CN102125687B - 鸭传染性浆膜炎二价灭活疫苗的生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种鸭传染性浆膜炎二价灭活疫苗的生产方法。本本发明所涉及的疫苗是采用免疫原性良好的鸭疫里默氏杆菌1型YBYN株、2型YBSD株分别接种于适宜培养基，收获培养物，经甲醛溶液灭活后，加入油佐剂混合乳化制成。用于预防由1型和2型鸭疫里默氏杆菌引起的鸭传染性浆膜炎。此疫苗具有安全性好、免疫效力高且免疫期长等优点。

Description

鸭传染性浆膜炎二价灭活疫苗的生产方法

技术领域

本发明涉及一种用于预防由1、2型鸭疫里默氏杆菌引起的鸭传染性浆膜炎的油乳剂疫苗制备方法，属于兽用生物制品领域。

背景技术

鸭传染性浆膜炎是由鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer，RA))引起鸭的一种呼吸系统重要传染病。鸭传染性浆膜炎(Infectious serositis)是由鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer，RA)引起的鸭的一种慢性或急性败血性接触性传染性疾病，又称鸭疫里默氏杆菌病、新鸭病、鸭败血症、鸭疫综合症。主要侵害雏鸭、雏鹅、以及雏火鸡等多种雏禽，以2～7周龄鸭最易感，主要表现为浆膜炎、纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、脑膜炎等。由于本病的高死亡率和高淘汰率目前已经成为严重危害养鸭业的疾病之一。

对鸭疫里默氏杆菌的血清型分类始于1969年，Harry采用试管凝集试验鉴定出16个血清型(A～P)，几年后美国国立动物疾病中心采用沉淀试验鉴定出7个血清型，以阿拉伯数字命名为1～7型，考虑到命名的标准化以及将来新型的增加，1982年Bisgarrd建议用阿拉伯数字对血清型进行命名，将已有的血清型命名为1～13型。在此基础上Sandhu和Leister对血清型重新进行整理，加上新发现的血清型取名为1～17型，加上后来Lon等报道的18、19型和Pathansophon等报道的20、21型，至此世界上报道的RA血清型共有21型。2003年我国四川农业大学程安春教授等报道了22～25四个新的血清型，进一步丰富了该病的病原学的研究。由于各型毒力有所差异，型间交叉保护性极差或缺少，因此对某地区本病的预防，最好方法是制备与当地相关型疫苗，才能获得最佳的免疫效果。(1、程安春，等.我国鸭疫里默氏杆菌血清型调查及新血清型的发现[J].中国畜牧兽医学会禽病学分会第十一次学术研讨会论文集，2004，453-457.)。

发明内容

本发明的目的是采用免疫原性良好的鸭疫里默氏杆菌1型YBYN株、2型YBSD株分别接种于适宜培养基，收获培养物，经甲醛溶液灭活后，加入油佐剂混合乳化制成。用于预防由1型和2型鸭疫里默氏杆菌引起的鸭传染性浆膜炎。

一、生产用菌株

1.菌株来源

制造和检验用鸭疫里默氏杆菌1型YBYN株、2型YBSD株由本发明人分离、鉴定、保存和供应，该两株已于2011年2月25日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号：YBSD株为CGMCC No.4614，YBYN株为CGMCC No.4615。

2.毒株特点

(1)形态 本菌为革兰氏阴性(G-)小杆菌，有荚膜、无芽孢、无鞭毛，常单个存在，少数呈双排列，偶见呈长丝状排列，涂片经瑞氏染色，可见部分菌体两端浓染。

(2)生化特性 过氧化氢酶、氧化酶、精氨酸脱羧酶试验为阳性，能缓慢液化明胶，靛基质、VP、甲基红、柠檬酸利用、硝酸盐还原试验为阴性，不产生硫化氢，不发酵葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖。

