CN112538537A - 检测家畜呼吸道病原菌的高通量微流控lamp芯片及检测方法 - Google Patents

检测家畜呼吸道病原菌的高通量微流控lamp芯片及检测方法 Download PDF

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CN112538537A CN202010569396.7A CN202010569396A CN112538537A CN 112538537 A CN112538537 A CN 112538537A CN 202010569396 A CN202010569396 A CN 202010569396A CN 112538537 A CN112538537 A CN 112538537A
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李军
吴翠兰
潘艳
彭昊
冯世文
钟舒红
介百飞
胡帅
谢永平
庞彬辉
马春霞
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Abstract

本发明公开了一种检测家畜呼吸道病原菌的高通量微流控LAMP芯片及检测方法，属于生物芯片技术领域。该LAMP芯片包括LAMP扩增试剂、DNA模板、LAMP质控阳性对照、LAMP质控阴性对照、检测芯片、芯片探针、微流控LAMP芯片分析仪，所述检测芯片置于恒温扩增微流控LAMP芯片分析仪内，所述芯片探针包括SEQ ID NO：1～23所示的核苷酸序列；用于检测溶血性曼氏杆菌、多杀性巴氏杆菌、支原体、化脓隐秘杆菌、肺炎克雷伯氏菌的特异性核酸片段。本发明能够在50分钟内完成检测，并且检出限为1.5×10‑2ng/μL，可以实时监测家畜呼吸道主要病原菌，具有操作简单、检测快速、敏感性高、特异性强的特点，为家畜呼吸道病原菌的检测带来便利。

Description

检测家畜呼吸道病原菌的高通量微流控LAMP芯片及检测方法
技术领域
本发明涉及生物芯片技术领域，尤其是一种检测家畜呼吸道病原菌的高通量微流控LAMP芯片及检测方法。
背景技术
微流控芯片技术是利用环介导恒温扩增(LAMP)的原理，把样品检测过程集成到一个数平方厘米的芯片上，可同时检测十几种病原体，具有特异性强、灵敏度高、反应用时短，检测范围广等优势，可实现对核酸的高通量快速检测，对多学科基础研究有重要影响，尤其对资源、技术相对短缺的基层兽医与畜牧领域影响较大，对于生物分子快速诊断具有重大的意义。
近年来，随着家畜养殖业向集约化、规模化方向的发展，呼吸道疾病发病迅速、传染性强，是对养殖业危害最大、最广泛的重要常见疫病之一，极易给养殖业造成巨大的经济损失，严重危害养殖业的健康发展。家畜主要呼吸道病原菌有溶血性曼氏杆菌、多杀性巴氏杆菌、支原体、化脓隐秘杆菌、肺炎克雷伯氏菌等多种，临床上呼吸道疾病常以混合感染的形式出现，其病原学研究越来越趋于专业化、复杂化，给临床诊断造成很大的困难。传统的诊断手段是通过细菌培养的方法，但其耗时长、敏感性低，难以满足临床诊断的需求，因此快速检测家畜呼吸道疾病病原极为重要。
公布号为CN110016512A的中国发明专利申请公开了同时检测三种牛呼吸道病原体的多重荧光定量PCR检测试剂盒及方法，是针对牛分支杆菌、牛支原体、牛肺炎克雷伯菌，对于牛三种牛呼吸道病原体的检测准确率高，但方法复杂。
目前尚无一种能够适用于任一家禽类、且操作简单、快速、精确的呼吸道病原菌检测方法及芯片。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种检测家畜呼吸道病原菌的高通量微流控LAMP芯片及检测方法。能够在50分钟内完成检测，并且检出限为1.5×10-2ng/μL，可以实时监测家畜呼吸道主要病原菌，具有操作简单、检测快速、敏感性高、特异性强的特点，为家畜呼吸道病原菌的检测带来便利。
本发明为实现上述目的提供如下方案：
