CN117344008B - 基于2-ΔΔCt法检测SMN1基因拷贝数的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供基于2‑ΔΔCt法检测SMN1基因拷贝数的试剂盒，所述试剂盒包括作为内对照线性化的质粒片段，所述线性化的质粒片段包括质粒载体骨架、设计的内参基因内对照序列和设计的SMN1内对照序列；所述SMN1内对照序列和所述内参基因内对照序列之间间隔2‑10kb的质粒骨架序列。本发明通过内对照替代常规的外对照样本，能够降低管间差异，减少样本中干扰物质对各片段扩增效率的影响，从而导致对SMN1拷贝数的计算；本发明针对现有的检测试剂均需要样本的核酸提取和纯化，通过内对照降低直接核酸释放模板中PCR抑制物对拷贝数检测的影响，从而实现对样本核酸粗提后SMN1基因的简便、快速、准确的拷贝数检测。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，特别涉及一种基于2-ΔΔCt法检测SMN1基因拷贝数的试剂盒。
背景技术
脊髓性肌萎缩症（spinal muscular atrophy，SMA）是一种常染色体隐性遗传病，为婴幼儿期最常见致死性和致严重残疾的神经肌肉病之一。活婴发病率为1/5000～1/10000，正常人群致病基因携带率为1/35～1/50。临床上根据SMA发病年龄和病程的不同，将患者分为I型、II型、Ⅲ型及Ⅳ型，其中占患者比例约70％的I型临床表型最为严重，常于6个月内起病，多数于2岁内夭折。运动神经元存活基因SMN1是SMA的致病基因，SMN2是SMN1修饰基因，两者之间高度同源，仅存在5个碱基的差异。SMN1突变可导致SMA表型，突变的主要形式是SMN1第7外显子缺失，而SMN2拷贝数数量则和SMA的严重程度有关。SMA作为单基因遗传病，可防、可控，如夫妻双方均为携带者，SMN1的拷贝数为1，不会有症状，但有25%的可能会生出SMA患儿。所以针对孕前或孕早期人群甚至新生儿中，通过检测SMN1外显子7的拷贝数，可以实现SMA基因筛查三级防控，达到优生优育的重要手段。
常用的SMN1基因拷贝数检测的技术包括：多重连接探针扩增（MLPA）、PCR-变性高效液相色谱（PCR-DHPLC）、微滴式数字PCR（ddPCR）、荧光定量PCR等技术。MLPA检测通过靶向SMA基因关键区域的特异性探针与SMN1和SMN2基因杂交后进行扩增，根据扩增产物和参照序列的比值，评价SMN1/2的拷贝数。但MLPA由于操作复杂，杂交、连接等过程会导致误差放大，容易出现假阴性；同时DNA模板需要精确定量，且样本容易被污染，所以不太适合作为高通量基于人群筛查的手段。PCR-DHPLC主要通过多重PCR结合DHPLC进行SMN1/2基因拷贝数的检测，需要在PCR反应结束后，开管对PCR产物进行DHPLC检测，在操作过程重易发生实验室污染，且费时、费力，无法实现批量检测。MLPA和PCR-DHPLC都属于在PCR反应终点时的半定量分析，其结果判断更多的是依据经验而无法形成标准化的结果判读。ddPCR是一种核酸分子绝对定量技术，直接计数目标基因与参照基因的数目，计算比值，直接得到目标基因SMN1的拷贝数。但ddPCR也存在成本高、操作繁琐、检测范围窄、通量有限等不足之处，也不适合作为SMN1高通量筛选的技术手段。
荧光定量PCR检测SMN1拷贝数的方法则以管家基因为内参基因序列，采用Taqman探针法或熔解曲线，分别对SMN1第7外显子拷贝数和内参基因进行相对定量来判断是否发生缺失变异。2-ΔΔCt探针法荧光定量PCR，操作简便、成本低廉，适用于人群规模的筛查，有效避免了MLPA、PCR-DHPLC和ddPCR的技术缺陷。但这这种相对定量方法的前提是：SMN1和内参基因的扩增效率都应接近100%，相对偏差不超过5%，而样本的扩增效率受模板纯度和模板量的影响，故样本需要提取、纯化核酸，并要对核酸模板进行定量，只有模板量在一定范围才能分析相对拷贝数，为保证结果的准确，对样本的上样量有严格的要求。同时，需要引入独立的对照样本组，以2-ΔΔCt法PCR为基础的检测技术存在一个共同的缺陷就是待测样本和对照样本是分管检测，这样不可避免导致两者中目的基因和内参基因的扩增效率会有差异。所以，基于2-ΔΔCt法检测人运动神经元基因（SMN1/2）拷贝数的专利，CN20150066921.2和CN201810353632.4，为减少对照样本的变异和保证结果的准确，均为对照样本设置3个不同浓度的复孔，取其Ct均，以避免由于对照样本Ct差异导致的检测结果的误差。
发明内容
