CN117247999B - 一种核酸完整性质量评估方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种核酸完整性质量评估方法及其应用。所述方法包括：数字PCR双荧光通道同时扩增检测核酸保守序列的两个区域，根据数字PCR结果的双荧光阳性液滴数在单、双荧光阳性总液滴数中的占比结果进行核酸质量评估。本发明方法能够快速、准确地检测核酸完整性，灵敏度高，最低可检测0.2 ng的基因组DNA，从可扩增角度对核酸质量进行评估，更接近分子生物的实际应用需求，操作简单，检测误差小。
Description
技术领域
本发明属于分子生物技术领域，涉及一种核酸完整性质量评估方法及其应用。
背景技术
分子诊断是当代医学发展的重要前沿领域之一，其核心是基因检测，而核酸是基因检测的对象和目标物。在分子诊断中，核酸完整性是极重要的质控指标之一，如目前占分子诊断的主要市场的PCR扩增和高通量测序，都要求核酸足够完整，否则严重降解的核酸样本会面临检测结果较差甚至失败的风险。对于基因检测，常用的石蜡包埋组织样本、放置很久的血液样本，以及法医鉴定取得的降解严重的样本，其核酸完整性往往都比较差，会导致后续的检测结果较差甚至失败。在基因检测正式启动前，如高通量测序文库制备之前，PCR扩增之前确定核酸样品的完整性是非常有用的，这样可以避免将时间和金钱浪费在严重降解而无法成功分析的样品上。因此，在进行基因检测前，需要对样本的核酸完整性质量进行评估，所以需要一种准确且高灵敏度的核酸完整性评估方法。
对于高质量完整性较好的核酸样本，通过Nanodrop和Qubit进行浓度和纯度的质量检测即可，但是对于降解较严重的核酸样本，是远远不够的，还需要进行完整性的评估，如经安捷伦生物分析系统2200/4200TapeStation分析并计算的出的DIN(DNA IntegrityNumber)数值，是对DNA完整性的评分。但在实验中发现，尤其是一些降解严重的核酸样本，即使通过对纯度、定量及完整性进行检测，检测合格后，再进行PCR扩增或测序建库时仍然存在失败的问题，这表明现有的质量评估方法存在问题，在这些样本中没有起到作用。因此，仍需要提供一种更有效的质量评估方法，以便更准确地评估样本的质量，从而更好的指导后续的基因检测。
原则上，可扩增性最接近核酸的功能评估，如何提供一种能够准确、快速评估核酸完整性、功能性的产品及方法，是分子生物技术领域亟待解决的问题之一。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了一种核酸完整性质量评估方法及其应用，能够快速、准确地检测核酸完整性质量，灵敏度高，最低可检测0.2 ng的基因组DNA，从可扩增角度对核酸质量进行评估，更接近分子生物的实际应用需求，操作简单，检测误差小。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种核酸完整性质量评估方法，所述方法包括：数字PCR双荧光通道同时扩增检测核酸保守序列的两个区域，根据数字PCR结果的双荧光阳性液滴数在单、双荧光阳性总液滴数中的占比结果进行核酸完整性质量评估。
其中，双荧光阳性液滴数是指双靶标区域阳性液滴数，单、双荧光阳性总液滴数是指单靶标区域阳性液滴数+双靶标区域阳性液滴数的总数。
本发明的核酸完整性质量评估方法能够快速、准确地检测核酸完整性，灵敏度高，最低可检测0.2 ng的基因组DNA，从可扩增角度对核酸质量进行评估，更接近分子生物的实际应用需求，操作简单，检测误差小。
数字PCR是一种基于单分子扩增的核酸检测技术，将含有待测样本的PCR反应体系制备成上万个微滴，每个微滴是一个独立的反应体系，通过控制上样量，使得每个微滴中最多分配到1个核酸分子，核酸分子被包裹在微滴中独立进行PCR扩增，PCR扩增后，对每个样品的微滴逐个进行荧光信号检测并计数，有荧光信号的微滴为阳性微滴；有单荧光信号的阳性微滴和双荧光信号的阳性微滴被分别进行计数。对于完整性质量好的待测核酸样本，其保守序列的两个扩增片段完整度高，为一个核酸分子，那么待扩增的这两个序列片段较大几率会分配到同一个微液滴中，这样的样本产生双荧光信号的阳性微滴的比例比较大；对于完整性质量差的待测样本，核酸降解率高，待扩增的两个序列片段断裂成两个核酸分子，那么这两个片段更大几率会分配到两个微液滴中，继而产生两个单荧光信号的阳性微滴的比例也更大，即产生双荧光信号的阳性微滴的比例较小。所以，通过待测核酸样本数字PCR检测结果的双荧光阳性液滴数在单、双荧光阳性总液滴数中的占比情况，可评估待测核酸样本的完整性质量。
