CN117551717A - 基因文库的构建方法及在检测病原微生物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本申请提出了一种基因文库的构建方法及在检测病原微生物中的应用。该方法包括：将待测核酸样本在反应液中进行片段化和末端修复处理；将所述经片段化和末端修复处理的核酸样本进行接头连接处理；对接头连接处理产物进行扩增处理，以便获得所述测序文库。其中，反应液包括40％～60％体积分数的片段化酶反应液、1‑10mM dATP、0.1‑5mM dNTP、1000‑5000U/mL T4DNA聚合酶、1000‑5000U/mL rTaq酶和1000‑5000U/mL T4多聚核苷酸激酶。与传统建库方法相比，本方法明显缩短了建库周期。
Description
技术领域
本申请涉及基因测序领域，具体涉及一种基因文库的构建方法及在检测病原微生物中的应用。
背景技术
在临床医学领域，感染性疾病一直是急危重症患者生命威胁的主要因素之一。感染病原体主要包括细菌、病毒、真菌和寄生虫等四大类。针对细菌感染，传统的诊断方法主要依赖于培养法，而对于病毒感染，则采用核酸扩增法或特异性抗原抗体检测法。然而，现有的诊断方法在敏感性、特异性、时效性以及提供信息量等方面存在一定的局限性。尤其在面对未知或罕见的病原微生物时，传统方法无法快速准确地识别，这给及时干预和治疗带来了挑战。
发明内容
本申请旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本申请的一个目的在于提出一种基因文库的构建方法及应用。
具体而言，本申请提供了如下技术方案：
在本申请的一方面，本申请提出了一种反应液。根据本申请的实施例，该所述反应液包括：40％～60％体积分数的片段化酶反应液、1-10mM dATP、0.1-5mM dNTP、1000-5000U/mL T4 DNA聚合酶、1000-5000U/mL rTaq酶和1000-5000U/mL T4多聚核苷酸激酶。发明人通过大量实验验证发现，该反应液应用于测序文库构建过程中，实现了片段化步骤、DNA末端修复和加A步骤同步进行，核酸样品的片段化以及末端修复和加A均可在该反应液中进行，极大缩减了建库时间。
在本申请的一些示例中，所称片段化酶反应液购自Enzymatics，货号：B0330。
根据本申请的实施例，上述反应液还可以包括下列技术特征的至少之一：
根据本申请的实施例，所述dATP与所述dNTP的摩尔比为4:1～6:1。在本申请的一些优选示例中，dATP与dNTP的摩尔比为5:1。在测序文库构建应用场景中，发明人发现dATP浓度过高，可能会导致A尾添加得过多，增加了文库构建后的假阳性率(特别是在PCR扩增等步骤中)。相反，如果dATP浓度太低，可能无法充分完成A尾修复，导致后续连接或扩增步骤的失败。经过大量优化实验发现，dATP与dNTP的摩尔比为5:1时，文库构建的效果和质量更好。
根据本申请的实施例，该反应液包括包括50％体积分数的片段化酶反应液、2mMdATP、0.4mM dNTP、1000U/mL T4 DNA聚合酶、1000U/mL Taq酶和1000U/mL T4多聚核苷酸激酶。经过发明人的大量实验验证，最终发现采用该配比的反应液，反应体系更加稳定，文库构建质量更好。
在本申请的第二方面，本申请提出了一种测序文库的构建方法。根据本申请的实施例，所述方法包括：将待测核酸样本在本申请第一方面所述的反应液中进行片段化和末端修复处理；将所述经片段化和末端修复处理的核酸样本进行接头连接处理；对接头连接处理产物进行扩增处理，以便获得所述测序文库。相比于常规构建测序文库的方法，利用本方法构建测序文库，明显缩短实验周期(建库时间缩短1小时左右)，可以大幅节省实验室人工和设备成本。
根据本申请的实施例，上述测序文库的构建方法还可以包括下列技术特征的至少之一：
根据本申请的实施例，所述片段化和末端修复处理是在如下条件下进行的：30～40℃，15～30min；60～75℃，5～20min。在本申请的一些示例中，随着反应体系的改变，发明人对相应的反应程序进行优化，最终发现在前述条件下可同步完成片段化和末端修复步骤。
