CN107964526A

CN107964526A - 一株鸭疫里默氏杆菌的减毒突变株及其应用

Info

Publication number: CN107964526A
Application number: CN201710949245.2A
Authority: CN
Inventors: 于圣青; 王小兰; 任晓梅; 丁铲; 王少辉
Original assignee: Shanghai Veterinary Research Institute CAAS
Current assignee: Shanghai Veterinary Research Institute CAAS
Priority date: 2017-10-12
Filing date: 2017-10-12
Publication date: 2018-04-27

Abstract

本发明提供了一株鸭疫里默氏杆菌的减毒突变株及其作为弱毒活疫苗候选株的应用，其中的减毒突变株命名为Yb2ΔbioF，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为：CGMCC No.14236，运用Yb2ΔbioF制备的弱毒活疫苗免疫7日龄樱桃谷鸭，采用免疫剂量为2×10⁹CFU一次免疫可以获得90％的免疫保护率，采用免疫剂量为1×10⁹CFU两次免疫可以获得100％的免疫保护率，免疫原性好，并且无致病力，表明该减毒突变株可以作为鸭疫里默氏杆菌弱毒活疫苗的候选菌株，能应用于制备防治鸭疫里默氏杆菌的疫苗，而制备出的弱毒活疫苗能用于制备用于预防鸭疫里默氏杆菌感染的制品。

Description

一株鸭疫里默氏杆菌的减毒突变株及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株鸭疫里默氏杆菌的减毒突变株及其作为弱毒活疫苗候选株的应用。

背景技术

鸭疫里默氏杆菌(Riemerellaanatipestifer)可感染鸭、鹅、火鸡、鹌鹑等多种鸟类引起高致病性、接触传染性疾病。在自然状态下以家鸭最易感，家鸭感染后，以纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎等广泛的纤维素性炎症为临床特征。本病在世界各地广泛分布，具有较高的发病率和死亡率，是引起养鸭业重大经济损失的主要传染病之一。

近年来，我国鸭疫里默氏杆菌感染呈上升和动态变化趋势，而本病的防治主要依靠抗生素治疗，使用药物防治导致大量耐药菌株的出现和动物体内的药物残留，因此，疫苗免疫是控制本病发生与传播最有效的手段。国内对于鸭疫里默氏杆菌疫苗的研究多集中于灭活疫苗，如鸭传染性浆膜炎灭活疫苗，鸭疫里默氏杆菌三价灭活疫苗等。

但是，灭活疫苗存在接种剂量大、免疫接种部位吸收不完全等缺陷，而弱毒疫苗能刺激机体快速产生细胞及体液免疫作用，一次免疫就可以产生较长时间的免疫保护力。

bioF基因编码7-酮基-8氨基壬酸合成酶，催化生物素合成保守途径的第一步反应。生物素是生物体内一些必须酶(丙酮酸羧化酶、酰基辅酶A羧化酶等)的辅因子，参与脂肪酸合成、糖质新生和氨基酸代谢等途径。迄今，对鸭疫里默氏杆菌bioF基因及其突变株对细菌毒力的影响未见报道。

发明内容

本发明提供一株鸭疫里默氏杆菌的减毒突变株及其作为弱毒活疫苗候选株的应用，以提供快速、免疫原性好、无致病力的弱毒菌株，从而能更好地防治鸭疫里默氏杆菌的感染。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

本发明提供了一株鸭疫里默氏杆菌的减毒突变株，命名为Yb2 ΔbioF，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为：CGMCC No.14236。