为了克服上述问题，本发明提供基于2-ΔΔCt法检测SMN1基因拷贝数的试剂盒，所述试剂盒包括作为内对照的线性化的质粒片段，所述线性化的质粒片段包括质粒载体骨架、设计的内参基因内对照序列和设计的SMN1内对照序列；所述SMN1内对照序列和人基因组中SMN1待扩增片段的大小、位置和序列一致，仅在探针结合区与所述人基因组中SMN1待扩增片段的核苷酸序列不同，以特异性区分样本中扩增的人基因组中SMN1片段和扩增的SMN1内对照序列；所述内参基因内对照序列和内参基因待扩增片段的大小、位置和序列一致，仅在探针结合区与所述内参基因待扩增片段的核苷酸序列不同，以特异性区分扩增的内参基因片段和扩增的内参基因内对照序列；所述SMN1内对照序列和所述内参基因内对照序列通过一段含有限制性内切酶特异性识别位点的DNA序列连接，经人工合成双链基因片段后，插入到质粒载体中，从而获得内对照质粒，在内参基因内对照序列、SMN1内对照序列和所述质粒载体中均不含所述限制性内切酶特异性识别位点；所述内对照质粒经限制性内切酶酶切、纯化，得到所述线性化的质粒片段，所述线性化的质粒片段两端分别是所述SMN1内对照序列和所述内参基因内对照序列，所述SMN1内对照序列和所述内参基因内对照序列之间间隔2-10kb的质粒骨架序列。
在一种实施方式中，所述限制性内切酶特异性识别位点是Apa I、Sac II、Sma I或Mlu I限制性内切酶特异性识别位点。
在一种实施方式中，所述限制性内切酶特异性识别位点是Mlu I限制性内切酶特异性识别位点，所述质粒载体骨架为2.7kb的pUCm-T载体。
在一种实施方式中，所述线性化的质粒片段中所述SMN1内对照序列和所述内参基因内对照序列的数量是1:1、1:2或2:1。
在一种实施方式中，所述SMN1内对照序列中探针结合区或所述内参基因内对照序列中探针结合区的长度为25-32bp碱基。
在一种实施方式中，所述SMN1内对照序列是SEQ ID NO.1：5’- CCCCTACCTCCGCCTCCCAAAGTTGTGGGATTGTAGGCATGAGCCACTGCAAGAAAACCTTAACTGCAGCCTAATAATTGTTTTCTTTGGGATAACTTTTAAAGTACATTAAAAGACTATCAACTTAATTTCTGATCATATTTTGTTGAATAAAATAAGTAAAATGTCTTGTGAAACAAAATGCTTTTTAACATCCATATAAAGCTATCTATATATAGCTATCTATGTCTATATAGCTATTTTTTTTAACTTCCTTTATTTTCCTTCTAAAACAGACTTTGGGACAAAAAAGAAGGAAGGTGCTCACATTCCTTAAATTAAGGAGTAAGTCTGCCAGCATTATGAAAGTGAATCTTACTTTTGTAAAACTTTATGGTTTGTGGAAAACAAATGTTTTTGAACATTTAAAAAGTTCAGATGTTAAAAAGTTGAAAGGTTAATGTAAAAC-3’。
在一种实施方式中，所述内参基因内对照序列是SEQ ID NO.2：5’-TCTTGATTCAACTGTCACACACCTGTCCTTAGTAGCATCTTTATGACCATTATTTTTCATTAGTAAAGAAATGTGATCATCCACCCATGCCAGAACCTTTGGTCAGACATGAGAACAAAAGCTAATCAGGCAGGCACTGTTAGGAAGAGGCTGTTAGGAACAATCATTTGATGAGCTTTAGGCAATTTGCATCAAAATGGTCTTAGTCTGAGTAATGGACCCTAGAACGACTATTTTATCCATCTAAAAATTTAAAATAAGATGCTATGAAAGAAATATTCACAACCTTCAATAGCACATTATTTTTAATTTTTCTTTTTCAAGAATTCCTATAGCAGTTTTAAAGTGAACTTGATTAATGTACCAAGATGAAAATCAGAACTTTTTCCTTAAAAAATAATTATGCTGATAATATCCTTTTTTTCT-3’。
在一种实施方式中，所述试剂盒还包括：一对SMN通用引物和一对内参基因通用引物：所述SMN通用引物用于特异性扩增基因组中的SMN1、SMN2以及SMN1内对照序列，所述内参基因通用引物特异性扩增内参基因和内参基因内对照序列；五条特异性核酸探针：一条检测基因组中SMN1的荧光探针，一条检测SMN1内对照序列的荧光探针，一条SMN2封闭探针；和一条检测基因组中内参基因的荧光探针，和一条检测内参基因内对照序列的荧光探针；其中基因组中扩增的SMN1片段覆盖SMN1外显子7中区别于SMN2突变的第6位的c840C的特异性位点，该位点位于基因组扩增片段中探针结合区中间；所述SMN2封闭探针是一段为降低SMN2片段对SMN1检测的干扰作用的不能被水解的寡核苷酸探针，其针对SMN2外显子7c840T的特异性位点，能特异性结合SMN2，而非SMN1，能封闭SMN2基因上的c840T的特异性位点。
