CN115094122A - 一种基于RPA-CRISPR-Cas12a可视化检测鸭疫里氏杆菌的试剂盒及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于RPA‑CRISPR‑Cas12a可视化检测鸭疫里氏杆菌的试剂盒及其应用，所述试剂盒包含特异性crRNA、鸭疫里氏杆菌特异性RPA引物对和探针，所述特异性crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述特异性RPA引物对的上游引物RPA‑F、下游引物RPA‑R和探针的核苷酸序列依次如SEQ ID NO：3～5所示；探针5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团。所述试剂盒具有成本低，操作便捷、耗时少、灵敏度高和特异性强等特点，全程在37～40℃环境下进行，可以有效脱离实验室大型仪器的依赖。
Description
技术领域
本发明涉及微生物快速检测技术领域，具体地，涉及一种基于RPA-CRISPR-Cas12a可视化检测鸭疫里氏杆菌的试剂盒及其应用。
背景技术
鸭疫里氏杆菌病的临床表现与其他细菌感染如多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌和肠道沙门氏菌相似。因此，很难通过病理特征来诊断鸭疫里氏杆菌感染。诊断鸭疫里氏杆菌感染的实验室方法主要基于平板培养、聚合酶链式反应、环介导等温扩增、酶联免疫吸附试验、凝胶扩散沉淀试验和玻片凝集试验。上述诊断方法的优点是具有较高的灵敏度、特异性和准确性，但上述诊断方法通常需要较长时间，方法比较繁琐或需要昂贵的仪器设备和高技能的人员。
目前鸭疫里氏杆菌感染的确诊仍然以实验室方法为基础，这限制了对鸭疫里氏杆菌杆菌病的早期诊断，早期发现，早期治疗。实验室方法的复杂性，繁琐性也不利于鸭疫里氏杆菌的大规模筛查。开发一种快速、现场、敏感、特异的定量检测方法，对于我国养鸭业具有重要的战略意义。
CRISPR-Cas技术是近年来发展迅猛的基因编辑技术，成簇的规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)及其相关蛋白(CRISPR-associated proteins,Cas)构成CRISPR-Cas系统。CRISPR-Cas系统原本是存在于原核生物体内的一种适应性免疫机制。目前，经过一系列的改造，CRISPR-Cas技术已在基因组编辑、基因表达调控、基因治疗、病原体检测、靶基因高通量筛选、表观遗传修饰等多个生命科学的研究领域被广泛应用。除了作为基因编辑工具，Ⅱ类Cas蛋白如Cas12a蛋白具有的“附属切割”特性，已被开发成识别不同类型靶标的核酸检测方法，在快速检测领域具有重大潜力。
重组酶聚合酶扩增(RPA)是一种等温扩增新技术，广泛用于病原菌核酸分子诊断。RPA用三种核心酶替代了聚合酶链式反应(PCR)所需的热循环。不同于许多其他等温技术，RPA省去了升高或精确控温阶段，扩增反应在25～42℃的温度范围内均可进行，反应通常在5～15min内完成。RPA技术自一出现就崭露头角，因其具有反应迅速(5～15min)、特异性强(引物)、低温运行(25～42℃)、样本容差(对样本类型的要求特别宽松)、灵敏度高(单拷贝)、适用性广、试剂形态灵活(液态试剂或干粉)和检测形式多样等优势，在核酸检测领域得到了广泛应用。
但是由于RPA扩增产物需要琼脂糖凝胶电泳来分析结果，使得该技术无法实施现场的即时检测。近年来，RPA技术也引入荧光探针法，使得检测结果可视化。但是，荧光探针的设计复杂，且探针的特异性不稳定，假阳性的结果时有发生。这在很大程度上限制了RPA技术在快速诊断方面的应用。
将CRISPR-Cas12a检测系统与RPA技术结合，通过RPA技术常温扩增目的片段，然后进行CRISPR-Cas12a检测反应，最后通过Cas12/13专用核酸检测试纸条进行结果的可视化。此结合的意义在于不需要在RPA扩增阶段引入探针，避免假阳性的产生，同时利用CRISPR-Cas12a检测的特异性保证检测结果的准确性。该检测方法只需要改变CRISPR-Cas12a检测反应中的特异性crRNA序列即可实现多种病原微生物的检测，大大提高了检测的适用性及使用范围。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种检测鸭疫里氏杆菌的试剂盒。
本发明的第一目的是提供一种用于检测鸭疫里氏杆菌的组合物。
本发明的第二目的是提供上述组合物在制备鸭疫里氏杆菌检测试剂盒中的应用。
本发明的第三目的是提供一种检测鸭疫里氏杆菌的试剂盒。
本发明的第四目的是提供一种非诊断目的可视化检测鸭疫里氏杆菌的方法。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
一种组合物，所述组合物包括特异性crRNA、特异性RPA引物对和探针；所述特异性crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
优选地，所述特异性RPA引物对的上游引物RPA-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，下游引物RPA-R的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示.
