CN110846425B - 血清1型、2型和11型鸭疫里默氏菌的pcr鉴定引物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了血清1型、2型和11型鸭疫里默氏菌的PCR鉴定引物、试剂盒及多重PCR鉴定方法，属于生物技术领域，PCR鉴定引物分别具有如SEQ ID NO：1‑SEQ ID NO：8所示核苷酸序列；采用分子生物学方法检测并鉴定鸭疫里默氏菌主要流行血清型，实现鸭疫里默氏菌血清1型、2型和11型的准确、快速、稳定和特异性检测，在分子流行病及疫苗研发上有较大的使用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及到血清1型、2型和11型鸭疫里默氏菌的PCR鉴定引物、试剂盒及多重PCR鉴定方法。
背景技术
鸭疫里默氏菌病是一种危害养禽业的重要疾病。鸭疫里默氏菌(Riemerellaanatipestifer， RA)为革兰阴性、无芽孢、无鞭毛的棒状杆菌。主要感染鸭、火鸡、鹅及其他家禽，主要引起纤维素性心包炎、肝周炎、心包炎及气囊炎。近年来鸭疫里默氏菌病呈现世界范围的流行，该病主要在水禽养殖地区分布广泛，耐过病鸭生长受阻、品质下降等，给全球水禽养殖行业造成巨大的经济损失。
自首例鸭疫里默氏菌病发现以来，新血清型不断增加，目前已报道的血清型至少21种，分别用阿拉伯数字命名为1～21型。RA血清型众多，而且相互间基本无交叉保护性。而自我国首次报道该病以来，张大丙等(1999年)、程安春等(2003年)分别分析了来自全国的鸭疫里默氏菌分离株的血清型，证实了目前我国RA流行株中，其血清型以1型和2型为主。我们近期的流行病学调查研究发现鸭疫里默氏菌血清型以1型、2型和11型为主。
目前国内外对RA血清型的鉴定方法普遍采用凝集试验和琼脂扩散沉淀试验，在实际工作中，常会遇到自凝集、交叉凝集或不凝集现象而影响其血清型的判断。并且由于RA标准血清的限制，不易在各个实验室和临床工作中应用。因此迫切需要一种便捷准确的RA血清型的鉴定方法。
发明内容
为了解决现有鸭疫里默氏菌血清型鉴定方法操作繁琐，费时费力，标准血清匮乏，不容易推广应用的问题，本发明公开血清1型、2型和11型鸭疫里默氏菌的PCR鉴定引物、试剂盒及多重PCR鉴定方法，采用分子生物学方法检测并鉴定鸭疫里默氏菌主要流行血清型，实现鸭疫里默氏菌血清1型、2型和11型的准确、快速、稳定和特异性检测，在分子流行病学及疫苗研发上有较大的使用价值。
本发明通过下述技术方案实现：
血清1型、2型和11型鸭疫里默氏菌的PCR鉴定引物，包括：
特异性扩增鸭疫里默氏菌血清1型上游引物，具有如SEQ ID NO：1所示核苷酸序列；
特异性扩增鸭疫里默氏菌血清1型下游引物，具有如SEQ ID NO：2所示核苷酸序列；
特异性扩增鸭疫里默氏菌血清2型上游引物，具有如SEQ ID NO：3所示核苷酸序列；
特异性扩增鸭疫里默氏菌血清2型下游引物，具有如SEQ ID NO：4所示核苷酸序列；
特异性扩增鸭疫里默氏菌血清11型上游引物，具有如SEQ ID NO：5所示核苷酸序列；
特异性扩增鸭疫里默氏菌血清11型下游引物，具有如SEQ ID NO：6所示核苷酸序列。
进一步的，还包括基于鸭疫里默氏菌O-抗原基因簇特异性鉴定鸭疫里默氏菌所需的种特异性鉴定引物序列：
鸭疫里默氏菌特异性鉴定上游引物具有如SEQ ID NO：7所示核苷酸序列；
鸭疫里默氏菌特异性鉴定下游引物具有如SEQ ID NO：8所示核苷酸序列。
本发明中，自行设计的特异性扩增鸭疫里默氏菌血清1型、2型和11型引物，以及基于鸭疫里默氏菌O-抗原基因簇的鸭疫里默氏菌特异性鉴定引物，能够用于PCR检测鸭疫里默氏菌血清1型、血清2型和血清11型的标准株和临床分离株，检测得出的分型结果准确无误，且没有假阳性和相互交叉反应的发生，有效提升血清型鉴定的准确性、稳定性、特异性和灵敏性。
血清1型、2型和11型鸭疫里默氏菌的PCR鉴定试剂盒，包括PCR反应缓冲液、MgCl2、dNTP、PCR引物、DNA聚合酶，所述PCR引物采用上述血清1型、2型和11型鸭疫里默氏菌的PCR鉴定引物。
