读时仅判断“有/无”两种扩增状态，因此也不需要检测荧光信号与设定阈值线的交点，完全不依赖于Ct值的鉴定，所以数字PCR反应和结果判读受扩增效率的影响大大降低，对PCR反应抑制物的耐受能力大大提高。此外，数字PCR实验中对反应体系进行分配的过程可以极大程度上在局部降低与靶标序列有竞争作用的背景序列浓度。因此，由于数字PCR具有更高的灵敏度和精确度，在需要以高灵敏度对拷贝量低的差异性核酸分子进行定量和检测时，体现出相比于传统的荧光定量PCR的显著优势。尤其是在复杂背景中检测稀有突变，常见于肿瘤液体活检、无创产前检测、器官移植监测、病毒载量的精确定量、转基因作物的成分检测等，例如在肿瘤患者外周血中检测稀有突变标志物，或是基因表达差异研究等。

TaqMan竞争探针法和扩增阻滞系统(Amplification Refractory MutationSystem,ARMS)是目前现有的基因突变检测试剂中最多被采用的方法。其中，TaqMan探针的基本原理是利用扩增过程中Taq酶的5’核酸外切酶活性切靶序列结合的寡核苷酸探针，该探针5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团并被磷酸化以防止探针延伸，当引物延伸至寡核苷酸探针结合位置时，Taq酶可以将其切割成小片段，使得荧光报告基团与淬灭基团分开，从而发出荧光。将其运用在肿瘤基因点突变检测中，通常会采用两条竞争性探针，一条针对突变型的靶核酸序列，另一条针对野生型的靶核酸序列。由于突变型与野生型仅仅只有一个碱基的差异，因此两者常常发生交叉反应，从而影响检测试剂的特异性，造成假阴性或假阳性结果。鉴于此，有一些检测方法采用小沟结合剂(Minor Groove Binder,MGB)修饰竞争性探针或是采用锁核酸(Locked Nucleic Acid,LNA)探针来提高探针的特异性从而减少或避免交叉反应。然而这些探针修饰方法均属于国外专利，价格昂贵，不利于大规模的推广使用。

扩增阻滞系统(ARMS)，是利用DNA聚合酶缺乏3’外切酶活性的特点，如果引物的3’末端碱基不能与靶核酸序列正确的互补配对，那么靶核酸序列就不能被有效的扩增。在进行点突变的检测时，使用两条竞争性的ARMS上游引物，分别扩增突变型和野生型的靶核酸序列，两者共用一条水解探针以及一条下游引物，因此难以在一个反应管中实现突变型与野生型的同时检测，所以通常使用两个单独的反应体系分别检测突变型或野生型。然而由于来自患者的生物标本通常十分有限，特别是在液体活检时采集的外周血、尿液、灌洗液、脑脊液等样本中所含的靶核酸浓度极低，分管检测将极大的降低检测灵敏度，同时增加检测成本，不利于临床应用。

TaqMan竞争探针法和ARMS法除了上面提到的成本高、不能同时检测野生型与突变型等缺点以外，这两种方法的检测灵敏度还受限于靶核酸待测片段的序列长度，这是由于这两种方法均需要至少三部分与靶核酸序列配对：上游引物、探针、下游引物。在高度片段化的游离DNA检测中，由于DNA的片段化是随机的，对于序列较短的DNA片段，采用TaqMan法和ARMS法的检测灵敏度还有待提高。

在目前的数字PCR检测技术中，检测的灵敏度还受到检测样本中靶核酸含量的限制，因为起始样本的缺乏，往往是液体活检的“玻璃天花板”，无论数字PCR技术有多么灵敏，最低检测限永远都不可能超过DNA输入量的限制，所以在有限的样本量中提高可检测靶标的数量能极大地增加检测的灵敏度。Mariana等人发现(参见Mariana等，“Denaturation-Enhanced Droplet Digital PCR for Liquid Biopsies”，Clinical Chemistry，Published October 1,2018)，在微滴生成之前将待检测的DNA模板进行解链，使得每个微滴中只包含一个单链DNA分子，从而将阳性微滴数加倍。理论上看来，检测结果的靶标浓度应该是不解链时的两倍，但实际上却只是1.4-1.6倍，低于理论的两倍。这是因为如果样本是平整末端的DNA，那单独分析正义链和反义链可以将阳性微滴数量加倍；当样本是随机切割的不均匀末端，如cfDNA，将正义链与反义链分开可能导致短的那条链无法与引物结合，所以阳性微滴数量小于2倍。因此，Mariana等人使用末端修复酶将单链的模板进行末端修复，检测结果可以达到1.9倍左右，接近理论的两倍。虽然Mariana等人的方法可以在一定程度上提高检测的灵敏度，但需要额外的末端修复操作，增加了检测成本和操作复杂度。

综上，不仅需要一种灵敏度高、特异性好、成本低的引物探针设计方法来满足临床使用数字PCR技术检测的需要，也需要通过一定手段提高有限的DNA样本中靶序列的含量，这两个因素共同决定着数字PCR技术的在基因突变检测方面的准确度和灵敏度。

发明内容

为解决上述问题，本发明第一方面，提供一种用于核酸序列检测的引物探针组合物，其包括：第一上游引物(简称“F1”)、第二上游引物(简称“F2”)、水解探针(简称“P”)和下游引物(简称“R”)；

其中，第一上游引物从5’端至3’端依次由下述两部分组成：

(1)不匹配区：与靶核酸序列不发生互补配对；该不匹配区的序列从5’端至3’端包括与第二上游引物相同的序列，和与水解探针相同的序列；

(2)匹配区：与靶核酸序列发生互补配对。

在一些实施方案中，该引物探针组合物中仅一种下游引物，即第一上游引物和第二上游引物共用一种下游引物。优选地，下游引物与靶核酸序列的互补区位于第一上游引物与靶核酸序列的互补区的下游1-150bp区域内，例如，可以是1bp、20bp、40bp、70bp、90bp、110bp、130bp、150bp等。

在一些实施方案中，第一上游引物与第二上游引物的Tm值相同。在一些实施方案中，第一上游引物与第二上游引物的Tm值不同，即第一上游引物的Tm值可以高于第二上游引物的Tm值，也可以是第一上游引物的Tm值低于第二上游引物的Tm值。在一些优选实施方案中，第一上游引物的Tm值比第二上游引物的Tm值相差0℃-20℃，例如，可以是0℃、5℃、8℃、10℃、12℃、15℃、18℃、20℃等。在一些优选实施方案中，第一上游引物的Tm值比第二上游引物的Tm值更高。

