CN110117671A - 鸭疫里默氏菌特异性pcr引物对、pcr检测方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明属于兽医微生物学分子检测技术领域，具体公开了一种鸭疫里默氏菌特异性PCR引物对，其核苷酸序列为：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；扩增片段为702bp，用于鸭疫里默氏菌特异性扩增检测，其核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示。本发明又公开了一种鸭疫里默氏菌检测方法。本发明还公开了一种简单快速的鸭疫里默氏菌PCR检测试剂盒，包括盒体，盒体内的试剂包括：(1)SEQ ID NO.1‑2；(2)2倍PCR扩增混合物；(3)质粒DNA阳性对照；(4)阴性对照(H2O)；(5)DNA Marker。本试剂盒选择特异性的扩增鸭疫里默氏菌16S rRNA片段的引物，并优化了退火温度和反应条件，具有灵敏度高、特异性强的优点，可直接从鸭疫里默氏菌菌液和菌液上清中扩增出特异性片段，适合临床样本分子检测和诊断。
Description
技术领域
本发明属于兽医微生物学分子检测技术领域，更具体的，涉及一种简单快速的鸭疫里默氏菌PCR检测试剂盒及其使用方法，适合于鸭疫里默氏菌临床可疑样本的分子检测和诊断。
背景技术
鸭疫里默氏杆菌病，又称鸭传染性浆膜炎，是由鸭疫里默氏杆菌感染引起的侵害雏鸭的一种急性败血性传染病，以全身浆膜面发生纤维素性炎症为特征，其发病率高达90％以上，死亡率高达75％以上，严重影响养鸭业健康稳定发展，其病变的主要特征是心包炎、肝周炎、气囊炎、脑膜炎及部分病例出现关节炎为特征，是目前鸭、鹅常见的一种细菌病。常规PCR检测方法特异性高，敏感性强，可以避免血清型的限制，达到快速检测鸭疫里默氏菌的目的，因此，本发明提供一种简单快速的鸭特异性的PCR检测试剂盒及其使用方法，可用于鸭疫里默氏菌的快速检测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于鸭疫里默氏菌16S rRNA序列的PCR引物对、PCR检测方法及试剂盒；本发明选择特异性的扩增鸭疫里默氏菌16S rRNA片段的引物，并优化了退火温度和反应条件，具有灵敏度高、特异性强的优点，可直接从鸭疫里默氏菌菌液和菌液上清中扩增出特异性片段，适合临床样本分子检测和诊断；利用本发明可简单、快速的检测鸭疫里默氏菌。
本发明的第一个目的是通过以下技术方案实现的，鸭疫里默氏菌特异性PCR引物对，其核苷酸序列为：
上游引物：5’-GGAGGCAGCAGTGAGGAATA-3’，
下游引物：5’-GGAGGCAGCAGTGAGGAATA-3’；
扩增片段为702bp，用于鸭疫里默氏菌特异性扩增检测，其核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。
本发明的第二个目的是通过以下技术方案实现的，鸭疫里默氏菌PCR检测方法：
(1)利用权利要求1所述的引物对，对待测细菌菌液样本或待测菌液上清样本进行PCR扩增；
(2)将PCR扩增产物采用1-2％的琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯照射下观察到702bp处单一扩增条带，说明待检测样本中含有鸭疫里默氏菌。否则，表明待测样品中无鸭疫里默氏菌。
优选的，所述PCR扩增反应体系为25μL：鸭疫里默氏菌特异性引物对1μL，引物对的工作浓度为10μM；待测样品模板1-2μL；2倍PCR预混试剂12μL；ddH2O10-11μL。
优选的，所述PCR扩增的反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min；共35个循环，72℃延伸10min，降温至16℃。
优选的，所述菌液上清的制备，包括如下步骤：
(1)挑取疑似鸭疫里默氏菌菌株，加入到添加有5％血清的胰蛋白胨大豆肉汤TSB培养液中，37℃摇床中过夜培养；
(2)用移液器吸取步骤1过夜培养的疑似鸭疫里默氏菌1mL，放入到1.5mL的离心管中，100℃加热10min；
(3)将步骤2中1.5mL的离心管放入离心机中，12000转/分钟离心10分钟，取上清。
本发明的第三个目的是通过以下技术方案实现的，基于鸭疫里默氏菌16S rRNA序列的PCR检测试剂盒，所述试剂盒含有如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对。
优选的，基于鸭疫里默氏菌16S rRNA序列的PCR检测试剂盒，可直接从鸭疫里默氏菌液或菌液上清中扩增出特异性片段，其扩增出的特异性片段序列如SEQ ID NO.3所示。
优选的，所述试剂盒含有2倍PCR预混试剂(2×Premix)；
优选的，所述试剂盒还含有阳性对照质粒DNA和阴性对照H2O；
优选的，所述试剂盒采用25μL反应体系，具体为：
