脊髓性肌萎缩症检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及分子诊断领域,特别涉及脊髓性肌萎缩症检测试剂盒及其应用。
背景技术
脊髓性肌萎缩症(spinal muscular atrophy,SMA)是世界上最常见的常染色体隐性遗传性神经肌肉疾病之一。在我国人群的基因携带者频率约为1/50。SMA临床的主要特征是进行性脊髓前角运动神经元退化和近端肌肉萎缩。针对SMA患者目前尚无规范的医学干预和明确的治疗药物,重症患儿常常死于呼吸衰竭。由于SMA预后不良,目前尚无特效治疗方法,故通过遗传筛查以及产前诊断来防止本病患儿的出生是预防本病最有效的方法。
SMA致病基因是位于5号染色体长臂1区3带(5q13)的运动神经元存活基因(suvival motor neuron,SMN)。人基因组有二个紧邻的高度同源的SMN基因:端粒侧的SMN1和中心粒侧SMN2。这两个即序列之间仅在3'端有5个碱基不同。SMN1是主要功能基因,SMN2为修饰基因(对病情严重程度起一定缓解作用)。SMN基因功能异常使脊髓前角alpha细胞变性是导致SMA发生的分子基础。目前已知超过90%的SMA患者为SMN1基因第7外显子纯合缺失所致,因此定量检测SMN1基因第7外显子拷贝数成为SMA基因筛查和产前分子诊断的主要策略。
传统检测SMN1基因第7外显子(ex7)拷贝数的方法包括聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)、多重连接依赖性探针扩增(MLPA)。PCR-RFLP只能检测第7外显子纯合缺失的情况,不能检测含有1个拷贝的携带者。MLPA能检测第7外显子的纯合缺失、含有1个拷贝的携带者,和2个拷贝的正常人,但操作负责,试剂昂贵,不容易临床推广应用。目前也有一些商业化试剂盒,通过荧光定量方法来定量检测SMN1基因拷贝数的变化,但对于要区分1个拷贝和2个拷贝的情况,荧光定量的方法首先要做标准曲线,这就使得临床在检测少量样本时试剂成本明显上升。
数字PCR技术是2010年左右开始成熟的一种可对基因拷贝数进行绝对定量的分子诊断方法,无需做标准曲线即可对样本中的靶基因的拷贝数目进行绝对定量。微滴式数字PCR技术,可以将反应体系分成超过2万个液滴反应单元,使得检测的靶基因浓度被极限地稀释,最终每个微滴反应单元不包含、或者包含1个靶基因序列。靶基因拷贝数的数量符合泊松分布。根据每个微滴反应单元的信号的有无,PCR结果判定为阳性或阴性。阳性可以理解为1,阴性可以理解为0,因此称为数字PCR。
发明内容
本发明提供一种脊髓性肌萎缩症检测试剂盒,所述试剂盒包括微滴式数字PCR方法定量检测SMN1基因第7外显子基因型的试剂,所述试剂基于微滴式数字PCR方法定量检测SMN1基因第7外显子拷贝数的试剂。
在一种实施方式中,所述试剂盒包括基于微滴式数字PCR方法定量检测人内参基因拷贝数的试剂。
在一种实施方式中,基于微滴式数字PCR方法定量检测SMN1基因第7外显子拷贝数的试剂包括以下引物和探针:上游引物序列:AAATGTCTTGTGAAACAAAATGC;下游引物序列:GAATGTGAGCACCTTCCTTCT;和检测探针序列:
CCGCTTCATCGCAGTGGGCTACGTG。
在一种实施方式中,所述内参基因是RPP30,基于微滴式数字PCR方法定量检测内参基因RPP30拷贝数的试剂包括以下引物和探针:上游引物序列:GATTTGGACCTGCGAGC;下游引物序列:GGTTGGCCAGGCGCGAAG;和检测探针序列:ACAGGGTTTCAGACAAAAT。
在一种实施方式中,如果SMN1/RPP30的比值为0.72-0.95,则表示基因SMN1和内参基因RPP30的拷贝数相同,都是正常的2个拷贝;如果SMN1/RPP30的比值为0.38-0.48,则表示基因SMN1比内参基因RPP30的拷贝数少1个拷贝,只有1个拷贝,第7外显子为缺失杂合突变;如果SMN1/RPP30的比值小于0.2,则表示基因SMN1比内参基因RPP30的拷贝数少2个拷贝,第7外显子为缺失纯合突变。