进一步的，各试剂的量为：PCR引物10μM(1型:P-1/P-2各0.1μl，2型：P-3/P-4各0.25μl， 11型：P-5/P-6：各1μl，特异性鉴定：P-7/P-8各0.5μl)、MgCl2 1.5μ1、10×PCR反应缓冲液 2.5μl、l0mM dNTP 2μl、5U/μl Taq聚合酶0.125μ1。
本发明中，试剂盒采用了自行设计的特异性扩增鸭疫里默氏菌血清1型、2型和11型引物，以及基于鸭疫里默氏菌O-抗原基因簇的鸭疫里默氏菌特异性鉴定引物，可用于血清1型、 2型和11型鸭疫里默氏菌的多重PCR鉴定，试剂配制简单，检测周期短、速度快，可操作性强。
血清1型、2型和11型鸭疫里默氏菌的多重PCR鉴定方法，包括以下步骤：
(1)将待测样品DNA及权利要求3或4所述的PCR鉴定试剂盒的试剂加入到PCR管中；
(2)进行PCR扩增反应，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，最后判定待测样品血清型。
其中，步骤(2)中，待测样品血清型的判定方法为：
电泳图谱出现1114bp特异性鉴定条带和269bp条带，则说明样本为血清1型鸭疫里默氏菌；
电泳图谱出现1114bp特异性鉴定条带和671bp条带，则说明样本为血清2型鸭疫里默氏菌；
电泳图谱出现1114bp特异性鉴定条带和510bp条带，则说明样本为血清11型鸭疫里默氏菌。
本发明中，多重PCR鉴定方法采用自行设计的特异性扩增鸭疫里默氏菌血清1型、2型和11型引物，以及基于鸭疫里默氏菌O-抗原基因簇的鸭疫里默氏菌特异性鉴定引物扩增目的序列，实现对鸭疫里默氏菌血清1型、2型和11型的准确、快速、稳定、特异性和高灵敏性的检测，相比现有鉴定方法而言，检测成本却相对较低，相比常规生化检测方法而言，本方法节省了人力物力，所需的试剂及设备成本较低，设计合成的检测引物-20℃可以长期保存，能多次使用，市场应用前景广。
血清1型、2型和11型鸭疫里默氏菌的PCR鉴定引物在鸭疫里默氏菌血清型鉴定中的用途。
血清1型、2型和11型鸭疫里默氏菌的PCR鉴定试剂盒在鸭疫里默氏菌血清型鉴定中的用途。
本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：
1、本发明血清1型、2型和11型鸭疫里默氏菌的PCR鉴定引物，自行设计的特异性扩增鸭疫里默氏菌血清1型、2型和11型引物，以及基于鸭疫里默氏菌O-抗原基因簇的鸭疫里默氏菌特异性鉴定引物，能够用于PCR检测鸭疫里默氏菌血清1型、血清2型和血清11型的标准株和临床分离株，检测得出的分型结果准确无误，且没有假阳性和相互交叉反应的发生，有效提升血清型鉴定的准确性、稳定性、特异性和灵敏性；
2、本发明血清1型、2型和11型鸭疫里默氏菌的PCR鉴定试剂盒，该试剂盒采用了自行设计的特异性扩增鸭疫里默氏菌血清1型、2型和11型引物，以及基于鸭疫里默氏菌O- 抗原基因簇的鸭疫里默氏菌特异性鉴定引物，可用于血清1型、2型和11型鸭疫里默氏菌的多重PCR鉴定，试剂配制简单，检测周期短、速度快，可操作性强；
3、本发明血清1型、2型和11型鸭疫里默氏菌的多重PCR鉴定方法，采用自行设计的特异性扩增鸭疫里默氏菌血清1型、2型和11型引物，以及基于鸭疫里默氏菌O-抗原基因簇的鸭疫里默氏菌特异性鉴定引物扩增目的序列，实现对鸭疫里默氏菌血清1型、2型和11型的准确、快速、稳定、特异性和高灵敏性的检测，相比现有鉴定方法而言，检测成本却相对较低，相比常规生化检测方法而言，本方法节省了人力物力。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：
图1为本发明实施例2多重PCR体系检测结果：其中M为2000bp DNA Ladder；泳道1：1型模板(ATCC 11845)；泳道2：2型模板(RA-CH-2)；泳道3：11型模板(RCAD0489) 4：混合模板；5：阴性对照。
图2为本发明实施例3多重PCR体系特异性验证结果：其中M为2000bp DNA Ladder；泳道1：1型模板(ATCC 11845)；泳道2：2型模板(RA-CH-2)；泳道3：11型模板RCAD0489；泳道4：混合模板；泳道5：Pasteurella multocida ATCC 15742模板；泳道6：Salmonellaenterica ATCC 14028模板；泳道7：Riemerella columbina CCUG 47689模板；泳道8：Escherichia coli ATCC 25922模板；泳道9：阴性对照。