一种检测家畜呼吸道病原菌的高通量微流控LAMP芯片，包括芯片探针，所述芯片探针包括SEQ ID NO：1～23所示的核苷酸序列；用于检测溶血性曼氏杆菌、多杀性巴氏杆菌、支原体、化脓隐秘杆菌、肺炎克雷伯氏菌的特异性核酸片段；
各个探针DNA序列如下：
溶血性曼氏杆菌探针：SEQ ID NO：1-5
SEQ ID NO：1GGGCAATACGAACTACTCGG
SEQ ID NO：2TCGTATTCGCAGCAAAGGTT
SEQ ID NO：3GCTACACCGGCAGGGTAATCCCCGGTGAAGCCTTTGACAA
SEQ ID NO：4ATTAGCCGAATCCGGCACGCATCCAGTCCCGGTCTGTC
SEQ ID NO：5GTTTTAAATTCCCTCGTCCAATGAC；
多杀性巴氏杆菌探针：SEQ ID NO：6-10
SEQ ID NO：6TGTCGGTAGTCTTTTATTTGG
SEQ ID NO：7GGAAATATTGATAAATCAGACTGAC
SEQ ID NO：8GGAAGCAGATTGGCTCAACATGGCAAAGAAAAGCACAG
SEQ ID NO：9TTGACAACGGCGCAACTGATAGGAAATATAAACCGGCAAAT
SEQ ID NO：10CACCAAACTCCGCCCAAC；
支原体探针：SEQ ID NO：11-14
SEQ ID NO：11AGGAGGAGAAAAAAGCCTAT
SEQ ID NO：12GCTAAAACTGAAGCTTGCA
SEQ ID NO：13CGCCACTTAATGTATGTGGATATCTGGCCTTTTGGAAAGATTTGG
SEQ ID NO：14ACAATGGTTGTTGCTTTAAAACCACAGTTGGATCTAAAGCAGTAG；
化脓隐秘杆菌探针：SEQ ID NO：15-18
SEQ ID NO：15GTGGCTATCGCTTCCTTCAA
SEQ ID NO：16CCGCTAAAAGCCGCTTGT
SEQ ID NO：17CGGTGACATTCGGGCCGAAAAACTACACGGCTAGCGTAGA
SEQ ID NO：18CGTCGGTCAGCTATGGACGCCATTGGAAGTCGAGGTCGTT；
肺炎克雷伯氏菌探针：SEQ ID NO：19-23
SEQ ID NO：19GCGGCCTGAAGCTCAACT
SEQ ID NO：20GTCCGGGAAGGTGGCT
SEQ ID NO：21CGCTTTTGCCGTCCCGAGCGGAGTCCGTGGCCCTGAT
SEQ ID NO：22CTGATGGAGGAAGGCCGACATGGACCTGGATATCCGGGATCA
SEQ ID NO：23CTGACCCGCAAGCAGGTGATG。
进一步地，所述LAMP芯片包括检测芯片，所述检测芯片共22个检测反应槽；所述检测芯片分A、B两个相同反应区域，所述每一反应区域均有11个检测反应槽；其中，一个检测反应槽中含一种芯片探针，对应检测一种病原菌。
进一步地，所述A、B反应区域均含有LAMP扩增试剂、DNA模板、LAMP质控阳性对照和LAMP质控阴性对照、5种家畜呼吸道病原菌的芯片探针。
进一步地，所述每一检测反应槽的容量为2μL。
进一步地，所述LAMP芯片于-20℃保存。
本发明包含所述检测家畜呼吸道病原菌的高通量微流控LAMP芯片的检测方法，包括以下步骤：
1)提取待测样品的DNA，将DNA样品置于-20℃保存备用；
2)LAMP反应体系：LAMP扩增试剂13μL，DNA 13μL，共计26μL；
3)将DNA与LAMP扩增试剂充分混匀后低速离心机瞬时离心至管底；
4)取出LAMP芯片使其恢复至室温，用移液器吸取26μL配制好的核酸扩增反应体系注入LAMP芯片使其充满LAMP芯片，将加样后的LAMP芯片固定在低速离心机上，离心30s，然后将LAMP芯片置于恒温扩增微流控LAMP芯片分析仪内，进行检测；