在一种实施方式中,提供脊髓性肌萎缩症检测试剂盒的应用,所述应用包括:基于微滴式数字PCR方法定量检测SMN1基因和人内参基因的数量;和根据SMN1和内参基因的数量比值确定SMN1的基因型。
在一种实施方式中,基于微滴式数字PCR方法定量检测SMN1基因的数量包括使用以下引物和探针:上游引物序列:AAATGTCTTGTGAAACAAAATGC;下游引物序列:GAATGTGAGCACCTTCCTTCT;和检测探针序列:
CCGCTTCATCGCAGTGGGCTACGTG。
在一种实施方式中,所述内参基因是RPP30,基于微滴式数字PCR方法定量检测人内参基因RPP30的数量包括使用以下引物和探针:上游引物序列:GATTTGGACCTGCGAGC;下游引物序列:GGTTGGCCAGGCGCGAAG;和检测探针序列:ACAGGGTTTCAGACAAAAT。
在一种实施方式中,如果SMN1/RPP30的比值为0.72-0.95,则表示基因SMN1是野生型;如果SMN1/RPP30的比值为0.38-0.48,则表示基因SMN1为缺失杂合突变;和如果SMN1/RPP30的比值小于0.2,则表示基因SMN1为缺失纯合突变。
如上所述,人基因组有二个紧邻的高度同源的SMN基因:端粒侧的SMN1和中心粒侧SMN2。这两个即序列之间仅在3'端有5个碱基不同。SMN1是主要功能基因,SMN2为修饰基因(对病情严重程度起一定缓解作用)。目前已知超过90%的SMA患者为SMN1基因第7外显子纯合缺失所致,因此定量检测SMN1基因第7外显子拷贝数成为SMA基因筛查和产前分子诊断的主要策略。但是由于SMN1的ex7和SMN2的ex7只有一个碱基的差异,导致在检测SMN1的ex7时由于SMN2的ex7的存在,在检测过程中非常容易出现假阳性。经过本发明人的优化,本发明的上述引物和探针的设计能做到只检测SMN1基因的ex7而不受SMN2基因的ex7的干扰。
使得本发明的试剂盒阳性检测准确率高达100%,重复性好,没有假阳性和假阴性;灵敏度高,每次检测的DNA用量仅需20ng;检测所需时间短,从样本DNA提取到检测结果出来最快只需要4个小时。
由于本发明使用的试剂盒可以高通量、自动化检测SMN1基因ex7的拷贝数缺失情况,降低了检测成本,并且结果准确,可以实现快速检测,适用于大规模的新生儿筛查。SMN1基因ex7筛查的意义,在于对产前诊断、治疗都具有指导作用。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例,对于本领域普通技术人员来说,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1是本发明中分析软件QuantaSoft软件展示的微滴PCR检测中的油滴分配图;其中蓝点(左上)是通道1通道FAM的阳性油滴,显示的是FAM标记的SMN1基因的ex7阳性油滴,绿点是通道2(右下)通道HEX的阳性油滴,显示的是HEX标记的内参基因RPP30阳性油滴,橘红色点(右上)是既包含SMN1又包含RPP30的双重阳性油滴,黑色油滴(左下)为阴性油滴,表示不包含SMN1或RPP30信号的阴性油滴;和
图2是采用本发明对9个经过MLPA检测已知的SMN1基因的ex7不同缺失状态的样本进行检测的分析结果图。
具体实施方式
为了使本领域技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案,下面将结合以下实施例对本发明作进一步说明,显然,所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例,都应当属于本申请保护的范围。
实施例一.脊髓性肌萎缩症检测试剂盒
为克服上述提到的定量检测SMN1基因第7外显子(ex7)拷贝数方法的缺陷,本发明提供了一种基于微滴式数字PCR方法对SMN1基因ex7拷贝数进行绝对定量的试剂盒。该方法中用到的引物、探针序列,和数字PCR反应体系如下。
表1.SMN1基因ex7进行数字PCR方法检测的引物和探针
名称 |
序列(5’-3’) |
序列号 |
