CN102134595A - 样品中核酸质量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，公开了一种样品的核酸质量检测方法，包含在样品中加入不同长度的内对照核酸分子，在同一反应体系特异性扩增样品待测核酸的不同长度保守序列以及所述内对照核酸分子；检测扩增结果，比较保守序列数量及内对照核酸分子数量并进行分析。作为优选，本发明采用实时荧光定量PCR技术进行所述扩增与检测步骤。本发明还提供核酸质量检测试剂盒。本发明所述方法通过检测不同长度的DNA片段来确定样品中DNA降解程度的方法，且能够准确的反映出样品抑制剂的影响程度，可广泛应用于法医学检验、微生物检验以及食品安全领域。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种样品中核酸质量检测方法。
背景技术
DNA(Deoxyribonucleic acid，脱氧核糖核酸)是广泛应用于法医检测的物质。DNA携带人类或其他物种的遗传信息，存在于各种样品中，如血液、组织、分泌物等。由于在法医DNA检验中，从现场取得的可用的生物样品很少是“干净的”，含有细菌、化学品等可能影响DNA检验的杂质。另外，低拷贝数量的DNA和/或高降解的DNA样品的DNA检验也是法医学DNA检验的难题之一。基于以上两个问题，需要在进行法医学DNA检验前对生物样品进行质量评估，评估内容包括：(1)样品中DNA的拷贝数量和降解程度；(2)样品中是否含有能够抑制DNA检验反应的抑制因素。
随着分子生物学技术的不断发展以及光电子技术的进步，近些年来实时荧光定量PCR(Realtime PCR)技术得到了很大的发展。实时荧光定量PCR技术是在定性PCR技术基础上发展起来的一种高度灵敏的核酸定量技术，于1996年由美国Applied biosystems公司推出，在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，使每一个循环变得“可见”，最后通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA的起始浓度进行定量的方法。实时荧光定量PCR是目前确定样品中DNA拷贝数最敏感、最准确的方法。实时荧光定量PCR法最大的优点是克服了终点PCR法进入平台期或叫饱和期后定量的较大误差，实现DNA的精确定量。该技术不仅实现了对DNA模板的定量，而且具有灵敏度和特异性高、能实现多重反应、自动化程度高、无污染、实时和准确等特点，该技术在医学临床检验及临床医学研究方面有着重要的意义。
实时荧光定量PCR分为荧光染料掺入法和探针法。荧光探针法的原理是：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5-3外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。荧光探针法比荧光染料法具有更强的特异性，能够快速准确的检测组织和细胞中的基因的表达变化。
目前用于人基因组DNA检测的试剂盒有美国Applied Biosystems公司的人DNA定量试剂盒、人基因组DNA中Y染色体定量试剂盒和人基因组DNA两重定量试剂盒。
人DNA定量试剂盒或人基因组DNA中Y染色体定量试剂盒通过荧光定量PCR技术在1管中同时检测1个基因片段和1个内对照DNA片段：(1)人类基因组中的基因端粒酶逆转录酶hTERT(TelomeraseReverse Transcriptase gene)片段，长度为62bp(QuantifilerHuman Kit)；或SRY gene(sex determining region Y)片段，长度为64bp(Quantifiler Y Kit)；(2)内对照DNA片段。
人基因组DNA两重定量试剂盒通过荧光定量PCR技术在1管中同时检测2个基因片段和1个内对照DNA片段：(1)人类基因组中的基因RPPH1(Ribonuclease P RNA component H1)片段，长度140bp；(2)仅在男性基因组中的含有的基因SRY(sex determining regionY)片段，长度130bp；(3)内对照DNA片段，长度为130bp。
以上三种试剂盒均利用荧光定量PCR技术对样品中人基因组DNA进行定量，并通过内对照(Internal PCR control，简称IPC)检测样品中的是否含有人基因组DNA或抑制剂，从而确定在后续法医检测中需要使用试剂盒种类。但是，法医DNA检测中所需要的样品中DNA模板长度范围是50-500bp。人DNA定量试剂盒或人基因组DNA中Y染色体定量试剂盒检测的DNA模板长度是62-64bp，人基因组DNA两重定量试剂盒检测的DNA模板长度是130-140bp。DNA模板长度的差异导致上述三种试剂盒均不能检测样品中DNA的降解情况，而DNA降解情况是DNA质量评估的重要参数之一，也不能确定样品中抑制剂对后续法医DNA检测的影响程度。
发明内容