优选地，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。
更优选地，所述探针的5’端标记荧光基团。
更优选地，所述探针的3’端标记淬灭基团。
进一步优选地，所述荧光基团为异硫氰酸荧光素(FITC)或6-羧基荧光素(6-FAM)。
进一步优选地，所述淬灭基团为生物素(Biotin)。
具体地，所述序列如下所示：
特异性crRNA1(SEQ ID NO：1)：
5’-AAUUUCUACUAAGUGUAGAUGCUUUAUCAACAGGUUUAGG-3’，
上游引物RPA-F(SEQ ID NO：3)：
5’-ATGATGTAACTTACGCGGGGTATAGCGA-3’，
下游引物RPA-R(SEQ ID NO：4)：
5’-TCCATCCTTATCCTTATCTCTGTTACCA-3’，
探针(SEQ ID NO：5)：
5’-(6-FAM)-TTATT-(Biotin)-3’。
本发明还请求保护上述组合物在制备鸭疫里氏杆菌检测试剂盒中的应用。
一种基于RPA-CRISPR-Cas12a可视化检测鸭疫里氏杆菌的试剂盒，所述试剂盒包含上述组合物。
优选地，所述试剂盒还包含Cas12/13专用核酸检测试纸条。
更优选地，所述Cas12/13专用核酸检测试纸条包括检测线T线和质控线C线。
进一步优选地，所述T线上包被有双抗，所述C线上包被链霉亲和素。
更优选地，所述Cas12/13专用核酸检测试纸条为沃博生物JY0301。
一种非诊断目的可视化检测鸭疫里氏杆菌的方法，包括如下步骤：
S1.提取待测样品基因组DNA；
S2.以步骤S1的DNA为模板，利用上述特异性RPA引物对进行等温扩增反应，得到RPA扩增产物；
S3.利用上述特异性crRNA制备Cas12a-crRNA复合物，再加入上述探针及步骤S2得到的RPA扩增产物，在CRISPR-Cas12a体系中进行切割反应，得到切割产物；
S4.将步骤S3得到的切割产物使用Cas12/13专用核酸检测试纸条(沃博生物JY0301)进行显色检测，若待测样品检测线T线出现红色条带或待测样品检测线T线和阴性样品质控线C线位置均出现红色条带，则表示待测样品感染鸭疫里氏杆菌；若检测线T线不出现红色条带，在质控线C线上出现红色条带，则表示待测样品未感染鸭疫里氏杆菌。
优选地，步骤S2所述等温扩增反应的反应体系为：Primer Free Rehydrationbuffer 14.8μL、10μM的上游引物RPA-F(SEQ ID NO：3)0.3μL、10μM的下游引物RPA-R(SEQID NO：4)0.3μL、待测样品的基因组DNA 0.5μL、水7.9μL和280mM的MgOAc 1.2μL。
优选地，步骤S3所述切割反应的体系为：NEBuffer 2.1 4μL、2μM的Cas12a蛋白1μL、2μM的特异性crRNA1(SEQ ID NO：1)1μL、10μM的探针(SEQ ID NO：5)2μL、水15μL和RPA扩增产物2.0μL。
优选地，步骤S4所述Cas12/13专用核酸检测试纸条包括检测线T线和质控线C线；所述T线上包被有双抗，所述C线上包被链霉亲和素。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明筛选得到了一种用于检测鸭疫里氏杆菌的组合物，所述组合物由特异性crRNA、特异性RPA引物对和探针组成，所述特异性RPA引物对和探针的特异性好，灵敏度高，可以区分鸭疫里氏杆菌与其他常见病原菌如大肠杆菌、巴氏杆菌和沙门氏菌等；本发明采用CRISPR-Cas12a体系建立了快速可视化检测鸭疫里氏杆菌的方法，通过RPA扩增以及crRNA识别双重特异地对鸭疫里氏杆菌进行检测，特异性强，灵敏度高。本发明具有成本低，操作便捷、耗时少、灵敏度高和特异性强等特定，全程在37～40℃环境下进行，可以有效脱离实验室大型仪器的依赖。
附图说明
图1为实验流程图；
图2为检测结果判读示意图；
图3为鸭疫里氏杆菌特异性crRNA1(SEQ ID NO：1)的特异性检验结果图；
图4为鸭疫里氏杆菌特异性crRNA2(SEQ ID NO：2)的特异性检验结果图；
图5为一种基于RPA-CRISPR-Cas12a可视化检测鸭疫里氏杆菌的试剂盒的灵敏度检测图。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
