CN111394434A - 一种TaqMan探针法的CHO宿主细胞DNA残留检测试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种TaqMan探针法的CHO宿主细胞DNA残留检测试剂盒及其应用，所述的试剂盒包含：CHO DNA Control，DNA Dilution Buffer，2x MaxDetect qPCR Mix，10x CHO Detection Mix；本发明还涉及上述试剂盒的用途和使用方法。试剂盒中包含制备标准曲线的DNA参考品CHO DNA Control，已溯源至国家标准品，利用Taqman探针定量PCR方法，能快速、特异地检测fg水平的CHO宿主细胞的DNA残留。本试剂盒适用于生物制药的中间产物到最终成品的不同样本类型，检测结果准确可靠，精密度高，可检测浓度范围为0.3ng/μL‑3fg/μL。

Description

一种TaqMan探针法的CHO宿主细胞DNA残留检测试剂盒及其 应用

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体地说，是一种TaqMan探针法的CHO宿主细胞DNA残留检测试剂盒及其应用。

背景技术

TaqMan荧光探针是一种寡核苷酸探针，其5’端携带荧光基团，如FAM、TET、VIC、HEX等，3’端携带淬灭基团，如TAMRA、BHQ等。PCR扩增时在加入引物的同时加入特异性的荧光探针。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告基团和淬灭基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号。即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

TaqMan探针法的开发

通过引入基于Taq DNA聚合酶5’-3’外切酶活性的荧光标记探针，实时定量PCR系统得到了显著提升。这些荧光探针的使用，使得实时定量的方法得到了发展，实现了仅对特定扩增产物的检测，避免了普通荧光定量PCR染料会结合引物二聚体或非特异性扩增产物的假阳性。此外，荧光标记探针的开发，也免去了用于探针降解分析的PCR反应后处理过程。

TaqMan探针法的工作原理

TaqMan试剂通过采用荧光探针在PCR循环过程中随着特定PCR产物的累计而对其进行检测。工作原理是：

1.构建一段寡核苷酸探针：5’端标记荧光染料报告基团，3’端标记淬灭染料基团。当探针保持完整时，淬灭基团的靠近会通过空间上的荧光共振能力转移(FRET)而显著降低由报告染料基团发射的荧光。

2.如果存在目标序列，探针便会在其中一个引物结合位点的下游发生退火，并随着引物的延伸通过Taq DNA聚合酶的5’-3’外切酶活性，完成切除。

3.探针的切除会：

将报告染料基团和淬灭染料基团进行分离，增强报告染料基团的信号。

将探针从目的链上去除，使引物继续沿模板链末端延伸。因此，探针的介入并不会抑制整个PCR过程。

4.每经过一个循环，就会有更多的报告基团染料分子从各自的探针上切断，荧光强度会随着合成的扩增片段数量的增加而增加。

TaqMan探针法的优缺点

TaqMan方法的优点如下：

需要在探针和目标分子(靶点)之间发生特异性的水解(杂交)，方可生成荧光信号

可使用明显不同的报告基因染料标记探针，在一个反应管内扩增并检测两个不同的序列，无需PCR后处理，减少分析工作量并节省材料成本。

TaqMan方法的主要缺点在于需要根据不同的序列，合成不同的探针。

使用TaqMan探针法的检测类型

用于RNA定量的一步法RT-PCR；

用于RNA定量的两步法RT-PCR；

DNA/cDNA定量；

等位基因检测；

通过IPC进行的正负检测。

TaqMan探针法的应用

TaqMan探针法荧光定量PCR适用于病原体检测，宿主核酸残留检测，疾病耐药基因研究，药物疗效考核，遗传疾病的诊断。新型的TaqMan-MGB探针还用于分析基因突变(SNP)，有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。

由上可知，TaqMan探针法特异性好，准确度高，是一种极其灵敏的核酸检测方法。随着生物制药行业的蓬勃发展，为提高行业生产工艺的标准，TaqMan探针法荧光定量PCR被广泛的应用于CHO宿主细胞DNA残留的检测，加之进口试剂盒价格昂贵，国产试剂盒容易污染的现状，急需一款检测精度高，外源无干扰的试剂盒。