在一些实施方案中，第一上游引物的3’端具有扩增决定位点，该扩增决定位点与靶序列上的变异检测位点互补，且扩增决定位点的上游具有由一个以上碱基组成的不与靶序列互补的错配区；在一些实施方式中，错配区的长度为1-15个碱基，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个碱基；在一些实施方案中，错配区位于第一上游引物的3’端的第2～14个碱基处。

在一些实施方案中，第一上游引物的匹配区和不匹配区之间间隔1个或多个碱基，也可以没有碱基间隔。第一上游引物的不匹配区不与靶核酸序列相同或互补配对或在高严格条件下杂交。

在一些实施方案中，探针带有报告基团。在优选的实施方案中，只有在探针被水解后，报告基团才是可检测的。在进一步的实施方案中，所述探针上带有报告基团和淬灭基团。在更进一步的实施方案中，所述报告基团可以是选自下组的荧光基团：FAM、HEX、VIC、ROX、Cy5、Cy3等；所述淬灭基团可以选自下组：TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3、DABCYL、QXL、DDQI等。在一些实施方案中，水解探针除报告基团和淬灭基团外不带有任何其他修饰，所述其他修饰例如MGB、LNA、PNA、BNA、SuperBase等。在一个优选实施方案中，本发明的探针为Taqman探针。在一个优选实施方案中，所述报告基团位于探针的5’端，淬灭基团位于探针的3’端。

在一些实施方案中，第一上游引物长度可以是50-120个碱基，优选为50-90个碱基。在一些实施方案中，第一正向引物的靶序列结合区的Tm值可以是40℃-90℃，优选为50℃-80℃，GC含量为40％-80％。

在一些实施方案中，第二上游引物长度可以是10-40个碱基，优选为13-30个碱基。在一些实施方案中，第二上游引物的Tm值可以是35℃-85℃，优选为55℃-75℃，GC含量为40％-80％。

在一些实施方案中，探针的长度为12-30个碱基。在进一步的实施方案中，探针的Tm值为55℃-75℃。在更进一步的实施方案中，探针的GC含量40％-80％。

在一些实施方案中，反向引物的长度为15-30个碱基。在进一步的实施方案中，反向引物的Tm值为55℃-75℃。在更进一步的实施方案中，反向引物的GC含量40％-80％。

本发明的第二方面，提供一种利用上述引物探针组合物进行核酸序列检测的方法，包括：

将待测样品与引物探针组合物、扩增试剂进行混合，得到样品混合物；

将样品混合物中的双链DNA变性为单链；

将样品混合物随机分配到500个以上的反应单元中，每个反应单元含有1条单链或不含有单链；

对所有反应单元进行统一的热循环扩增；

检测每个反应单元中单链的存在；

其中，上述“引物探针组合物”包括第一上游引物、第二上游引物、探针和下游引物，即为本发明第一方面提供的引物探针组合物。

上述“扩增试剂”是指用于PCR的试剂，包括但不限于dNTP、DNA聚合酶、以及一些促进PCR反应的试剂，例如KCl、MgCl₂、Tris-HCl、二硫苏糖醇(DTT)等。

上述“变性”的目的是破坏双链DNA上成对的互补碱基之间的氢键，从而允许双链分开成两条单链。在一些实施方案中，可以通过加热含有双链DNA混合物的方法来形成单链，例如，将混合物加热至90℃、92℃、95℃或98℃来解离双链DNA。通常，在双链解离时，需要将混合物在升高的温度下维持至少10秒或者更长，例如，30秒、1分钟、2分钟、5分钟，甚至更长，以实现双链DNA的90％或更高的解离。解离完成后，将其冷却至室温或室温以下。

在一些实施方案中，上述“变性”还可以通过改变溶液离子强度(例如，加入酸、碱、盐等)来破坏双链DNA之间的氢键，也可以采用酶(例如，解旋酶)来实现将双链DNA解离成单链DNA。

在一些实施方案中，上述“热循环扩增”包括以下内容：以第一上游引物(F1)和下游引物(R)作为引物对靶核酸序列进行预扩增，获得预扩增产物；以第二上游引物(F2)和下游引物(R)作为引物对预扩增产物进行继续扩增。在一些具体实施方案中，F1和R作为引物进行预扩增的循环数为3-10个循环；更优选地，预扩增的循环数为5-8个循环。在一些具体实施方案中，F2和R作为引物进行扩增、同时水解探针(P)进行测定的循环数为35-50个循环，更优选的，循环数为40-45个循环。

在一些具体实施方案中，上述预扩增比继续扩增的退火温度高5℃-20℃，更优选为高10℃-15℃。

预扩增及继续扩增所适用的程序及常用反应条件(如变性温度、时间等)是本领域所熟知的。例如，在一些示例性的实施方案中，预扩增及继续扩的具体反应条件可以是：92℃-96℃预变性5-15分钟；92℃-95℃变性10-60秒，55℃-75℃退火及延伸30-90秒，共进行3-10个循环；92℃-95℃变性10-60秒，45℃-65℃退火及延伸30-90秒，共进行35-50个循环；94℃-98℃灭活5-15分钟；4℃-15℃终止反应。

本发明扩增反应体系中引物和探针的浓度可以通过本领域常规实验来确定。在一些示例性的实施方案中，反应体系中F1引物的浓度为15nM-150nM，F2引物的浓度为150nM-1500nM，探针P的浓度为50nM-800nM，R引物的浓度为150nM-1800nM。在一些更优选的实施方案中，反应体系中F1引物的浓度为30nM-60nM，F2引物的浓度为300nM-600nM，探针P的浓度为150nM-400nM，引物R的浓度为300nM-900nM。

本发明中“检测每个反应单元中单链的存在”可采用TaqMan探针法的原理，即利用DNA聚合酶的5’-3’外切酶活性使探针水解进而产生荧光信号。若反应单元中含有欲检测的靶核酸，探针与靶核酸特异性结合，在热循环扩增过程中，即发出荧光信号。本发明中，对存在单链的反应单元进行计数也可采用TaqMan探针法的原理，由于每个反应单元中含有1条单链或不含有单链，所以发出荧光信号的反应单元数量就代表了反应体系中靶核酸的数量，最后通过泊松修正即可得到待测样品中靶核酸的浓度。