本发明的实验流程如图1所示。
实施例1一种用于检测鸭疫里氏杆菌的特异性crRNA和特异性RPA引物对的设计和筛选
1、实验方法
(1)特异性crRNA的设计：通过文献报道确定鸭疫里氏杆菌的外膜蛋白基因(ompA)为鸭疫里氏杆菌的特异性基因。针对ompA基因，使用crRNA在线设计网站CHOPCHOP(https://chopchop.cbu.uib.no/)设计crRNA，得到一系列候选crRNA核苷酸序列，将候选crRNA核苷酸序列在美国国家生物技术信息中心(NCBI)中进行在线比对，检查比对结果是否为鸭疫里氏杆菌，从而得到特异性crRNA。
(2)特异性RPA引物对的设计：针对ompA基因，使用Primer Premier5.0软件设计RPA等温扩增反应的上、下游引物，扩增产物的预计大小为300bp，得到一系列候选引物序列。将候选引物序列在美国国家生物技术信息中心(NCBI)中进行在线比对，检查比对结果是否为鸭疫里氏杆菌，从而得到特异性RPA引物对。
2、实验结果
根据设计得到特异性crRNA1(SEQ ID NO：1)和特异性crRNA2(SEQ ID NO：2)，具体核苷酸信息如下所示：5’-AAUUUCUACUAAGUGUAGAUGCUUUAUCAACAGGUUUAGG-3’(SEQ ID NO：1)，5’-AAUUUCUACUAAGUGUAGAUGAUGUAACUUACGCGGGGUAUAGC-3’(SEQ ID NO：2)。
根据设计得到特异性RPA引物对，其中上游引物RPA-F(SEQ ID NO：3)，具体核苷酸信息如下所示：5’-ATGATGTAACTTACGCGGGGTATAGCGA-3’；下游引物RPA-R(SEQ ID NO：4)，具体核苷酸信息如下所示：5’-TCCATCCTTATCCTTATCTCTGTTACCA-3’。
实施例2一种非诊断性检测鸭疫里氏杆菌的方法
1、实验方法
(1)提取待测样品的基因组DNA，利用实施例1中得到的特异性RPA引物对，进行重组酶聚合酶扩增反应技术(RPA)反应，扩增目的片段。
RPA反应体系为：Primer Free Rehydration buffer 14.8μL、10μM的上游引物RPA-F(SEQ ID NO：3)0.3μL、10μM的下游引物RPA-R(SEQ ID NO：4)0.3μL、待测样品的基因组DNA 0.5μL、水7.9μL和280mM的MgOAc 1.2μL。
将反应体系置于37℃下反应15min，得到扩增产物。
(2)通过实施例1得到的特异性crRNA1(SEQ ID NO：1)引导链霉菌ND2006 Cas12a蛋白(Lachnospiraceae bacterium ND2006 Cas12a，LbCas12a)对步骤(1)得到的扩增产物在37℃下孵育10分钟进行切割反应，得到反应产物。
切割反应的反应体系为：NEBuffer 2.1 4μL，2μM的Cas12a蛋白1μL，2μM的特异性crRNA1(SEQ ID NO：1)1μL，10μM的探针(SEQ ID NO：5)2μL，水15μL以及步骤(1)得到的扩增产物2.0μL。
(3)将步骤(2)得到的反应产物与Cas12/13专用核酸检测试纸条(购自沃博生物)进行孵育，孵育5分钟后得到带有结果的Cas12/13专用核酸检测试纸条，并对试纸条进行结果判读。
所述Cas12/13专用核酸检测试纸条包括检测线T线和质控线C线；所述T线上包被有双抗，所述C线上包被链霉亲和素。
2、结果判读
结果判读示意图如图2所示，根据图2可以得知：
当检测结果为阴性时，试纸条质控线(C线)出现一条红色条带，检测线(T线)没有条带，说明样本中不含目的核酸片段，或目的核酸片段数量低于试纸条的最低检测限。
当检测结果为阳性时，试纸条出现两条或一条红色条带。当出现两条红色条带时，一条位于质控线(C线)，一条位于检测线(T线)；当出现一条红色条带时，红色条带位于检测线(T线)，说明样品中含有目的核酸片段，且目的核酸片段地数量达到或高于试纸条地最的检出量。
当试纸条的质控线(C线)和检测线(T线)均未出现条带，说明所用的试纸条和反应试剂可能已经损坏、失效或检测过程中操作有误。
实施例3鸭疫里氏杆菌特异性crRNA1(SEQ ID NO：1)和特异性crRNA2(SEQ ID NO：2)的检测效果比较
1、实验方法