基于此，我们研发了这款TaqMan探针法的CHO宿主DNA残留检测试剂盒，能快速、特异、精确地检测低至fg水平的CHO宿主细胞的DNA残留，较国内同款产品有无外源干扰，精密度更高的优势。关于本发明一种TaqMan探针法的CHO宿主细胞DNA残留检测试剂盒及其应用目前还未有相关报道。

发明内容

本发明的第一个目的是针对现有技术的不足，提供一种用于检测CHO宿主细胞DNA残留的引物对。

本发明的第二个目的是针对现有技术的不足，提供一种用于检测CHO宿主细胞DNA残留的反应体系。

本发明的第三个目的是针对现有技术的不足，提供如上所述反应体系的用途。

本发明的第四个目的是针对现有技术的不足，提供一种用于检测CHO宿主细胞DNA残留的方法。

本发明的第五个目的是针对现有技术的不足，提供一种TaqMan探针法的CHO宿主DNA残留检测试剂盒。

本发明的第六个目的是针对现有技术的不足，提供如上所述试剂盒的使用方法。

为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：

一种用于检测CHO宿主细胞DNA残留的引物对，其特征在于，所述引物对为senseprimer:5’-GACAGGGTTTCTCTGTGTAG-3’(SEQ ID NO:1)所示的正向引物和anti primer:5’-CAGCACTCGGGAGGCAGA-3’(SEQ ID NO:2)所示的反向引物。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：

一种用于检测CHO宿主细胞DNA残留的反应体系，所述的反应体系为实时荧光定量PCR反应体系，包含权SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物对和probe:5’-CTTTGGAGCCTATCCTG-3’(5'-FAM，3'-BHQ1)(SEQ ID NO:3)所示的探针。

为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：

如上所述的反应体系在制备CHO宿主细胞DNA残留检测的试剂盒中的应用。

优选地，所述的CHO宿主细胞DNA残留检测是适用于但不限于CHO细胞表达或生产的治疗蛋白质药物、重组疫苗或单克隆抗体。

优选地，所述的CHO宿主细胞DNA残留检测是适用于以CHO为宿主细胞的生物制药工艺的中间产物到最终成品的不同样本类型。

为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是：

一种用于检测CHO宿主细胞DNA残留的方法，所述的方法为：使用上述反应体系对待测样本提取DNA后进行实时荧光定量PCR，根据所获得的标准曲线，计算得到待检样本中CHO细胞DNA的量。

优选地，所述的待测样本可为但不限于CHO细胞表达或生产的治疗蛋白质药物、重组疫苗或单克隆抗体。

优选地，所述的待测样本是以CHO为宿主细胞的生物制药工艺的中间产物到最终成品的不同样本类型。

为实现上述第五个目的，本发明采取的技术方案是：

一种TaqMan探针法的CHO宿主DNA残留检测试剂盒，所述的试剂盒包含CHO DNAControl，DNA Dilution Buffer，2x MaxDetect qPCR Mix，10x CHO Detection Mix；所述的DNA Dilution Buffer中含有NaN₃；所述的10x CHO Detection Mix中含有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物对和SEQ ID NO:3所示的探针。

优选地，所述的CHO DNA Control浓度为30ng/μL，可溯源至国家标准品。

为实现上述第六个目的，本发明采取的技术方案是：

TaqMan探针法的CHO宿主DNA残留检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

a)样本通过前处理试剂盒提取DNA后，利用DNA Dilution Buffer稀释到合适浓度；

b)将CHO DNA Control利用DNA Dilution Buffer十倍梯度稀释，生成6个浓度的标准品：300pg/μL，30pg/μL，3pg/μL，300fg/μL，30fg/μL，3fg/μL；

c)根据要检测的数量配置PCR反应混合液，依次加入Negative Control(water)，10x CHO Detection Mix，2x MaxDetect qPCR Mix，混匀后分装于用作荧光定量PCR的0.2mL的八连管或96孔板中；