本发明的发明目的为提供一种样品的核酸质量检测方法，该方法可检测样品中DNA的降解情况，并且确定样品中抑制剂对DNA检测的影响程度。
为了实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
一种样品的核酸质量检测方法，包含以下步骤：
在样品中加入不同长度的内对照核酸分子，在同一反应体系特异性扩增样品待测核酸的不同长度保守序列以及所述内对照核酸分子；
检测扩增结果，比较保守序列数量及内对照核酸分子数量并进行分析。
所述扩增可采用多种生物技术进行，如PCR技术、NASBA等。NASBA(Nucleic acid sequence-based amplification，依赖核酸序列的扩增技术)是一项连续、等温、基于酶反应的核酸扩增技术。所述检测也可选择多种方法进行检测，如RT-PCR、琼脂糖电泳、探针法进行检测。检测探针可用多种生物方法进行标记，如由生物素或地高辛标记，加入底物，经过终止反应步骤后经分光光度计读取吸光度值进行结果判定或直接用荧光标记物进行标记。
作为优选，所述扩增步骤与检测步骤同时进行。
更优选地，所述扩增步骤与检测步骤采用实时荧光定量PCR技术。所述实时荧光定量PCR法反应程序优选为：95℃，10min；(95℃，15s；60℃，1min)为一个循环，设定40个循环。
本发明中检测不同DNA模板长度的目的是检测样品中的DNA降解程，如根据荧光定量PCR的结果可以分别计算出样品中人基因组DNA的数量，由两种或多种荧光信号所计算出的差异体现出样品中的DNA降解程度。本发明所述通过检测不同长度的DNA片段来确定样品中DNA降解程度的方法，可应用于其他方面定量检测中，如检测食品或药品样品中某物种DNA的含量。
本发明通过检测不同长度的IPC片段来确定样品中DNA受抑制剂影响程度；本发明中两个内对照DNA片段的数量是固定的，通过检测两种或多种荧光信号的降低程度可以确定样品中抑制剂对法医DNA检测的影响程度。由于不同长度的DNA片段受抑制剂影响的程度不同，片段越长，受抑制的程度越严重，所以，2个或多个长度的IPC能够更准确的反映出抑制剂的影响程度，从而指导法医DNA检测实验选择合适的试剂。
所述生物样品为人基因组样品、动物基因组样品、植物基因组样品或微生物基因组样品。
在食品安全领域，本发明也具有能够同时检测样品核酸降解程度和抑制剂的影响程度的作用。如针对转基因食品样品，检测其中重组DNA含量时，同样会面临DNA降解和抑制剂影响的问题。本发明通过检测样品中的2个或多个不同长度的片段可以检测样品DNA降解程度，通过检测2个或多个不同长度的内对照，可以检测抑制剂对后续PCR检测过程的影响程度。
在检测致病微生物领域，本发明也具有能够同时检测样品核酸降解程度和抑制剂的影响程度的作用。如检测RNA病毒时，由于RNA分子极易降解，RNA降解程度是评价样品中RNA模板质量的重要参数之一。本发明通过检测样品中的2个或多个不同长度的RNA片段可以检测样品RNA模板降解程度，通过RT-PCR技术(反转录，reversetranscriptase PCR)检测2个不同长度的内对照，可以检测抑制剂对后续PCR检测过程的影响程度。
作为优选，本发明所述核酸质量检测方法中所述内对照核酸分子为两种以上，所述保守序列为两种以上。
在法医学检测领域，作为优选，所述核酸保守序列为人RPPH1基因和人Fas基因。人类基因组DNA中的基因RPPH1(Ribonuclease P RNAcomponent H1)片段为人类基因的保守片段，长度380bp；人类基因组DNA中的基因Fas(TNF receptor superfamily，member 6)片段也是人类基因的保守片段，长度160bp。
用于扩增所述核酸保守序列RPPH 1的引物核苷酸序列分别如SEQID No.1、SEQ ID No.2所示，探针序列如SEQ ID No.3所示。
用于扩增所述核酸保守序列人Fa s基因片段的扩增引物核苷酸序列如SEQ ID No.3、SEQ ID No.4所示，检测探针核苷酸序列如SEQID No.5所示。
所述内对照核酸分子(IPC序列)为人工合成DNA，在自然界的任何物种的基因中均没有扩增基因，作为优选，所述内对照核酸分子为核苷酸序列如SEQ ID No.21的IPC1片段、SEQ ID No.22所示的IPC2片段。
用于扩增内对照核酸分子的引物以及检测探针须不与其他基因杂交，更优选地，所述内对照序列扩增引物核苷酸序列如SEQ IDNo.7、SEQ ID No.8所示，探针序列如SEQ ID No.9所示。
在具体实施方式中，本发明采用实时荧光定量PCR技术的TaqMan探针法进行样品的核酸质量检测。用于检测的探针可选用多种荧光分子进行标记，但须保证各种检测探针所标记的荧光物质各不相同。所述检测探针其5’端标记可选自6-FAM、TET、HEX、TAMRA、ROX、CY5、CY3、JOE、Texas Red其中一种，3’端标记可选自TAMRA、BHQ-1、Eclipse、Iowa Black其中一种。