(1)将鸭疫里氏杆菌、金黄色葡萄糖球菌、沙门氏菌、巴氏杆菌和大肠杆菌分别接种于增菌培养基，培养过夜后，利用细菌基因组提取试剂盒分别提取每个细菌的基因组DNA，得到每个细菌提取得到的基因组DNA。
以鸭疫里氏杆菌为例：以鸭疫里氏杆菌的基因组DNA为模板，利用实施例1得到的特异性RPA引物对(SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4)，通过重组酶聚合酶扩增反应技术(RPA)进行扩增，得到对应的扩增产物。
对每个细菌提取得到的基因组DNA进行同等处理，得到对应的扩增产物，所有细菌的RPA扩增引物对均选用实施例1得到的特异性RPA引物对，即RPA-F(SEQ ID NO：3)和RPA-R(SEQ ID NO：4)。
(2)以鸭疫里氏杆菌为例：利用实施例1得到的特异性crRNA1(SEQ ID NO：1)和特异性crRNA2(SEQ ID NO：2)分别引导链霉菌ND2006 Cas12a蛋白(Lachnospiraceaebacterium ND2006 Cas12a，LbCas12a)，对步骤(1)得到的扩增产物在37℃下孵育10分钟进行切割反应，得到crRNA1对应的反应产物和crRNA2对应的反应产物。
对每个细菌提取得到的基因组DNA对应的扩增产物进行同等处理，分别得到对应的反应产物。
切割反应的反应体系为：NEBuffer 2.1 4μL，2μM的Cas12a蛋白1μL，2μM的特异性crRNA1(SEQ ID NO：1)或特异性crRNA2(SEQ ID NO：2)1μL，10μM的探针(SEQ ID NO：5)2μL，水15μL以及步骤(1)得到的扩增产物2.0μL。
(3)以鸭疫里氏杆菌为例：将步骤(2)得到的crRNA1对应的反应产物和crRNA2对应的反应产物分别用Cas12/13专用核酸检测试纸条(沃博生物JY0301)进行孵育，孵育5分钟后得到带有结果的Cas12/13专用核酸检测试纸条，并对试纸条进行结果判读。
对每个提取得到的细菌的基因组DNA对应的反应产物进行同等处理，得到对应的带有结果的Cas12/13专用核酸检测试纸条，并对试纸条进行结果判读。
所述Cas12/13专用核酸检测试纸条包括检测线T线和质控线C线；所述T线上包被有双抗，所述C线上包被链霉亲和素。
2、实验结果
鸭疫里氏杆菌的特异性crRNA1(SEQ ID NO：1)的检验结果如图3所示，结果判读方式参照实施例2的结果判读。图3结果显示：只有检测鸭疫里氏杆菌的试纸条呈现阳性检测结果，其他试纸条均为阴性结果。
鸭疫里氏杆菌的特异性crRNA2(SEQ ID NO：2)的检验结果如图4所示，结果判读方式参照实施例2的结果判读。图4结果显示：所有试纸条均为阴性结果，特异性crRNA2(SEQID NO：2)无法准确检验鸭疫里氏杆菌。
结果说明：特异性crRNA1(SEQ ID NO：1)可以引导链霉菌ND2006 Cas12a蛋白(Lachnospiraceae bacterium ND2006 Cas12a，LbCas12a)对实施例1得到的特异性RPA引物对扩增的鸭疫里氏杆菌的基因组序列进行切割反应，特异性crRNA2(SEQ ID NO：2)不可以引导链霉菌ND2006 Cas12a蛋白(Lachnospiraceae bacterium ND2006 Cas12a，LbCas12a)对实施例1得到的特异性RPA引物对扩增的鸭疫里氏杆菌的基因组序列进行切割反应。
即特异性crRNA1(SEQ ID NO：1)与特异性RPA引物对结合可以特异性检测鸭疫里氏杆菌，特异性crRNA2(SEQ ID NO：2)与特异性RPA引物对结合无法特异性检测鸭疫里氏杆菌。
实施例4一种可视化检测鸭疫里氏杆菌的试剂盒
1、一种基于RPA-CRISPR-Cas12a可视化检测鸭疫里氏杆菌的试剂盒，包括实施例1得到的特异性RPA引物对(SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4)、Primer Free Rehydrationbuffer、280mM的MgOAc、无菌水、NEBuffer 2.1、2μM的Cas12a蛋白、特异性crRNA1(SEQ IDNO：1)、探针(SEQ ID NO：5)、Cas12/13专用核酸检测试纸条(沃博生物JY0301)和含鸭疫里氏杆菌基因片段的质粒标准品。