优选地，所述方法包括以下步骤：
（1）选择2个保守核酸序列，覆盖不同长度分别选择2个区域来设计PCR引物和探针；
（2）每个保守核酸序列的2组引物探针分别与PCR酶、PCR缓冲液、dNTP混合，配制成2个数字PCR反应体系；
（3）用步骤（2）所述2个数字PCR反应体系，分别对待测核酸样本和参照品进行数字PCR扩增；
（4）根据2个核酸保守序列的数字PCR结果，分析双荧光阳性液滴数在单、双荧光阳性总液滴数中的占比结果，来判断核酸完整性质量。
优选地，所述核酸保守序列的来源包括GAPDH基因和ACTB基因；所述GAPDH基因的核酸序列包括如SEQ ID No.13所示的人GAPDH基因片段；所述ACTB基因的核酸序列包括如SEQ ID No.14所示的人ACTB基因片段。
SEQ ID No.13：
GATCATCAGGTGAGGAAGGCAGGGCCCGTGGAGAAGCGGCCAGCCTGGCACCCTATGGACACGCTCCCCTGACTTGCGCCCCGCTCCCTCTTTCTTTGCAGCAATGCCTCCTGCACCACCAACTGCTTAGCACCCCTGGCCAAGGTCATCCATGACAACTTTGGTATCGTGGAAGGACTCATGGTATGAGAGCTGGGGAATGGGACTGAGGCTCCCACCTTTCTCATCCAAGACTGGCTCCTCCCTGCCGGGGCTGCGTGCAACCCTGGGGTTGGGGGTTCTGGGGACTGGCTTTCCCATAATTTCCTTTCAAGGTGGGGAGGGAGGTAGAGGGGTGATGTGGGGAGTACGCTGCAGGGCCTCACTCCTTTTGCAGACCACAGTCCATGCCATCACTGCCACCCAGAAGACTGT。
SEQ ID No.14：
TTTGAACCGGGCGGAGGCGGGGCTGGCGCCCGGTTGGGAGGGGGTTGGGGCCTGGCTTCCTGCCGCGCGCCGCGGGGACGCCTCCGACCAGTGTTTGCCTTTTATGGTAATAACGCGGCCGGCCCGGCTTCCTTTGTCCCCAATCTGGGCGCGCGCCGGCGCCCCCTGGCGGCCTAAGGACTCGGCGCGCCGGAAGTGGCCAGGGCGGGGGCGACCTCGGCTCACAGCGCGCCCGGCTATTCTCGCAGCTCACCATGGATGATGATATCGCCGCGCTCGTCGTCGACAACGGCTCCGGCATGTGCAAGGCCGGCTTCGCGGGCGACGATGCCCCCCGGGCCGTCTTCCCCTCCATCGTGGGGCGCCCCAGGCACCAGGTAGGGGAGCTGGCTGGGTGGGGCAGCCCCGGGAGCGGGCGGGAGGCAAGGGCGCTTTCTCTGCACAGGAGCCTCCCGGTTTCCGGGGTGGGGGCTGCGCCCGTGCTCAGGGCTTCTTGTCCTTTCCTTCCCAGGGCGTGATGGTGGGCATGGGTCAGAAGGATTCCTATGTGGGCGACGAGGCCCAGAGCAAGAGAGGCATCCTCACCCTGAAGTACCCCATCGAGCACGGCATCGTCACCAACTGGGACGACATGGAGAAAATCTGGCACCACACCTTCTACAATGAGCTGCGTGTGGCTCCCGAGGAGCA。
优选地，所述核酸保守序列的两个区域跨越覆盖碱基长度为200-1000 bp。
上述200-1000 bp中的具体点值可以选择200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、600bp、700 bp、800 bp、900 bp、1000 bp等。