本发明还提供一种核酸质量检测试剂盒，包含不同长度的内对照核酸分子、用于扩增所述内对照核酸分子的试剂、用于扩增样品中待测核酸不同长度的保守序列的试剂、检测扩增结果的试剂。
作为优选，所述保守序列为核苷酸序列如SEQ ID No.19所示的人RPPH1基因片段和核苷酸序列如SEQ ID No.20所示的人Fas基因片段，所述内对照核酸分子为核苷酸序列如SEQ ID No.21的IPC1片段、SEQ ID No.22所示的IPC2片段。
在具体实施方式中，本发明所述核酸质量检测试剂盒除以及实时荧光定量PCR技术所需常规试剂外，还具体包含：
作为内对照的核苷酸序列如SEQ ID No.21的IPC1片段，长度分别为95bp；作为内对照的如SEQ ID No.22所示的IPC2片段，长度分别为380bp；
扩增RPPH1基因的引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID No.1、SEQID No.2所示，和FAM标记的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的探针；
扩增Fas基因的引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID No.4、SEQ IDNo.5所示，和HEX标记的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的探针；
扩增内对照IPC1的引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID No.7、SEQID No.8所示，和TAMRA标记的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示的探针；
扩增内对照IPC2的引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID No.10、SEQ ID No.11所示，和QUASAR670标记的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示的探针。
在具体实施例中，本发明所述人核酸质量检测方法通过荧光定量PCR技术在1管中同时检测上述2个基因片段和2个内对照DNA片段，并进行结果分析。
本发明术语“引物”指作为合成引物延伸产物的起始位点的单链寡核苷酸序列，其与待复制的核酸链互补，长度和序列必须适合于延伸产物的合成。
本发明术语“探针”指单链寡核苷酸，用于与核酸片段特异性杂交。“特异性杂交”指所述探针与核酸的整个区域或一部分在特定的实验条件下形成双链体，且在这些条件下，所述探针不与待检测样品中存在的其他核酸或核酸的其他区域形成双链体。
本发明所述“TaqMan探针”是一种寡核苷酸探针，是在寡核苷酸两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团，报告荧光基团连接在探针的5’末端，而淬灭荧光基团则在3’末端。
术语“Ct值”：为了便于对所检测样品进行比较，在实时荧光PCR反应的指数期，首先需设定一定荧光信号的域值，一般这个域值是以PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。如果检测到荧光信号超过域值被认为是真正的信号，它可用于定义样品的域值循环数(Ct)。Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，因此只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
与现有技术的核酸质量检测方法相比，本发明所述方法具有以下优点：
(1)本发明中检测不同DNA模板长度能够更好的反应检测样品中的DNA降解程度。在具体实施例中，由于法医DNA检测中所需要的样品中DNA模板长度范围是50-500bp，与人基因组DNA两重定量试剂盒检测的DNA模板长度是130-140bp相比，本发明检测的DNA模板长度是160-380bp，能够更好的反应检测样品中的DNA降解程度，与法医DNA检测片段更接近。
(2)本发明中检测不同DNA模板长度的内对照，能够更好的检测样品中抑制剂对法医DNA检测的影响情况。在具体实施例中，与人基因组DNA两重定量试剂盒检测的内对照片段长度是130bp相比，本发明检测的内对照长度分别是95bp、380bp，能够更准确的反应检测样品中抑制剂对法医DNA检测的影响情况，从而指导法医DNA检测实验选择合适的试剂，也扩大了法医DNA检测实验选择的试剂范围。
(3)通过多个长度不同的内对照和多个长度不同的DNA片段的检测，可以区别样品中模板降解和抑制剂对PCR的影响。这种Ct值的差异能够更真实的反映抑制剂对不同长度的DNA片段的抑制情况，为DNA检测提供更加详实的参考数据。在DNA检测中，当抑制剂完全抑制长片段的扩增时，需要对样品DNA进行处理，减少或去除抑制剂对PCR的影响。