在一种实施方式中，所述SMN2封闭探针与检测基因组中SMN1的荧光探针在同一条DNA链，其通过MGB修饰或LAN锁核酸修饰，提高Tm值，增加与拟封闭序列的结合特异性。
在一种实施方式中，所述内参基因是RPP30，其中所述两对引物和五条探针如下：
在一种实施方式中，检测基因组中SMN1的荧光探针和SMN2封闭探针通过MGB修饰。
本发明基于竞争性PCR，提供了一种基于内对照准确检测SMN1拷贝数的方法，即在同一PCR反应体系中涉及两组模板，一组是待测样本，另一组是合成的一段核苷酸序列，用作内对照，两组模板在目标序列长度、GC含量上完全一致，仅有20bp左右的探针结合区序列不一样，因此两者扩增效率一致，两种扩增产物量直观的反映了初始模板量，即可通过计算内参基因的ΔCt和SMN1的ΔCt值来计算SMN1的拷贝数。这种方法受PCR扩增抑制的影响小，适用于各种复杂样本的检测，如干血片样本，样本中含有多种PCR抑制物的标本。
同时，由于SMN2是SMN1的假基因，SMN1和SMN2间的相互转换会影响SMN1拷贝数的检测，本发明通过通用引物，同时竞争性扩增SMN1和SMN2片段，而非常规方法通过SMN1第7外显子和第7内含子的两个突变位点的ARMS-PCR，通过特异性SMN1的探针实现SMN1拷贝数的精确定值。
本发明至少具有下列优点及有益效果：
1）常规外对照样本设置的检测体系，1拷贝和2拷贝的SMN1 Ct值仅相差1个Ct，很容易检测错误。本发明通过内对照替代常规的外对照样本，能够降低管间差异，减少样本中干扰物质对各片段扩增效率的影响导致的对SMN1拷贝数的计算；
2）本发明针对现有的检测试剂均需要样本的核酸提取和纯化，通过内对照降低直接核酸释放模板中PCR抑制物对拷贝数检测的影响，从而实现对样本核酸粗提后SMN1基因的简便、快速、准确的拷贝数检测，常见的PCR抑制物对本发明检测结果影响小。
3）通过通用引物的竞争性PCR扩增，单个突变位点的检测，通过特异性的SMN1探针和针对SMN2的封闭探针，有效降低SMN2假基因的干扰，同时提高SMN1拷贝数检测的准确性。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1是本发明检测SMN1基因拷贝数的的检测原理示意图；和
图2是本发明检测0、1、2、3及3以上SMN1拷贝样本的PCR扩增图。
具体实施方式
为了使本领域技术人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合实施例对本发明作进一步说明，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。以下实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种化学试剂，均为市售产品。
实施例一 内对照的设计合成
一．内对照序列的合成
本发明的线性化的质粒片段包括质粒载体骨架、设计的内参基因内对照序列和设计的SMN1内对照序列；所述SMN1内对照序列（简称为SMN1 IRS）和人基因组中SMN1待扩增片段的大小、位置和序列一致，仅在探针结合区与所述人基因组中SMN1待扩增片段的核苷酸序列不同，以特异性区分样本中扩增的人基因组中SMN1片段和扩增的SMN1内对照序列。
本发明所提供SMN1内对照序列，是基于基因组中拟扩增的SMN1序列确定的，基因组中扩增的SMN1片段需要覆盖SMN1外显子7中区别于SMN2突变的第6位c.840C的特异性位点，该位点位于基因组扩增片段中探针结合区中间。基于PCR扩增实验，通过扩增效率接近1，例如扩增效率为0.9-1.1之间，特异性高以及SMN2的干扰小来筛选、验证SMN1的扩增区，并最终确定扩增引物对及与之配套的探针结合区。确定SMN1扩增序列后，结合配套的探针结合区，设计SMN1内对照序列：首先为保证两个片段扩增能共用一对引物，保证它们在同一反应体系中的扩增效率高度一致，SMN1内对照序列与基因组中扩增片段的大小和位置一致，核苷酸序列仅在中间位置的探针结合区与基因组片段不同，探针结合区的长度为25-32bp碱基，尽可能靠近上下游扩增引物，但不和引物重叠。基于此荧光探针的GC含量，人工设计核苷酸序列组成，合成一组含不同探针结合区的SMN1内对照序列，用以筛选、验证与基因组的探针结合区无非特异性结合，并和Taqman荧光探针配套使用，选择扩增效率接近为1的探针结合区，从而确定人工合成的SMN1内对照序列，序列组成见SEQ ID No.1。