根据本申请的实施例，所述片段化和末端修复处理是在如下条件下进行的30℃，15～30min；72℃，5～20min。发明人对片段化和末端修复的最适温度做了筛选，发现在上述温度下，酶活性更好，非特异性剪切或修复更少。
根据本申请的实施例，所述片段化和末端修复处理是在如下条件下进行的30℃，20min；72℃，10min。在经过大量实验筛选后，发明人确定的最优片段化和末端修复处理反应程序为30℃，20min；72℃，10min。
根据本申请的实施例，待测核酸样本来自实体组织样本或体液样本。
根据本申请的实施例，体液包括选自血液、脑脊液、痰液和肺泡灌洗液的至少之一。
在本申请的第三方面，本申请提出了一种测序文库。根据本申请的实施例，所述测序文库通过本申请第二方面所述的方法制备获得。通过本申请第二方面所述方法制备测序文库，可大幅缩短建库周期，且获得的测序文库质量不低于现有建库方法获得的测序文库。
在本申请的第四方面，本申请提出了一种测序方法。根据本申请的实施例，所述方法包括：对本申请第三方面所述的测序文库进行测序。相比以往测序过程，通过对第三方面所述的测序文库进行测序，可快速获得测序数据。
根据本申请的实施例，上述测序方法还可以包括下列技术特征的至少之一：
根据本申请的实施例，所述测序是在MGISEQ-2000或BGISEQ-50测序平台上进行的。在本申请的一些示例中，测序平台也可选自Illumina公司的Hiseq、Miseq、Nextseq和Novaseq测序平台、Thermo Fisher/Life Technologies公司的Ion Torrent平台；测序方式可以选择单端测序、双末端测序或者选择所选用的自动化测序平台可支持的测序方式等。
在本申请的第五方面，本申请提出了一种非诊断治疗目的的微生物检测方法。根据本申请的实施例，所述方法包括：利用本申请第二方面所述的方法构建待测核酸样本的测序文库；将所述测序文库进行测序处理，以便获得测序结果；以及将所述测序结果与预定微生物参照基因序列进行比对处理，以获得所述待测核酸样本中的微生物核酸信息。
在本申请的一些示例中，利用高通量测序检测病原微生物能够直接对各类样本(如血液、脑脊液、痰液和肺泡灌洗液)中的微生物进行全面、无偏向性的检测，包括细菌、病毒、真菌和寄生虫等。与传统培养相比，无需分离、培养、富集纯化等传统步骤，极大地缩短了检测周期，迅速地获取病原微生物信息。
所称的参照基因序列(reference，ref)为已确定的序列，可以是自己预先测定组装的DNA和/或RNA序列，也可以是他人测定公开的DNA和/或RNA序列，可以是预先获得的样本来源个体/目标个体所属生物类别中的任意的参考模板，例如，同一生物类别的已公开的基因组组装序列的全部或者至少一部分。
在本申请的一些示例中，上述微生物检测方法可用于流行病学研究中，了解不同病原体的传播途径和变异情况，为疾病的防控和预防提供了关键性支持。
根据本申请的实施例，上述非诊断治疗目的的微生物检测方法还可以包括下列技术特征的至少之一：
根据本申请的实施例，所述待测核酸样本选自实体组织样本或体液样本。
根据本申请的实施例，所述体液包括选自血液、脑脊液、痰液和肺泡灌洗液的至少之一。已有的检测标本中微生物的方法对样本的要求较高，大多选择肺泡灌洗液。而利用本申请的高通量测序方法进行微生物的检测，可以突破现有检测样本的限制。
根据本申请的实施例，所述微生物为病原微生物。
在本申请的第六方面，本申请提出了一种试剂盒。根据本申请的实施例，所述试剂盒包括：本申请第一方面或任一实施例所述的反应液。在本申请的一些示例中，所述试剂盒可用于测序文库的构建。
根据本申请的实施例，上述试剂盒还可以包括下列技术特征的至少之一：
根据本申请的实施例，所述试剂盒进一步包括连接缓冲液、连接酶、标签接头、PCR反应液、PCR引物、阳性对照品、阴性对照品、内标、磁珠和溶解液中的至少之一。其中，所述内标可以为CN114107325A中所示内参序列。
需要说明的是，在本申请中针对第一方面所描述的特征和优点，同样适用于其他方面，在此不再赘述。
本申请的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本申请的实践了解到。