本发明所述核酸质量检测方法以及核酸质量检测试剂盒用于检测DNA检测前的样品评估，通过检测不同长度的DNA片段来确定样品中DNA降解程度的方法，且能够准确的反映出样品抑制剂的影响程度，可以对样品的核酸质量进行评估，为DNA检测提供参考，可广泛应用于法医学检验、微生物检验以及食品安全领域。
附图说明
图1为采用实时荧光定量PCR技术的标准曲线。
具体实施方式
本发明公开了一种样品核酸质量检测方法及试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及试剂盒已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1：用本发明所述方法评估生物样品的降解情况
实验方案：25ul荧光定量PCR反应体系中，包含2条扩增RPPH1基因的引物(其核苷酸序列分别如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示)和1条FAM标记的探针(其核苷酸序列分别如SEQ ID No.3所示)；
2条扩增Fas基因的引物(其核苷酸序列分别如SEQ ID No.4和SEQID No.5所示)和1条HEX标记的探针(其核苷酸序列分别如SEQ ID No.6所示)；
2条扩增内对照IPC1的引物(其核苷酸序列分别如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示)和1条TAMRA标记的探针(其核苷酸序列分别如SEQ ID No.9所示)；
2条扩增内对照IPC2的引物(其核苷酸序列分别如SEQ ID No.10和SEQ ID No.11所示)和1条QUASAR670标记的探针(其核苷酸序列分别如SEQ ID No.12所示)。
4对引物和4条探针终浓度均为200nM；IPC1、IPC2模板量均为100拷贝。
荧光定量PCR反应条件：95℃，10min；(95℃，15s；60℃，1min)40个循环。
定量过程：绘制标准曲线，如图1所示，按照公式Ct＝斜率*1g(模板数)+Y轴截距，计算模板的拷贝数，然后根据1个拷贝模板的质量算出PCR起始模板的质量。
模拟实际样品，将取自人类的样品基因组DNA用DNaseI进行降解处理，并对降解后的DNA进行荧光定量PCR反应。Real-time PCR反应条件是，95℃，10min；(95℃，15s；60℃，1min)40个循环。反应在荧光定量PCR仪上运行，结束后分析结果，计算出样品中的有效人基因组DNA的质量。数据如下：
表1、本发明所述方法评估样品降解情况
表1中的数据显示，扩增不同长度的基因片段计算出的模拟样品中人基因组DNA量是不同的，即样品中人基因组DNA有效模板数不同。如在经0.1U的DNaseI降解后的样品中，160bp的有效DNA模板数Fas基因为19.49ng，380bp的有效DNA模板数RPPH1基因为10.99ng，说明在被降解的DNA片段中，大于160bp的DNA片段占总DNA量的78％，大于380bp的DNA片段占总DNA量的44％。这样就可以防止只检测小片段DNA导致的对样品中有效DNA模板量的过高估计，为法医DNA检测提供更加详实的参考数据。
在法医DNA检测中，通常加入的样品DNA的质量范围是0.5-2ng，模板量过多导致扩增不平衡，模板量过少则导致等位基因缺失。根据本发明的结果，当样品中大于长度380bp的有效DNA模板浓度是1.05ng/ul时，加入的样品DNA的体积是0.5-2ul。
实施例2：用本发明所述方法评估生物样品受抑制剂影响情况
参照实施例1，模拟实际样品，将广泛存在于土壤、植物等环境中的PCR抑制剂腐植酸(Humic acid)加入到同实施例1的荧光定量PCR反应体系中，所有体系中含有相同的人基因组DNA量，得到反应的Ct值反应出PCR体系受到抑制剂的程度。数据如表2所示：
表2、本发明所述方法评估样品受抑制剂影响情况
表2中的数据显示，在PCR中，相同抑制剂浓度对不同长度的IPC片段抑制程度不同，对长片段的抑制程度大于对小片段的抑制程度。如在3ng/ul的腐植酸存在时，IPC1的Ct值为31.52，IPC2的Ct值为40，即3ng/ul的腐植酸对IPC1的PCR过程没有抑制作用，而对IPC2的PCR过程则完全抑制。
由于长片段的PCR受抑制剂影响较短片段大，通过2个长度不同的内对照和2个长度不同的基因DNA片段的检测，可以区别样品中模板降解和抑制剂对PCR的影响。这种Ct值的差异能够更真实的反映抑制剂对不同长度的DNA片段的抑制情况，与法医DNA检测的DNA片段长度更接近，为法医DNA检测提供更加详实的参考数据。在法医DNA检测中，当抑制剂完全抑制长片段的扩增时，需要对样品DNA进行处理，减少或去除抑制剂对PCR的影响。根据本发明的结果，当内对照IPC2(380bp)的PCR扩增被完全抑制时，就需要对样品进行处理，降低抑制剂对PCR扩增的影响。
实施例3：用本发明所述方法评估生物样品的降解情况
