CN103007261B - 一种鸭疫里默氏杆菌及其应用 - Google Patents
一种鸭疫里默氏杆菌及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种鸭疫里默氏杆菌，保藏号为CGMCC No.6832。上述的鸭疫里默氏杆菌用于制备鸭疫里默氏杆菌灭活疫苗，所制得的疫苗可以预防以神经症状、纤维素性心包炎、肝周炎和气囊炎为特征的鸭传染性浆膜炎的发生。灭活疫苗中鸭疫里默氏杆菌6832的数量不低于1×108CFU/mL。本发明筛选得到的鸭疫里默氏杆菌具有高致病性，用其制备的灭活疫苗，能够预防以神经症状、纤维素性心包炎、肝周炎和气囊炎为特征的鸭传染性浆膜炎的发生，具有良好的市场推广前景。
Description
技术领域
本发明属于兽用生物制品技术领域，具体是涉及一种鸭疫里默氏杆菌及其应用，即一株可引起鸭神经症状和纤维素性心包炎、肝周炎和气囊炎的细菌及其应用。
背景技术
鸭传染性浆膜炎，又称鸭疫里默氏杆菌病、鸭疫巴氏杆菌病、新鸭病等，是由鸭疫里默氏杆菌(Riemerella Anatipestifer，简称RA)引起的鸭、鹅、火鸡及其他家禽和野禽的一种急性或慢性接触性传染病，主要侵害2～7周龄雏鸭，以神经症状和纤维素性心包炎、肝周炎和气囊炎为特征。本病于1932年在美国纽约首次发现，我国邝荣禄等于1975年首次报道本病在广州的存在；郭玉璞等(1982)在北京地区商品鸭中首次分离出该病原菌；随后，我国广东、上海、福建、北京、四川、湖南、江苏、海南、山东、重庆、湖北等地区均报道了发生该病的情况。迄今为止，国际上报道鸭疫里默氏杆菌共有21个血清型。由于缺乏相应的参考菌株，在早期研究中，我国关于RA血清型的报道不多。早年高福等（1987）对从北京、广东和上海等地分离的205个菌株经凝集和琼扩试验鉴定证明均属血清1型。但近年来发现其血清型已发生了巨大变化：除了血清2型、6型、10型、11型、13型和14型，汪铭书等（2001）还报道了血清4型及血清8型鸭疫里默氏杆菌在我国的存在；李文杨等（2002）从福建省103个肉鸭场116份病料中共分离到细菌107株，其中鸭疫里默氏菌84株，占78.5%；大肠杆菌23株，占21.5%。在分离鉴定的84株鸭疫里默氏杆菌中，血清2型占60.7%，1型占25.0%，其它占14.3%。韦强等（2003）研究结果表明，优势血清型在不同的年份出现不同的变化，2000年鸭疫里默氏杆菌以1型为主，占总分离菌数的51.9%；2001年以后2型占绝对优势，占总分离菌数的89.5%；2002年RA2型依旧占53.3%的绝对优势。可见我国目前流行的鸭疫里默氏菌其血清型已发生了明显变化，2型已成为主要流行的血清型。
当前，鸭疫里默氏杆菌对养殖业的危害除直接引起动物发病、死亡外，感染过鸭疫里默氏杆菌的鸭因饲料转化率降低、生长发育迟缓而带来的间接经济损失也十分严重，鸭疫里默氏杆菌虽然对部分抗菌药物敏感，但难于清除，尤其是该菌侵入气囊后，药物难以到达，由于不合理的用药方案，鸭疫里默氏杆菌耐药现象普遍存在，耐药率高且广泛，同时造成一定的药物残留等问题。目前防止该病的重要手段是接种鸭疫里默氏杆菌疫苗，但国内针对该病的商品化疫苗非常少。因此，筛选出致病力强、免疫原性好的鸭疫里默氏杆对于制备疫苗具有重要的作用。
发明内容
本发明的目的是提供了一株鸭疫里默氏杆菌及其应用，以该菌为抗原制备的疫苗可有效防治以神经症状、纤维素性心包炎、肝周炎和气囊炎为特征的鸭传染性浆膜炎，为鸭传染性浆膜炎的预防和治疗提供了产品和使用方法。
本发明的鸭疫里默氏杆菌(Riemeralla anatipestifer)RA BYT06株已于2012年11月15日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.6832。
上述的鸭疫里默氏杆菌用于制备鸭疫里默氏杆菌灭活疫苗，所制得的疫苗可以预防以神经症状、纤维素性心包炎、肝周炎和气囊炎为特征的鸭传染性浆膜炎的发生。
本发明筛选得到的鸭疫里默氏杆菌具有高致病性，用其制备的灭活疫苗，能够预防以神经症状、纤维素性心包炎、肝周炎和气囊炎为特征的鸭传染性浆膜炎的发生，具有良好的市场推广前景。