5’-CCCCTACCTCCGCCTCCCAAAGTTGTGGGATTGTAGGCATGAGCCACTGCAAGAAAACCTTAACTGCAGCCTAATAATTGTTTTCTTTGGGATAACTTTTAAAGTACATTAAAAGACTATCAACTTAATTTCTGATCATATTTTGTTGAATAAAATAAGTAAAATGTCTTGTGAAACAAAATGCTTTTTAACATCCATATAAAGCTATCTATATATA GCTATCTATGTCTATATAGCTATTTTTTTTAACTTCCTTTATTTTCCTTCTAAAACAGACTTTGGGACAAAAAAGAAGGAAGGTGCTCACATTCCTTAAATTAAGGAGTAAGTCTGCCAGCATTATGAAAGTGAATCTTACTTTTGTAAAACTTTATGGTTTGTGGAAAACAAATGTTTTTGAACATTTAAAAAGTTCAGATGTTAAAAAGTTGAAAGGTTAATGTAAAAC-3’(SEQ ID NO.1)。
在上述序列中带下划线区域为上下游引物结合区域，用于扩增产物；斜体部分为探针结合区域。
所述内参基因内对照序列和内参基因待扩增片段的大小、位置和序列一致，仅在探针结合区与所述内参基因待扩增片段的核苷酸序列不同，以特异性区分扩增的内参基因片段和扩增的内参基因内对照序列。
本发明所选内参基因为已知人白细胞内明确为两个拷贝的看家基因，如RPP30、β-actin、GADPH等，比较和SMN1扩增片段GC含量，优选RPP30，扩增片段选择RPP30基因上一段高度保守序列，且其GC含量和SMN1的扩增片段接近的基因片段。基于PCR扩增实验，通过扩增效率接近1，例如扩增效率为0.9-1.1之间，扩增特异性高等条件来筛选、验证RPP30的扩增区，并最终确定扩增引物对和与之配套的探针结合区。确定RPP30扩增序列后，结合其探针结合区，设计内参基因RPP30内对照序列（简称为RPP30 IRS）：同样为保证两个片段扩增能共用一对引物，保证它们在同一反应体系中的扩增效率高度一致，内参基因RPP30内对照序列与基因组中扩增片段的大小和位置一致，核苷酸序列仅在中间位置的探针结合区与基因组片段不同，探针结合区的长度为25-32bp碱基，尽可能靠近上下游扩增引物，但不和引物重叠。同样基于荧光探针的碱基组成，人工设计核苷酸序列组成，合成一组不同碱基序列的内参基因RPP30内对照序列，筛选、确定与基因组的探针结合区无非特异性结合，并和对应Taqman荧光探针配套使用，选择扩增效率接近为1的探针结合区，从而确定人工合成的内参基因RPP30内对照序列，序列组成见SEQ ID No.2。
5’-TCTTGATTCAACTGTCACACACCTGTCCTTAGTAGCATCTTTATGACCATTATTTTTCATTAGTAAAGAAATGTGATCATCCACCCATGCCAGAACCTTTGGTCAGACATGAGAACAAAAGCTAATCAGGCAGGCACTGTTAGGAAGAGGCTGTTAGGAACAATCATTTGATGAGCTTTAGGCAATTTGCATCAAAATGGTCTTA GTCTGAGTAATG GACCCTAGAACGAC TATTTTATCCATCTAAAAATTTAAAATAAGATGCTATGAAAGAAATATTCACAACCTTCAAT AGCACATTATTTTTAATTTTTCTTTTTCAAGAATTCCTATAGCAGTTTTAAAGTGAACTTGATTAATGTACCAAGATGAAAATCAGAACTTTTTCCTTAAAAAATAATTATGCTGATAATATCCTTTTTTTCT-3’(SEQ ID No.2)。
在上述序列中带下划线区域为上下游引物结合区域，用于扩增产物；斜体部分为探针结合区域。
二．内对照质粒的构建
本发明SMN1内对照序列和内参基因内对照序列通过一段含有限制性内切酶特异性识别位点的DNA序列连接，经人工合成双链基因片段后，插入到质粒载体中，从而获得内对照质粒，在内参基因内对照序列、SMN1内对照序列和所述质粒载体中均不含所述限制性内切酶特异性识别位点；所述内对照质粒经限制性内切酶酶切、纯化，得到所述线性化的质粒片段，所述线性化的质粒片段两端分别是所述SMN1内对照序列和所述内参基因内对照序列，所述SMN1内对照序列和所述内参基因内对照序列之间间隔2-10kb的质粒骨架序列。
在一种实施方式中，本发明提供的内对照序列除了人工合成的RPP30 IRS、SMN1IRS序列外，还有含有一个质粒骨架。所述RPP30 IRS、SMN1 IRS两个序列的数量比可为1：1，1：2或2：1，优选为1：1。RPP30 IRS和SMN1 IRS序列之间引入一段含至少一个限制性内切酶位点的序列，通过基因克隆插入到质粒载体pUCm T载体，所述序列包含至少一个限制性内切酶特异性识别位点，而在RPP30 IRS序列、SMN1 IRS、pUCm T载体中均不含该酶切位点，可以为Apa I、Sac II、Sma I、Mlu I等酶切位点，优选Mlu I，引入该酶切位点可以将内对照质粒进行酶切线性化。