本发明提供的减毒突变株，还具有这样的特征：其中，减毒突变株的bioF基因由于转座子Tn4351的插入而导致失活。

进一步的，本发明还提供了一种上述的减毒突变株在疫苗制备中的应用。

进一步的，本发明还提供了一种包含上述减毒突变株的弱毒活疫苗。

本发明提供的弱毒活疫苗，还具有这样的特征：其中，弱毒活疫苗中，减毒突变株的抗原含量大于等于1×10⁹CFU/mL。

进一步地，本发明还提供了一种上述的弱毒活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，将冻存的减毒突变株Yb2ΔbioF 的菌种培养后作为种子液；步骤2，按种子液与灭菌培养基的体积比为3-5:100向灭菌培养基中培养后进行离心收集洗涤得到菌体；步骤 3，采用无菌PBS将菌体调整为含菌量大于等于1×10⁹CFU/ml的细菌悬液，即为弱毒活疫苗。

本发明提供的制备方法，还具有这样的特征：其中，步骤1中的培养条件为：温度为37℃，振荡频率为200转/分钟，培养时间为8-12 h。

本发明提供的制备方法，还具有这样的特征：其中，步骤2中的培养条件为：温度为37℃，振荡频率为200转/分钟，培养时间为8-12 h。

本发明提供的制备方法，还具有这样的特征：其中，步骤2中的离心条件为：温度为4℃，离心力为4000×g，离心时间为5分钟。

进一步地，本发明还提供了一种上述弱毒活疫苗在制备预防鸭疫里默氏杆菌感染的制品中的应用。

发明作用与效果

根据本发明构建提供的鸭疫里默氏杆菌的Yb2ΔbioF减毒突变株，相对于野生型菌株Yb2具有明显的低毒性，所以以该弱毒菌株制备的疫苗不仅可以刺激雏鸭产生体液免疫，而且可以刺激雏鸭产生细胞免疫，能有效地预防国内养鸭地区流行的血清2型鸭疫里默氏杆菌感染，可见该弱毒菌株是免疫原性好、无致病力的弱毒菌株，所以能用于制备用于预防鸭疫里默氏杆菌感染的疫苗。

附图说明

图1为实施例一中涉及的减毒突变株的鉴定结果。

图2为生长曲线测定。在TSB培养基中培养，Yb2ΔbioF株在对数生长期的生长速度显著低于野生株Yb2，TSB中添加1μg/ml生物素后其生长速度可达到野生株水平。(*,p<0.05,***,p<0.001)

图3为血液载菌量测定。Yb2和Yb2ΔbioF分别以1×10⁷CFU的剂量感染18日龄樱桃谷鸭，于感染后6h、12h、24h和36h检测感染鸭血液载菌量。自感染后12h起，Yb2ΔbioF感染雏鸭的血液载菌量显著低于野生株Yb2。(**,p<0.01)

图4为安全性评价。Yb2ΔbioF经体外连续传代30代后以2.5×10¹⁰ CFU剂量感染18日龄樱桃谷鸭，于感染后第7天进行剖解观察和组织切片观察，结果显示感染鸭心、肝、脾组织未见眼观可见病变和组织病变。A:各组织器官的眼观特征；B：各组织器官的组织学观察；a：正常健康、未攻毒对照组，b：Yb2ΔbioF攻毒组。

图5为免疫血清抗体水平测定。用野生株Yb2全菌蛋白作为抗原包被酶标板，间接ELISA方法检测雏鸭经一次免疫或两次免疫后血清抗体水平。一次免疫后14天雏鸭血清抗体效价为1：2400，二次免疫后14天血清抗体效价可达1：4200，未接种疫苗组的血清ELISA效价约为1：100。(***,p<0.001)

图6为疫苗免疫后血清中细胞因子量变化。二次免疫后24h、48h 和72h用ELISA试剂盒检测雏鸭血清中细胞因子水平。Yb2ΔbioF免疫后雏鸭产生较高水平的IL-10，IFNγ，IL-4和IL-2，与对照组相比差异显著。(*,p<0.05,**,p<0.01)

具体实施方式

以下结合附图来说明本发明的具体实施方式。对于实施例中所用到的具体方法或材料，本领域技术人员可以在本发明技术思路的基础上，根据已有的技术进行常规的替换选择，而不仅限于本发明实施例的具体记载。