5)检测反应程序为：在恒温扩增微流控LAMP芯片分析仪内于65℃扩增50min。
6)检测结果：在检测反应时，实时收集检测反应槽内的荧光值，产生典型荧光跃升扩增曲线的反应槽为阳性扩增，反之则为阴性。
进一步地，所述LAMP芯片检测的阳性对照为溶血性曼氏杆菌、多杀性巴氏杆菌、支原体、化脓隐秘杆菌、肺炎克雷伯氏菌的DNA。
本发明针对家畜呼吸道病原菌溶血性曼氏杆菌(M haemolytica)、多杀性巴氏杆菌(P.m)、支原体(M.bovis)、化脓隐秘杆菌(A.pyogenes)、肺炎克雷伯氏菌(K.pneumniae；Kpn)，通过分子信息学方法分析5种家畜呼吸道病原菌特异性靶基因的保守区域，设计LAMP特异性引物，通过优化条件，建立一套家畜呼吸道病原菌LAMP检测方法。
本发明具有以下有益效果：
1.本发明提供一种检测家畜呼吸道病原菌的高通量微流控LAMP芯片及检测方法，在LAMP检测方法的基础上，将芯片探针LAMP引物点样于LAMP芯片的检测反应槽中，经过特异性和敏感性试验，并对家畜病样品进行检测，结果证实：研发的LAMP芯片能够在临床上可以应用，其在50分钟内完成检测，并且检出限为1.5×10-2ng/μL，可以实时监测家畜呼吸道主要病原菌，具有操作简单、检测快速、敏感性高、特异性强的特点，为家畜呼吸道病原菌的检测带来便利。
2.本发明可在一块小的芯片上实现同时检测5种家畜呼吸道病原菌的特异性核酸，使分析效率成倍提高。
3.本发明检测工作在50分钟内完成，极大的缩短扩增反应时间，可以满足临床快速检测的需求。
4.本发明芯片检测探针扩增相应病原特异性核酸片段，探针之间无交叉反应灵；敏度高：微流控芯片检出限为1.5×10-2ng/μL；检测结果准确：能够准确区分不同病原核酸。
5.本发明建立的家畜呼吸道病原菌微流控LAMP芯片，为增强防控家畜呼吸道疫病工作奠定良好的基础。这种快捷、高效的检测方法可为养殖业提供一种较为实用的检测技术，有助于有效预防家畜呼吸道疫病的流行和爆发。
附图说明
图1为本发明LAMP芯片的实物照片图。
图2为本发明LAMP芯片的特异性试验结果。
图3-7为本发明LAMP芯片对下列病原菌的敏感性试验结果；其中，图3：溶血性曼氏杆菌M haemolytica；图4：多杀性巴氏杆菌P.m；图5：支原体M.bovis；图6：化脓隐秘杆菌A.pyogenes；图7：肺炎克雷伯氏菌Kpn。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，但本发明的实施方式并不局限于实施例表示的范围。这些实施例仅用于说明本发明，而非用于限制本发明的范围。此外，在阅读本发明的内容后，本领域的技术人员可以对本发明作各种修改，这些等价变化同样落于本发明所附权利要求书所限定的范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1准备材料
1)试剂
细菌基因组DNA提取试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司；
Figure BDA0002548900320000041
扩增反应试剂盒，购自荣研生物科技(中国)有限公司；其他化学试剂均为国产分析纯试剂。溶血性曼氏杆菌、多杀性巴氏杆菌、支原体、化脓隐秘杆菌、肺炎克雷伯氏菌由本实验室保存。
2)病原基因组的提取
采用细菌基因组DNA提取试剂提取溶血性曼氏杆菌、多杀性巴氏杆菌、支原体、化脓隐秘杆菌、肺炎克雷伯氏菌的DNA。DNA样品置于-20℃保存备用。
3)LAMP芯片的制备
LAMP芯片左右的A、B反应区域各有11个样品检测孔，每孔容量为2μL。将优化好的LAMP引物，各自按照一定的浓度混合后，分别点样于芯片不同的反应槽内，待引物干燥后，将芯片保存于-20℃备用(图1)。LAMP引物的点样由北京博奥晶典生物技术有限公司合成。
实施例2 LAMP芯片的检测方法