本发明提供的质粒载体为通用T载体或其它质粒载体，载体序列长度为2-10kb，如pUCm T、pUC57、pGEM T等T载体或其它质粒，优选质粒骨架为2.7kb的pUCm-T载体。RPP30IRS和SMN1 IRS序列在同一质粒上，拷贝数的比值为恒定的1:1，相当于样本中2拷贝SMN1的正常样本，作为正常样本的对照。内对照质粒经Mlu I酶切线性化后，使RPP30 IRS和SMN1IRS两个序列正好位于线性化的DNA片段两端，中间间隔2.7kb的质粒骨架序列，可使两个序列的扩增独立进行，不会互相干扰。插入到质粒载体中含RPP30 IRS和SMN1 IRS的人工合成的片段见SEQ ID NO.3。
5’-CCCCTACCTCCGCCTCCCAAAGTTGTGGGATTGTAGGCATGAGCCACTGCAAGAAAACCTTAACTGCAGCCTAATAATTGTTTTCTTTGGGATAACTTTTAAAGTACATTAAAAGACTATCAACTTAATTTCTGATCATATTTTGTTGAATAAAATAAGTAAAATGTCTTGTGAAACAAAATGCTTTTTAACATCCATATAAAGCTATCTATATATA GCTATCTATGTCTATATAGCTATTTTTTTTAACTTCCTTTATTTTCCTTCTAAAACAGACTTTGGGACAAAAAAGAAGGAAGGTGCTCACATTCCTTAAATTAAGGAGTAAGTCTGCCAGCATTATGAAAGTGAATCTTACTTTTGTAAAACTTTATGGTTTGTGGAAAACAAATGTTTTTGAACATTTAAAAAGTTCAGATGTTAAAAAGTTGAAAGGTTAATGTAAAACACGCGTTCTTGATTCAACTGTCACACACCTGTCCTTAGTAGCATCTTTATGACCATTATTTTTCATTAGTAAAGAAATGTGATCATCCACCCATGCCAGAACCTTTGGTCAGACATGAGAACAAAAGCTAATCAGGCAGGCACTGTTAG GAAGAGGCTGTTAGGAACAATCATTTGATGAGCTTTAGGCAATTTGCATCAAAATGGTCTTAGTCTGAGTAATGGA CCCTAGAACGACTATTTTATCCATCTAAAAATTTAAAATAAGATGCTATGAAAGAAATATTCACAACCTTCAATAG CACATTATTTTTAATTTTTCTTTTTCAAGAATTCCTATAGCAGTTTTAAAGTGAACTTGATTAATGTACCAAGATGAAAATCAGAACTTTTTCCTTAAAAAATAATTATGCTGATAATATCCTTTTTTTCT-3’(SEQ ID NO.3)。
在上述序列中带下划线区域为上下游引物结合区域，用于扩增产物；斜体部分为探针结合区域；带方框序列为限制性内切酶位点的序列。
实施例二 通用引物和探针的设计合成
本发明提供2对通用引物和用于检测的4条特异性荧光探针，所述引物包括SMN通用引物和内参基因RPP30通用引物。其中通用引物SM F（SEQ ID No.4）和SM R（SEQ IDNo.5）在检测体系中特异性扩增基因组中的SMN1、SMN2以及内对照序列SMN1 IRS；其中通用引物RP F（SEQ ID No.6）和RP R（SEQ ID No.7）在扩增体系中特异性扩增基因组中RPP30和内对照片段中RPP30 IRS序列。所述4条荧光探针包括：针对基因组中SMN1的5’端标记FAM，3’端标记MGB的荧光探针SM1 WP（SEQ ID No.8）；针对内对照中的SMN1 IRS的为5’端标记ROX，3’端标记BHQ2的荧光探针SM1 RP（SEQ ID No.9）；针对基因组中内参基因RPP30的5’端标记VIC，3’端标记Eclipse的荧光探针RP WP（SEQ ID No.10）；针对内对照片段中RPP30的5’端标记CY5，3’端标记BHQ2的荧光探针RP RP（SEQ ID No.11）。