SMN1-F |
AAATGTCTTGTGAAACAAAATGC |
SEQ ID NO:1 |
SMN1-R |
GAATGTGAGCACCTTCCTTCT |
SEQ ID NO:2 |
SMN1-P |
CCGCTTCATCGCAGTGGGCTACGTG |
SEQ ID NO:3 |
为了监测qPCR反应体系是否正常工作,还同时加入了内参基因人的RPP30基因,RPP30基因的引物、探针如下表2。
表2.内参基因RPP30基因进行数字PCR方法检测的引物和探针
名称 |
序列(5’-3’) |
序列号 |
RPP30-F |
GATTTGGACCTGCGAGC |
SEQ ID NO:4 |
RPP30-R |
GGTTGGCCAGGCGCGAAG |
SEQ ID NO:5 |
RPP30-P |
ACAGGGTTTCAGACAAAAT |
SEQ ID NO:6 |
其中探针5’端带有荧光报告基团HEX,3’端带有荧光淬灭基团MGB。
由于SMN1的ex7和SMN2的ex7只有一个碱基的差异,上述引物和探针的设计能做到只检测SMN1基因的ex7而不受SMN2基因的ex7的干扰。
实施例二.脊髓性肌萎缩症检测试剂盒的应用
本发明所检测的标本类型外周全血的临床样本,将提取的基因组DNA模板稀释到20ng/μl。血样在提取基因组DNA后,先通过MLPA检测SMN1的ex7缺失情况,找出ex7野生型、拷贝数缺失1个的杂合型、拷贝数缺失2个纯合缺失型样本。
微滴数字PCR反应包括配制体系,微滴生成,扩增循环和信号读取4个步骤。
1、仪器和耗材:微滴生成仪、PCR仪T-100、油滴读数仪、PX1热封仪、微滴生成耗材(包括DG8 cartridge、holder、胶垫gasket)、锡质封板膜,96孔板均来自美国伯乐公司。
2、PCR试剂购自北京康为世纪公司;数字PCR稳定剂、生成油、检测油购自北京新羿生物科技有限公司/
3、实验流程
3.1 PCR反应体系配制,总体积20μl,其中加入10μl的2×qPCR buffer(北京康为世纪),模板为1μl基因组DNA,总量20ng,SMN1和RPP30两个基因的引物和探针加入同一PCR管,使引物终浓度为250nmol/L,探针终浓度为400nmol/L,再加入数字PCR稳定剂2μl,补水至20μl;
3.2将一个DG8 cartridge放入holder中,注意缺口放置方向;
3.3将20μl样品反应体系加入到DG8 cartridge中间一排的8个孔内,缓慢打出液体,打出一部分后慢慢提升枪头位置再打出余下液体,免引入气泡;
3.4在DG8 cartridge最底下一排8个孔中各加入70μl微滴生成油(DG Oil);
3.5盖上胶垫(gasket),注意两边的小孔都要钩牢;
3.6将以上holder轻轻地平稳放置于微滴生成仪中,开始生成微滴,注意仪器上指示灯状态,一般2分钟之内完成;
3.7微滴生成于cartridge最上面一排孔内,微滴生成后,用移液器吸取40μl,转移到PCR的96孔板里面;
3.8用预热好的PX1热封仪对96孔板进行封膜,推荐的运行程序为:180℃,10秒。采用锡质封板膜封好膜,在30分钟内进行PCR反应,或者放于4℃冰箱4小时之内进行PCR。
3.9微滴PCR扩增:PCR仪为美国Bio-Rad公司的T-100。PCR反应条件为:95℃10分钟,然后进行40个循环的95℃30秒,58℃20秒,65℃40秒反应,最后72℃10分钟。
4、信号读取
4.1将完成PCR的96孔板放入plate holder中组装好,注意板斜角方位,组装好之后轻轻地平稳放入微滴读取仪中;
4.2打开QuantaSoft软件,建议每次实验之前做一次Flush System,若一周以上未使用建议先做一次Prime再做Flush System。之后对96孔板中样品信息进行设置实验名称、实验类型以及探针信息等,完成后即可进行,读取微滴信号,进行结果分析。结束后结果会被自动分析,人工核实后保存结果。
