CN110616261A - 一种用于检测egfr基因t790m突变的试剂盒及检测方法 - Google Patents

一种用于检测egfr基因t790m突变的试剂盒及检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110616261A
CN110616261A CN201910937501.5A CN201910937501A CN110616261A CN 110616261 A CN110616261 A CN 110616261A CN 201910937501 A CN201910937501 A CN 201910937501A CN 110616261 A CN110616261 A CN 110616261A
Authority
CN
China
Prior art keywords
detection
detected
mutation
dna
kit
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
CN201910937501.5A
Other languages
English (en)
Inventor
张鸿
聂志超
徐子静
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to CN201910937501.5A priority Critical patent/CN110616261A/zh
Publication of CN110616261A publication Critical patent/CN110616261A/zh
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种用于检测EGFR基因T790M突变的试剂盒以及基于此试剂盒的基因突变的检测方法，涉及基因检测技术领域。所述试剂盒包括等温扩增反应体系、检测反应体系和至少2种已知EGFR基因T790M突变频率的循环肿瘤DNA标准品。本发明所述试剂盒具有灵敏度高，特异性强，操作简单，携带方便等特点，非常适合用于肿瘤DNA分子低频突变的检测。基于本发明试剂盒的检测方法的检测灵敏度可以达到10‑18摩尔/升，即阿摩尔级别，特异性可以达到识别单个碱基的差异的核酸片段。

Description

一种用于检测EGFR基因T790M突变的试剂盒及检测方法
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，具体涉及一种用于检测EGFR基因T790M突变的试剂盒。
背景技术
目前20号外显子上的T790M突变为最为常见的一种基因突变，因此，针对这一突变涌现出的以Osimertinib为代表的第三代TKI进入大家的视线，T790M突变检测越来越热门，也急需一种简易快速的检测T790M突变的方法。
目前，已经有多个基于PCR检测的诊断平台用于EGFR突变检测，包括cobas法、ARMS法、BEAMing法、数字PCR法、HRM法、DHPLC法、质谱分析基因分型、电场诱导释放与测量法(EFIRM)和二代测序(NGS)。
快速检测高灵敏度和单碱基特异性的核酸数据有助于对人体各项生理指标的检测。基因突变检测已成为精准医疗中一项重要临床分析指标，以此监测临床动态及治疗效果评估，为医生制定精准医疗方案提供相应的科学数据。而传统检测技术主要利用核酸杂交探针的原理，通过QPCR分析目的片段的已知突变基因位点并进行定量分析。但是传统的基因分型技术主要检测DNA，不仅依赖于复杂的温控设备，还受到核酸聚合酶本身活性的限制，难以在临床样品中直接检出低频突变。
发明内容
为了解决传统检测EGFR基因T790M突变频率手续复杂，检测时间长，检测成本高的问题，实际在临床中仅需要检测检测EGFR基因是否发生了T790M耐药突变，并不需要精确的知晓其突变频率，本发明提供了一种用于检测EGFR基因T790M突变的试剂盒及检测方法，可以快速判读血液DNA中EGFR基因是否发生T790M突变，并知晓基因突变频率区间，为医生的诊断提供准确的科学依据，降低了检测时间和成本。
一种用于检测EGFR基因T790M突变的试剂盒，所述试剂盒包括等温扩增反应体系、检测反应体系和至少2种已知EGFR基因T790M突变频率的ctDNA标准品；
所述等温扩增反应体系包括：T790M位点检测引物、Rehydration Buffer、MgAC和RPA冻干酶；
其中，所述T790M检测引物包括引物T790M-F和引物T790M-R：
所述引物T790M-F的碱基序列如下：