优选地，所述GAPDH基因的两段PCR扩增产物共跨越覆盖碱基长度180-220 bp。
上述180-220 bp中的具体点值可以选择180 bp、190 bp、194 bp、198 bp、202 bp、206 bp、210 bp、220 bp等。
优选地，所述ACTB基因的两段PCR扩增产物共跨越覆盖碱基450-550 bp。
上述450-550 bp中的具体点值可以选择450 bp、460 bp、470 bp、480 bp、490 bp、500 bp、510 bp、520 bp、530 bp、540 bp、550 bp等。
优选地，所述GAPDH基因的两段PCR扩增产物和所述ACTB基因的两段PCR扩增产物的长度各自独立地为60-300 bp。
上述60-300 bp中的具体点值可以选择60 bp、80 bp、100 bp、160 bp、180 bp、200bp、260 bp、280 bp、300 bp等。
优选地，所述人GAPDH基因片段的扩增区域1的扩增引物序列如SEQ ID No.1和SEQID No.2所示，探针序列如SEQ ID No.3所示；扩增区域2的扩增引物序列如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示，探针序列如SEQ ID No.6所示。
SEQ ID No.1：CTTTGCAGCAATGCCTCCTG。
SEQ ID No.2：TCCCATTCCCCAGCTCTCAT。
SEQ ID No.3：ACCAACTGCTTAGCACCCCTGGCCAAGGTCA。
SEQ ID No.4：ACTGAGGCTCCCACCTTTCT。
SEQ ID No.5：TGGGAAAGCCAGTCCCCAG。
SEQ ID No.6：CTGGCTCCTCCCTGCCGGGGCTGCGTGCAA。
优选地，所述人ACTB基因片段的扩增区域1的扩增引物序列如SEQ ID No.7和SEQID No.8所示，探针序列如SEQ ID No.9所示；扩增区域2的扩增引物序列如SEQ ID No.10和SEQ ID No.11所示，探针序列如SEQ ID No.12所示。
SEQ ID No.7：CTCCGACCAGTGTTTGCCTT。
SEQ ID No.8：GAGTCCTTAGGCCGCCAGG。
SEQ ID No.9：TGGTAATAACGCGGCCGGCCCGGCTT。
SEQ ID No.10：ATGGGTCAGAAGGATTCCTA。
SEQ ID No.11：TTGGTGACGATGCCGTGCTC。
SEQ ID No.12：CGACGAGGCCCAGAGCAAGAGAGGCAT。
优选地，所述探针的5’端含有荧光基团，3’端含有淬灭基团；所述荧光基团包括FAM或VIC，所述淬灭基团包括BHQ。
优选地，所述待测核酸样本包括石蜡包埋组织核酸样本、血液核酸样本、新鲜组织核酸样本或冰冻组织核酸样本中任意一种；所述参照品包括完整性良好的人类细胞系基因组DNA。
第二方面，本发明提供了一种核酸完整性质量评估试剂盒，所述核酸完整性质量评估试剂盒包括如SEQ ID No.1- SEQ ID No.12所示的引物探针，其中，SEQ ID No.1-6所示的引物探针用于扩增保守序列1，SEQ ID No.7-12所示的引物探针用于扩增保守序列2；
所述核酸完整性质量评估试剂盒还包括参照品、PCR酶和PCR缓冲液；
所述参照品包括完整性良好的人类细胞系基因组DNA。
第三方面，本发明提供了一种根据第二方面所述的核酸完整性质量评估试剂盒评估核酸完整性质量的方法，所述方法包括以下步骤：
（1）待测样本核酸提取；
（2）将待测核酸和参照品稀释至相同浓度，浓度范围0.2-20 ng/μL；
（3）PCR反应混合液配制：用于扩增保守序列1的引物探针、PCR酶、dNTP及PCR缓冲液混合配置成PCR反应液1，用于扩增保守序列2的引物探针、PCR酶、dNTP及PCR缓冲液混合配置成PCR反应液2；