实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例一减毒突变株的筛选及转座子插入位点的鉴定

鸭疫里默氏杆菌Yb2随机突变株文库由中国农业科学院上海兽医研究所畜禽细菌性传染病创新团队构建。

将Yb2随机突变文库的菌株复苏后振荡培养至对数生长前中期，灭菌磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后将菌液稀释至含菌量为1×10⁷ CFU/0.5ml，分别腿部肌肉接种14-21日龄樱桃谷鸭，获得不能感染雏鸭引起发病的减毒突变株，命名为Yb2ΔbioF，分类命名为鸭疫里默氏杆菌Riemerella anatipestifer，于2017年6月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCCNo.14236。

图1为实施例一中涉及的减毒突变株的鉴定结果。

在图1中，A为转座子Tn4351插入鸭疫里默氏杆菌Yb2的bioF基因的模式图，图中：bioF：鸭疫里默氏杆菌Yb2的bioF基因； AS87_RS09160和AS87_RS09165：鸭疫里默氏杆菌Yb2的bioF基因上游邻近开放阅读框。AS87_RS09175和AS87_RS09180：鸭疫里默氏杆菌Yb2的bioF基因下游邻近开放阅读框；Tn4351：转座子Tn4351插入序列。

如图1中A所示，Southern blotting鉴定结果表明，上述Yb2ΔbioF 减毒突变株中，转座子Tn4351在Yb2基因组中为单次插入，插入位点为bioF(Gene tag:AS87_RS09170)基因的749bp。

PCR鉴定减毒突变株Yb2ΔbioF。取对数生长期新鲜菌液，参考细菌DNA提取试剂盒说明书进行基因组DNA的提取。分别以突变株Yb2ΔbioF和野生株Yb2基因组DNA为模板，PCR扩增转座子上 ermF基因、鸭疫里默氏杆菌16S rRNA基因和bioF基因。

在图1中，B为：对本实施例涉及的减毒突变株Yb2ΔbioF的 PCR鉴定。M：DNAmarker DM2000；泳道1：PCR扩增Yb2ΔbioF ermF(833bp)和16S rRNA(496bp)基因片段，不能扩增1,158bp bioF基因片段；泳道2：PCR扩增野生株Yb2bioF(1,158bp)和16S rRNA(496bp)基因片段；泳道3：阴性对照。

如图1中B所示，PCR结果与预期一致，在Yb2ΔbioF中能扩增到833bp的ermF基因和496bp的16S rRNA基因，不能扩增到 1,158bp的bioF基因；在野生株Yb2中，能扩增到1,158bp的bioF 基因和496bp的16S rRNA基因。

表1本发明所用的引物

引物名称	序列	来源
			bioF-F	5’-ATGAATATTCCCAAAAGATTGTTAGAT-3’	本研究
bioF-R	5’-TTATTTCTTTAAATTAGAAATGATAAAATTGTGGGC-3’	本研究
			16S rRNA-F	5’-GGAGGCAGCAGTGAGGAATA-3’	本研究
16S rRNA-R	5’-ATCGTTTACGGCGTGGACTA-3’	本研究
			ermF-F	5’-GCCCGAAATGTTCAAGTTGT-3’	本研究
ermF-R	5’-CTTGACAACCACCCGACTTT-3’	本研究

实施例二Yb2ΔbioF表型特征及生长曲线测定

Yb2ΔbioF在TSB和胰蛋白胨大豆琼脂平板(TSA)培养基中均可生长，在TSA平板可生长出圆形微突起、透明、边缘整齐的小菌落。将各菌株培养至对数生长前中期(OD₆₀₀≈1.0)，按照1:100的比例分别接种至10mL TSB培养基和含1μg/ml生物素的TSB培养基中，37℃200rpm培养18h，每隔2h从各个培养的培养中取样基测定细菌的OD₆₀₀值，各个培养基中每种菌株重复三次，计算平均值，分别绘制生长曲线。