在一些实施方案中，待测样品可以是生物样品，例如生物体液、活体组织、冷冻组织、石蜡切片等。在一些优选的实施方案中，所述样品是，例如外周血、尿液、灌洗液、脑脊液、粪便、唾液等。

本发明提供的核酸序列检测的方法，可以是对待测样品中的某一种核酸进行检测，例如，仅检测样品中的突变型靶序列，或仅检测野生型靶序列，此时，扩增反应体系中可使用一种第一上游引物和一种探针。该检测方法还可以对两种以上的核酸进行检测，例如，同时检测一种突变型核酸和野生型核酸，或同时检测两种以上突变型核酸和野生型核酸等，此时，同一扩增反应体系中可使用多种(例如2种或更多种)第一上游引物(例如同一反应单元中具有多种第一上游引物)，以及多种(例如2种或更多种)探针(例如同一反应单元中具有多种探针)。例如，上述多种第一上游引物的匹配区不同，上述多种探针具有互相不同的序列和报告基因。任选地，上述多种第一上游引物的不匹配区也可以不同。在使用多种第一上游引物及探针的一些实施方案中，不同的第一上游引物可以共用同一种下游引物。

在一些实施方案中，本发明提供的核酸序列检测的方法，可用于检测核酸序列的变异。所述核酸序列变异可以是选自下组的一项或多项：碱基置换突变、插入突变、缺失突变、和倒位突变。在一些实施方案中，所述核酸序列变异是碱基置换突变，即待检测的两种靶序列(例如野生型和突变型)之间没有碱基数目的差别，例如，其中一个或多个碱基的类型不同。在一些实施方案中，所述核酸序列变异是点突变，即只有1个碱基的类型不同。

定义

在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。

如本文中所用，术语“核酸”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”可互换地使用，并且是指核苷酸单体的单链和/或双链聚合物，包括(但不限于)通过核苷酸间磷酸二酯键连接或核苷酸间类似物连接的2'-脱氧核糖核苷酸(DNA)和核糖核苷酸(RNA)。核酸中的核苷酸单体可称为“核苷酸残基”。核酸可以完全由脱氧核糖核苷酸构成、完全由核糖核苷酸构成或由其嵌合混合物构成，并且可以包括核苷酸类似物。核苷酸单体单元可以包含本文中所述的核苷酸中的任一个，包括(但不限于)核苷酸和/或核苷酸类似物。核酸的大小通常从几个核苷酸残基到几千个核苷酸残基不等。其中“寡核苷酸”通常指长度相对较短的核苷酸聚合物，例如1-80个。除非另外指出，否则每当呈现核酸序列时，都应了解，核苷酸从左到右是按5'到3'的顺序。非另行指出，否则“A”表示脱氧腺苷，“C”表示脱氧胞苷，“G”表示脱氧鸟苷，“T”表示脱氧胸苷，并且“U”表示脱氧尿苷。

根据本领域习惯用语，核酸的长度可表示为碱基、碱基对(缩写“bp”)、核苷酸/核苷酸残基(缩写为“nt”)或千碱基(“kb”)。在上下文允许的情况下，术语“碱基”、“核苷酸”、“核苷酸残基”可以描述单链或双链的多核苷酸。当该术语应用于双链分子时，其用于指整个长度，并且应理解为相当于术语“碱基对”。

术语“错配碱基”，是指DNA双螺旋结构中碱基之间的配对不是随意的碱基，总是腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)配对，鸟嘌呤(G)与胞嘧啶(C)配对的原则。若出现了A与C或G配对，或T与G或C配对，则为碱基错配。

术语“引物”表示这样的寡核苷酸：其与靶核酸中的序列杂交，且能够充当沿着核酸的互补链合成(在适合于这样的合成的条件下)的起始点。

本文中使用的术语“探针”表示这样的寡核苷酸：其与靶核酸中的序列杂交，且通常被可检测地标记。探针可以具有修饰(诸如3’-端修饰和/或5’-端修饰，其使探针可以被检测到或是被核酸聚合酶水解等)，所述修饰也可包括一个或多个生色团。

本文中使用的术语“靶序列”、“靶核酸”、“靶核酸序列”或“靶标”可互换使用且意指要扩增、检测或扩增并检测的核酸序列部分，其可在杂交、退火或扩增条件下与探针或引物进行退火或杂交。术语“杂交”表示两个核酸之间的碱基配对相互作用，其导致双链体的形成。不要求2个核酸在它们的全长上具有100％互补性才可实现杂交。

本发明中使用的术语“上游引物”，也称正向引物，是沿着负链进行不间断延长的寡核苷酸；本发明中使用的术语“下游引物”，也称反向引物，是沿着正链进行不间断延长的寡核苷酸。正链即有义链、正义链，也称编码链，一般位于双链DNA上端，方向从左到右为5’-3’，碱基序列和该基因mRNA基本相同；与该链结合的引物为反向引物；负链即无义链，也称非编码连，和正链互补，与该链结合的引物为正向引物。应理解，当正义链和反义链的指定发生互换时，对应的正向和反向引物命名也可随之互换。

在本发明的上下文中，简称“F1”和“第一上游引物”可互换使用，“F2”和“第二上游引物”可互换使用，“R”和“反向引物”可互换使用，“P”和“探针”可互换使用。

本文所用的术语“上游”、“位于/在……上游”、“上游具有……”等，在描述核酸序列的语境下是表示在同一核酸序列上比指代区域更靠近5’端的部分，例如可以是紧邻指代区域，也可以与指代区域有一个或多个碱基的间隔。本文所用的术语“下游”、“位于/在……下游”、“下游具有……”等，在描述核酸序列的语境下是表示在同一核酸序列上比指代区域更靠近3’端的部分，例如可以是紧邻指代区域，也可以与指代区域有一个或多个碱基的间隔。应了解，除另有说明外，在描述的核酸为双链核酸时，“上游”和“下游”的表示方法通常以正义链的5’端和3’端为准。