具体实施方式
本发明对山东、广东、福建、广西等地的疑似鸭疫里默氏杆菌病死鸭进行病原分离、鉴定，获得38株病原为鸭疫里默氏杆菌，对其进行血清型鉴定表明，其中有7株为血清2型；动物回归及毒力试验表明RA BYT06株毒力最强，可致鸭只10/10发病且其中5只死亡；免疫原性试验结果表明，当免疫剂量为0.25mL（抗原含量达到1.0×108CFU/mL）时即可使攻毒保护达到9/10。以上结果表明，筛选得到一株血清2型鸭疫里默氏杆菌，其致病力最强、免疫原性好、制备的油苗攻毒保护效果好，确定为生产用菌株，于2012年11月15日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.6832。
下面对本发明进行详细的描述。
一、鸭疫里默氏杆菌的分离及鉴定：
⑴将从山东、广东、福建、广西等地收集的病死鸭进行无菌操作，取病死鸭心、血、肝或脑组织划线接种于胰蛋白胨大豆琼脂（使用前加5%犊牛血清）平板、鲜血营养琼脂培养基、普通营养琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基平板上，置于含5%CO2的37℃恒温培养箱中培养24h。其中38株的结果如下：在胰蛋白胨大豆琼脂平板上，置含5%CO2恒温培养箱培养，菌落呈圆形奶白色，突起，光滑，边缘整齐，斜光观察时菌落发绿光，有的培养基亦被衬成绿色，不同菌株绿光深浅程度不同，在鲜血琼脂上呈圆形，不溶血，有闪光，呈奶油状菌落，麦康凯琼脂和普通营养琼脂上均不生长，38株分离菌分别命名为RA BYT01、RA BYT02至RA BYT38。
⑵取纯培养的细菌的单个菌落涂于干净的载玻片上，然后分别用瑞氏染色法染色和革兰氏染色，镜检，观察其形态特征。革兰氏染色，为革兰氏阴性细小杆菌，呈单个或成对分布，偶尔呈链状排列，不运动，无芽胞；瑞氏染色大部分菌体两极浓染。
⑶取纯培养物分别进行吲哚（靛基质）试验，甲基红（M.R.）试验，V-P试验，过氧化氢酶试验，接触酶试验，尿素酶试验，葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、阿拉伯糖、甘露醇、卫矛醇、鼠李糖、果糖发酵试验。37℃培养，连续观察7天。结果表明其中9株菌部分发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖外，其余菌株均不发酵糖类，不产生硫化氢，过氧化氢酶试验、接触酶试验、尿素酶试验均为阳性，V-P试验、甲基红（M.R.）试验、吲哚（靛基质）试验均为阴性，符合鸭疫里默氏杆菌的生化反应特征。
⑷取初步分离保存的各株鸭疫里默氏杆菌纯培养物，分别用鸭疫里默氏杆菌定型血清作平板凝集试验，以确定其血清型。结果显示，38株细菌分离株中7株为血清型2型，4株为血清型1型，3株为血清型3型，3株为血清型4型，1株为血清型5型，2株为血清型6型，3株为血清型7型，3株为血清型9型，3株为血清型10型，1株为血清型11型，其中2型为优势血清型。
⑸7株血清2型鸭疫里默氏杆菌毒力测定试验
分别将分离菌纯培养的单个菌落划线接种于胰蛋白胨大豆琼脂（使用前加5%犊牛血清）平板上，37℃培养24h，刮取平板上所有菌落混于灭菌生理盐水中制成细菌悬液，以0.5mL/只剂量肌肉注射19日龄健康易感鸭10只，同时设立灭菌生理盐水注射对照组10只。攻毒后连续观察10天，每日记录鸭子的精神、食欲、饮水、运动及死亡情况，并对死亡鸭进行病理剖检、细菌分离及鉴定。结果表明，RA BYT06株所攻毒鸭在攻毒40h后，鸭开始出现精神萎靡，行动迟缓或俯卧不起，眼、鼻流分泌物，共济失调等症状，其余株部分在90h后出现症状，部分未临床出现症状；RA BYT06株攻毒后全部发病，10天内多数发病鸭死亡，死亡达到5/10，剖检可见典型的心包炎、肝周炎、气囊炎，RABYT17、RA BYT21、RA BYT24株发病3/10~7/10，死亡0/10~2/10，因此可确定RA BYT06株毒力最强，详见表1。取心血涂片和肝组织印片进行瑞氏染色后显微镜下观察检查，RA BYT06株可见两极浓染的小杆菌，单个或成对存在，并能从心血和肝组织在胰蛋白胨大豆琼脂培养基上分离出接种菌，其生化及培养特征与RA BYT06株株鉴定结果一致，因此本研究选用RA BYT06株作为疫苗用强毒菌株。并送中科院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.6832。