(3)培养特性 本菌在普通琼脂培养基和麦康凯培养基上不生长。初次分离培养，需要供给5％～10％的CO₂。将本菌接种于巧克力琼脂、含3％小牛血清的胰蛋白胨大豆琼脂(改良TSA配方见附注2)，置5％～10％CO₂、37℃培养24～48小时，可生长出圆形微隆起、表面光滑、直径1～2mm无色素菌落。在5％绵羊鲜血琼脂平板上生长但不溶血。在含有3％小牛血清的胰蛋白胨大豆肉汤培养基中，37℃培养24小时，呈上下一致轻微浑浊，管底有少量沉淀，无菌膜。

(4)血清型 YBYN株为鸭疫里默氏杆菌1型、YBSD株为鸭疫里默氏杆菌2型。

(5)最小致病菌量 能使10只1月龄健康易感鸭至少7只发病的最小致病菌量分别为：YBYN株为1×10⁹CFU，YBSD株为2×10⁸CFU。

(6)免疫原性用鸭疫里默氏杆菌YBYN、YBSD株灭活菌液按水相∶油相＝1∶2的比例分别制备单价油乳剂灭活疫苗(灭活前各型活菌含量约为1×10⁹CFU/ml)，分别颈部皮下注射3-7日龄健康易感鸭10只，0.3ml/只，另设两个非免疫对照组，每组各10只。免疫后14日，连同相同饲养条件下的对照鸭各一组，分别用相应的YBYN株、YBSD株新鲜菌液腿部肌肉注射攻毒1ml(YBYN株活菌含量约为2×10⁹CFU/ml，YBSD株活菌含量约为4×10⁸CFU/ml)，观察10日，每株菌攻毒后对照组应至少8只发病(发病判定标准详见附注1)，免疫组应至少8只保护。

二、鸭疫里默氏杆菌二价灭活疫苗的生产方法，主要是：

1.采用发酵罐分别培养YBYN菌株、YBSD菌株。先将半合成肉汤培养基(胰蛋白胨大豆肉汤粉5g、氯化钠5g、牛肉浸膏5g、水解乳蛋白5g、7水硫酸镁0.5g、琼脂粉12g、溶于1000ml无离子水中，加热溶化后调pH至7.0～7.2，121℃高压20min后，待冷却至55℃左右，按无菌要求加入经抽滤无菌的1％维生素B₁1ml。对发酵罐进行灭菌，待温度降至37～38℃时，将2～8℃保存的二级种子液分别按2％～2.5％加入到发酵罐内。培养温度控制在37～38℃，搅拌转速为100～200r/min，pH为7.2，罐压为0.03～0.05Pa，容氧量为40％，培养9～10小时收获，留样检验，置2～8℃保存，不超过5日。

2.根据活菌计数结果，将灭活的鸭疫里默氏杆菌1、2型菌液均稀释成约6×10⁹CFU/ml后等量混合。

3.按常规方法制备成油乳剂灭活疫苗。

本发明的详细描述

一、疫苗制备

1.生产用种子制备

(1)一级种子繁殖与鉴定 将YBYN株、YBSD株的冻干菌种分别接种于巧克力琼脂平板上，置5％～10％CO₂、37℃培养20小时，选典型菌落接种于含3％小牛血清的TSA琼脂斜面，37℃培养24小时，然后接种于TSA肉汤，37℃振荡培养24小时，按15％加入灭菌甘油混匀，定量分装，注明菌株名称、装量、分装日期，经纯粹检验合格后，作为一级种子，-20℃保存，保存期不超过3个月。

(2)二级种子繁殖 将一级种子划线接种到3％小牛血清的TSA琼脂平板，37℃培养24小时，挑选典型菌落(或菌苔)接种于TSA肉汤，37℃振荡培养24小时，经纯粹检验后，作为二级种子。在2～8℃保存，应不超过48小时。

2.菌液培养 采用发酵罐分别培养YBYN菌株、YBSD菌株。先将半合成肉汤培养基进行灭菌，待温度降至37～38℃时，将2～8℃保存的二级种子液分别按2％～2.5％加入到发酵罐内。培养温度控制在37～38℃，搅拌转速为100～200r/min，pH为7.2，罐压为0.03～0.05Pa，容氧量为40％，培养9～10小时收获，留样检验，置2～8℃保存，不超过5日。