附图说明
无。
具体实施方式
在本文中，除非另有说明，以单数形式“一种”、“一个”等限定的方式包括其复数指代物(一个或一个以上)。“一组”或者“多个”指两个或两个以上。
在本文中，“包含”或“包括”为开放式表达，包括其后所指明或示例的内容或情形，且还包括适用或符合所说的情形但未具体列明的的内容或情形。
在本文中，所称的“测序”为核酸序列测定，同“核酸测序”或“基因测序”，指测定核酸分子一级结构碱基排列次序，可利用合成测序(边合成边测序Sequencing bySynthesis，SBS)和/或连接测序(边连接边测序，SBL)实现。测序可包括DNA测序和/或RNA测序。包括长片段测序和/或短片段测序，所称的长片段和短片段是相对的，如长于1Kb、2Kb、5Kb或者10Kb的核酸分子可称为长片段，短于1Kb或者800bp的可称为短片段；可包括双末端测序、单末端测序和/或配对末端测序等，所称的双末端测序或者配对末端测序可以指相同核酸分子的不完全重叠的任意两段或两个部分的读出。
本申请的发明人在研究过程中发现：
在医学实践中，对于感染病原微生物的检测通常依赖于几种主要方法，包括实验室培养法、PCR核酸检测法以及直接或间接的免疫方法学。这些方法各自具有一定的优势和局限性。
首先，实验室培养法是一种常用的传统检测方法，其基本原理是将临床样本在特定的培养条件下进行培养，使得潜在的病原微生物在培养基上生长繁殖。然而，在这个过程中，部分细菌可能会在后续的分离、富集和纯化步骤中损耗，导致培养后的样本并不是纯净的病原微生物。这种损耗不仅影响了检测的灵敏度，也增加了误诊的可能性。
其次，PCR核酸检测法是一种基于生物分子技术的检测方法，能够通过扩增目标病原微生物的核酸序列来实现检测。然而，传统PCR方法通常一次只能检出一种或者少数几种特定的病原微生物，这在处理多种病原混合感染的情况下存在局限性。此外，PCR技术对于样本中的目标核酸序列的选择性较高，可能会忽略掉其他潜在的病原微生物。
另外，免疫方法学检测是利用免疫学原理，通过检测体内特定抗体或抗原的存在来判断感染状态。这种方法包括直接检测患者体液中的抗体或抗原，或者通过间接方法，如ELISA(酶联免疫吸附试验)来检测免疫反应的产物。然而，由于不同病原微生物所诱导的免疫反应差异较大，免疫方法学检测的特异性和准确性受到影响，可能出现交叉反应或者假阴性结果。
本申请提出的高通量测序方法尤其适用于病原微生物的检测。相较于传统方法，本申请检测方法方法在以下几个方面进行了显著改进，从而在提高病原检测的准确性和灵敏度方面具备独特优势。
首先，本发明的方法允许使用较少量的临床样本进行检测。传统方法可能需要大量的样本来进行培养或者反复的PCR扩增，而这可能限制了某些特殊患者或者特定临床场景下的检测操作。而本方法不仅可以减少对样本的需求，还能够在短时间内获得充分的病原信息，加速了诊断的速度。
其次，本发明的方法采用了高通量测序技术，能够单次实验中同时检测多种不同病原微生物，从而大大提高了检测的通量。这种高通量性质意味着在相同的时间内，可以处理更多的样本，或者在相同数量的样本上获得更为详尽的病原信息。这种能力对于处理大规模疫情爆发或者医院内部感染控制等方面具有重要意义。
最重要的是，本发明通过高通量测序技术的应用，显著提高了病原检出的灵敏度。传统方法可能在病原微生物数量较少或者样本中混杂其他成分时产生假阴性结果，而高通量测序技术能够深入挖掘样本中微生物的遗传信息，即便微生物数量较少，也能够被高效检测到，降低了漏检的可能性。这种高灵敏度对于早期感染的检测尤为关键，可以在病情尚未严重的阶段就提供准确的诊断结果，为患者提供更早的治疗和干预。
因此，本发明的高通量测序病原微生物检测方法不仅克服了传统方法中样本需求大、通量低和灵敏度不足等问题，同时也为医学诊断领域带来了一种更为高效、准确和全面的病原检测解决方案。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。例如可以通过一些市售的试剂盒中的试剂或者借助于本领域成熟的技术和条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：