所述特异性RPA引物对：
上游引物RPA-F(SEQ ID NO：3)：5’-ATGATGTAACTTACGCGGGGTATAGCGA-3’，
下游引物RPA-R(SEQ ID NO：4)：5’-TCCATCCTTATCCTTATCTCTGTTACCA-3’；
特异性crRNA1(SEQ ID NO：1)：
5’-AAUUUCUACUAAGUGUAGAUGCUUUAUCAACAGGUUUAGG-3’；
探针(SEQ ID NO：5)：5’-(6-FAM)-TTATT-(Biotin)-3’。
所述Cas12/13专用核酸检测试纸条包括检测线T线和质控线C线；所述T线上包被有双抗，所述C线上包被链霉亲和素。
2、利用所述试剂盒进行可视化检测鸭疫里氏杆菌的方法，包括如下步骤：
(1)提取待测样品基因组DNA，得到基因组DNA；
(2)将步骤(1)得到的基因组DNA加入试剂盒中，与Primer Free Rehydrationbuffer、280mM的MgOAc和无菌水充分混合，在特异性RPA引物的作用下，在37℃下进行等温扩增反应15min，得到RPA扩增产物；
(3)接着将RPA扩增产物与NEBuffer 2.1、2μM的Cas12a蛋白、探针充分混合，在37℃下孵育10min进行切割反应，得到切割产物。
(4)将步骤(3)得到的切割产物在试剂盒中孵育5分钟，对孵育结束的试剂盒进行结果判读。
3、结果判读
若检测线出现红色条带或检测线和质控线位置均出现红色条带，则表示待测样品感染鸭疫里氏杆菌；若检测线不出现红色条带，在质控线上出现红色条带，则表示待测样品未感染鸭疫里氏杆菌。
实施例5基于RPA-CRISPR-Cas12a可视化检测鸭疫里氏杆菌的试剂盒的灵敏度检验
1、实验方法
(1)将鸭疫里氏杆菌接种于细菌培养基中，培养过夜后，利用细菌基因组提取试剂盒提取鸭疫里氏杆菌的基因组DNA，将提取得到的基因组DNA用无菌水进行梯度稀释，得到浓度为101～107aM的鸭疫里氏杆菌的基因组DNA。
将这些不同浓度的基因组DNA分别使用实施例4制备得到的试剂盒进行检测，并对结果进行判读。
2、实验结果
不同浓度的基因组DNA对应的检测试剂盒的检测结果如图5所示，结果表示浓度为101aM和102aM的鸭疫里氏杆菌的基因组DNA的检测结果同阴性对照一致，浓度从103aM开始可以在试剂盒上显示阳性结果，说明该试剂盒对鸭疫里氏杆菌的检测限低至103aM。
实施例6 RPA反应体系对鸭疫里氏杆菌检测结果的影响
1、实验方法
设置四组不同的实验，分别为组1、组2、组3和组4。
其中组1中阳性对照的RPA反应体系为：Primer Free Rehydration buffer 14.8μL、10μM的上游引物RPA-F 1μL、10μM的下游引物RPA-R 1μL和鸭疫里氏杆菌基因组DNA 0.5μL，用水补充体积至23.8μL，最后加入280mM的MgOAc 1.2μL。
组1阴性对照的RPA反应体系中除将鸭疫里氏杆菌基因组DNA 0.5μL替换为水0.5μL外，其余物质同组1阳性对照的RPA反应体系一致。
组2中阳性对照的RPA反应体系为：Primer Free Rehydration buffer 14.8μL、10μM的上游引物RPA-F 0.5μL、10μM的下游引物RPA-R 0.5μL和鸭疫里氏杆菌基因组DNA 0.5μL，用水补充体积至23.8μL，最后加入280mM的MgOAc 1.2μL。
组2阴性对照的RPA反应体系中除将鸭疫里氏杆菌基因组DNA 0.5μL替换为水0.5μL外，其余物质同组2阳性对照的RPA反应体系一致。
组3中阳性对照的RPA反应体系为：Primer Free Rehydration buffer 14.8μL、10μM的上游引物RPA-F 0.2μL、10μM的下游引物RPA-R 0.2μL和鸭疫里氏杆菌基因组DNA 0.5μL，用水补充体积至23.8μL，最后加入280mM的MgOAc 1.2μL。
组3阴性对照的RPA反应体系中除将鸭疫里氏杆菌基因组DNA 0.5μL替换为水0.5μL外，其余物质同组3阳性对照的RPA反应体系一致。
组4中阳性对照的RPA反应体系为：Primer Free Rehydration buffer 14.8μL、10μM的上游引物RPA-F 0.3μL、10μM的下游引物RPA-R 0.3μL和鸭疫里氏杆菌基因组DNA 0.5μL，用水补充体积至23.8μL，最后加入280mM的MgOAc 1.2μL。