LAMP反应体系为LAMP扩增试剂13μL，DNA13μL，共计26μL。样品检测时，取出LAMP芯片使其恢复至室温，用移液器吸取26μL配制好的核酸扩增反应体系注入微流控LAMP芯片主通道中，使其充满芯片，将加样后的芯片固定在低速离心机上，离心30s，然后将芯片置于恒温扩增微流控LAMP芯片分析仪内，进行检测。LAMP反应时，实时收集反应槽内的荧光值。产生典型荧光跃升扩增曲线的反应槽为阳性扩增，反之则为阴性。
实施例3 LAMP芯片特异性试验
将溶血性曼氏杆菌、多杀性巴氏杆菌、支原体、化脓隐秘杆菌、肺炎克雷伯氏菌的DNA与LAMP扩增试剂混合后，加入LAMP芯片反应槽内，在恒温扩增微流控分析仪内65℃扩增50min，测定LAMP芯片的特异性。
结果：
将溶血性曼氏杆菌、多杀性巴氏杆菌、支原体、化脓隐秘杆菌、肺炎克雷伯氏菌的DNA作为模板，使用LAMP扩增试剂进行检测，结果如图2所示。由图2可见，血性曼氏杆菌、多杀性巴氏杆菌、支原体、化脓隐秘杆菌、肺炎克雷伯氏菌的相应检测指标及阳性对照反应槽的LAMP扩增结果呈阳性，荧光曲线具有典型的“S”形，而阴性对照和空白对照均为阴性，微流控芯片特异性扩增结果与预期一致，没有假阳性结果，表明微流控芯片具有良好的特异性。
实施例4 LAMP芯片灵敏性试验
分别取溶血性曼氏杆菌、多杀性巴氏杆菌、支原体、化脓隐秘杆菌、肺炎克雷伯氏菌的DNA稀释至1.5×10-2ng/μL，与LAMP扩增试剂混合后，加入LAMP芯片反应槽内，在恒温扩增微流控分析仪内65℃扩增50min，测定LAMP芯片灵敏性。
结果：
分别取溶血性曼氏杆菌、多杀性巴氏杆菌、支原体、化脓隐秘杆菌、肺炎克雷伯氏菌的DNA稀释至1.5×10-2ng/μL，与LAMP扩增试剂混合后，加入微流控LAMP芯片反应槽内，在恒温扩增微流控LAMP分析仪内65℃扩增50min，结果分别如图3-10所示。由图3-7可见，在模板浓度为1.5×10-2ng/μL，各反应槽具有扩增曲线，说明微流控芯片的检测灵敏度达到1.5×10-2ng/μL。
实施例5 LAMP芯片检测准确性试验
取30份临床样品，分别进行LAMP芯片检测和PCR检测，比较两者间的一致性，检测结果见表1。
表1临床样品的病原检测比较
Figure BDA0002548900320000061
由表1检测结果显示，LAMP芯片检测和PCR检测的结果相一致。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的包含范围之内。
序列表
<110> 广西壮族自治区兽医研究所
<120> 检测家畜呼吸道病原菌的高通量微流控LAMP芯片及检测方法
<160> 23
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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20

Claims (7)

1.一种检测家畜呼吸道病原菌的高通量微流控LAMP芯片，其特征在于，包括芯片探针，所述芯片探针包括SEQ ID NO：1～23所示的核苷酸序列；用于检测溶血性曼氏杆菌、多杀性巴氏杆菌、支原体、化脓隐秘杆菌、肺炎克雷伯氏菌的特异性核酸片段；
各个芯片探针DNA序列如下：
溶血性曼氏杆菌探针：SEQ ID NO：1-5
SEQ ID NO：1GGGCAATACGAACTACTCGG
SEQ ID NO：2TCGTATTCGCAGCAAAGGTT
SEQ ID NO：3GCTACACCGGCAGGGTAATCCCCGGTGAAGCCTTTGACAA
SEQ ID NO：4ATTAGCCGAATCCGGCACGCATCCAGTCCCGGTCTGTC
SEQ ID NO：5GTTTTAAATTCCCTCGTCCAATGAC；
多杀性巴氏杆菌探针：SEQ ID NO：6-10
SEQ ID NO：6TGTCGGTAGTCTTTTATTTGG
SEQ ID NO：7GGAAATATTGATAAATCAGACTGAC