本发明所述SM1 WP探针，针对的是SMN1和SMN2的差异位点，用以特异性检测SMN1。由于SMN1和SMN2基因的高度同源性，仅5个碱基存在差异，包括第7外显子c.840C>T和第6内含子的G-A（ins6-45，G/A）两个位点，常规SMN1拷贝数检测方法多为ARMS-PCR，针对这两个位点分别作为上下游引物3’端的最后一个碱基进行引物设计，通过与模板不能完全匹配的上下游引物将不能完全形成互补碱基对，形成错配，延伸受阻，不能产生PCR产物，从而特异性扩增SMN1片段而非SMN2片段。但在PCR扩增时，DNA聚合酶的严谨性受多因素影响，即使引物的3’末端碱基与模板不互补，延伸仍然可以进行，因此会有一定SMN2的非特异性扩增。同时高度同源的SMN1和SMN2基因在基因组中存在相互转化，针对两个位点进行ARMS-PCR检测SMN1拷贝数的方法，可能因为一条引物区的转化，会导致SMN1拷贝数减少，出现SMN1假阳性的结果。本发明为克服上述问题，设计能同时扩增SMN1和SMN2片段的通用引物，而扩增片段中包含能够区分SMN1和SMN2的第7外显子第6位的c840C>T位点，SM1 WP探针通过设计提高Tm值而增加其和SMN1片段结合的特异性，使其检测的信号来源于SMN1而非SMN2。
本发明提供的SMN2封闭探针SM2 BP，是一段为降低SMN2片段对SMN1检测的干扰作用的不能被水解的寡核苷酸探针，其针对SMN2外显子7 c840 T位点，能特异性结合SMN2，而非SMN1，能封闭SMN2基因上的c.840 T位点。所述封闭探针，与SMN1检测探针SM1 WP在同一条DNA链；通过MGB修饰或LAN锁核酸修饰，提高Tm值，增加与拟封闭序列的结合特异性，优选为MGB修饰，相较与传统的锁核酸修饰，MGB修饰的探针与目标序列结合的特异性更强，可以提升短序列和低GC序列的Tm值，扩展探针可用的区域。本发明所提供的通用引物、荧光探针和封闭探针序列见表1。
表1 本发明中的引物和探针序列及修饰情况
实施例三 本发明检测SMN1拷贝数的方法
本发明检测SMN1拷贝数的方法如图1所示。
1.设计SMN1的内对照序列，和基因组中待扩增片段的大小、位置和序列一致，仅在探针结合区与基因组片段的核苷酸序列不同，以特异性区分样本中扩增的基因组SMN1片段和内对照中扩增的SMN1内对照序列；
2. 设计内参基因RPP30的内对照序列，和基因组中待扩增片段的大小、位置和序列一致，仅在探针结合区与基因组片段的核苷酸序列不同，以特异性区分样本中的扩增的基因组RPP30片段和内对照中扩增的内参基因内对照序列；
3. 设计的SMN1内对照序列和内参基因内对照序列通过一段含有限制性内切酶位点如Mlu I的DNA序列连接，经人工合成双链基因片段后，插入到质粒载体pUCm 18T，获得内对照质粒；
4. 内对照质粒经Mlu I限制性内切酶酶切、纯化，得到线性化内参基因内对照序列，再经ddPCR定值确定其浓度；
5. 打孔钳在待检血斑上打下3.2mm的干血片，每个样本加入40µl核酸释放剂，同时加入一定体积的线性化内对照片段，使内对照片段的拷贝数和基因组中SMN1的拷贝数大致相同，经核酸释放后，离心获得上清，即是PCR扩增的模板；
6. 构建多重荧光定量PCR扩增体系：包括2对通用引物，其中SM F和SM R用来扩增样本中的SMN1基因片段、SMN2基因片段及内对照中的SMN1 IRS基因片段；RP F和RP R用来扩增基因组中的RPP30基因片段和内对照中的RPP30 IRS基因片段。扩增体系中的4条特异性荧光探针，其中SM1 WP和SM1 RP分别特异性结合基因组中扩增的SMN1片段和内对照中的SMN1 IRS片段；RP WP和RP RP分别特异性结合基因组中扩增的RPP30片段和内对照中RPP30IRS片段。扩增体系中SM2 BP封闭探针，能特异性结合扩增产物SMN2中的SM1 WP可能结合的区域，通过封闭该段序列，避免与SM1 WP探针的非特异性结合，减少SMN2的基因片段对SMN1荧光检测信号的影响，增加SMN1检测的特异性；
7. 样本在构建的多重扩增体系中进行扩增后，2对通用引物能扩增5条基因片段，分别是SMN1、SMN2、SMN1 IRS、RPP30和RPP30 IRS，4条荧光Taqman探针能特异性识别、检测SMN1、SMN1 IRS、RPP30和RPP30 IRS扩增片段；
根据SMN1、SMN1 IRS、RPP30和RPP30 IRS四个片段的Ct值，以2-ΔΔCt法计算相对表达量RQ值（relative quantity），RQ=2-ΔΔCt =2-(ΔCt1-ΔCt2)，ΔCt1=ΔCtSMN1-ΔCtRPP30，ΔCt2=ΔCtSMN1 IRS-ΔCtRPP30 IRS，再根据RQ的大小判断待检样本中的SMN1的拷贝数。
实施例四 本发明对干血片或全血样本中SMN1拷贝数的检测
1. 干血片或血液样本前处理
打孔钳打下3.2mm干血片，或取3µL 血液至0.2ml PCR管中，加入40µL核酸释放剂，同95℃ 10min后，离心收集上清作为PCR扩增的模板。
2. 反应体系建立