（4）加样：在PCR反应液1和PCR反应液2中分别加入待测核酸样本或参照品；
（5）数字PCR扩增：将步骤（4）中的2组PCR体系进行数字PCR扩增和结果检测；
（6）数字PCR结果分析计算：根据数字PCR双荧光阳性液滴数在单、双荧光阳性总液滴数中的占比结果，来评估核酸完整性质量。
第四方面，本发明提供了第一方面所述的核酸完整性质量评估方法或第二方面所述的核酸完整性质量评估试剂盒在制备高通量测序文库中的应用。
本发明在一优选的实例中，针对GAPDH基因、ACTB基因这2个基因分别设计2段跨越覆盖不同长度的PCR区域，覆盖200～550 bp，在常规的Q-PCR、数字PCR、NGS建库等检测中的产物长度一般不超过400 bp，所以设计以上长度的片段能满足绝大多数的检测实验要求，覆盖比较全面。（1）ACTB基因的两段PCR区域跨越覆盖碱基长度540 bp，可以考察500 bp以内核酸的完整性质量，若待测样本的ACTB体系的数字PCR双荧光阳性液滴数在单、双荧光阳性总液滴数中的占比不小于参照品的占比的80%，表明该核酸样本的完整性非常好，为A级质量，可安全用于后续Q-PCR、ddPCR、NGS等检测；若待测样本的ACTB的数字PCR双荧光阳性液滴数在单、双荧光阳性总液滴数中的占比不小于参照品的占比的50%，但小于80%，表明该核酸样本的在500bp长度左右存在50%左右的降解，用于后续Q-PCR、ddPCR、NGS等检测无风险或风险较小，为B级质量。（2）GAPDH基因的两段PCR区域跨越覆盖206 bp，可以考察200 bp以内核酸的完整性质量，若待测样本的ACTB体系的数字PCR双荧光阳性液滴数在单、双荧光阳性总液滴数中的占比小于参照品的50%，但GAPDH体系的数字PCR双荧光阳性液滴数在单、双荧光阳性总液滴数中的占比大于参照品的占比的80%，表明核酸样本发生了一定程度的降解，为C级质量，建议后续只用于不大于200 bp片段的分析检测，如一定要进行大于200bp片段的检测，需要相应的提高上样量，以提高检测成功率；若待测样本GAPDH体系的数字PCR双荧光阳性液滴数在单、双荧光阳性总液滴数中的占比小于参照品的占比的50%，表明该核酸样本的存在较严重的降解，为D级质量，不建议用于后续Q-PCR，ddPCR，NGS等分子生物学技术的检测。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
（1）本发明基于数字PCR技术，灵敏度高，最低可检测0.2 ng的基因组DNA；
（2）本发明设计待测样本与参照品同时扩增检测，可减少实验操作和检测过程产生的误差；
（3）本发明从可扩增角度对核酸质量进行评估，更接近分子生物的实际应用需求；
（4）本发明基于数字PCR，与现有从可扩增角度评估核酸质量的方法相比，操作更简便，更精确。
附图说明
图1为本发明的设计示意图；
图2为本发明实施例2中样本1 ACTB的数字PCR检测结果图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
1核酸完整性评估试剂盒的设计与建立。
1.扩增片段的选择
针对GAPDH基因保守序列1（SEQ ID NO.13），选择跨越覆盖为206 bp的两个片段，两个片段的具体序列分别为CTTTGCAGCAATGCCTCCTGCACCA CCAACTGCTTAGCACCCCTGGCCAAGGTCATCCATGACAACTTTGGTATCGTGGAAGGACTCATGGTATGAGAGC和ACTGAGGCTCCCACCTTTCTCATCCAAGACTGGCTCCTCCCTGCCGGGGCTGCGTGCAACCCTGGGGTTGGGGGTTCTGGGGACTGGCTTTCCCA。
针对ACTB基因保守序列2（SEQ ID NO.14），选择跨越覆盖540 bp两个片段，两个片段的具体序列分别为CTCCGACCAGTG TTTGCCTTTTATGGTAATAACGCGGCCGGCCCGGCTTCCTTTGTCCCCAATCTGGGCGCGCGCCGGCGCCCCCTGGCGGCCTAAGGACTC和ATGGGTCAG AAGGATTCCTATGTGGGCGACGAGGCCCAGAGCAAGAGAGGCATCCTCACCCTGAAGTACCCCATCGAGCACGGCATCGTCACCAA。