d)将阴性对照，a)中稀释好的样本，b)中稀释好的标准品依次加入已分装的PCR反应混合液中，混匀后放入定量PCR仪进行检测；

e)根据检测结果绘制标准曲线，计算待测样本中含有的CHO宿主DNA的浓度。

优选地，所述的DNA Dilution Buffer中NaN₃的含量比例是1/10000。

本发明优点在于：

本发明提供了一种TaqMan探针法的CHO宿主DNA残留检测试剂盒。该检测试剂盒设计的TaqMan探针及引物对可以特异性检测到CHO多位点的目的序列，且不会被亲缘关系较近的小鼠、大鼠基因组及人、大肠杆菌等生物制药工艺中常见的外源基因组干扰。在同类产品中，准确性好，精密度高，且专属性更好，无外源基因组干扰，可以为重组蛋白药物的生产提供可靠的质量检测数据，为重组蛋白药物的研发和安全生产提供重要支持。

附图说明

附图1是本发明的原理图。

附图2是实施例1中6个标准品的扩增曲线。

附图3是实施例1中6个标准品的标准曲线。

附图4是实施例1中CHO参考品与CHO参考品中分别混合了人、大肠杆菌、小鼠或大鼠的基因组污染后的检测对比结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

应用本发明的TaqMan探针法的CHO宿主细胞DNA残留检测试剂盒进行CHO宿主细胞DNA残留检测的总体思路为：提取工艺流程中待测样本的DNA，稀释到合适的浓度范围，同时将CHO DNA Control参考品用DNA Dilution Buffer稀释为6个浓度梯度的标准品，将上述样品，标准品还有阴性对照利用试剂盒中已有的PCR反应试剂进行qPCR的检测，然后根据标准曲线计算待测样本中CHO宿主DNA的浓度。

实施例1效果实验

一、试剂准备

1)CHO DNA Control制备

首先使用天根生物的“血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒”(DP304-02)提取CHO细胞的基因组。

然后将CHO DNA国家标准品(批号：270026-201101)和上述提取的CHO基因组稀释到CHO DNA Control所需浓度30ng/μL，并进一步稀释到6个制备标准曲线的标准品所需浓度梯度。通过qPCR运行后扩增曲线的Ct值将提取的CHO基因组与CHO DNA国家标准品对标，从而得到CHO DNA Control。

2)DNA Dilution Buffer制备

表1

试剂原液浓度	终浓度
		2M Tris HCl(pH7.5)	1mM
1M EDTA	0.1mM
		10％NaN<sub>3</sub>	0.01％

3)2x MaxDetect qPCRMix制备

即生工产品B532953 SGExcel GoldStar TaqMan qPCR预混液(含ROX)按包装规格分装即可。

4)10x CHO Detection Mix制备

表2

根据以上序列进行序列合成，并配制sense/anti primer及probe的终浓度为10μM，-20℃保存备用。

二、DNA样本准备

1)将待测样本用1xPBS稀释到合适浓度范围。

2)采用依科赛MaxExtract通用型宿主DNA残留样本前处理试剂盒(MB000-0011)抽提待测样本中的DNA。

三、梯度稀释CHO DNA Control制备标准品

对于CHO，需要准备6个稀释梯度的标准品：300pg/μL，30pg/μL，3pg/μL，300fg/μL，30fg/μL，3fg/μL。

1)标记7个低吸附的1.5mL离心管，标记为C0，C1，C2，C3，C4，C5，C6。C0为中间稀释过渡管，其余C1至C6依次对应以上6个稀释梯度的标准品。

2)以上7个离心管中均加入90μL DNA Dilution Buffer。

3)将CHO DNA Control(30ng/μL)从-20℃冰箱取出，轻微涡旋混匀后快速离心，使管盖和管壁的液体聚集到离心管底部。

4)取10μL CHO DNA Control加入C0管中，与已有的90μL DNA Dilution Buffer充分涡旋混匀，并快速离心所有液体到管底。

5)再按以下表格依次进行6次10倍梯度稀释，操作步骤同步骤4。

表3

管号	稀释方法	浓度
			C0	10μL CHO DNA Control+90μL DNA Dilution Buffer	3ng/μL
C1	10μL C0+90μL DNA Dilution Buffer	300pg/μL
			C2	10μL C1+90μL DNA Dilution Buffer	30pg/μL
C3	10μL C2+90μL DNA Dilution Buffer	3pg/μL
			C4	10μL C3+90μL DNA Dilution Buffer	300fg/μL
C5	10μL C4+90μL DNA Dilution Buffer	30fg/μL
			C6	10μL C5+90μL DNA Dilution Buffer	3fg/μL