3.活菌计数 取培养9～10h的菌液1ml，按(中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二○○五年版(三部).中国农业出版社，2006，本发明简称《中国兽药典》)附录方法进行活菌计数，各型活菌含量均应不低于6×10⁹CFU/ml。

4.灭活 将检验合格的菌液导入灭活罐中，按菌液体积的0.3％加入甲醛溶液，37℃搅拌灭活20小时，置2～8℃保存，不超过7日。

5.疫苗制备

(1)水相配制 取灭菌的吐温-804份、无菌检验合格的菌液96份，导入配液罐中，开启搅拌电机，匀速搅拌至吐温-80完全溶解。

(2)油相制备 取注射用白油94份、司本-806份和硬脂酸铝1份加入油相制备罐中，开启搅拌电机，匀速搅拌，同时开启导热油开关，125℃加热30min，冷却后，导入贮油罐中备用。

(3)乳化 取油相2份置于乳化罐内，开动电机低速搅拌，同时缓缓加入水相1份，再以4000r/min乳化30min。乳化后，取样10ml，以3000r/min离心15min，应不分层；若有分层现象，应重新乳化1次。

(4)分装 定量分装，加盖密封。

二、疫苗的安全试验

1.鸭传染性浆膜炎二价灭活疫苗对靶动物的一次单剂量接种的安全性试验 用本发明人按本法试制的200801、200802、200803三批鸭疫里默氏杆菌二价灭活疫苗对3～7日龄健康易感鸭(购自青岛平度)进行一次单剂量接种安全性试验，0.3ml/只，观察14日，记录疫苗接种对试验鸭的安全性。试验结果表明，本实验室试制的200801、200802、200803批疫苗接种后，试验鸭的精神、饮食与对照鸭无明显差异，接种后14日疫苗吸收良好。说明我们试制的疫苗一次单剂量接种3～7日龄健康易感鸭是安全的(详见表1)。

表1试验鸭一次单剂量接种安全性试验结果

2.对靶动物一次超剂量接种的安全性试验

用本发明人试制的3批(200801、200802、200803)鸭传染性浆膜炎二价灭活疫苗按颈部皮下注射和胸部肌肉注射两种接种途径对3日龄、5日龄、7日龄健康肉鸭分别进行一次超剂量接种，0.6ml/只，同时也对8日龄、10日龄、15日龄健康蛋鸭分别按两种接种途径进行一次超剂量接种，1.0ml/只，观察14日，记录疫苗接种试验鸭的安全性。同时继续观察接种蛋鸭至产蛋，观察接种鸭和对照鸭产蛋率是否存在明显差别。试验结果表明，本实验室试制的3批疫苗按此两种接种途径超剂量接种，对3～7日龄肉鸭和8～15日龄蛋鸭均无明显不良反应，14日疫苗吸收良好，试验鸭增重与对照鸭无明显差异。继续观察接种蛋鸭至产蛋，接种鸭和对照鸭的产蛋率也未见明显差别。说明我们试制的3批疫苗按不同途径对肉鸭和蛋鸭一次超剂量接种都是安全的(详见表2)。

表2试验肉鸭一次超剂量接种安全性试验结果

3.单剂量重复接种安全试验

用本发明人试制的200801批鸭疫里默氏杆菌二价灭活疫苗对3～7日龄健康易感鸭进行颈部皮下接种，0.3ml/只，于接种后14日、28日再重复注射2次，记录疫苗接种对试验鸭的安全性。试验结果表明，本实验室试制的疫苗单剂量重复接种后，试验鸭的精神、饮食与对照鸭无明显差异。说明我们试制的疫苗单剂量重复接种3～7日龄健康易感鸭是安全的。详见表3