图2为本实施例涉及的减毒突变株Yb2ΔbioF的生长曲线测定。

如图2，在TSB培养基中培养，Yb2ΔbioF株在对数生长期的生长速度显著低于野生株Yb2，TSB中添加1μg/ml生物素后其生长速度可达到野生株水平。(*,p<0.05,***,p<0.001)。

实施例三Yb2ΔbioF毒力测定及安全性评价

将实施二中相应的Yb2和Yb2ΔbioF各菌株培养至对数生长前中期，用灭菌PBS稀释至不同含菌量后接种18日龄樱桃谷鸭，改良冦氏法计算各菌株的LD₅₀。Yb2ΔbioF和野生株Yb2的LD₅₀依次分别为：8.22×10¹⁰CFU和1.07×10⁵CFU，表明Yb2ΔbioF毒力减弱约 768,000倍。

为确定bioF是否参与鸭疫里默氏杆菌进入宿主血液循环建立全身感染，检测了各菌株接种18日龄樱桃谷鸭的血液载菌情况：Yb2 和Yb2ΔbioF分别以1×10⁷CFU的剂量感染18日龄樱桃谷鸭，于感染后6h、12h、24h和36h检测感染鸭血液载菌量。

图3为对本实施例进行感染鸭血液载菌量检测得到的检测结果。

如图3所示，自感染后12h起，Yb2ΔbioF感染雏鸭的血液载菌量显著低于野生株Yb2。(**,p<0.01)Yb2ΔbioF和野生株Yb2感染樱桃谷鸭6h后，血液中分离到的细菌数量无显著差异；随着感染时间的延长，Yb2ΔbioF感染雏鸭的血液载菌量逐渐减少，36h后血液含菌量约124CFU/mL，而野生株Yb2感染雏鸭的血液载菌量逐渐增多，36h后血液含菌量高达1.83×10⁶CFU/mL。

将复苏后的Yb2ΔbioF在TSB和TSA上交替传代30次，每隔 10代对其菌株的形态、生化反应特性(尿素分解为阳性；柠檬酸盐利用、硝酸盐还原、硫化氢产生试验为阴性；不发酵葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、山梨糖；液化明胶)、分子生物学特性(PCR扩增16S rRNA,ermF基因均为阳性，PCR扩增bioF基因为阴性)以及对易感日龄樱桃谷鸭的致病性进行鉴定，表明Yb2ΔbioF在体外连续传代30 次后各种特性均不发生变化，其致病性未见返强(如表2)。

表2 Yb2ΔbioF株遗传稳定性测定结果

^a：各代次Yb2ΔbioF株生化特性均保持一致，表格中仅以尿素分解试验作为阳性反应代表，柠檬酸盐利用试验作为阴性反应代表。

+：阳性；-：阴性。

Yb2ΔbioF经体外连续传代30代后以2.5×10¹⁰CFU剂量感染18 日龄樱桃谷鸭，于感染第7天后，雏鸭精神状态、采食饮水、生活习性等均正常，剖检感染鸭未见心、肝、脾有任何眼观病变，组织学检查也未见任何病变。

图4为对实施例三中涉及减毒突变株Yb2ΔbioF的安全性评价。

在图4中，A:各组织器官的眼观特征；B：各组织器官的组织学观察；a：正常健康、未攻毒对照组，b：Yb2ΔbioF攻毒组。

于感染7天后，进行剖解观察和组织切片观察，如图4所示，结果显示感染鸭心、肝、脾组织未见眼观可见病变和组织病变。

实施例四鸭疫里默氏杆菌弱毒疫苗的制备及检验

(1)Yb2ΔbioF弱毒活疫苗的制备

步骤1，将冻存的减毒突变株Yb2ΔbioF的菌种培养后作为种子液，具体包括：

步骤1.1，将冻存的减毒突变株Yb2ΔbioF的菌种接种于含50

μg/ml卡那霉素和0.5μg/ml红霉素的胰蛋白胨大豆肉汤中培养后得到初步培养物，这里的培养条件为：温度为37℃，振荡频率为200 转/分钟，培养时间为8-12h；