选取人类基因TH01(intron1 of human tyrosine hydroxylasegene)中的2个DNA片段(无重叠区域)，其核苷酸序列分别如SEQ IDNo.23、SEQ ID No.24所示，参照实施例1，进行荧光定量PCR检测。扩增试剂组分包含：
(1)2条扩增TH01基因的引物(其核苷酸序列分别如SEQ ID No.13、如SEQ ID No.14所示)和1条FAM标记的探针(其核苷酸序列如SEQ IDNo.15所示)，产物为135bp；
(2)2条扩增TH01基因的引物(其核苷酸序列分别如SEQ ID No.16、如SEQ ID No.17所示)和1条HEX标记的探针(其核苷酸序列如SEQ IDNo.18所示)，产物为313bp；
(3)2条扩增内对照IPC1的引物(其核苷酸序列分别如SEQ ID No.7、如SEQ ID No.8所示)和1条TAMRA标记的探针(其核苷酸序列如SEQ IDNo.9所示)；
(4)2条扩增内对照IPC2的引物(其核苷酸序列分别如SEQ ID No.10、如SEQ ID No.11所示)和1条QUASAR670标记的探针(其核苷酸序列如SEQ ID No.12所示)。
参照实施例1，模拟实际样品，将人类基因组DNA用DNaseI进行降解处理，并对降解后的DNA进行荧光定量PCR反应，计算出样品中的有效人基因组的质量。数据如表3所示：
表3
表3中的数据显示，扩增不同长度的基因片段计算出的模拟样品中人基因组DNA量是不同的，即样品中人基因组DNA有效模板数不同。如在经0.4U的DNaseI降解后的样品中，135bp的有效DNA模板数为7.36ng，313bp的有效DNA模板数为2.76ng，说明在被降解的DNA片段中，大于135bp的DNA片段占总DNA量的23.0％，大于380bp的DNA片段占总DNA量的8.6％。
在法医DNA检测中，通常加入的样品DNA的质量范围是0.5-2ng，模板量过多导致扩增不平衡，模板量过少则导致等位基因缺失。根据本发明的结果，当样品中大于长度313bp的有效DNA模板浓度是2.76ng/ul时，加入的样品DNA的体积是0.2-0.8ul；当样品中大于长度313bp的有效DNA模板浓度是0ng/ul时，说明样品中DNA已经被降解成小于313bp的片段，在后续法医DNA检测中，无法扩增得到大于313bp的目的片段。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (14)
1.一种样品核酸质量的检测方法，其特征在于，包含以下步骤：
在样品中加入不同长度的内对照核酸分子，在同一反应体系特异性扩增样品待测核酸的不同长度保守序列以及所述内对照核酸分子；
检测扩增结果，比较保守序列数量及内对照核酸分子数量并进行分析。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述扩增步骤与检测步骤同时进行。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述扩增步骤与检测步骤采用实时荧光定量PCR技术。
4.根据权利要求1-3任一项所述的检测方法，其特征在于，所述生物样品为人基因组样品、动物基因组样品、植物基因组样品或微生物基因组样品。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述内对照核酸分子为两种以上，所述保守序列为两种以上。
6.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述核酸保守序列为核苷酸序列如SEQ ID No.19所示的人RPPH1基因片段和核苷酸序列如SEQ ID No.20所示的人Fas基因片段。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述人RPPH1基因片段的扩增引物核苷酸序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2所示，检测探针核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
8.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述人Fas基因片段的扩增引物核苷酸序列如SEQ ID No.3、SEQ ID No.4所示，检测探针核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
9.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述内对照核酸分子为核苷酸序列如SEQ ID No.21的IPC1片段、SEQ ID No.22所示的IPC2片段。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，扩增内对照序列IPC1的引物核苷酸序列如SEQ ID No.7、SEQ ID No.8所示，探针序列如SEQ ID No.9所示。