GAAATTAATACGACTCACTATAGGGCATCTGCCTCACCTCCACCGTGCAGCTCATC。
所述引物T790M-R的碱基序列如下：
TTCCCGGACATAGTCCAGGAGGCAGCCGAAGGGC；
其中，所述RPA冻干酶，包括噬菌体重组酶UvsX，辅助因子UvsY，DNA聚合酶，单链DNA结合蛋白和dNTPs。
Cas13a酶混合液、检测突变型探针、T7酶混合液，RNA信号报告分子1，RNA信号报告分子2，MgCl2和横向流动试纸条；
所述检测突变型探针为T790MProbe，所述T790MProbe的碱基序列为：
TAATACGACTCACTATAGGGGATTTAGACTACCCCAAAAACGAAGGGGACTAAAACGCATCATGAGCTGCACGGTGGAGGTGAG。
其中，所述T7酶混合液，包括T7 DNA聚合酶和rNTPs。
其中，所述RNA信号报告分子1的序列为：
/56-FAM/mArArUrGrGrCmAmArArUrGrGrCmA/3TAMRA/，其中5’端用FAM标记，3’端用TAMRA标记。
其中，所述RNA信号报告分子2的序列为：
/56-FAM/mArArUrGrGrCmAmArArUrGrGrCmA/3Bio/，其中5’端用FAM标记，3’端用生物素标记。
其中，所述横向流动试纸条前端包被有带FAM抗体的纳米金粒，检测线上包被有生物素抗体，质控线上包被有固定抗体。
所述已知EGFR基因T790M突变频率的ctDNA标准品为EGFR基因T790M位点0.1～10％突变型中的两种或多种。
同时，本发明还提供了一种基于上述的试剂盒的检测T790M突变频率的方法，所述检测方法如下：
①提取待检测外周血的DNA作为待检测样品，配制成待测DNA溶液；
②取待测DNA溶液、ctDNA标准品溶液和无核酸水分别加入等温扩增反应体系中，混匀；将反应板置于37℃反应60分钟，反应结束后，分别得到待测DNA和ctDNA标准品的等温扩增反应产物；其中，所述等温扩增反应体系为：T790M-F含量0.48μM；T790M-R含量0.48μM；Rehydration Buffer、MgAC含量2μL和RPA冻干酶。
③取3μL-5μL扩增产物直接加入到检测反应体系中，所述检测反应体系为：Cas13a酶混合液含量82.58nM；T790MProbe含量0.4μM；RNA信号报告分子1含量200nM；rNTP Mix含量5μL；T7酶混合液含量1μL；MgCl2含量5mM；
④将待测DNA荧光体系、ctDNA标准品荧光体系和无核酸水荧光体系均置于酶标仪上检测荧光信号，设置反应条件为37℃，其中酶标仪的激发波长为490±10nm，发射波长为520±10nm；在反应过程中每5分钟记录520nm处的荧光信号值，反应时间为120分钟。
最终通过以下公式计算最终信号：最终荧光信号F＝∑【F实验组每个时间点-F实验组最初-(F阴性对照组每个时间点-F阴性对照组最初)】，阴性对照组为每个实验组相对应的无核酸水的阴性信号组。
⑤将待测DNA荧光体系的数字荧光值和ctDNA标准品荧光体系和无核酸水荧光体系的数字荧光值区间比对，待测DNA荧光体系的数字荧光值所在的ctDNA标准品区间为其T790M突变频率区间。
所述检测反应体系体系中的RNA信号报告分子1更换成RNA信号报告分子2即可进行横向流动试纸条的检测。所述检测方法如下：
①提取待检测外周血的DNA作为待检测样品，配制成待测DNA溶液；
②取待测DNA溶液、ctDNA标准品溶液和无核酸水分别加入等温扩增反应体系中，混匀；将反应板置于39℃反应20～40分钟，反应结束后，分别得到待测DNA和ctDNA标准品的等温扩增反应产物；其中，所述等温扩增反应体系为：T790M-F含量0.48μM；T790M-R含量0.48μM；Rehydration Buffer、MgAC含量2μL和RPA冻干酶。
③取3μL-5μL扩增产物直接加入到检测反应体系中，所述检测反应体系为：Cas13a酶混合液含量82.58nM；T790MProbe含量0.4μM；RNA信号报告分子2含量200nM；rNTP Mix含量5μL；T7酶混合液含量1μL；MgCl2含量5mM；
④将待测DNA荧光体系、ctDNA标准品荧光体系和无核酸水荧光体系均置于温控反应设备中，设置反应条件为37℃，反应结束后，分别取10μL反应产物进行横向流动试纸条检测。
所述待测DNA溶液的DNA含量为10ng/μL。
有益效果