四、PCR反应混合液的准备

1)首先确定要检测的样本数量和对照数量。

2)将所需试剂在室温完全解冻后，混匀并快速离心。

3)按以下表格里的试剂和对应体积准备一个PCR反应混合液。

表4

试剂	1个30μL反应中所需体积
		Negative Control(water)	2μL
10x CHO Detection Mix	3μL
		2x Max Detect qPCR Mix	15μL
Total	20μL

五、准备标准曲线和样本测试

1)根据标准品和样本数量，计算反应所需孔数，一般一个模板三个复孔(首次测定标准曲线时，不可只做一个复孔)。

反应孔数＝(6个浓度梯度的标准曲线+1个无模板对照NTC+1个阴性质控NEG+待测样TS个数+待测样本对应加标回收ERC个数)*3

NTC＝No Template Control(DNA稀释液DNA Dilution Buffer或阴性对照water)

NEG＝Negative Extraction Control(样本基质溶液或PBS与待测样本一起进行样本前处理，所得纯化液为NEG)

TS＝Test Sample(待测样本)

ERC＝Extraction Recovery Control(待测样本中加入如30pg CHO标准品DNA后与同批待测样本一起进行样本前处理，所得纯化液为加标回收ERC)。

2)如下示例96孔板排版

表5

3)每孔加入20μLPCR反应混合液。

4)加入10μL上述模板DNA到对应孔。

5)盖好管盖或封好96孔板的封口膜后，混匀并快速离心后上机检测。

六、定量PCR程序设置及上机

以下操作步骤为Agilentent Technologies公司Stratagenes Mx3000P，软件为MxPro：

1)打开软件。

2)点击Setup，首先选择Plate Setup按钮在96孔面板上设定排版。

3)选择报告荧光基团为FAM，淬灭荧光基团为none(Applied Biosystems7500qPCR仪检测参比荧光为ROX)。

4)然后选择Thermal Profile Setup按钮设定PCR的循环程序。

5)点击RUN进行定量PCR测定。

七、定量PCR数据分析

以下操作步骤为Agilent Technologies公司Stratagene Mx3000P，软件为MxPro：

1)点击Analyze，在Results的Amplification Plot面板中，此时可初步查看扩增曲线的形态是否正常。

2)点击Setup，在Plate Setup面板中，将标准曲线孔的Well type一栏设置为Standard，并且在Standard Quantity一栏分别赋值为3000、300、30、3、0.3、0.03(含义为每孔的DNA总量，单位为pg)，并且在相应的Show Well Names一栏中命名为C1，C2，C3，C4，C5，C6。

3)在Plate Setup面板中，将无模板对照NTC孔的Well type一栏设置为NTC，将阴性质控NEG孔、待测样本孔、样本ERC孔的Well type一栏设置为Unknow，并且在相应的ShowWell Names一栏中命名为NTC、NEG、TS、ERC。

4)点击Analyze，在Results的Standard Curve面板中，可读取标准曲线的R²、斜率(Slope)、截距(Intercept)和扩增效率(Efficiency)。

5)在Results的Text Report面板中，Quantity一栏可读取无模板对照NTC、阴性质控NEG、待测样本、样本ERC的检测值，单位为pg/10μL。后续可在检测报告中将单位换算为pg/μL或pg/mL。