表3试验鸭单剂量重复接种安全性试验结果

4.疫苗接种对靶动物免疫学功能的影响

用本发明人试制的200801批鸭传染性浆膜炎二价灭活疫苗接种60日龄健康易感鸭，同时接种鸭瘟活疫苗，观察我们制备的疫苗对鸭瘟活疫苗的免疫效力有无影响。试验结果表明，试验鸭无论单独接种鸭瘟活疫苗，还是接种鸭瘟活疫苗后再接种我们研制的鸭传染性浆膜炎二价灭活疫苗，免后14日后所产生攻毒保护效力没有明显差异。该试验结果表明，我们研制的疫苗对试验鸭的免疫学功能没有明显影响。详见表4

表4疫苗接种对鸭子免疫学功能影响结果

注：/表示未进行试验

5.疫苗对非使用日龄试验动物的安全性试验

为了检验疫苗对非使用日龄试验动物的安全性，用本发明人试制的200801批鸭传染性浆膜炎二价灭活疫苗对1日龄健康蛋鸭进行了安全性试验。试验结果表明：疫苗对1日龄健康蛋鸭接种存在一定的不良反应。详见表5

表5 1日龄试验鸭接种安全性试验结果

三、鸭传染性浆膜炎二价灭活疫苗的交叉保护试验

为了确定本发明人试制的鸭传染性浆膜炎二价灭活疫苗的免疫交叉保护性，分别用鸭疫里默氏杆菌(简称RA)制苗菌株YBYN(RA-1)、YBSD(RA-2)株制备了1、2型单价灭活疫苗各1批(批号分别为：2008001、2008002)，免疫3～7日龄健康蛋鸭，颈部皮下注射0.3ml/只，免后14日分别用YBYN株、YBSD株进行交叉攻毒保护试验，结果表明，鸭疫里默氏杆菌1、2型单价疫苗间缺乏交叉保护。详见表6

表6 RA1、2型单价疫苗的型间交叉保护力的测定结果

注：分数表示：健康鸭羽数/攻毒鸭羽数，“/”表示未进行试验。

四、鸭传染性浆膜炎二价灭活疫苗的保存期试验

用本发明人试制的二价灭活疫苗3批(200801、200802、200803)，分别置于2～8℃、室温(20～25℃)及37℃三种条件下保存，间隔一定时间检测疫苗的物理性状并抽样进行效力检验，对免疫后的试验鸭，定期购回，测定对RA-1型、RA-2型的攻毒保护率，确定疫苗保存期。试验结果表明，实验室制备的三批灭活疫苗在2～8℃可以保存18个月；室温可以保存6个月；37℃保存1个月。在上述时间内，灭活疫苗的物理性状没有发生改变，同时免疫效力不变(详见表7和表8)。

表7不同保存条件下疫苗物理性状和安全性检验结果

注：“/”表示未进行此项试验

表8 200801、200802、200803三批疫苗的免疫效力

*分数表示：健康鸭只数/攻毒鸭只数

五、疫苗成品检验

(1)性状

外观 乳白色乳液。

剂型 油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水表面，除第一滴外，均应呈油滴状不扩散。

稳定性 吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15min，管底析出的水相应≤0.5ml。

粘度 用1ml吸管(下口内径为1.2mm，上口内径为2.7mm)吸取25℃左右疫苗1.0ml，令其垂直自然流出，记录流出0.4ml所需的时间，应在6s以内。

(2)无菌检验 按《中国兽药典》方法进行，应无菌生长。

(3)安全检验取3～7日龄的健康易感鸭10只，每只颈部皮下注射疫苗0.6ml，观察14日，应全部健活。

(4)效力检验 取3～7日龄健康易感鸭40只，随机分成4组，每组10只。第1、2组为免疫组，每只颈部皮下注射疫苗0.3ml；第三、四组为非免疫对照组。免后14日，1、3组腿部肌肉注射YBYN株1ml(活菌含量约为2×10⁹CFU/ml)，2、4组腿部肌肉注射YBSD株1ml(活菌含量约为4×10⁸CFU/ml)。观察10日，对照组应至少8只发病(发病判定标准见附注1)，免疫组应至少8只保护。