SEQ ID NO：8GGAAGCAGATTGGCTCAACATGGCAAAGAAAAGCACAG
SEQ ID NO：9TTGACAACGGCGCAACTGATAGGAAATATAAACCGGCAAAT
SEQ ID NO：10CACCAAACTCCGCCCAAC；
支原体探针：SEQ ID NO：11-14
SEQ ID NO：11AGGAGGAGAAAAAAGCCTAT
SEQ ID NO：12GCTAAAACTGAAGCTTGCA
SEQ ID NO：13CGCCACTTAATGTATGTGGATATCTGGCCTTTTGGAAAGATTTGG
SEQ ID NO：14ACAATGGTTGTTGCTTTAAAACCACAGTTGGATCTAAAGCAGTAG；
化脓隐秘杆菌探针：SEQ ID NO：15-18
SEQ ID NO：15GTGGCTATCGCTTCCTTCAA
SEQ ID NO：16CCGCTAAAAGCCGCTTGT
SEQ ID NO：17CGGTGACATTCGGGCCGAAAAACTACACGGCTAGCGTAGA
SEQ ID NO：18CGTCGGTCAGCTATGGACGCCATTGGAAGTCGAGGTCGTT；
肺炎克雷伯氏菌探针：SEQ ID NO：19-23
SEQ ID NO：19GCGGCCTGAAGCTCAACT
SEQ ID NO：20GTCCGGGAAGGTGGCT
SEQ ID NO：21CGCTTTTGCCGTCCCGAGCGGAGTCCGTGGCCCTGAT
SEQ ID NO：22CTGATGGAGGAAGGCCGACATGGACCTGGATATCCGGGATCA
SEQ ID NO：23CTGACCCGCAAGCAGGTGATG。
2.根据权利要求1所述检测家畜呼吸道病原菌的高通量微流控LAMP芯片，其特征在于，所述LAMP芯片包括检测芯片，所述检测芯片共22个检测反应槽；所述检测芯片分A、B两个相同反应区域，所述每一反应区域均有11个检测反应槽；其中，一个检测反应槽中含一种芯片探针，对应检测一种病原菌。
3.根据权利要求2所述检测家畜呼吸道病原菌的高通量微流控LAMP芯片，其特征在于，所述A、B反应区域均含有LAMP扩增试剂、DNA模板、LAMP质控阳性对照和LAMP质控阴性对照、5种家畜呼吸道病原菌的芯片探针。
4.根据权利要求2所述检测家畜呼吸道病原菌的高通量微流控LAMP芯片，其特征在于，所述每一检测反应槽的容量为2μL。
5.根据权利要求1所述检测家畜呼吸道病原菌的高通量微流控LAMP芯片，其特征在于，所述LAMP芯片于-20℃保存。
6.根据权利要求1-5任一项所述检测家畜呼吸道病原菌的高通量微流控LAMP芯片的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)提取待测样品的DNA，将DNA样品置于-20℃保存备用；
2)LAMP反应体系：LAMP扩增试剂13μL，DNA 13μL，共计26μL；
3)将DNA与LAMP扩增试剂充分混匀后低速离心机瞬时离心至管底；
4)取出LAMP芯片使其恢复至室温，用移液器吸取26μL配制好的核酸扩增反应体系注入LAMP芯片使其充满LAMP芯片，将加样后的LAMP芯片固定在低速离心机上，离心30s，然后将LAMP芯片置于恒温扩增微流控LAMP芯片分析仪内，进行检测；
5)检测反应程序为：在恒温扩增微流控LAMP芯片分析仪内于65℃扩增50min。
6)检测结果：在检测反应时，实时收集检测反应槽内的荧光值，产生典型荧光跃升扩增曲线的反应槽为阳性扩增，反之则为阴性。
7.根据权利要求6所述检测家畜呼吸道病原菌的高通量微流控LAMP芯片的检测方法，其特征在于，所述LAMP芯片检测的阳性对照为溶血性曼氏杆菌、多杀性巴氏杆菌、支原体、化脓隐秘杆菌、肺炎克雷伯氏菌的DNA。
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