本文中术语“Taqman探针(TaqMan probe)”与“水解探针(hydrolysis probe)”可互换使用。Taqman探针是在Real-time PCR技术平台发展出的荧光检测技术，探针的5’端含有荧光报告基团，3’端含有荧光淬灭基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，当进行PCR扩增时，Taq DNA聚合酶的5’端到3’端的外切酶活性将探针酶切降解，使得报告基团和淬灭基团分离，发出荧光信号，从而达到荧光信号的积累与PCR产物形成完全同步。具体地，报告基团可利用FAM、FAM、HEX、VIC、ROX、Cy5、Cy3等，淬灭基团可利用TAMRA、TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3、DABCYL、QXL、DDQI，但并不局限于此。此外，Taqman探针还衍生出其他修饰形式，例如Taqman-MGB探针是在3’端具有小沟结合分子(minor groove binder，MGB)的Taqman探针，提高了探针的Tm值，缩短探针长度，便于多突变位点的同时检测。

本说明书所述的“严格条件”，可以为低严格条件、中严格条件、高严格条件中的任一种。“低严格条件”，如为5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、32℃的条件；此外，“中严格条件”，如为5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、42℃的条件；“高严格条件”，如为5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、50℃的条件。在这些条件下，预期温度越高越能有效得到同源性高的多核苷酸，如DNA。虽然影响杂交的严格度的因素有多种，如温度、探针浓度、探针长度、离子强度、时间、盐浓度等，但本领域技术人员可通过适当选择这些要素得到类似的严格度。

本文所用术语“突变丰度”是指突变型靶标基因的相对或绝对定量值，在检测中一般将“突变丰度”定义为突变型靶标基因分子数在总的DNA分子数中所占比例。

本文所用术语“待测样品”表示含有核酸或推测含有核酸的任何组合物。样品可来源于生物来源(“生物样品”)，例如组织(例如活组织检查样品)、提取物或培养物和生物或生理流体等。例如，样品可包括皮肤、血浆、血清、脊髓液、淋巴液、滑液、尿、泪水、血细胞、器官和肿瘤。并且，样品还可包括从取自个体的细胞建立的体外培养物的样品或经固定化的样品，例如福尔马林固定的石蜡包埋组织(FFPET)和从其分离的核酸分离物。

有益效果

本发明的引物探针组合物及方法与现有技术相比，其优点在于：

(1)靶核酸序列短：如背景技术中所述，TaqMan探针法以及ARMS法受限于靶核酸待测片段的序列长度。而本发明提供的引物探针设计方法相较于常规的TaqMan探针法以及ARMS法需要的靶核酸待测片段长度更短，最短可短至40bp以下。这一优势可以体现在不同的检测场景中，例如在高度片段化的游离DNA检测中，由于DNA的片段化是随机的，更短的检测片段可以检出更多的DNA靶标，进而大大提高检测的灵敏度。

(2)对靶核酸序列要求较低：与上述优点类似，本发明提供的引物探针设计方法由于探针P在预扩增完成后才能与上游引物F1的5’端互补序列互相配对结合，因此实际与靶核酸序列配对结合的部分只有两部分：F1的3’端序列以及下游引物R的序列。因此对于复杂的靶核酸序列检测时，本发明所述引物探针的设计方法可以避开GC不平衡区域，尤其在探针的设计难度上相对于TaqMan探针法以及ARMS更低。

(3)对样本中目标DNA含量要求较低：在分析目标DNA含量低于最优数量的样本时，本发明提供的引物探针组合物及检测方法可以用来有效的增加样本中的目标序列的数量，提高检测的灵敏度，从而减少因为样本数量过少产生的误差。因此，本发明更适用于目标DNA含量很低的稀少样本，例如血浆(cf DNA样本)，活检穿刺，或者FFPE样本。

(4)高灵敏度：本发明提供的引物探针组合物及检测方法，在复杂背景中检出靶核酸序列的最低灵敏度可达0.01％，更优选的，本发明在复杂背景中检出靶核酸序列的灵敏度为0.05％，即可保证在>95％的检测中能够在20,000拷贝的总核酸背景中可稳定检出10拷贝的靶核酸序列，或在30,000拷贝的总核酸背景中可稳定检出15拷贝的靶核酸序列。本发明可以实现低浓度样本以及低突变丰度样本的稳定检测，适用于临床对肿瘤患者外周血循环游离DNA样本的监测，反映患者肿瘤当前的状态，指导靶向用药以及用于预后监测等。

(5)高特异性：本发明提供的引物探针设计方法以及反应体系可以良好地避免交叉反应，即在检测突变型靶核酸序列时，无野生型或其它相近或具有同源性的靶核酸交叉反应。尤其在同时检测野生型与突变型时，两者交叉反应小，更有利于稀有突变的检测。

(6)适用范围广：本发明提供的引物探针组合物及检测方法，可检测小于200bp的短片段DNA，且对PCR抑制物的耐受良好，可以适用于多种样本类型的核酸检测，包括福尔马林固定石蜡包埋组织(FFPE)样本、新鲜组织样本、外周血样本、尿液样本、灌洗液样本、脑脊液样本、人工培养的细胞系样本、人工合成的质粒样本等。

(7)样本消耗少：本发明本发明提供的引物探针组合物及检测方法可在一个反应管中同时检测突变型与野生型靶核酸序列，并对两者进行绝对定量及突变丰度统计，特别适合用于稀少样本，如外周血循环肿瘤DNA样本的检测。

(8)成本低：本发明提供的引物探针设计方法及检测方法无需经过昂贵的MGB修饰或LNA修饰，大大减少引物探针使用成本，同时拥有更好的检测性能，满足临床使用的需要；此外，本发明在将目标DNA双链解旋成单链后，不需要使用末端修复酶将不均衡的游离DNA进行修复，减少了检测成本。

(9)实验步骤简便：本发明在将含有模板的反应体系经过解链步骤后，不需要在反应液中添加末端修复酶来进行修复，减少了实验步骤，节约了实验时间。

附图说明

图1为本发明引物探针组合物结构的一种实施方式示意图。第一上游引物F1从5’端至3’端依次包含不与靶序列结合的不匹配区、与靶序列结合的匹配区；第一上游引物F1的3’端具有扩增决定位点，该扩增决定位点与靶序列上的突变位点/SNP位点互补，在扩增决定位点的上游具有由一个以上碱基组成的不与靶序列互补的错配区；第一上游引物F1的不匹配区的序列从5’端至3’端包括与第二上游引物F2相同的序列，和与探针P相同的序列。