优选的，所述质粒DNA阳性对照为鸭疫里默氏菌特异性的702bp的PCR产物与pGM-T载体的重组质粒。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明公开了一种基于鸭疫里默氏菌16S rRNA的简单、快速的鸭疫里默氏菌检测试剂盒及其使用方法，通过该方法检测鸭疫里默氏菌，不需提取细菌的基因组DNA，可直接从鸭疫里默氏菌的菌液或菌液上清中扩增出特异性片段，避免了采用传统鉴定提取DNA的步骤，所需时间短，检测成本低，准确性高，降低了检测成本。本发明的检测靶点具有单一特异性，检测结果特异，结果判定简单。
附图说明
图1，本发明的PCR方法建立检测图；M:DL2000marker 1：702bp特异性扩增产物；2：阴性对照(H20)。
图2，本发明的PCR方法特异性检测图；M:DL2000Marker 1：鸭疫里默氏菌标准株菌液2：大肠杆菌标准株菌液3：沙门氏菌标准株菌液4：鸭疫里默氏菌标准株菌液上清5：大肠杆菌标准株菌液上清6：沙门氏菌标准株菌液上清7：阳性对照(质粒DNA)8：阴性对照(H2O)。
图3，鸭疫里默氏菌PCR检测方法灵敏度评价图；M:DL2000Marker 1：稀释1000000倍的质粒DNA2：稀释100000倍的质粒DNA 3：稀释10000倍的质粒DNA 4：稀释1000倍的质粒DNA5：稀释100的质粒DNA6：稀释10倍的质粒DNA7：质粒DNA原液8：阴性对照(H2O)
图4，鸭疫里默氏菌PCR检测试剂盒应用图；M:DL2000Marker 1：阳性对照(质粒DNA) 2：阴性对照(H2O) 3：鸭疫里默氏菌疑似菌株1菌液 4：鸭疫里默氏菌疑似菌株2菌液5：鸭疫里默氏菌疑似菌株3菌液 6：鸭疫里默氏菌疑似菌株4菌液 7：鸭疫里默氏菌疑似菌株1菌液上清 8：鸭疫里默氏菌疑似菌株2菌液上清 9：鸭疫里默氏菌疑似菌株3菌液上清10：鸭疫里默氏菌疑似菌株4菌液上清；
图5，鸭疫里默氏菌PCR检测试剂盒结构示意图。
具体实施方式
以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。
实例1：鸭疫里默氏菌PCR方法的建立
设计特异性扩增鸭疫里默氏菌的引物对：通过生物信息学分析从Genbank中查找鸭疫里默氏菌标准菌株ATCC 11845的16S rRNA序列(Genbank NO:NR_026025.1)，将之作为鸭疫里默氏菌检测靶基因。
(1)引物设计
将该鸭疫里默氏菌标准菌株ATCC 11845的16S rRNA序列输入到引物设计软件Primer Premier 5.0中设计引物，设置产物大小范围为100-1000bp，从备选引物对中选择出引物，引物序列如下(引物由上海英骏生物技术有限公司合成)：
上游引物：5’-GGAGGCAGCAGTGAGGAATA-3’(SEQ ID NO.1)
下游引物：5’-GGAGGCAGCAGTGAGGAATA-3’(SEQ ID NO.2)
(2)菌液或菌液上清制备
取鸭疫里默氏菌标准株1μL，加入到添加有5％血清的TSB(胰蛋白胨大豆肉汤)培养液中，37℃摇床中过夜培养。用移液器吸取过夜培养的鸭疫里默氏菌1mL，放入到1.5mL的离心管中，100℃加热10min。将装有过夜培养的鸭疫里默氏菌液的1.5mL的离心管放入离心机中，12000转/分钟离心10分钟，取上清。
(3)PCR检测
PCR反应体系为25μL：鸭疫里默氏菌特异性引物对1μL，引物对的工作浓度为10μM；模板(菌液或菌液上清1-2μL)；2倍PCR预混试剂(2×Premix)12μL；ddH2O10-11μL。PCR反应条件为：①94℃变性5min，②94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；③72℃延伸10min。
(4)判断标准
所述判断标准具体为：取PCR扩增产物10μL加2μL 6×loading buffer，在1-2％的琼脂糖凝胶中进行电泳分析，在紫外灯照射下进行观察，如果电泳结果出现相应的702bp单一扩增条带，则说明样品中含有鸭疫里默氏菌；如果没有出现相应的702bp单一扩增条带，则样品中不含有鸭疫里默氏菌。
结果：取PCR扩增产物10μL加2μL 6×loading buffer，采用1-2％的琼脂糖凝胶电泳后，在紫外灯照射下观察到702bp单一扩增条带，说明所建立的PCR方法能检测鸭疫里默氏菌。
实施例2，鸭疫里默氏菌PCR检测试剂盒的特异性
利用实施例1中建立的鸭疫里默氏菌特异性PCR检测方法对鸭疫里默氏菌标准株(ATCC11845)，大肠杆菌标准株(CMCC44102)和沙门氏菌标准株(50336)的菌液和菌液上清进行检测，结果鸭疫里默氏菌菌液和菌液上清均呈阳性，大肠杆菌标准株和沙门氏菌标准株的菌液和菌液上清均呈阴性结果。通过本实施例说明，所建立的鸭疫里默氏菌的PCR检测方法在鉴定细菌中具有属特异性。
实施例3，鸭疫里默氏菌PCR检测方法灵敏度评价
以实施例1获得的702bp产物与pGM-T载体连接并转化获得重组质粒，经过OD260/280的测定，重组质粒浓度为68ng/μL，用无菌水做10倍梯度稀释，共稀释7个梯度，每个梯度分别取1μL加入PCR反应体系，按照实施例1步骤(3)中方法对质粒DNA模板进行PCR扩增检测。取PCR扩增产物10μL，在1％的琼脂糖凝胶中进行电泳，在凝胶成像仪中观察凝胶电泳结果如图3所示。由图3可知，在第3条泳道可以看到清晰的条带，所对应质粒DNA浓度68pg，具有极高的灵敏性。