靶序列扩增引物和内参引物、探针终浓度选择50nM-500nM，MgCl2终浓度选择1.5mM-6mM，dN(U)TP终浓度选择100nM-800nM，BSA选择0.05%-0.5%，UNG酶选择0.05-0.3IU/反应，内对照序列IRS选择0.1-30ng/µL，封闭探针SMN2 BP选择50nM-500nM，为满足各个基因片段扩增效率一致，各引物和探针浓度利用正交试验方法，通过大量试验对比，对各引物和探针浓度、反应体系中各个组分浓度进行调整优化，以获得最佳的扩增效率组合。本发明采用含U（尿嘧啶）体系，UNG酶可以消除产物带来的污染，在不影响扩增效率的情况下，优化dUTP和UNG酶的浓度。最终确定最优的PCR反应体系见下表2。
表2 PCR反应体系组成（30µL反应体系）
。
3. 确定PCR扩增程序
针对上述反应液组成，逐步对反应条件进行优化，经过大量实验对比优化，最终确定的最佳反应扩增体系如表3。
表3 PCR扩增体系组成
。
UNG酶处理时间和预变性时间按照试剂生产厂家说明书推荐的时间进行，退火温度和退火时间对PCR扩增效率和特异性影响较大，上述条件优化结果显示退火温度偏低会有非特异性扩增信号，退火温度太高会导致扩增效率降低，特异性好。优化的扩增条件间表4。
表4 PCR扩增条件
4. 结果分析
按PCR反应体系和实验条件对25分临床标本进行检测。根据软件给出的Ct值，分别计算各待检样本和内对照中SMN1基因和内参基因RPP30的ΔCt，记为ΔCt1和ΔCt2，ΔCt1=ΔCtSMN1-ΔCtRPP30，ΔCt2=ΔCtSMN1 IR-ΔCtRPP30 IR，以2-ΔΔCt法计算相对表达量RQ值（relative quantity）。若计算得RQ值小于0.2或SMN1通道无扩增则判断此样本中SMN1为0拷贝；若RQ值在0.3-0.7之间，则判断此样本中SMN1为1拷贝；若RQ值在0.8-1.2之间，则判断此样本中SMN1为2拷贝；若RQ值大于1.3，则判断此样本中SMN1为3及3拷贝及以上。25例的干血斑标本检测结果间表5。本发明方法检测0、1、2、3及3以上SMN1拷贝样本的PCR扩增图如图2所示。
表5 25例干血斑标本SMN1拷贝数检测结果
。
实施例五 本发明检测含PCR抑制物样本的结果
本发明的内对照和待检片段为同一PCR管内扩增，同时SMN1的片段和内参基因RPP30的片段均采用通用扩增引物，本发明的体系的待检样本和对照序列的扩增效率受各种PCR抑制物的影响较小。肝素是常用的抗凝剂，样本中可能存在外源性肝素的存在，但肝素会影响PCR扩增反应，阴离子物质，可以结合DNA，在提取过程中不能完全去除，通过抑制DNA聚合酶的活性抑制PCR扩增。内源性物质血红蛋白和胆红素可直接与Taq酶相互作用，抑制Taq酶活性，显著降低PCR扩增效率，导致基因扩增Ct值增大或不能正常扩增。
为验证本发明对各种PCR抑制物的耐受性，选择3例1、2、3及3以上SMN1拷贝的全血标本，通过添加不同浓度的肝素、血红蛋白、胆红素和甘油三酯，滴制干血斑，按实施例2的条件进行检测，以验证添加抑制物后本发明检测SMN1拷贝数的准确性。检测结果见表6。
表6 不同PCR抑制物对SMN1拷贝数检测结果的影响
由表6可见，本发明检测方法，在全血中添加浓度达0.5U/mL的肝素，300mg/mL的血红蛋白，2mg/dL的胆红素时，对1、2、3及3以上拷贝的SMN1的检测没有影响。表明常见的PCR抑制物对本发明检测结果影响小。
应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。
本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。
Claims (9)
1.基于2-ΔΔCt法检测SMN1基因拷贝数的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括作为内对照的线性化的质粒片段，所述线性化的质粒片段包括质粒载体骨架、设计的内参基因内对照序列和设计的SMN1内对照序列；
所述SMN1内对照序列和人基因组中SMN1待扩增片段的大小、位置和序列一致，仅在探针结合区与所述人基因组中SMN1待扩增片段的核苷酸序列不同，以特异性区分样本中扩增的人基因组中SMN1片段和扩增的SMN1内对照序列；
所述内参基因内对照序列和内参基因待扩增片段的大小、位置和序列一致，仅在探针结合区与所述内参基因待扩增片段的核苷酸序列不同，以特异性区分扩增的内参基因片段和扩增的内参基因内对照序列；
所述SMN1内对照序列和所述内参基因内对照序列通过一段含有限制性内切酶特异性识别位点的DNA序列连接，经人工合成双链基因片段后，插入到质粒载体中，从而获得内对照质粒，在内参基因内对照序列、SMN1内对照序列和所述质粒载体中均不含所述限制性内切酶特异性识别位点；所述内对照质粒经限制性内切酶酶切、纯化，得到所述线性化的质粒片段，所述线性化的质粒片段两端分别是所述SMN1内对照序列和所述内参基因内对照序列，所述SMN1内对照序列和所述内参基因内对照序列之间间隔2-10kb的质粒骨架序列；
所述SMN1内对照序列是