图2为实施例1中对片段化的NCI-H1975细胞系DNA样本(理论突变丰度10％)的检测结果散点图；

图3为实施例2中对片段化Colo 205细胞系DNA样本(BRAF V600E突变)检测结果散点图；

图4为实施例3中对片段化NCI-H1650细胞系DNA样本(EGFR 19del突变)的检测结果散点图；

图5为实施例4中反应体系1与反应体系2检测所得到的平均突变靶标浓度对比结果图；

图6为实施例5中反应体系3-5检测所得到的平均突变靶标浓度对比结果图。

具体实施方式

下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。

主要实验设备及材料如下：

设备/材料	厂家/型号
		2X ddPCR Supermix for Probes	Bio-Rad，货号1863010
微滴发生卡	Bio-Rad，货号1864008
		ddPCR微滴发生油	Bio-Rad，货号1863005
密封条	Bio-Rad，货号1863009
		微滴分析油	Bio-Rad，货号1863004
半裙边96孔板	Eppendorf，货号30128575
		微滴发生仪	Bio-Rad，货号1864002
封膜仪	Bio-Rad，货号1814000
		PCR热循环仪	Bio-Rad，货号1851197
微滴分析仪	Bio-Rad，货号1864003
		Colo 205细胞系	科佰生物，货号CBP-60026
引物	由生工生物合成
		探针	由生工生物合成
核酸片段化酶(KAPA Frag Kit)	Roche，货号7962495001
		分析软件	Bio-Rad，QuantaSoft数字PCR分析软件

实施例1

在本实施例中，选取一种常见的核酸变异为例对本发明的引物探针组合物及检测体系进行了测试。具体地，采用了人类EFGR基因的L858R突变为例模拟临床样品来评估了本发明检测体系的性能。

EFGR是非小细胞肺癌的常见驱动基因，其突变主要发生在18/19/20/21外显子，而45％以上的EGFR驱动突变都是由21外显子编码的第858个氨基酸从亮氨酸(L)变成了精氨酸(R)引起的，上述突变引起EGFR下游通路的持续激活，导致肿瘤的发生。同时，在靶向治疗的过程中，由EGFR基因L858R突变引起的肿瘤被发现对第一代EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)类药物敏感，因此对于EGFR基因L858R突变的定量检测以及持续跟踪对于靶向治疗尤为重要。

1.样品制备：

准备来自于健康人血浆提取的游离DNA，经二代测序确定不含有EGFR基因L858R突变，得到野生型游离DNA样本，作为阴性样本。

同时准备经过数字PCR定量的NCI-H1975细胞系DNA样本，经酶切进行片段化处理后，使用野生型DNA样本进行稀释至突变丰度10％的EGFR基因L858R突变样本，作为阳性样本。

空白对照为无DNA的Tris-EDTA缓冲液。

2.反应体系制备

2.1引物探针组合物

本发明引物及探针由生工生物工程股份有限公司合成制备而成。其中，引物探针组合物具体序列如表1所示。

表1：

上述引物探针中，两条不同的F1引物分别用于扩增突变型与野生型靶核酸序列。突变型F1引物(SEQ ID NO:1)全长65bp，野生型F1引物(SEQ ID NO:2)全长66bp，两者的3’端23个碱基与靶核酸序列配对，3’末端为EGFR基因L858R突变位点。突变型引物5’端的19个碱基与对应F2引物(SEQ ID NO:3)的碱基序列相同,野生型F1引物5’端的18个碱基分别与对应F2引物(SEQ ID NO:4)的碱基序列相同。在突变型F1引物5’端第22个碱基至第40个碱基序列与对应的突变型探针P(SEQ ID NO:5)的碱基序列相同。在野生型F1引物5’端第22个碱基至第40个碱基序列与对应的野生型探针P(SEQ ID NO:6)的碱基序列相同。因此在突变型F1引物以及野生型F1引物分别对靶核酸进行特异性扩增后，生成的扩增产物会被添加一段来自F1引物5’端的碱基序列及其互补序列，然后F2引物以及探针P才可以与对应的靶核酸模板配对结合并水解发出荧光信号。

2.2反应体系

PCR反应液中各试剂成分含量如表2所示。

表2：

2.3反应单元制备

将配制完成的PCR反应液采用95℃高温一分钟使双链DNA解链成单链，然后迅速降温，使其保持单链状态；

将上述解链后的PCR反应液20μL加入到微滴发生卡的样本孔中，然后加入70μL微滴发生油至微滴发生卡的油孔中，最后使用密封条对微滴发生卡进行密封；

将制备好的微滴发生卡放入微滴发生器中，开始微滴生成。大约2分钟后，微滴制备完成，取出卡槽，从最上排孔中小心的转移出约40μL的微滴悬浊液至96孔PCR板。

3.扩增读取

将96孔板进行封膜后，放置于PCR热循环仪中进行PCR扩增。反应体系所使用程序为：95℃预变性10分钟；94℃变性30秒，65℃退火延伸60秒，共进行5个循环；94℃变性30秒，52℃退火延伸60秒，共进行40个循环；98℃灭活10分钟；10℃终止反应。

待PCR扩增结束，将96孔板放置于微滴分析仪中选择FAM/HEX通道进行信号读取。

4.分析统计

使用QuantaSoft分析软件对荧光信号的强度、数目进行分析，得到EGFR基因L858R突变型与野生型的拷贝数及浓度，并计算出突变丰度。

经PCR扩增后，逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0，根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例即可得出靶分子的起始拷贝数或浓度，并根据阴性/阳性微滴所占比例，进而计算出该样本中靶核酸序列的突变丰度：

[(突变型浓度)/(突变型浓度+野生型浓度)]*100％

例如在待测样本中检出EGFR基因L858R突变型靶核酸浓度为50拷贝/μL，同时检出EGFR基因L858R野生型靶核酸浓度为9950拷贝/μL，则该待测样本中EGFR基因L858R突变的丰度为:

[(50拷贝/μL)/(50拷贝/μL+9950拷贝/μL)]*100％＝0.5％

对片段化的NCI-H1975细胞系DNA样本(理论突变丰度10％)的检测结果散点图如图2所示。

图2为2-D散点图，其左下角的象限表示“双阴性”的微滴，即不含野生型靶核酸模板也不含突变型靶核酸模板；其左上角的象限表示“突变阳性”的微滴，即不含野生型靶核酸模板只含有突变型靶核酸模板的微滴；其右下角的象限表示“野生阳性”的微滴，即只含有野生型靶核酸模板而不含突变型靶核酸模板的微滴；其右上角的象限表示“双阳性”的微滴，即这些微滴中既含有野生型靶核酸模板也含有突变型靶核酸模板。由于野生型靶核酸模板与突变型靶核酸模板之间仅有一个碱基的差异，因此“双阳性”的微滴中野生型信号与突变型信号容易交叉干扰，从而造成阈值划分的不准确。而从图2可看出，本发明所述试剂盒在“双阳性”的微滴检测时，不容易造成交叉干扰，从而使得阈值划分更精确，对低浓度的靶核酸检测的准确度更高。

此外，使用本发明所述试剂盒，阴性对照品及空白对照品的检测结果阴性符合率为100％。

使用本发明所述试剂盒，通过对理论突变丰度10％的稀释样本进行重复测试，经分析统计，得到本发明中所述试剂盒的测量精密度在理论突变丰度为10％的样本中，定量结果的CV值为5.24％，小于20％，平均值10.3％，标准差0.54％。

实施例2

为了进一步验证本发明引物及方法的效果，本实施例针对另一种基因变异(人BRAF基因V600E突变)进行了检测。

1.样品准备：

使用经过数字PCR定量的片段化Colo 205细胞系DNA样品，含突变丰度为65.8％的BRAF基因V600E突变，模拟临床循环肿瘤DNA。

具体而言，用QIAGEN公司DNA Mini Kit按照该试剂盒的操作说明书对含有BRAF基因V600E突变的Colo 205细胞系进行核酸提取，得到BRAF基因V600E突变细胞系基因组DNA。使用KAPA Frag Kit对提取后的BRAF基因V600E突变细胞系DNA进行酶切打断，得到片段长度在120-130bp左右的片段化突变型DNA，模拟临床循环肿瘤DNA的片段大小。

准备来自于健康人血浆提取的游离DNA，经二代测序确定不含有BRAF基因V600E突变，得到野生型游离DNA样本。

阳性对照为经测定突变丰度65.8％的BRAF基因V600E突变样本，阴性对照为片段化的野生型基因组DNA样本，空白对照为无DNA的Tris-EDTA缓冲液。

2.反应体系制备

2.1引物探针组合物

引物探针组合物具体序列如下表3所示。

表3：

引物及探针由生工生物工程股份有限公司合成制备而成。

上述引物中，突变型F1引物(SEQ ID NO:8)全长62bp，野生型F1引物(SEQ ID NO:9)全长61bp，两者的3’端23个碱基为与靶序列互补配对的匹配区，3’末端最后一个碱基为BRAF基因V600E突变位点，在3’端的第3个碱基位置引入了1个增强扩增阻滞的错配碱基。

2.2反应体系

PCR反应液中各试剂成分含量如表4所示。

表4：

2.3反应单元制备

与实施例1相同。

3.扩增读取

将96孔板进行封膜后，放置于PCR热循环仪中进行PCR扩增。反应体系所使用程序为：95℃预变性10分钟；94℃变性30秒，54℃退火延伸60秒；94℃变性30秒，54℃退火延伸60秒，共进行47个循环；98℃灭活10分钟；10℃终止反应。

4.分析统计

使用QuantaSoft分析软件对荧光信号的强度、数目进行分析，得到BRAF基因V600E突变型的拷贝数及浓度，并计算出突变丰度。

对片段化Colo 205细胞系DNA样本(BRAF V600E突变)检测结果散点图如图3所示。

图3为2-D散点图，其四象限表示的阴阳性微滴与图1类似。从图3可看出，本发明所述试剂盒在“双阳性”的微滴检测时，不容易造成交叉干扰，从而使得阈值划分更精确，可以很清楚地将野生型与突变型进行区分，对靶核酸检测的准确度更高。

使用本发明所述试剂盒，通过对理论突变丰度65.8％的稀释样本进行重复测试，得到本发明中所述试剂盒的测量精密度在理论突变丰度为65.8％的样本中，定量结果的CV值为1.13％，小于20％，平均值为65.6％，标准差0.74％。

实施例3

在本实施例中，使用NCI-H1650细胞系DNA样品针对人EGFR基因19号外显子突变，测试了本发明引物探针组合物及检测方法对于缺失突变的检测效果。

1.样品准备：

准备经超声纯化的293T细胞系DNA，经二代测序确定不含有EGFR基因19del突变，作为阴性样本。

同时准备经过数字PCR定量的NCI-H1650细胞系DNA样本，经片段化处理后，使用野生型DNA样本进行稀释至突变丰度10％的EGFR基因19del突变样本，作为阳性样本。

空白对照为无DNA的Tris-EDTA缓冲液。

2.反应体系制备

2.1引物探针组合物

本发明引物及探针由生工生物工程股份有限公司合成制备而成。其中，引物探针组合物具体序列如表5所示。

表5：

表5中，突变型F1的核苷酸序列中包括简并碱基R，对应A和G两种碱基。

2.2反应体系

PCR反应液中各试剂成分含量如表6所示。

表6：

2.3反应单元制备

与实施例1相同。

3.扩增读取

将96孔板进行封膜后，放置于PCR热循环仪中进行PCR扩增。所使用程序为：95℃预变性10分钟；94℃变性30秒，54℃退火延伸60秒；94℃变性30秒，54℃退火延伸60秒，共进行47个循环；98℃灭活10分钟；10℃终止反应。

4.分析统计

使用QuantaSoft分析软件对荧光信号的强度、数目进行分析，得到EGFR基因19del突变型的拷贝数及浓度，并计算出突变丰度。

对片段化NCI-H1650细胞系DNA样本(EGFR 19del突变)的检测结果散点图如图4所示。

图4为2-D散点图，其四象限表示的阴阳性微滴与图1类似。从图4可看出，本发明所述试剂盒在“双阳性”的微滴检测时，不容易造成交叉干扰，从而使得阈值划分更精确，可以很清楚地将野生型与突变型进行区分，对靶核酸检测的准确度更高。

使用本发明所述试剂盒，通过对理论突变丰度10％的稀释样本进行重复测试，得到本发明中所述试剂盒的测量精密度在理论突变丰度为10％的样本中，定量结果的CV值为2.02％，小于20％，平均值为9.9％，标准差0.20％。