本发明将血液游离DNA中EGFR基因的T790M位点进行扩增并获得转录产物，然后针对目的基因靶向设计RNA引导序列，并在检测体系中加入RNA信号报告分子，利用Cas13a蛋白酶的特性，识别靶标RNA序列后可被激活的RNA酶广谱活性，释放RNA信号报告分子，实现信号的放大和读取，其中信号的强度与循环肿瘤DNA的突变频率具有正相关，能根据已知基因突变频率的标准品信号区间进行快速判读。本发明所述方法的检测灵敏度可以达到10-18摩尔/升，即阿摩尔级别，特异性可以达到识别单个碱基的差异的核酸片段。除此之外，本发明利用横向流动试纸条对T790M基因扩增产物进行可视化定性检测，整个反应在37℃条件下，即可通过肉眼观察试纸条的条带颜色，快速判读野生型和突变型型的模板。
本发明不需要复杂昂贵的温控设备，通过对比标准品就可以高灵敏度、高准确性地检测到肿瘤组织各处来源的T790M异常基因，能快速的判断出T790M的基因突变率，根据T790M的基因突变率可以为肿瘤早期诊断提供相关的数据信息。而现有的EGFR多位点联合qPCR方法检测试剂盒的灵敏度和精密度很难达到要求。本发明是为T790M检测单独设计的检测组合，对T790M突变患者治疗和用药提供理论指导。
附图说明
图1为不同反应时间节点酶标仪显示的标准品荧光检测结果。
图2为体系反应时间为2小时，四种标准品体系的酶标仪数据分析图。
图3为不同突变频率标准品在试纸条上的检测结果。
具体实施方式
下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
本实施例中
rNTP Mix来源于New England Biolabs的试剂盒HiScribe T7 Quick High YieldRNA Synthesis kit；
RNA信号报告分子来源于IDT公司；
Rehydration Buffer来源于Twista的试剂盒Basic kit；
RPA冻干酶来源于Twista的试剂盒Basic kit；
T7酶混合液来源于New England Biolabs的试剂盒HiScribe T7 Quick HighYield RNA Synthesis kit；
50mM的MgCl2为Bioline公司；
280mM的MgAc来源于Twista公司的试剂盒Basic kit；
标准品1～4为未因生物的Multiplex I cfDNA Reference Standard Set多元游离DNA标准品；
无核酸水来源于赛默飞公司的Nuclease-Free Water(not DEPC-Treated)。
实施例1
本实施例提供了一种用于检测EGFR基因T790M突变的试剂盒，包括等温扩增反应体系、检测反应体系和已知EGFR基因T790M突变频率的ctDNA标准品。
所述等温扩增反应体系包括：
所述等温扩增反应体系包括：T790M位点检测引物、Rehydration Buffer、MgAC和RPA冻干酶；
其中，所述T790M位点检测引物包括引物T790M-F和引物T790M-R：
所述引物T790M-F的碱基序列如下：
GAAATTAATACGACTCACTATAGGGCATCTGCCTCACCTCCACCGTGCAGCTCATC。
所述引物T790M-R的碱基序列如下：
TTCCCGGACATAGTCCAGGAGGCAGCCGAAGGGC。
所述检测反应体系包括：Cas13a Enzyme Mix、检测突变型探针、dNTP Mix、T7 RNAPolymerase Mix和MgCl2。
所述检测突变型探针为T790MProbe，所述T790MProbe的碱基序列为：
TAATACGACTCACTATAGGGGATTTAGACTACCCCAAAAACGAAGGGGACTAAAACGCATCATGAGCTGCACGGTGGAGGTGAG。
所述已知EGFR基因T790M突变频率的ctDNA标准品包括ctDNA标准品1，ctDNA标准品2、ctDNA标准品3和标准品4。其中，所述ctDNA标准品1为10ng/μL EGFR基因T790M位点野生型、所述ctDNA标准品2为10ng/μL EGFR基因T790M位点0.1％突变型、所述ctDNA标准品3为10ng/μL EGFR基因T790M位点1％突变型、所述ctDNA标准品4为10ng/μL EGFR基因T790M位点5％突变型。
基于上述试剂盒，本发明提供了一种简易的检测T790M突变频率的方法，所述检测方法如下：
(1)提取待检测外周血的游离DNA作为待检测样品，配制成10ng/μL待测DNA溶液。
(2)取4μL待检测样品、ctDNA标准品1、ctDNA标准品2、ctDNA标准品3、ctDNA标准品4和无核酸水分别加入等温扩增反应体系中，混匀；将反应板置于37℃反应60分钟，反应结束后，分别得到待检测样品和标准品的等温扩增反应产物。