图3为本发明实施例3多重PCR体系血清型特异性验证结果：其中M为2000bp DNALadder；泳道1：3型模板(RCAD0475)；泳道2：5型模板(RCAD0493)；泳道3：6型模板(RCAD0152)；泳道4：7型模板(RCAD0135)；泳道5：8型模板(RCAD0504)；泳道 6：12型模板(RCAD0497)；泳道7：阴性对照。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
实施例1
本发明血清1型、2型和11型鸭疫里默氏菌的多重PCR鉴定方法，包括以下步骤：
1、引物的设计
使用本实验室测定并提交NCBI数据库的鸭疫里默氏菌基因组序列，针对血清型1型O- 抗原基因簇特异区，2型O-抗原基因簇特异区，11型的O-抗原基因簇特异区，O抗原基因簇保守区间设计引物；引物序列如下表1所示：
表1鸭疫里默氏菌3种血清型及特异性鉴定的特异引物序列
2、多重PCR体系
2.1多重PCR反应体系包括MgCl2、PCR引物、dNTP、PCR反应缓冲液和DNA聚合酶，其中PCR引物如上表1所示，单次检测试验所使用的试剂量为25μl，具体组成如下表2所示。
2.2检测试验所需试剂、材料及设备的准备
其中MgCl2、10×PCR反应缓冲液、dNTP、Taq聚合酶由宝日医生物技术(北京)有限公司提供；引物混合物为自行设计的序列提供给北京华大基因合成；阳性对照品、阴性对照品和ddH2O为自行制备。
实验设备包括：PCR仪(又名DNA热循环扩增仪)、电泳设备(包括电泳仪及电泳槽)、凝胶成像仪、-20℃冰箱、高速离心机、微量移液器和0.2ml PCR薄壁管。
表2 Multiplex PCR反应混合液配方
其中，表中P-1至P-8与表1中指向相同。
3、多重PCR反应
将表2中的Multiplex PCR反应混合液配方与待测样品DNA提取物1μl加入到0.2mlPCR薄壁管内，用ddH20补足至25μl，然后将PCR薄壁管置于PCR仪进行扩增反应。
本实施例中的多重PCR反应最终的反应条件如下：
4、血清型鉴定
利用电泳设备对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据最终的电泳图谱判定鸭疫里默氏菌的血清型：
电泳图谱出现1114bp特异性鉴定条带和269bp条带，则说明样本为血清1型鸭疫里默氏菌；
电泳图谱出现1114bp特异性鉴定条带和671bp条带，则说明样本为血清2型鸭疫里默氏菌；
电泳图谱出现1114bp特异性鉴定条带和510bp条带，则说明样本为血清11型鸭疫里默氏菌。
实施例2
将鸭疫里默氏菌血清1型，2型，11型的标准菌株按照实施例1中的多重PCR反应体系和反应条件进行检测，步骤如下：
1)按照表2中的组分和量向PCR薄壁管中加入MgCl2、PCR引物、dNTP、PCR反应缓冲液和DNA聚合酶，取1μl的基因组DNA作为模板加入；
2)按照实施例1中反应条件进行多重PCR反应；
3)进行凝胶电泳检测，结果分析参照图1所示。
由图1可知，血清1型鸭疫里默氏菌标准菌株的电泳图谱出现了1114bp特异性鉴定条带和269bp条带；血清2型鸭疫里默氏菌标准菌株的电泳图谱出现了1114bp特异性鉴定条带和 671bp条带；血清11型鸭疫里默氏菌标准菌株的电泳图谱出现了1114bp特异性鉴定条带和 510bp条带；混合模板的电泳图谱同时出现了1114bp特异性鉴定条带、269bp条带、671bp 条带和510bp条带。
实施例3
本实施例取3种鸭疫里默氏菌血清型标准菌株各1株(血清1型，2型，11型)，6种鸭疫里默氏菌其它血清型的标准菌株各1株、以及4种常见及近缘菌的标准菌株各1株作为反应模板，采用实施例1中表2的反应体系和反应条件对上述菌株进行多重PCR鉴定，以验证引物的特异性。标准菌株编号和来源如下表3所示：
表3供试的标准菌株
其中：ATCC：美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)
CCUG：瑞典哥德堡大学培养物保藏中心(Culture Collection of theUniversity of Gothenburg)