实施例4

本实施例中，使用片段化NCI-H1975细胞系DNA样本(EGFR L858R突变)对比了同类厂家试剂盒的检测效果。

1.样品制备：

同时准备经过数字PCR定量的NCI-H1975细胞系DNA样本，经酶切进行片段化处理后，使用野生型DNA样本进行稀释至突变丰度10％的EGFR基因L858R突变样本。

将已制备好的片段化突变型DNA与片段化野生型DNA按一定比例混合后，采用数字PCR对其进行定量后，利用片段化野生型DNA对突变型DNA进行稀释，得到理论突变丰度为30％的混合样本，每个反应取15ng的混合样本进行检测，作为阳性样本。

空白对照为无DNA的Tris-EDTA缓冲液。

2.反应体系制备

2.1引物探针组合物

为体现本发明的效果，本实施例采用两个反应体系。

其中，反应体系1采用本发明提供的引物探针组合物，具体序列与实施例1相同；

反应体系2采用的引物探针组合物，借鉴的是厦门艾德生物医药科技有限公司公开的专利申请(CN105349654B)，其引物探针组合物具体序列如表7所示。

表7：

反应体系1和反应体系2的靶序列长度因引物和探针设计不同而不同，分别为60bp和121bp。

2.2反应体系

反应体系1的PCR反应液中各试剂成分含量与实施例1相同；

反应体系2的PCR反应液中各试剂成分含量如表8所示。

表8：

2.3反应单元制备

反应体系1在制备反应单元时，与实施例1相同；

反应体系2在制备反应单元时，除了没有加热变性成单链外，其余操作与实施例1相同。

3.扩增读取

将96孔板进行封膜后，放置于PCR热循环仪中进行PCR扩增。所使用程序为：95℃预变性10分钟；94℃变性30秒，52℃退火延伸60秒；94℃变性30秒，52℃退火延伸60秒，共进行47个循环；98℃灭活10分钟；10℃终止反应。

4.分析统计

使用QuantaSoft分析软件对荧光信号的强度、数目进行分析，得到EGFR基因L858R突变型的拷贝数及浓度，以及EGFR基因L858R野生型的拷贝数和浓度。

采用本发明的反应体系1和参考对比厂家的反应体系2，对片段化NCI-H1975细胞系样本进行进行5次相互独立的重复检测，其检测结果如表9所示。

表9：

本发明反应体系1与对比公司(艾德公司)反应体系2对相同样本进行检测所得到的平均突变靶标浓度对比结果如图5所示，具体数据结果如表10所示。

表10：

从表10及图5可以看出：在所加样本的类型和浓度含量相同的情况下，采用本发明提供的反应体系1检测得到的突变型平均浓度为114.0拷贝/微升，是反应体系2检测结果的3.8倍。也就是说，本申请提供的引物探针组合物及检测方法，能够检测出更多的突变型靶标，即检测灵敏度更高，相比同类产品的检测灵敏度提高约3.8倍。

实施例5

为了进一步验证本发明引物及方法的效果，本实施例设置3个不同的引物扩增体系，对本发明引物的扩增子长度及模板检出能力进行了探索。

1.样品制备：

准备来自于健康人的基因组DNA，经二代测序确定不含有EGFR基因L858R突变后，同样进行酶切打断，得到片段化野生型DNA，模拟临床游离DNA样本，作为阴性样本。

同时准备经过数字PCR定量的NCI-H1975细胞系DNA样本，经酶切进行片段化处理后，使用野生型DNA样本进行稀释至突变丰度75％的EGFR基因L858R突变样本。

将已制备好的片段化突变型DNA与片段化野生型DNA按一定比例混合后，采用数字PCR对其进行定量后，利用片段化野生型DNA对突变型DNA进行稀释，得到理论突变丰度为30％的混合样本，每反应取15ng的混合样本进行检测，作为阳性样本。

空白对照为无DNA的Tris-EDTA缓冲液。

2.反应体系制备

2.1引物探针组合物

为体现本发明的效果，本实施例采用了3个平行的扩增检测体系，其各自引物及探针如下：

反应体系3：具体序列与实施例1相同；

反应体系4和反应体系5，除下游引物的序列与反应体系3不同外，其余引物和探针均相同，反应体系3-5的下游引物分别如表11所示。

表11：

2.2反应体系

反应体系3-5的PCR反应液中各试剂成分含量与实施例1相同；

2.3反应单元制备

反应体系3-5在制备反应单元时，与实施例1相同；

3.扩增读取

4.分析统计

本实施例中，采用反应体系3-5对片段化NCI-H1975细胞系样本进行5次相互独立的重复检测，其检测结果如表12所示。

表12：

其中，反应体系3-5检测所得到的平均突变靶标浓度如图6所示。

从表12及图6可以看出，在所加样本的类型和浓度含量相同的情况下，不同的靶序列长度(即，扩增子长度)对于核酸检测的结果有显著差异，在对片段化的DNA模板定量检测时，更短的扩增子长度可以检出更多的靶核酸模板，从而在结果中得出更高的浓度及拷贝数。即，使用本发明所述的引物探针设计方法，可以有效减少靶核酸待测片段长度，提高对片段化靶核酸模板的检出率，因此对于稀有突变的检测，尤其是在外周血或其它体液中进行肿瘤突变靶标的检测时，本发明所述引物及检测方法拥有更好的检测性能。

实施例6

为了进一步验证本发明检测方法的效果，本实施例提供临床DNA样本在两种数字PCR检测方法(分别记为：检测方法A和检测方法B)下的检测灵敏度对比。

1.样品制备：

收集临床肺癌患者血浆样本，得到临床游离DNA样本。

空白对照为无DNA的Tris-EDTA缓冲液。

2.反应体系制备

2.1引物探针组合物

本实施例中两种数字PCR检测方法所采用的引物探针组合物与实施例1完全相同。其中，靶序列长度为60bp。

2.2反应体系

本实施例中两种数字PCR检测方法所采用的反应体系与实施例1均完全相同。

2.3反应单元制备

检测方法A：将配制完成的PCR反应液采用95℃高温一分钟使双链DNA解链成单链，然后迅速降温，使其保持单链状态；将上述解链后的PCR反应液20μL加入到微滴发生卡的样本孔中，然后加入70μL微滴发生油至微滴发生卡的油孔中，最后使用密封条对微滴发生卡进行密封；将制备好的微滴发生卡放入微滴发生器中，开始微滴生成。大约2分钟后，微滴制备完成，取出卡槽，从最上排孔中小心的转移出约40μL的微滴悬浊液至96孔PCR板。