其中，所述等温扩增反应体系为：
试剂 用量
浓度为10μM的T790M-F 2.4μL
浓度为10μM的T790M-R 2.4μL
RehydrationBuffer 29.5μL
浓度为280mM的MgAc 2.5μL
RPA冻干酶 9.2μL
(3)分别在检测反应体系中加入3μL扩增产物，
其中，所述检测反应体系为：
成分 含量
Cas13a酶混合液 82.58nM
T790MProbe 0.4μM
RNA信号报告分子1 200nM
dNTPMix 5μL
T7酶混合液 1μL
MgCl<sub>2</sub> 5mM
(4)将待测DNA荧光体系、ctDNA标准品荧光体系和无核酸水荧光体系均置于酶标仪上检测荧光信号，设置反应条件为37℃，其中酶标仪的激发波长为490±10nm，发射波长为520±10nm；在反应过程中每5分钟记录520nm处的荧光信号值，反应时间为120分钟。最终通过以下公式计算最终信号：最终荧光信号F＝∑【F实验组每个时间点-F实验组最初-(F阴性对照组每个时间点-F阴性对照组最初)】，阴性对照组为每个实验组相对应的无核酸水的阴性信号组。
检测结果判定：
待测ctDNA的荧光信号区间 结果判定
标准品1<待测ctDNA<标准品2 阳性，突变频率为0-0.1％
标准品2<待测ctDNA<标准品3 阳性，突变频率为0.1％-1％
标准品3<待测ctDNA<标准品4 阳性，突变频率为1％-5％
标准品4<待测ctDNA 阳性，突变频率大于5％
待测ctDNA≥标准品1 阴性
本实施例采用赛默飞公司的QuantStudio6 Flex的实时荧光定量PCR系统进行FAM荧光信号收集。也可在反应过程中实时监测FAM荧光信号。
图1为不同反应时间节点酶标仪显示的标准品体系荧光检测结果。由图1可以看出，标准品体系检测反应进行到35分钟以后，就可以利用附带切割效应有效区分5％、1％、0.1％和野生型四种不同突变频率的标准品。其中信号检测到的最佳时间段为60-120分钟。
图2为体系反应时间为2小时，四种标准品体系的酶标仪数据分析图。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。分析结果显示，EGFR基因T790M 5％和1％分别与野生型相比，存在显著差异，0.1％与野生型标准品相比也存在显著差异，表明可以利用附带切割效应有效区分5％、1％、0.1％和野生型四种不同突变频率的标准品。
实施例2
本实施例提供了一种用于检测EGFR基因T790M突变的试剂盒，包括等温扩增反应体系、检测反应体系和已知EGFR基因T790M突变频率的ctDNA标准品。
T790M位点检测引物、Rehydration Buffer、MgAC和RPA冻干酶；
其中，所述T790M位点检测引物包括引物T790M-F和引物T790M-R：
所述引物T790M-F的碱基序列如下：
GAAATTAATACGACTCACTATAGGGCATCTGCCTCACCTCCACCGTGCAGCTCATC。
所述引物T790M-R的碱基序列如下：
TTCCCGGACATAGTCCAGGAGGCAGCCGAAGGGC。
所述检测反应体系包括：Cas13a Enzyme Mix、检测突变型探针、dNTP Mix、T7 RNAPolymerase Mix和MgCl2。
所述检测突变型探针为T790MProbe，所述T790MProbe的碱基序列为：
TAATACGACTCACTATAGGGGATTTAGACTACCCCAAAAACGAAGGGGACTAAAACGCATCATGAGCTGCACGGTGGAGGTGAG。
所述已知EGFR基因T790M突变频率的ctDNA标准品包括ctDNA标准品1，ctDNA标准品2、ctDNA标准品3和标准品4。其中，所述ctDNA标准品1为10ng/μL EGFR基因T790M位点野生型、所述ctDNA标准品2为10ng/μL EGFR基因T790M位点0.1％突变型、所述ctDNA标准品3为10ng/μL EGFR基因T790M位点1％突变型、所述ctDNA标准品4为10ng/μL EGFR基因T790M位点5％突变型。
基于上述试剂盒，本发明提供了一种简易的检测T790M突变频率的方法，所述检测方法如下：
(1)提取待检测外周血的游离DNA作为待检测样品，配制成10ng/μL待测DNA溶液。
(2)取4μL待检测样品、ctDNA标准品1、ctDNA标准品2、ctDNA标准品3、ctDNA标准品4和无核酸水分别加入等温扩增反应体系中，混匀；将反应板置于37℃反应60分钟，反应结束后，分别得到待检测样品和标准品的等温扩增反应产物。