步骤1.2取初步培养物划线培养于含50μg/ml卡那霉素和 0.5μg/ml红霉素的TSA平板生长得到菌落群；

步骤1.3，从菌落群中挑取菌落形态典型的单菌落接种于胰蛋白胨大豆肉汤培养后作为种子液。

步骤2，按种子液与灭菌培养基的体积比为3-5:100向灭菌培养基中培养后进行离心收集洗涤得到菌体，具体包括：

步骤2.1，新鲜配制胰蛋白胨大豆肉汤的液体培养基，灭菌后按所述种子液与液体培养基的体积比为3-5:100接入种子液，然后培养得到二次培养物，这里的培养条件为：温度为37℃，振荡频率为200 转/分钟，培养时间为8-12h；

步骤2.2，对二次培养物进行离心收集后用无菌PBS洗涤，然后再次离心收集得到菌体，这里的两次离心的条件均为：温度为 4℃，离心力为4000×g，离心时间为5分钟。

步骤3，用PBS将菌体调整为含菌量大于等于4×10⁹CFU/ml 的细菌悬液，即为弱毒活疫苗。

(2)免疫接种

将40羽7日龄樱桃谷鸭随机分成4组，10羽/组。组1和组3作为免疫组，组1腿部肌肉注射0.25ml(2×10⁹CFU)免疫一次；组3 腿部肌肉注射0.25ml(1×10⁹CFU)免疫两次，免疫间隔7天。组2 和组4作为对照组，接种相同剂量无菌PBS。

(3)血清抗体水平检测

首次免疫及二次免疫后14天分别颈静脉采血分离血清，以野生株Yb2全菌蛋白作为抗原包被酶标板，间接ELISA方法检测抗体水平。具体操作流程为：对数生长期Yb2菌液用PBS洗3次，以碳酸盐缓冲液稀释至10⁸CFU/mL，50μL/孔包被经2.5％戊二醛溶液活化的酶标板，50℃烘干；用PBST洗3次，加入200μL/孔封闭液，37℃ 封闭2h；洗涤后加入分别作1：400～1：12800倍倍比稀释的待检血清，100μL/孔各加样3孔，37℃作用1.5h；洗涤后加入1：1000稀释的山羊抗鸭IgG-HRP，100μL/孔，37℃作用1.0h；用PBST洗3 次，加入TMB底物溶液，100μL/孔，避光显色15min，加入终止液 50μL/孔，轻拍混匀，用酶标仪测OD₄₅₀值。未免疫鸭血清以及血清 2型鸭疫里默氏杆菌标准阳性血清分别用作阴性、阳性血清对照。

用野生株Yb2全菌蛋白作为抗原包被酶标板，间接ELISA方法检测雏鸭经一次免疫或两次免疫后血清抗体水平。

图5为实施例四的免疫血清抗体水平测定结果。

如图5所示，一次免疫后14天雏鸭血清抗体效价为1：2400，二次免疫后14天血清抗体效价可达1：4200，未接种疫苗组的血清 ELISA效价约为1：100。(***,p<0.001)，说明雏鸭经一次免疫或两次免疫后，Yb2ΔbioF弱毒活疫苗均能刺激机体产生较高的抗体水平。

(4)血清细胞因子水平检测

二次免疫后24h、48h和72h，分别颈静脉采集分离各实验组鸭血清，参考鸭细胞因子ELISA检测试剂盒说明书定量检测血清中Th1 型细胞因子(IL-2和IFNγ)和Th2型细胞因子(IL-4和IL-10)水平的变化。检测前将待测血清样品用样品稀释液稀释5倍，样品稀释液用作空白对照。反应后用酶标仪测各孔OD₄₅₀值。以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样品浓度值。