2.引物探针的设计合成
针对所述两个保守序列4个片段的PCR扩增的引物探针序列设计如下：
G-F1：SEQ ID NO.1。
G-R1：SEQ ID NO.2。
G-P1：SEQ ID NO.3（5’端FAM修饰，3’端BHQ1修饰）。
G-F2：SEQ ID NO.4。
G-R2：SEQ ID NO.5。
G-P2：SEQ ID NO.6（5’端VIC修饰，3’端BHQ1修饰）。
A-F1：SEQ ID NO.7。
A-R1：SEQ ID NO.8。
A-P1：SEQ ID NO.9（5’端FAM修饰，3’端BHQ1修饰）。
A-F2：SEQ ID NO.10。
A-R2：SEQ ID NO.11。
A-P2：SEQ ID NO.12（5’端VIC修饰，3’端BHQ1修饰）。
3.参照品的制备
所述参照品为人标准基因组DNA，来源于人类细胞系（K562细胞系，购自国家实验细胞资源共享服务平台NICR），细胞系采用细胞DNA提取试剂盒进行DNA提取，提取完的DNA进行Nanodrop测定纯度，Qubit测定浓度，然后将细胞系DNA稀释至20 ng/μL作为试剂盒中的参照品。
4.数字PCR体系的构建
每个保守序列按下表1配制数字PCR反应体系，每个反应体系两对引物探针。
表1
PCR体系制备完成后，按照新羿TD-1数字PCR说明书进行液滴制备，扩增和荧光信号读取，扩增程序如下表2。
表2
实施例2
试剂盒性能检测分析。
1.准确性分析
使用降解程度不同的4例石蜡包埋组织（FFPE）样本进行测试（样本来源为医院科研合作项目），已知样本降解程度为样本4＞样本3＞样本2＞样本1。
（1）核酸提取
按照相应DNA提取试剂盒（迈杰转化医学研究（苏州）有限公司的石蜡组织DNA提取试剂盒（货号N032A01））说明书进行DNA提取，用Nanodrop测定纯度和浓度后备用。
（2）数字PCR反应体系配制
按照表1，配制GAPDH和ACTB 2个PCR体系，分装，分别加入待测样本或参照品。
（3）数字PCR扩增检测
按照数字PCR操作流程和表2的扩增程序进行数字PCR扩增和检测。
（4）结果分析和核酸质量评定
根据数字PCR检测结果，计算双荧光阳性液滴数在单、双荧光阳性总液滴数中的占比结果，结果如表3。
表3
检测结果与样本已知降解情况一致，表明本发明试剂盒对样本完整度质量评估的准确性良好。
2.灵敏度分析
（1）样本稀释
将上述4例DNA样本以及参照品，分别稀释至0.2 ng。
（2）数字PCR反应体系配制
按照表1，对GAPDH和ACTB 2个PCR体系进行制备，分装，分别加入待测样本或参照品，上样0.2 ng。
（3）数字PCR扩增检测
按照数字PCR操作流程和表2的扩增程序进行数字PCR扩增和检测。
（4）结果分析和核酸质量评定
根据数字PCR检测结果，计算双荧光阳性液滴数在单、双荧光阳性总液滴数中的占比，结果如表4。
表4
检测结果表明，上样0.2 ng时，检测结果仍能正确评估样本的质量，表明本发明试剂盒最低检测限可低至0.2 ng，灵敏度较好。
综上所述，本发明方法能够快速、准确地检测核酸完整性，灵敏度高，最低可检测0.2 ng的基因组DNA，从可扩增角度对核酸质量进行评估，更接近分子生物的实际应用需求，操作简单，检测误差小。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种核酸完整性质量评估方法，其特征在于，所述方法包括：数字PCR双荧光通道同时扩增检测核酸保守序列的两个区域，根据数字PCR结果的双荧光阳性液滴数在单、双荧光阳性总液滴数中的占比结果进行核酸完整性质量评估；
所述核酸保守序列的来源包括GAPDH基因和ACTB基因；
所述核酸保守序列的两个区域跨越覆盖碱基长度为200-1000 bp；
所述GAPDH基因的两段PCR扩增产物和所述ACTB基因的两段PCR扩增产物的长度各自独立地为60-160 bp。