微滴信号的读取原理是,微滴发生器将含有荧光探针、核酸模板等的反应体系和油滴颗粒充分混合,分成上万个纳升级的油包水微滴,每个微滴不含待测目标基因或者至少含有一个待测目标基因,每个微滴作为一个独立的PCR反应器,经过PCR扩增后,采用微滴分析仪逐个对每个微滴分别进行FAM和HEX两个荧光信号检测。有荧光信号的微滴判读为1,没有荧光信号的微滴判读为0。通过FAM和HEX通道的阳性或者阴性油滴数,根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例,分析软件可计算出FAM标记的目标基因SMN1和HEX标记的内参基因RPP30的拷贝数。
5、结果分析
分析软件QuantaSoft软件展示的微滴PCR检测中的油滴分配图(如图1所示),表示了所有微滴的荧光信号读取结果,蓝点是通道FAM的阳性油滴,显示的是FAM标记的SMN1阳性油滴。绿点是通道HEX的阳性油滴,显示的是HEX标记的内参基因RPP30阳性油滴。橘红色点是既包含SMN1又包含RPP30的双重阳性油滴,黑色油滴为阴性油滴,表示不包含SMN1或RPP30模板片段的油滴。蓝色SMN1阳性油滴、绿色RPP30阳性油滴、橘红色SMN1和RPP30的双重阳性油滴以及黑色阴性油滴分别聚集在不同区域。
根据油滴读数仪(QX200 Droplet Reader)读取的荧光信号,计算目标基因SMN1和内参基因RPP30的数量和比值,从而获得SMN1的拷贝数。
根据已知样本测试,我们设置了一个阈值,如果SMN1/RPP30的比值为0.72-0.95,则表示目标基因SMN1和内参基因RPP30的拷贝数相同都是正常的2个拷贝。如果SMN1/RPP30的比值为0.38-0.48,则表示目标基因SMN1比内参基因RPP30的拷贝数少1个拷贝,只有1个拷贝,为ex7缺失杂合突变。如果SMN1/RPP30的比值小于0.2,则表示目标基因SMN1比内参基因RPP30的拷贝数少2个拷贝,为ex7缺失纯合突变。
如图2所示,左边的三个样本为SMN1的ex7纯合缺失,中间的三个样本为SMN1的ex7杂合缺失,右边的三个样本为SMN1的ex7野生型。
对于待测DNA的选择,本发明并没有特别的限制,既可以是从人体的血液也可以是其他体液、组织,甚至口腔拭子,为了方便实施,通常优选从血液中提取的基因组DNA。
对于本发明中的PCR扩增反应的条件,并不受到特别的限制,只要能够获得扩增产物,利于探针结合即可。
应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质,因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的,而不是意欲限制本发明的范围,本发明的范围仅受限于所附的权利要求。
本领域的技术人员还将认识到,或者能够确认使用不超过常规实验,在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。
序列表
<110> 佛山市顺德区辉锦创兴生物医学科技有限公司
<120> 脊髓性肌萎缩症检测试剂盒及其应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aaatgtcttg tgaaacaaaa tgc 23
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gaatgtgagc accttccttc t 21
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccgcttcatc gcagtgggct acgtg 25
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gatttggacc tgcgagc 17
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggttggccag gcgcgaag 18
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
acagggtttc agacaaaat 19