本实施例以检测样品中金黄色葡萄球菌(金葡)、肺炎克雷伯菌(肺克)、鲍曼不动杆菌(鲍曼)、大肠埃希菌(大肠)、屎肠球菌为例，对本发明方法进行举例说明。以下说明本发明方法的示例性检测步骤。
一.样本配制
使用人Hela细胞系与生理盐水模拟人正常肺泡灌洗液样本Hela细胞(阴性对照品N1)，使用不同浓度的5种病原与阴性对照品N1模拟感染5种病原的肺泡灌洗液样本，具体各病原浓度及稀释如表1所示。阳性对照品形成的病原组合作为模拟样本母液A1如表2所示；阴性对照品购自购自北京全式金生物技术有限公司，阳性对照品购自北纳生物。
表1
表2
表3
二.样本前处理及核酸提取
使用华大生物科技(武汉)有限公司生产的核酸提取或纯化试剂(鄂汉械备20220609号)按照说明书进行样本前处理及核酸提取，用无核酸酶水回溶核酸，提取得到总DNA。
三.文库制备
将提取的核酸通过DNA片段化&末修&A、接头连接、PCR扩增进行文库制备。
1、片段化&末修&A
该步骤将基因组DNA片段化，同时进行末端修复以及A尾添加。该流程同样适用于血浆样本。
1.1将表1中各试剂解冻后，颠倒混匀、短暂离心后，置于冰上备用。R1酶切反应液使用吹吸混匀。或颠倒混匀方式，禁止振荡混匀。
在冰上配置DNA片段化&末修&加A反应液(表4)，使用移液器吹吸混匀或颠倒混匀后，短暂离心至管底。表4DNA片段化&末修&加A反应液包括酶切反应液(10x片段化酶反应液+dATP+dNTP+水)和末端修复酶(T4 DNA聚合酶+rTaq酶+T4多聚核苷酸激酶)，配置形成50％体积分数的片段化酶反应液、2mM dATP、0.4mM dNTP、1000U/mL T4 DNA聚合酶、1000U/mLTaq酶和1000U/mL T4多聚核苷酸激酶的反应液。10x片段化酶反应液购自EnzymaticsB0330。
表4：片段化&末修&加A反应液
1.2取PCR管，加入核酸40.0μL，再加入10.0μL DNA片段化&末修&加A反应液，吹吸混匀或颠倒混匀后，瞬时离心，置于PCR仪上，运行表5反应程序；
表5：DNA片段化&末修&加A反应程序
| 温度 | 时间 |
| 4℃ | 1min |
| 30℃ | 20min |
| 72℃ | 10min |
| 4℃ | 保持 |
。
2、接头连接
2.1根据表6的比例在新离心管中配制检测所需量的连接反应混合液，其中连接酶购自Enzymatics L6030；
表6：连接反应混合液
2.2向步骤2.1.2PCR管加入2.0μL标签接头(每个样本一个接头，不同样本接头中NNNNNNNNNN部分不同；上游接头：5’-AGTCGGAGGCCAAGCGGTCTTAGGAAGACAANNNNNNNNNNCAACTCCTTGGCTCACA-3’；下游接头：5’-TTGTCTTCCTAAGGAACGACATGGCTACGATCCGACTT-3’)后，再加入28.0μL连接反应混合液，充分混匀后瞬时离心，置于PCR仪上运行表7程序；
表7：接头连接反应程序
| 温度 | 时间 |
| 23℃ | 15min |
| 4℃ | 保持 |
；
2.3向连接反应后样本中加入40μL磁珠(磁珠需提前30min平衡至室温)，充分混合，室温静置5min，置于磁力架3min至溶液澄清，弃上清液；
2.4加入200μL 80％乙醇，吹打5次，置于磁力架2min至溶液澄清，弃上清液；
2.5重复2.4一次，将残余乙醇吸净后，室温晾干至磁珠表面哑光(不超过5min)，立即加入步骤2.3中的PCR反应混合液。
3、PCR扩增
3.1根据表8的比例在新离心管中配制检测所需量的PCR反应混合液，其中PCR反应液2×KaPa HiFi Ready Mix购自KaPa biosystems KK2602；PCR引物为：引物-1：5’-3’：PO4-GAACGACATGGCTACGA，引物2：5’-3’：TGTGAGCCAAGGAGTTG；
表8：PCR反应混合液
| 试剂 | 一个反应标准量 |
| PCR反应液 | 25.0μL |
| PCR引物 | 4.0μL |
| 无核酸酶水 | 21.0μL |
| 总体积 | 50.0μL |
；
3.2向步骤2.5的PCR管中加入50.0μL PCR反应混合液，充分混匀，运行表9的PCR反应程序；