其中，所述等温扩增反应体系为：其中，所述等温扩增反应体系为：
试剂 用量
浓度为10μM的T790M-F 2.4μL
浓度为10μM的T790M-R 2.4μL
RehydrationBuffer 29.5μL
浓度为280mM的MgAc 2.5μL
RPA冻干酶 9.2μL
(3)分别在检测反应体系中加入3μL扩增产物。
其中，所述检测反应体系为：
成分 含量
Cas13a酶混合液 82.58nM
T790MProbe 0.4μM
RNA信号报告分子2 200nM
rNTPMix 5μL
T7酶混合液 1μL
MgCl<sub>2</sub> 5mM
(4)将待检测体系置于37℃避光条件下反应60min后进行横向流动试纸条检测。
图3为不同突破频率的cfDNA标准品在横向流动试纸条上的检测结果。分析结果显示：突变型标准品5％、1％和0.1％与野生型标准品相比，其检测线的条带有明显的亮度差异，可以通过肉眼直接观察并进行判读。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，标准品的数量可以无限制的增加，其待测的精度也会随着标准品的增加而增加。
尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于检测EGFR基因T790M突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括等温扩增反应体系、检测反应体系和至少2种已知EGFR基因T790M突变频率的ctDNA标准品；
所述等温扩增反应体系包括：T790M位点检测引物、Rehydration Buffer、MgAC和RPA冻干酶；
其中，所述T790M检测引物包括引物T790M-F和引物T790M-R：
所述引物T790M-F的碱基序列如下：
GAAATTAATACGACTCACTATAGGGCATCTGCCTCACCTCCACCGTGCAGCTCATC。
所述引物T790M-R的碱基序列如下：
TTCCCGGACATAGTCCAGGAGGCAGCCGAAGGGC；
所述检测反应体系包括：Cas13a酶混合液、检测突变型探针、T7酶混合液，RNA信号报告分子1，RNA信号报告分子2，MgCl2和横向流动试纸条；
所述检测突变型探针为T790MProbe，所述T790MProbe的碱基序列为：
TAATACGACTCACTATAGGGGATTTAGACTACCCCAAAAACGAAGGGGACTAAAACGCATCATGAGCTGCACGGTGGAGGTGAG；
其中，所述RNA信号报告分子1的序列为：
/56-FAM/mArArUrGrGrCmAmArArUrGrGrCmA/3TAMRA/，其中5’端用FAM标记，3’端用TAMRA标记；
其中，所述RNA信号报告分子2的序列为：/56-FAM/mArArUrGrGrCmAmArArUrGrGrCmA/3Bio/，其中5’端用FAM标记，3’端用生物素标记。
2.根据权利要求1所述的用于检测EGFR基因T790M突变的试剂盒，其特征在于：所述RPA冻干酶，包括噬菌体重组酶UvsX，辅助因子UvsY，DNA聚合酶，单链DNA结合蛋白和dNTPs。
3.根据权利要求1所述的用于检测EGFR基因T790M突变的试剂盒，其特征在于：所述T7酶混合液，包括T7 DNA聚合酶和rNTPs。
4.根据权利要求1所述的用于检测EGFR基因T790M突变的试剂盒，其特征在于：所述横向流动试纸条前端包被有带FAM抗体的纳米金粒，检测线上包被有生物素抗体，质控线上包被有固定抗体。
5.根据权利要求1所述的用于检测EGFR基因T790M突变的试剂盒，其特征在于：所述已知EGFR基因T790M突变频率的ctDNA标准品为EGFR基因T790M位0.1～10％突变型中的两种或多种。
6.一种基于权利要求1所述的试剂盒的检测T790M突变频率的方法，其特征在于：所述检测方法如下：
①提取待检测外周血的DNA作为待检测样品，配制成待测DNA溶液；
②取待测DNA溶液、ctDNA标准品溶液和无核酸水分别加入等温扩增反应体系中，混匀；将反应板置于37℃反应60分钟，反应结束后，分别得到待测DNA和ctDNA标准品的等温扩增反应产物；
其中，所述等温扩增反应体系包括：T790M-F；T790M-R；Rehydration Buffer、MgAC和RPA冻干酶；
③将扩增产物直接加入到检测反应体系中，其中，所述检测反应体系包括：Cas13a酶混合液；T790MProbe；RNA信号报告分子1；rNTP Mix；T7酶混合液和MgCl2；其中，所述RNA信号报告分子1的序列为：