实施例4，鸭疫里默氏菌PCR检测试剂盒的应用
利用实施例1中建立的鸭疫里默氏菌特异性PCR检测方法对分离的4株疑似鸭疫里默氏菌临床分离株进行检测，同时设阳性对照和阴性对照，比较试验结果。
结果：利用实施例1建立的鸭疫里默氏菌特异性PCR检测方法，4株疑似鸭疫里默氏菌的菌液和菌液上清中均呈阳性结果，经测序并与鸭疫里默氏菌标准株序列比对，测序结果与鸭疫里默氏菌标准株的一致性达99％，通过本实施证明，所建立的鸭疫里默氏菌的特异性PCR方法具有非常高的可靠性。
如图5所示，一种鸭疫里默氏菌PCR检测试剂盒，包括盒体6，盒体6内的试剂包括：鸭疫里默氏菌检测的特异性PCR引物对1、2倍PCR预混试剂2、质粒DNA阳性对照3、阴性对照H2O 4、DNA分子量标准溶液5。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
Claims (7)
1.鸭疫里默氏菌特异性PCR引物对，其核苷酸序列为：
上游引物：5’-GGAGGCAGCAGTGAGGAATA-3’，
下游引物：5’-GGAGGCAGCAGTGAGGAATA-3’；
扩增片段为702bp，用于鸭疫里默氏菌特异性扩增检测，其核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示。
2.鸭疫里默氏菌PCR检测方法，其特征是，所述检测方法为：
(1)利用权利要求1所述的引物对，对待测细菌菌液或待测菌液上清进行PCR扩增；
(2)取PCR扩增产物采用琼脂糖凝胶电泳后，在紫外灯照射下观察，如果得到702bp单一扩增条带，表明待测样品中含有鸭疫里默氏菌，否则，表明待测样品中无鸭疫里默氏菌。
3.根据权利要求2所述的鸭疫里默氏菌PCR检测方法，其特征是，所述PCR扩增反应体系为25μL：鸭疫里默氏菌特异性引物对1μL，引物对的工作浓度为10μM；待测样品模板1-2μL；2倍PCR预混试剂12μL；ddH2O10-11μL。
4.根据权利要求2所述的鸭疫里默氏菌PCR检测方法，其特征是，所述PCR反应条件为：①94℃变性5min，②94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；③72℃延伸10min。
5.根据权利要求2所述的鸭疫里默氏菌PCR检测方法，其特征是，所述菌液上清的制备，包括如下步骤：
(1)挑取疑似鸭疫里默氏菌菌株，加入到添加有5％血清的胰蛋白胨大豆肉汤TSB培养液中，37℃摇床中过夜培养；
(2)用移液器吸取步骤1过夜培养的疑似鸭疫里默氏菌1mL，放入到1.5mL的离心管中，100℃加热10min；
(3)将步骤2中1.5mL的离心管放入离心机中，12000转/分钟离心10分钟，取上清。
6.一种鸭疫里默氏菌PCR检测试剂盒，包括盒体，其特征是，所述盒体内的试剂包括：(1)权利要求1所述的鸭疫里默氏菌检测的特异性PCR引物对；(2)2倍PCR预混试剂；(3)质粒DNA阳性对照；(4)阴性对照H2O；(5)DNA分子量标准溶液。
7.根据权利要求6所述的一种鸭疫里默氏菌PCR检测试剂盒，其特征是，所述质粒DNA阳性对照为鸭疫里默氏菌特异性的702bp的PCR产物与pGM-T载体的重组质粒。
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| CN201910555249.1A CN110117671A (zh) | 2019-06-25 | 2019-06-25 | 鸭疫里默氏菌特异性pcr引物对、pcr检测方法及试剂盒 |
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Cited By (3)
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|---|---|---|---|---|
| CN110551801A (zh) * | 2019-09-11 | 2019-12-10 | 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 | 一种鉴定2型鸭疫里默氏菌是否对氟喹诺酮类药物耐药的方法 |
| CN110846425A (zh) * | 2019-11-20 | 2020-02-28 | 四川农业大学 | 血清1型、2型和11型鸭疫里默氏菌的pcr鉴定引物、试剂盒及多重pcr鉴定方法 |
| CN111286552A (zh) * | 2020-03-13 | 2020-06-16 | 广东省农业科学院动物卫生研究所 | 一种鉴别鸭疫里默氏杆菌野毒株和疫苗株的pcr-hrm引物及方法 |
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2019
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