图6为实施例四中进行疫苗免疫后血清中细胞因子量变化图。

如图6所示，二次免疫后24h和48h，Yb2ΔbioF免疫后雏鸭产生较高水平的机体产生高水平的IL-10；免疫后48h和72h，机体产生高水平的IFN-γ和IL-4；免疫后72h，机体产生高水平的IL-2，表明疫苗免疫后显著地引起了细胞免疫应答和体液免疫应答。(*, p<0.05,**,p<0.01)

(5)攻毒保护试验

一次免疫或二次免疫后14天，用1×10⁷CFU/羽Yb2菌液腿部肌肉注射攻毒，0.5ml/羽，观察记录攻毒后1周内发病死亡情况，并统计分析免疫保护率。结果如表3所示，雏鸭经一次免疫和二次免疫后，均可获得较好的针对鸭疫里默氏杆菌强毒攻击的免疫保护力，其中，雏鸭经一次免疫后对Yb2强毒攻击保护率为90％，经两次免疫后对 Yb2强毒攻击保护率高达100％；相比之下，未免疫雏鸭在鸭疫里默氏杆菌强毒攻击后没有任何抵抗力，感染鸭全部发病死亡。

表3弱毒活疫苗Yb2ΔbioF的免疫保护效果

从实施例一至实施例四可见，通过动物实验筛选Yb2随机突变株文库，获得了一株减毒突变株，转座子Tn4351插入位点是Yb2基因组的bioF基因，命名该减毒突变株为Yb2ΔbioF。应用18日龄樱桃谷鸭对Yb2ΔbioF的毒力进行检测，其LD₅₀为8.22×10¹⁰CFU，表明其毒力下降768,000倍。并且，Yb2ΔbioF感染18日龄樱桃谷鸭后，在雏鸭体内的增殖能力显著低于野生株Yb2。运用Yb2ΔbioF制备的弱毒活疫苗免疫7日龄樱桃谷鸭，采用免疫剂量为2×10⁹CFU一次免疫可以获得90％的免疫保护率，采用免疫剂量为1×10⁹CFU两次免疫可以获得100％的免疫保护率，免疫原性好，并且无致病力，表明该减毒突变株可以作为鸭疫里默氏杆菌弱毒活疫苗的候选菌株，能应用于制备防治鸭疫里默氏杆菌的疫苗，而制备出的弱毒活疫苗能用于制备用于预防鸭疫里默氏杆菌感染的制品。

Claims

1.一株鸭疫里默氏杆菌的减毒突变株，命名为Yb2ΔbioF，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为：CGMCC No.14236。

2.根据权利要求1所述的减毒突变株，其特征在于：

其中，所述减毒突变株的bioF基因由于转座子Tn4351的插入而导致失活。

3.根据权利要求1或2所述鸭疫里默氏杆菌的减毒突变株在疫苗制备中的应用。

4.一种包含权利要求1或2所述减毒突变株的弱毒活疫苗。

5.根据权利要求4所述的弱毒活疫苗，其特征在于：

其中，所述弱毒活疫苗中，所述减毒突变株的抗原含量大于等于1×10⁹CFU/mL。

6.一种权利要求4或5所述弱毒活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1，将冻存的减毒突变株Yb2ΔbioF的菌种培养后作为种子液；

步骤2，按所述种子液与灭菌培养基的体积比为3-5:100向所述灭菌培养基中培养后进行离心收集洗涤得到菌体；

步骤3，采用无菌PBS将所述菌体调整为含菌量大于等于1×10⁹CFU/ml的细菌悬液，即为所述弱毒活疫苗。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：

其中，步骤1中的培养条件为：温度为37℃，振荡频率为200转/分钟，培养时间为8-12h。

8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：

其中，步骤2中的培养条件为：温度为37℃，振荡频率为200转/分钟，培养时间为8-12h。

9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：

其中，步骤2中的离心条件为：温度为4℃，离心力为4000×g，离心时间为5分钟。

10.根据权利要求4或5所述的弱毒活疫苗在制备预防鸭疫里默氏杆菌感染的制品中的应用。