/56-FAM/mArArUrGrGrCmAmArArUrGrGrCmA/3TAMRA/，其中5’端用FAM标记，3’端用TAMRA标记；
④将待测DNA荧光体系、ctDNA标准品荧光体系和无核酸水荧光体系均置于酶标仪上检测荧光信号，设置反应条件为37±2℃，其中酶标仪的激发波长为490±10nm，发射波长为520±10nm；在反应过程中记录520±10nm处的荧光信号值和反应时间为120分钟。
通过以下公式计算最终信号：最终荧光信号F＝∑【F实验组每个时间点-F实验组最初值-(F阴性对照组每个时间点-F阴性对照组最初值)】，其中，阴性对照组为每个实验组相对应的无核酸水的阴性信号组。
⑤将待测DNA荧光体系的数字荧光值和ctDNA标准品荧光体系和无核酸水荧光体系的数字荧光值区间比对，待测DNA荧光体系的数字荧光值所在的ctDNA标准品区间为其T790M突变频率区间。
7.根据权利要求6所述的检测T790M突变频率的方法，其特征在于：所述检测反应体系体系中的RNA信号报告分子1更换成RNA信号报告分子2即可进行横向流动试纸条的检测。所述检测方法如下：
①提取待检测外周血的DNA作为待检测样品，配制成待测DNA溶液；
②取待测DNA溶液、ctDNA标准品溶液和无核酸水分别加入等温扩增反应体系中，混匀；将反应板置于39℃反应20～40分钟，反应结束后，分别得到待测DNA和ctDNA标准品的等温扩增反应产物；其中，所述等温扩增反应体系为：T790M-F含量0.48μM；T790M-R含量0.48μM；Rehydration Buffer、MgAC含量2μL和RPA冻干酶。
③取3μL-5μL扩增产物直接加入到检测反应体系中，所述检测反应体系为：Cas13a酶混合液含量82.58nM；T790MProbe含量0.4μM；RNA信号报告分子2含量200nM；rNTP Mix含量5μL；T7酶混合液含量1μL；MgCl2含量5mM；
④将待测DNA荧光体系、ctDNA标准品荧光体系和无核酸水荧光体系均置于温控反应设备中，设置反应条件为37℃，反应结束后，分别取10μL反应产物进行横向流动试纸条检测。
8.根据权利7所述横向流动试纸条的检测，其特征在于：利用带生物素和FAM标记的RNA信号报告分子2，横向流动试纸条的前端包被有带FAM抗体的纳米金颗粒，检测线上包被有生物素抗体，当反应液进入试纸条时，带有FAM标记的RNA信号报告分子2会通过抗原抗体结合，在控制线上形成复合体并显色，而只有识别靶标RNA序列的RNA酶广谱活性可以释放FAM标记在检测线上形成生物素抗体-核酸-纳米金粒复合体并显色。
9.根据权利要求6所述的检测T790M突变频率的方法，其特征在于：所述Cas13a蛋白酶混合液来源于细菌Leptotrichia wadei。
10.根据权利要求6所述的检测T790M突变频率的方法，其特征在于：所述待测DNA溶液的DNA含量为10ng/μL。
CN201910937501.5A 2019-09-30 2019-09-30 一种用于检测egfr基因t790m突变的试剂盒及检测方法 Withdrawn CN110616261A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910937501.5A CN110616261A (zh) 2019-09-30 2019-09-30 一种用于检测egfr基因t790m突变的试剂盒及检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910937501.5A CN110616261A (zh) 2019-09-30 2019-09-30 一种用于检测egfr基因t790m突变的试剂盒及检测方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110616261A true CN110616261A (zh) 2019-12-27

Family

ID=68924903

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910937501.5A Withdrawn CN110616261A (zh) 2019-09-30 2019-09-30 一种用于检测egfr基因t790m突变的试剂盒及检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110616261A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112111602A (zh) * 2020-08-13 2020-12-22 安徽微分基因科技有限公司 一种巢式等温扩增结合基因编辑检测covid-19病毒的试剂盒及方法