2.根据权利要求1所述的核酸完整性质量评估方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
（1）分别在GAPDH基因和ACTB基因上选择1个保守核酸序列，覆盖200-1000 bp选择2个区域来设计PCR引物和探针；
（2）步骤（1）中获得的引物探针分别与PCR酶、PCR缓冲液、dNTP混合，配制成2个数字PCR反应体系；
（3）用步骤（2）所述2个数字PCR反应体系，分别对待测核酸样本和参照品进行数字PCR扩增；
（4）根据2个核酸保守序列的数字PCR结果，分析双荧光阳性液滴数在单、双荧光阳性总液滴数中的占比结果，来判断核酸完整性质量。
3. 根据权利要求1所述的核酸完整性质量评估方法，其特征在于，所述GAPDH基因的核酸序列包括如SEQ ID No.13所示的人GAPDH基因片段；所述ACTB基因的核酸序列包括如SEQID No.14所示的人ACTB基因片段。
4. 根据权利要求3所述的核酸完整性质量评估方法，其特征在于，所述GAPDH基因的两段PCR扩增产物共跨越覆盖碱基长度180-220 bp；
所述ACTB基因的两段PCR扩增产物共跨越覆盖碱基长度450-550 bp。
5. 根据权利要求3所述的核酸完整性质量评估方法，其特征在于，所述人GAPDH基因片段的扩增区域1的扩增引物序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，探针序列如SEQ IDNo.3所示；扩增区域2的扩增引物序列如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示，探针序列如SEQID No.6所示；
所述人ACTB基因片段的扩增区域1的扩增引物序列如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示，探针序列如SEQ ID No.9所示；扩增区域2的扩增引物序列如SEQ ID No.10和SEQ IDNo.11所示，探针序列如SEQ ID No.12所示。
6.根据权利要求5所述的核酸完整性质量评估方法，其特征在于，所述探针的5’端含有荧光基团，3’端含有淬灭基团；所述荧光基团包括FAM或VIC，所述淬灭基团包括BHQ。
7.根据权利要求2所述的核酸完整性质量评估方法，其特征在于，所述待测核酸样本包括石蜡包埋组织核酸样本、血液核酸样本、新鲜组织核酸样本或冰冻组织核酸样本中任意一种；所述参照品包括完整性良好的人类细胞系基因组DNA。
8. 一种核酸完整性质量评估试剂盒，其特征在于，所述核酸完整性质量评估试剂盒包括如SEQ ID No.1-SEQ ID No.12所示的引物探针，其中，SEQ ID No.1-6所示的引物探针用于扩增保守序列1，SEQ ID No.7-12所示的引物探针用于扩增保守序列2；
所述核酸完整性质量评估试剂盒还包括参照品、PCR酶和PCR缓冲液；
所述参照品包括完整性良好的人类细胞系基因组DNA。
9.一种根据权利要求8所述的核酸完整性质量评估试剂盒评估核酸完整性质量的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
（1）待测样本核酸提取；
（2）将待测核酸和参照品稀释至相同浓度，浓度范围0.2-20 ng/μL；
（3）PCR反应混合液配制：用于扩增保守序列1的引物探针、PCR酶、dNTP及PCR缓冲液混合配置成PCR反应液1，用于扩增保守序列2的引物探针、PCR酶、dNTP及PCR缓冲液混合配置成PCR反应液2；
（4）加样：在PCR反应液1和PCR反应液2中分别加入待测核酸样本或参照品；
（5）数字PCR扩增：将步骤（4）中的2组PCR体系进行数字PCR扩增和结果检测；
（6）数字PCR结果分析计算：根据数字PCR双荧光阳性液滴数在单、双荧光阳性总液滴数中的占比结果，来评估核酸完整性质量。
10.权利要求1-7中任一项所述的核酸完整性质量评估方法或权利要求8所述的核酸完整性质量评估试剂盒在制备高通量测序文库中的应用。
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