八、实验结果

如图2所示为6个标准品的扩增曲线，图中显示扩增曲线有明显的指数增长期，每个浓度的扩增曲线均匀叠和在一起，表明本方法重复性好。

如图3所示为6个标准品的标准曲线，图中显示标准曲线线性良好，检测灵敏度可达到3.0fg/μl。标准曲线方程为Y＝-3.469*log(X)+27.93,R²＝1.000,扩增效率Eff.＝94.2％。

如图4所示为CHO参考品与CHO参考品中分别混合了人、大肠杆菌、小鼠或大鼠的基因组污染后的检测对比结果，从图4可以看到，加入人、大肠杆菌、小鼠或大鼠的基因组与未加其他种类的基因组DNA的标准曲线高度重合，说明了引物和探针不会在其他物种的基因组DNA发生非特异性反应，说明本实验所设计的引物和探针具有高度的特异性，专属性较好。

九、结论

(1)本发明设计的试剂盒，每个Q-PCR反应管中都设置了内控试剂，保证所有的反应管中的PCR扩增效率的一致性，提高结果的可信度。

(2)参考品的标准曲线线性良好，检测灵敏度可达到3.0fg/μl。

(3)在专属性实验中，掺入人、大肠杆菌、小鼠或大鼠的基因组DNA均不会产生非特异性扩增，所以，本方法的专属性很好，能特异性的检测CHO细胞基因组DNA。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 依科赛生物科技(太仓)有限公司

<120> 一种TaqMan探针法的CHO宿主细胞DNA残留检测试剂盒及其应用

<130> /

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gacagggttt ctctgtgtag 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gacagggttt ctctgtgtag 20

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ctttggagcc tatcctg 17

Claims (10)

1.一种用于检测CHO宿主细胞DNA残留的引物对，其特征在于，所述引物对为SEQ IDNO:1所示的正向引物和SEQ ID NO:2所示的反向引物。

2.一种用于检测CHO宿主细胞DNA残留的反应体系，其特征在于，所述的反应体系为实时荧光定量PCR反应体系，包含权利要求1所述的引物对和SEQ ID NO:3所示的探针。

3.权利要求2所述的反应体系在制备CHO宿主细胞DNA残留检测的试剂盒中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的CHO宿主细胞DNA残留检测是适用于但不限于CHO细胞表达或生产的治疗蛋白质药物、重组疫苗或单克隆抗体。

5.一种用于检测CHO宿主细胞DNA残留的方法，其特征在于，所述的方法为：使用权利要求2所述的反应体系对待测样本提取DNA后进行实时荧光定量PCR，根据所获得的标准曲线，计算得到待检样本中CHO细胞DNA的量。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的待测样本可为但不限于CHO细胞表达或生产的治疗蛋白质药物、重组疫苗或单克隆抗体。

7.一种TaqMan探针法的CHO宿主DNA残留检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含CHO DNAControl，DNADilution Buffer，2x MaxDetect qPCR Mix，10x CHO DetectionMix；所述的DNADilution Buffer中含有NaN₃；所述的10x CHO Detection Mix中含有权利要求1所述的引物对和SEQ ID NO:3所示的探针。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述的CHO DNAControl浓度为30ng/μL。

9.权利要求7所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：

a)样本通过前处理试剂盒提取DNA后，利用DNADilution Buffer稀释到合适浓度；

b)将CHO DNA Control利用DNADilution Buffer十倍梯度稀释，生成6个浓度的标准品：300pg/μL，30pg/μL，3pg/μL，300fg/μL，30fg/μL，3fg/μL；

c)根据要检测的数量配置PCR反应混合液，依次加入Negative Control(water)，10xCHO Detection Mix，2x MaxDetect qPCR Mix，混匀后分装于用作荧光定量PCR的0.2mL的八连管或96孔板中；

d)将阴性对照，a)中稀释好的样本，b)中稀释好的标准品依次加入已分装的PCR反应混合液中，混匀后放入定量PCR仪进行检测；

e)根据检测结果绘制标准曲线，计算待测样本中含有的CHO宿主DNA的浓度。

10.根据权利要求9所述的使用方法，其特征在于，所述的DNADilution Buffer中NaN₃的含量比例是1/10000。

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