11.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，扩增内对照序列IPC2的引物核苷酸序列如SEQ ID No.10、SEQ ID No.11所示，探针序列如SEQ ID No.12所示。
12.一种核酸质量检测试剂盒，包含不同长度的内对照核酸分子、用于扩增所述内对照核酸分子的试剂、用于扩增样品中待测核酸不同长度的保守序列的试剂、检测扩增结果的试剂。
13.根据权利要求12所述的核酸质量检测试剂盒，其特征在于，所述保守序列为核苷酸序列如SEQ ID No.19所示的人RPPH1基因片段和核苷酸序列如SEQ ID No.20所示的人Fas基因片段，所述内对照核酸分子为核苷酸序列如SEQ ID No.21的IPC1片段、SEQ ID No.22所示的IPC2片段。
14.根据权利要求12或13所述的核酸质量检测试剂盒，其特征在于，具体包含：
作为内对照的核苷酸序列如SEQ ID No.21的IPC1片段、SEQ IDNo.22所示的IPC2片段；
扩增RPPH1基因的引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID No.1、SEQID No.2所示，和FAM标记的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的探针；
扩增Fas基因的引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID No.4、SEQ IDNo.5所示，和HEX标记的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的探针；
扩增内对照IPC1的引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID No.7、SEQID No.8所示，和TAMRA标记的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示的探针；
扩增内对照IPC2的引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID No.10、SEQID No.11所示，和QUASAR670标记的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示的探针；
以及实时荧光定量PCR技术所需常规试剂。
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| EP2882871A4 (en) * | 2012-08-13 | 2016-04-13 | Sudhir Sinha | DEVELOPMENT OF A HIGHLY SENSITIVE QUANTIFICATION SYSTEM TO ASSESS DEGRADATION AND QUALITY OF DNA IN MEDICO-LEGAL SAMPLES |
| US10993418B2 (en) | 2012-08-13 | 2021-05-04 | Life Genetics Lab, Llc | Method for measuring tumor burden in patient derived xenograft (PDX) mice |
| CN117344008A (zh) * | 2023-12-05 | 2024-01-05 | 北京华瀚基因科技有限公司 | 基于2-ΔΔCt法检测SMN1基因拷贝数的试剂盒 |
-
2010
- 2010-12-23 CN CN 201010605791 patent/CN102134595B/zh active Active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
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| 《水生生物学报》 20100930 谢芝勋 贝类派琴虫和折光马尔太虫二重荧光定量PCR方法的建立 第34卷, 第5期 * |
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| US9957557B2 (en) | 2012-08-13 | 2018-05-01 | Life Genetics Lab, Llc | Development of a highly sensitive quantification system for assessing DNA degradation and quality in forensic samples |
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