SEQ ID NO.1：5’- CCCCTACCTCCGCCTCCCAAAGTTGTGGGATTGTAGGCATGAGCCACTGCAAGAAAACCTTAACTGCAGCCTAATAATTGTTTTCTTTGGGATAACTTTTAAAGTACATTAAAAGACTATCAACTTAATTTCTGATCATATTTTGTTGAATAAAATAAGTAAAATGTCTTGTGAAACAAAATGCTTTTTAACATCCATATAAAGCTATCTATATATAGCTATCTATGTCTATATAGCTATTTTTTTTAACTTCCTTTATTTTCCTTCTAAAACAGACTTTGGGACAAAAAAGAAGGAAGGTGCTCACATTCCTTAAATTAAGGAGTAAGTCTGCCAGCATTATGAAAGTGAATCTTACTTTTGTAAAACTTTATGGTTTGTGGAAAACAAATGTTTTTGAACATTTAAAAAGTTCAGATGTTAAAAAGTTGAAAGGTTAATGTAAAAC-3’；和/或，
所述内参基因内对照序列是SEQ ID NO.2：5’-TCTTGATTCAACTGTCACACACCTGTCCTTAGTAGCATCTTTATGACCATTATTTTTCATTAGTAAAGAAATGTGATCATCCACCCATGCCAGAACCTTTGGTCAGACATGAGAACAAAAGCTAATCAGGCAGGCACTGTTAGGAAGAGGCTGTTAGGAACAATCATTTGATGAGCTTTAGGCAATTTGCATCAAAATGGTCTTAGTCTGAGTAATGGACCCTAGAACGACTATTTTATCCATCTAAAAATTTAAAATAAGATGCTATGAAAGAAATATTCACAACCTTCAATAGCACATTATTTTTAATTTTTCTTTTTCAAGAATTCCTATAGCAGTTTTAAAGTGAACTTGATTAATGTACCAAGATGAAAATCAGAACTTTTTCCTTAAAAAATAATTATGCTGATAATATCCTTTTTTTCT-3’。
2.根据权利要求1所述的的试剂盒，其特征在于，所述限制性内切酶特异性识别位点是Apa I、Sac II、Sma I或Mlu I限制性内切酶特异性识别位点。
3.根据权利要求2所述的的试剂盒，其特征在于，所述限制性内切酶特异性识别位点是Mlu I限制性内切酶特异性识别位点，所述质粒载体骨架为2.7kb的pUCm-T载体。
4.根据权利要求1所述的的试剂盒，其特征在于，所述线性化的质粒片段中所述SMN1内对照序列和所述内参基因内对照序列的数量是1:1、1:2或2:1。
5.根据权利要求1所述的的试剂盒，其特征在于，所述SMN1内对照序列中探针结合区或所述内参基因内对照序列中探针结合区的长度为25-32bp碱基。
6.根据权利要求1所述的的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：一对SMN通用引物和一对内参基因通用引物：所述SMN通用引物用于特异性扩增基因组中的SMN1、SMN2以及SMN1内对照序列，所述内参基因通用引物特异性扩增基因组内参基因和内参基因内对照序列；
五条特异性核酸探针：一条检测基因组中SMN1的荧光探针，一条检测SMN1内对照序列的荧光探针，一条SMN2封闭探针；和一条检测基因组中内参基因的荧光探针，和一条检测内参基因内对照序列的荧光探针；
其中基因组中扩增的SMN1片段覆盖SMN1外显子7中区别于SMN2突变的第6位的c840C的特异性位点，该位点位于基因组扩增片段中探针结合区中间；所述SMN2封闭探针是一段为降低SMN2片段对SMN1检测的干扰作用的不能被水解的寡核苷酸探针，其针对SMN2外显子7c840T的特异性位点，能特异性结合SMN2，而非SMN1，能封闭SMN2基因上的c840T的特异性位点。
7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述SMN2封闭探针与检测基因组中SMN1的荧光探针在同一条DNA链，其通过MGB修饰或LAN锁核酸修饰，提高Tm值，增加与拟封闭序列的结合特异性。
8.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述内参基因是RPP30，其中所述两对通用引物和五条探针如下：
。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，检测基因组中SMN1的荧光探针和SMN2封闭探针通过MGB修饰。
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