组4阴性对照的RPA反应体系中除将鸭疫里氏杆菌基因组DNA 0.5μL替换为水0.5μL外，其余物质同组4阳性对照的RPA反应体系一致。
将组1～组4分别用实施例2中的实验方法进行扩增切割检测，对结果进行判读。
2、实验结果
组1的RPA反应体系下的阳性对照和阴性对照判读结果均为阳性；组2的RPA反应体系下的阳性对照和阴性对照判读结果均为阳性，其阴性对照的结果相较于第一组有所减弱；组3的RPA反应体系下的阳性对照和阴性对照判读结果均为阴性；组4的阳性对照结果为阳性，阴性对照结果为阴性。
说明组4所述的RPA反应体系为最佳的反应体系，在此体系下，可以准确检测出样本是否正常表现出阳性结果。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 一种基于RPA-CRISPR-Cas12a可视化检测鸭疫里氏杆菌的试剂盒及应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 40
<212> RNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
aauuucuacu aaguguagau gcuuuaucaa cagguuuagg 40
<210> 2
<211> 44
<212> RNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 2
aauuucuacu aaguguagau gauguaacuu acgcggggua uagc 44
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 4
atgatgtaac ttacgcgggg tatagcga 28
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 4
tccatcctta tccttatctc tgttacca 28
<210> 5
<211> 5
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 5
ttatt 5
Claims (10)
1.一种组合物，其特征在于，所述组合物包括特异性crRNA、特异性RPA引物对和探针；所述特异性crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述特异性RPA引物对的上游引物RPA-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，下游引物RPA-R的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，探针5’端标记荧光基团。
4.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述探针的3’端标记淬灭基团。
5.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述荧光基团为异硫氰酸荧光素或6-羧基荧光素。
6.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述淬灭基团为生物素。
7.权利要求1～6任一所述的组合物在制备鸭疫里氏杆菌检测试剂盒中的应用。
8.一种基于RPA-CRISPR-Cas12a可视化检测鸭疫里氏杆菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1～6任一所述的组合物。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含Cas12/13专用核酸检测试纸条，所述Cas12/13专用核酸检测试纸条包括检测线T线和质控线C线。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述T线上包被有双抗，所述C线上包被链霉亲和素。
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