RCAD：四川农业大学动物医学院禽病防治研究中心(Research Center of AvianDisease, College of Veterinary Medicine,Sichuan Agricultural University)
鉴定结果如图2、图3所示，由图2、图3可知：
血清1型、2型和11型的鸭疫里默氏菌的电泳图谱显示得到了特异性条带和特异性鉴定条带，而4种常见菌鸭疫里默氏菌没有得到任何PCR产物带，检测范围外的6种鸭疫里默氏菌血清型仅扩增出用于鉴定是否是鸭疫里默氏菌的特异性鉴定条带。因此，上述寡核苷酸引物是高度特异的。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 四川农业大学
<120> 血清1型、2型和11型鸭疫里默氏杆菌的PCR鉴定引物、试剂盒及多重PCR鉴定方法
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(1)
<400> 1
cttggagtgc agagtccgaa 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(2)
<400> 2
aactcccatt tcctcagcga 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(3)
<400> 3
gcacctcttg ttgccgattt 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(4)
<400> 4
actgcctcct gccacttatc 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(5)
<400> 5
gggatgcgat tagtggggag 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(6)
<400> 6
cacatgcgta gaccaccctt 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(7)
<400> 7
atgcccaagc gaaactcgta 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(8)
<400> 8
cgcctgtttt agcttcgtgg 20
Claims (3)
1.血清1型、2型和11型鸭疫里默氏菌的PCR鉴定引物，其特征在于，包括：特异性扩增鸭疫里默氏菌血清1型上游引物，如SEQ ID NO：1所示核苷酸序列；
特异性扩增鸭疫里默氏菌血清1型下游引物，如SEQ ID NO：2所示核苷酸序列；
特异性扩增鸭疫里默氏菌血清2型上游引物，如SEQ ID NO：3所示核苷酸序列；
特异性扩增鸭疫里默氏菌血清2型下游引物，如SEQ ID NO：4所示核苷酸序列；
特异性扩增鸭疫里默氏菌血清11型上游引物，如SEQ ID NO：5所示核苷酸序列；
特异性扩增鸭疫里默氏菌血清11型下游引物，如SEQ ID NO：6所示核苷酸序列；
还包括基于鸭疫里默氏菌O-抗原基因簇的鸭疫里默氏菌种特异性鉴定所需的引物序列：鸭疫里默氏菌种特异性鉴定上游引物如SEQ ID NO：7所示核苷酸序列；
鸭疫里默氏菌种特异性鉴定下游引物如SEQ ID NO：8所示核苷酸序列。
2.血清1型、2型和11型鸭疫里默氏菌的PCR鉴定试剂盒，其特征在于，包括PCR反应缓冲液、MgCl2、dNTP、PCR引物、DNA聚合酶，所述PCR引物采用如权利要求1所述的血清1型、2型和11型鸭疫里默氏菌的PCR鉴定引物。
3.根据权利要求2所述的血清1型、2型和11型鸭疫里默氏菌的PCR鉴定试剂盒，其特征在于，各试剂的量为：PCR引物10μM、MgCl2 1.5μ1、10×PCR反应缓冲液2.5μl、l0mM dNTP 2μl、5U/μl Taq DNA聚合酶0.125μ1。
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