(5)甲醛残留量测定 按现行《中国兽药典》附录进行测定，应符合兽用生物制品通则的规定。

六、疫苗的作用与用途

用于预防由1型和2型鸭疫里默氏杆菌引起的鸭传染性浆膜炎。

七、用法与用量

颈部皮下注射。3～7日龄雏鸭，0.3ml/只，免疫期为4个月；8日龄以上，0.5ml/只，免疫期为6个月。

本发明的积极意义：

本发明涉及一种鸭传染性浆膜炎二价灭活疫苗的生产方法。本本发明所涉及的疫苗是采用免疫原性良好的鸭疫里默氏杆菌1型YBYN株、2型YBSD株分别接种于适宜培养基，收获培养物，经甲醛溶液灭活后，加入油佐剂混合乳化制成。用于预防由1型和2型鸭疫里默氏杆菌引起的鸭传染性浆膜炎。此疫苗具有安全性好、免疫效力高且免疫期长等优点。

实施例

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的保护范围。

实施例1

1.生产用种子制备

(1)一级种子繁殖与鉴定将YBYN株、YBSD株的冻干菌种分别接种于巧克力琼脂平板上，置5％～10％CO₂、37℃培养20小时，选典型菌落接种于TSA琼脂斜面，37℃培养24小时，然后接种于TSA肉汤，37℃振荡培养24小时，按15％加入灭菌甘油混匀，定量分装，注明菌株名称、装量、分装日期，经纯粹检验合格后，作为一级种子，-20℃保存，保存期不超过3个月(详见表9)。

表9一级种子

菌株号	种子数量(ml)	使用培养基	菌落生长情况
				RA YBYN株	100	巧克力琼脂	圆形微隆起、表面光滑、无色素菌落
RA YBSD株	100	巧克力琼脂	圆形微隆起、表面光滑、无色素菌落

(2)二级种子繁殖将一级种子划线接种到TSA琼脂平板，37℃培养24小时，挑选典型菌落(或菌苔)接种于TSA肉汤，37℃振荡培养24小时，经纯粹检验后，作为二级种子。在2～8℃保存，应不超过48小时详见表10。

表10二级种子

菌株号	种子数量(ml)	使用培养基	菌落生长情况
				RA YBYN株	100	TSA琼脂	圆形微隆起、表面光滑菌落
RA YBSD株	100	TSA琼脂	圆形微隆起、表面光滑菌落

2.菌液培养 采用发酵罐分别培养YBYN菌株、YBSD菌株。先将TSA肉汤培养基进行灭菌，待温度降至37～38℃时，将2～8℃保存的二级种子液分别按2％～2.5％加入到发酵罐内。培养温度控制在37～38℃，搅拌转速为100～200转/分，pH为7.2，罐压为0.03～0.05Pa，容氧量为40％，培养9～10小时收获，留样检验，置2～8℃保存，不超过5日详见表11。

表11YBYN、YBSD株在优化条件下培养菌数测定结果

4.疫苗配制(参见表12)

(1)水相配制 取灭菌的吐温-804份、无菌检验合格的菌液96份，导入配液罐中，开启搅拌电机，匀速搅拌至吐温-80完全溶解。

(2)油相制备 取注射用白油94份、司本-806份和硬脂酸铝1份加入油相制备罐中，开启搅拌电机，匀速搅拌，同时开启导热油开关，125℃加热30min，冷却后，导入贮油罐中备用。

(3)乳化 取油相2份置于乳化罐内，开动电机低速搅拌，同时缓缓加入水相1份，再以4000r/min乳化30min。乳化后，取样10ml，以3000r/min离心15min，应不分层；若有分层现象，应重新乳化1次。