表9：PCR反应程序
3.3反应结束后瞬时离心，向样本中加入50μL磁珠(磁珠需提前30min平衡至室温)，充分混匀，室温静置5min，置于磁力架3min至溶液澄清，弃上清液；
3.4加入200μL 80％乙醇，吹打5次，置于磁力架2min至溶液澄清，弃上清液；
3.5重复2.3.4一次，室温静置2min，从磁力架上取下离心管；
3.6加入23μL溶解液，充分混匀，室温静置5min，置于磁力架3min至溶液澄清，取21μL上清液于新PCR管中；
3.7使用Qubit荧光定量检测仪或同等功能的仪器对步骤2.3.6所得的PCR纯化产物即文库进行浓度测定，以文库浓度≥1ng/μL为文库合格标准。
四.测序
使用武汉华大智造科技有限公司生产的基因测序仪(MGISEQ-2000)与配套测序反应通用试剂盒(联合探针锚定聚合测序法)(医疗器械备案凭证编号：鄂汉械备20190039号)进行测序反应，或使用基因测序仪(BGISEQ-50)与配套测序反应通用试剂盒(联合探针锚定聚合测序法)(医疗器械备案凭证编号：鄂汉械备20170041号)进行测序反应，严格按照说明书操作。
五.数据分析
使用PMseq感染病原体核酸检测软件，对数据进行分析比对，严格按照说明书操作，获得比对结果。
六.结果分析
在本实施例中，(A1-1)是指A1稀释10倍，(A1-2)则为(A1-1)基础上再稀释10倍，后续稀释浓度依次类推，如(A1-3)则为(A1-2)基础上再稀释10倍，(A1-4)则为(A1-3)基础上再稀释10倍，(A1-5)则为(A1-4)基础上再稀释10倍。需要说明的是，A1～(A1-3)未稀释Hela细胞。
在本实施例中，5(A1-5)是指在(A1-4)浓度上稀释2倍，即5倍的(A1-5)浓度。
在本实施例中，A1(1)、A1(2)、A1(3)表示3个平行母液A1样，依此类推，A1-1(1)、A1-1(2)、A1-1(3)表示3个平行A1-1样，A1-2(1)、A1-2(2)、A1-2(3)表示3个平行A1-2样。
1最低检测限
用模拟样本N1对模拟样本A1进行10倍梯度稀释，制备得到7个不同浓度梯度的模拟样本(A1及A1-1～A1-6)，共7例样本，每个样本重复3次进行检测限测试，检测结果如下表：
结果如表10所示，部分靶标A1-5为初步确定的检测限浓度。
表10
对A1-5和5(A1-5)进行20次重复测试以验证不同靶标5(A1-5)、A1-5是否为对应病原的检测限，检测结果如表11、表12所示。
表11
表12
| 病原菌株 | 检测限分析 | 浓度 | 检出标准 | 检出率 |
| 肺炎克雷伯菌 | (A1-4) | 12cfu/ml | 95％ | 100％ |
| 鲍曼不动杆菌 | 5(A1-5) | 5*10^1cfu/ml | 95％ | 100％ |
| 大肠埃希菌 | (A1-5) | 1*10^2cfu/ml | 95％ | 100％ |
| 屎肠球菌 | 5(A1-5) | 5*10^1cfu/ml | 95％ | 100％ |
| 金黄色葡萄球菌 | (A1-5) | 1*10^2cfu/ml | 95％ | 100％ |
。
2精密度
2.1重复性
对2倍检测限样本A1-4、100倍检测限样本5(A1-3)进行3次重复检测，阴性对照品N1进行2次重复，检测结果如表13所示，本发明方法结果重复性较好。
表13
。
2.2重现性
由两名实验员在不同日间，不同实验室分别对2倍检测限样本A1-4、100倍检测限样本5(A1-3)进行3次重复检测，检测阴性对照品N1作为阴性对照，检测结果表14所示。表14的结果显示本发明方法检测结果重现性较好。
表14
结果显示：由上述重复性与重现性结果显示，本申请检测方案有较好的精密度。
3准确性
检测100倍检测限样本5(A1-3)、10倍检测限样本5(A1-4)、检测限样本5(A1-5)和阴性参考品N1进行准确性测试，检测结果如表15所示。表15结果显示，本发明方法检测结果准确性为100％。
表15
4抗干扰性
4.1血红蛋白干扰
在10倍检测限样本5(A1-4)中分别添加0g/dL、10/dL、20g/dL血红蛋白，检测血红蛋白对病原体干扰的影响，结果见如表16所示。结果显示，血红蛋白浓度≤20g/dL时对病原体的检测无影响。