检测方法B：将配制完成的PCR反应液20μL加入到微滴发生卡的样本孔中，然后加入70μL微滴发生油至微滴发生卡的油孔中，最后使用密封条对微滴发生卡进行密封；将制备好的微滴发生卡放入微滴发生器中，开始微滴生成。大约2分钟后，微滴制备完成，取出卡槽，从最上排孔中小心的转移出约40μL的微滴悬浊液至96孔PCR板。

3.扩增读取

本实施例中两种数字PCR检测方法所采用的扩增读取与实施例完全相同。

4.分析统计

使用QuantaSoft分析软件对荧光信号的强度、数目进行分析，得到EGFR基因L858R野生型的拷贝数和浓度。

本实施例中，采用检测方法A和检测方法B分别对临床样本进行3次相互独立的重复检测，得到的野生型靶标浓度如表13所示。

表13：

从表13可看出：在所加样本的类型和浓度含量相同的情况下，利用本发明的提供的引物探针组合物，采用检测方法A(即扩增前将DNA双链变性为单链)检测出的平均野生型靶标浓度为357.3拷贝/微升；采用检测方法B(即扩增前不将DNA双链变性为单链)检测出的平均野生型靶标浓度为181.7拷贝/微升。也就是说，采用本发明提供的引物探针组合物及检测方法，不需要添加末端修复酶进行末端修复，对靶标浓度的检测灵敏度提高了1.95倍。

序列表

<110> 迈克生物股份有限公司

<120> 检测核酸序列的组合物及检测方法

<130> MB-2019-1-023-1

<160> 26

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 65

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

actgctctaa cctccttcca tctcctcacg ctcgctctcc tcgtcaagat cacagatttt 60

ggtcg 65

<210> 2

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atcgctctaa cctccttcct tcgcacctac cgcagactcg catgtcaaga tcacagatta 60

tgggct 66

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

actgctctaa cctccttcc 19

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atcgctctaa cctccttc 18

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctcctcacgc tcgctctcc 19

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cgcacctacc gcagactcg 19

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atggtattct ttctcttccg 20

<210> 8

<211> 62

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

accgacagtg gtacgcaacg attcctatgc tcgctgtcgg gtgattttgg tctagctact 60

ga 62

<210> 9

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gcgtcacgtc ctgaagcagt cgtttcgcag atcgctcggg tgattttggt ctagctacgg 60

t 61

<210> 10

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

accgacagtg gtacgc 16

<210> 11

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gcgtcacgtc ctgaag 16

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

acgattccta tgctcgctgt 20

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

agtcgtttcg cagatcgct 19

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

cctcaattct taccatccac aa 22

<210> 15

<211> 65

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ccgtctcgca ttaacatatt cctaaccgtt ccgcctgttc caaacgtcgc tatcaarrca 60

tctcc 65

<210> 16

<211> 67

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

cgcctctcct aatcatctta ctctcgtctc agcctccatc cacgctatca aggaattaag 60

agaagca 67

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ccgtctcgca ttaacatatt 20

<210> 18

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

cgcctctcct aatcatctt 19

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ctaaccgttc cgcctgttcc 20

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ctctcgtctc agcctccatc c 21

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

caaagcagaa actcacatcg 20

<210> 22

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

gcagcatgtc aagatcacag attttgggcg 30

<210> 23

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

ccatgcagaa ggaggcaaag taagga 26

<210> 24

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

gtcaggaaaa tgctggctga cctaaag 27

<210> 25

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

tccttacttt gcctccttc 19

<210> 26

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

atgctggctg acctaa 16

Claims

1.检测核酸序列的引物探针组合物，包括：第一上游引物、第二上游引物、探针和下游引物；

所述第一上游引物从5’端至3’端依次由下述两部分组成：

(1)不匹配区：与靶核酸序列不发生互补配对；该不匹配区的序列从5’端至3’端包括与第二上游引物相同的序列，和与探针相同的序列；

(2)匹配区：与靶核酸序列发生互补配对。

2.根据权利要求1所述的引物探针组合物，其特征在于，所述下游引物与靶核酸序列的互补区位于第一上游引物与靶核酸序列的互补区的下游1-150bp区域内。

3.根据权利要求1所述的引物探针组合物，其特征在于，所述第一上游引物的Tm值与第二上游引物的Tm值相差0～20℃。

4.根据权利要求1所述的引物探针组合物，其特征在于，所述第一上游引物Tm值高于第二上游引物的Tm值。

5.根据权利要求1所述的引物探针组合物，其特征在于，所述第一上游引物的3’端具有扩增决定位点，所述扩增决定位点与靶序列上的变异检测位点互补，且扩增决定位点的上游具有由一个以上碱基组成的不与靶序列互补的错配区；优选地，所述第一上游引物的3’端的第2～14个碱基处含有1～15个碱基组成的不与靶序列互补的错配区。

6.根据权利要求1所述的引物探针组合物，其特征在于，所述探针的5’端和3’端上分别修饰报告基团和淬灭基团。

7.一种利用权利要求1-6任一项所述的引物探针组合物进行核酸序列检测的方法，该方法包括：

将待测样品与权利要求1-6任一项所述的引物探针组合物、扩增试剂进行混合，得到样品混合物；

将样品混合物中的双链DNA变性为单链；

对所有反应单元进行统一的热循环扩增；

检测每个反应单元中单链的存在。

8.根据权利要求7所述的核酸序列检测的方法，其特征在于，所述变性包括加热双链DNA；优选地，所述加热包括将所述双链DNA的温度升高至至少90℃。

9.根据权利要求7所述的核酸序列检测的方法，其特征在于，所述热循环扩增包括以下内容：以第一上游引物和下游引物作为引物对靶核酸序列进行预扩增，获得预扩增产物；以第二上游引物和下游引物作为引物对预扩增产物进行继续扩增。

10.根据权利要求7所述的核酸序列检测的方法，其特征在于，所述检测还包括对存在单链的反应单元进行计数。