(4)分装 定量分装，加盖密封。

表12疫苗乳化和分装

实施例2

疫苗成品检验

(1)性状

外观 乳白色乳液。

剂型 油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水表面呈油滴状不扩散。

稳定性 吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15min，不分层。

粘度 用1ml吸管(下口内径为1.2mm，上口内径为2.7mm)吸取25℃左右疫苗1.0ml，令其垂直自然流出，记录流出0.4ml所需的时间为4.9秒。

(2)无菌检验 按《中国兽药典》方法进行，无菌生长。

安全检验 取3～7日龄的健康易感鸭10只，每只颈部皮下注射疫苗0.6ml，观察14日，全部健活。

(3)效力检验

取3～7日龄健康易感鸭40只，随机分成4组，每组10只。第1、2组为免疫组，每只颈部皮下注射疫苗0.3ml；第3、4组为非免疫对照组。免后14日，1、3组腿部肌肉注射YBYN株1ml(活菌含量约为2×10⁹CFU/ml)，2、4组腿部肌肉注射YBSD株1ml(活菌含量约为4×10⁸CFU/ml)。观察10日，对照组8只发病(发病判定标准见附注1)，免疫组分别保护9只和10只。

(4)甲醛残留量测定 按《中国兽药典》规定进行测定，应符合“兽用生物制品通则”的规定。

附注：

1发病判定标准(符合下列条件之一，判为发病)

(1)精神不振、行动蹒跚、眼鼻有分泌物流出、排绿色或黄绿色稀薄粪便或死亡。

(2)对无临床症状的鸭剖检观察病变，出现心包膜炎或肝周炎或浆膜炎病变。

(3)对无病变的鸭无菌采集心血或肝脏或脾脏，接种巧克力琼脂平板分离细菌，分离到的细菌呈阳性。

2改良胰蛋白胨大豆琼脂配方(改良TSA)

胰蛋白胨17g、大豆胨3g、氯化钠5g、磷酸氢二钾2.5g、葡萄糖2.5g、琼脂12g、溶于1000ml无离子水中，115℃高压20分钟，待冷却至55℃左右时，按无菌要求加入30ml无菌小牛血清。

Claims (1)

1.一种鸭传染性浆膜炎二价灭活疫苗的生产方法，其特征在于： 

（1）生产菌种为鸭疫里默氏杆菌1型YBSD株菌、2型YBYN株菌，该两株已于2011年2月25日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号YBSD株为CGMCC No.4614，YBYN株为CGMCC No.4615； 

（2）使用半合成肉汤培养基是：胰蛋白胨大豆肉汤粉5g、氯化钠5g、牛肉浸膏5g、水解乳蛋白5g、七水硫酸镁0.5g、溶于1000ml无离子水中，加热溶化后调pH至7.0～7.2，121℃高压20分钟后，待冷却至55℃，按无菌要求加入经抽滤无菌的1%维生素B₁1ml； 

（3）一级种子繁殖与鉴定:将YBYN株、YBSD株的冻干菌种分别接种于巧克力琼脂平板上，置5%～10%CO₂、37℃培养20小时，选典型菌落接种于含3%小牛血清的TSA琼脂斜面，37℃培养24小时，然后接种于TSA肉汤，37℃振荡培养24小时，按15%加入灭菌甘油混匀，定量分装，经纯粹检验合格后，作为一级种子； 

（4）二级种子繁殖:将一级种子划线接种到3%小牛血清的TSA琼脂平板，37℃培养24小时，挑选典型菌落或菌苔接种于TSA肉汤，37℃振荡培养24小时，经纯粹检验后，作为二级种子； 

（5）采用机械搅拌发酵罐分别培养1型鸭疫里默氏杆菌CGMCC No.4614株菌和2型鸭疫里默氏杆菌CGMCC No.4615株菌菌液：先将半合成肉汤培养基进行灭菌，待温度降至37～38℃时，将2～8℃保存的二级种子液分别按2%～2.5%加入到发酵罐内，培养温度控制在37～38℃，搅拌转速为100～200r/min，pH为7.2，罐压为0.03～0.05Pa，溶氧量为40%，培养9～10小时收获，留样检验，置2～8℃保存，不超过5日； 

（6）根据活菌计数结果，将灭活的1型鸭疫里默氏杆菌菌液和2型鸭疫里默氏杆菌菌液均稀释成约6×10⁹CFU/ml后等量混合； 

（7）按常规方法制备成矿物油佐剂灭活疫苗。