表16
4.2人源核酸干扰
在检测限样本5(A1-5)、10倍检测限样本5(A1-4)、100倍检测限样本5(A1-3)中分别添加100ng/mL、1000ng/mL人源核酸，检测人源核酸含量对病原体检测的影响，检测结果如表17所示。结果显示，人源核酸含量越高病原体检测灵敏度越低，在相应病原检测限浓度样本中额外添加人源核酸后病原体无法检出。
表17
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (10)
1.一种反应液，其特征在于，包括：
40％～60％体积分数的片段化酶反应液、1-10mM dATP、0.1-5mM dNTP、1000-5000U/mLT4 DNA聚合酶、1000-5000U/mL rTaq酶和1000-5000U/mL T4多聚核苷酸激酶。
2.根据权利要求1所述的反应液，其特征在于，所述dATP与所述dNTP的摩尔比为4:1～6:1；优选5:1。
3.根据权利要求1或2所述的反应液，其特征在于，包括50％体积分数的片段化酶反应液、2mM dATP、0.4mM dNTP、1000U/mL T4 DNA聚合酶、1000U/mL Taq酶和1000U/mL T4多聚核苷酸激酶。
4.一种测序文库的构建方法，其特征在于，包括：
将待测核酸样本在权利要求1～3任一项所述的反应液中进行片段化和末端修复处理；
将所述经片段化和末端修复处理的核酸样本进行接头连接处理；
对接头连接处理产物进行扩增处理，以便获得所述测序文库。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述片段化和末端修复处理是在如下条件下进行的：
30～40℃，15～30min；60～75℃，5～20min；
任选地，所述片段化和末端修复处理是在如下条件下进行的：30℃，15～30min；72℃，5～20min；
优选地，所述片段化和末端修复处理是在如下条件下进行的：30℃，20min；72℃，10min。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述待测核酸样本来自实体组织样本或体液样本；
任选地，所述体液包括选自血液、脑脊液、痰液和肺泡灌洗液的至少之一。
7.一种测序文库，其特征在于，所述测序文库通过权利要求4～6任一项所述的方法制备获得。
8.一种测序方法，其特征在于，包括：对权利要求7所述的测序文库进行测序；
任选地，所述测序是在MGISEQ-2000或BGISEQ-50测序平台上进行的。
9.一种非诊断治疗目的的微生物检测方法，其特征在于，包括：
利用权利要求4～6任一项所述的方法构建待测核酸样本的测序文库；
将所述测序文库进行测序处理，以便获得测序结果；以及
将所述测序结果与预定微生物参照基因序列进行比对处理，以获得所述待测核酸样本中的微生物核酸信息；
任选地，所述待测核酸样本选自实体组织样本或体液样本；
任选地，所述体液包括选自血液、脑脊液、痰液和肺泡灌洗液的至少之一；
任选地，所述微生物为病原微生物。
10.一种试剂盒，其特征在于，包括：权利要求1～3任一项所述的反应液；
任选地，所述试剂盒进一步包括连接缓冲液、连接酶、标签接头、PCR反应液、PCR引物、阳性对照品、阴性对照品、内标、磁珠和溶解液中的至少之一。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
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Applications Claiming Priority (1)
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2023
- 2023-11-14 CN CN202311513822.5A patent/CN117551717A/zh active Pending
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