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112111602A (zh) * 2020-08-13 2020-12-22 安徽微分基因科技有限公司 一种巢式等温扩增结合基因编辑检测covid-19病毒的试剂盒及方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3792364A1 (en) Method for detecting nucleic acid based on prokaryotic argonaute protein and application thereof
CN110964814B (zh) 用于核酸序列变异检测的引物、组合物及方法
CN110878343B (zh) 一种用于遗传性耳聋致病基因SLC26A4突变快速检测的Cpf1试剂盒及其检测方法
CN111073961A (zh) 一种基因稀有突变的高通量检测方法
CN110541033B (zh) Egfr基因突变检测用组合物及检测方法
EP3105324B1 (en) Ngs systems control and methods involving the same
CN111850117A (zh) 检测人tert启动子突变的引物和探针、试剂盒和装置
JP5590781B2 (ja) 標的核酸比率推定方法
CN110592215A (zh) 检测核酸序列的组合物及检测方法
CN110863053A (zh) 一种检测EGFR vIII突变体的引物、探针及方法
CN110616261A (zh) 一种用于检测egfr基因t790m突变的试剂盒及检测方法
CN116377036A (zh) 一种基于CRISPR/Cas12a的肺癌患者外周血EGFR基因突变检测系统和方法
CN108165633B (zh) 一种特异性阻抑引物体系及肿瘤ct-DNA突变检测的方法
CN113930501A (zh) 人egfr基因突变的数字pcr检测方法及应用
Moldovan et al. Multiplex ligation-dependent probe amplification–a short overview
CN114908086B (zh) 一种基于数字PCR检测EGFR 19del的引物探针组合物、试剂盒和检测方法
RU2688189C1 (ru) Панель последовательностей олигонуклеотидов для определения мутации Q61R гена NRAS в опухолевых образованиях щитовидной железы
CN117247999B (zh) 一种核酸完整性质量评估方法及其应用
CN108342473A (zh) 一种用于检测血脂代谢相关基因abcg1甲基化的试剂盒
CN113897430B (zh) 人idh1/idh2基因突变的数字pcr检测方法及应用
KR20240023307A (ko) 다중 표적 동시 분석을 통한 변이체 검출용 qPCR 방법
Si et al. A Rapid and Accurate CRISPR/Cas12b-Mediated Genotyping Assay for the Methylenetetrahydrofolate Reductase Gene Polymorphism C677T
CN115807066A (zh) 一种通过数字pcr检测基因编辑的方法及其应用
CN117051087A (zh) 一种egfr胞外结构域区域突变的检测方法
CN115948405A (zh) 一种基于CRISPR-Cas13a系统的可视化环状RNA快速检测试剂盒及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WW01 Invention patent application withdrawn after publication

Application publication date: 20191227

WW01 Invention patent application withdrawn after publication