表1：7株血清型2型鸭疫里默氏杆菌的毒力测定试验结果
注："-"表示未发病
⑹鸭疫里默氏杆菌强毒分离株RA BYT06株的免疫原性测定
将确定的强毒分离株RA BYT06接种胰蛋白胨大豆肉汤（使用前加5%犊牛血清）培养基培养后，以平板培养计数法进行活菌计数，收集菌体，将其浓度稀释到3.0×106、3.0×107、3.0×108、3.0×109、3.0×1010CFU/mL五组，分别按照油水比为2:1的比例做成油佐剂灭活疫苗，使配苗后每毫升抗原液菌数分别为1.0×106、1.0×107、1.0×108、1.0×109、1.0×1010CFU，取5日龄健康易感雏鸭60只，10只/组，分别用含有不同浓度抗原的灭活疫苗进行颈部皮下注射，0.25mL/只，10只作为非免疫对照，接种后14日，每只鸭各肌肉注射0.5mL(1.0×106CFU/mL)RA BYT06株菌液，观测10日，测定疫苗的免疫保护效果。结果如表3所示，当抗原含量达到1.0×107CFU/mL以上，免疫剂量为0.25mL时，保护8/10，当抗原含量达到1.0×108CFU/mL以上，免疫剂量为0.25mL时，保护达到9/10，对照组10/10发病且其中5只死亡，结果表明当抗原含量达到1.0×108CFU/mL时，攻毒保护达到9/10，免疫原性好；具体结果见表2。
表2：RA BYT06分离株的免疫原性试验结果
二、鸭疫里默氏杆菌灭活疫苗的制备
⑴将鸭疫里默氏杆菌RA BYT06冻干菌种接种于胰蛋白胨大豆肉汤（使用前加5%犊牛血清）中，37℃培养20h后，取培养物于胰蛋白胨大豆琼脂（使用前加5%犊牛血清）平板上划线培养，挑选10个左右典型菌落，分别接种胰蛋白胨大豆琼脂（使用前加5%犊牛血清）斜面若干支，置37℃培养24h，经纯粹检验合格作为一级种子。在2～8℃保存，使用期不超过14日。
⑵将一级种子接种于胰蛋白胨大豆肉汤（使用前加5%犊牛血清）中，置37℃培养20h，取样进行纯粹检验合格者作为二级种子。置2～8℃保存，使用期不超过3日。
⑶用发酵罐进行鸭疫里默氏杆菌RA BYT06株通气培养，按容积装入60％胰蛋白胨大豆肉汤培养基及消泡剂。灭菌后按培养基量的2%接种二级种子液，37℃培养10h～12h。按现行《中国兽药典》附录进行纯粹检验，应纯粹。每毫升菌液中活菌数应不少于2×109CFU。
⑷根据活菌计数结果，计算细菌的总含量，再将菌液经连续离心机浓缩后，取菌泥用灭菌生理盐水稀释，调整至每毫升菌液中含鸭疫里默氏杆菌6.0×1010CFU。加入终浓度为0.5%的甲醛溶液，经37℃灭活48h，作灭活检验。按现行《中国兽药典》附录做灭活检验，应无菌生长。
⑸将检验合格的灭活菌液，用灭菌生理盐水调整至生产用体积，使每毫升菌液中至少含鸭疫里默氏杆菌6.0×109CFU。按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验检验，应无菌生长。
⑹取注射用白油94份、司本-806份混合后，加入2%硬脂酸铝，加热熔化至透明，混合均匀，制成油相，取鸭疫里默氏杆菌RA BYT06菌液96份，加入高压灭菌的吐温-804份，充分溶解混匀。从油相罐内将2份油相打到乳化罐内，开动电机预乳化，同时徐徐加入制备好的鸭疫里默氏杆菌液1份，加完后再以3500r/min乳化40分钟即可（乳化温度应控制在25~28℃之间）在乳化终止前加入1%硫柳汞溶液，使其终浓度为0.01%。定量分装，加盖密封。
三、鸭疫里默氏杆菌灭活疫苗的检验
⑴性状：外观应为乳白色乳剂；剂型应为油包水型，取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水表面，除第1滴外，均应呈油滴状不扩散；稳定性，吸取疫苗10mL，装于离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相应不高于0.5mL；黏度，按现行《中国兽药典》附录检验，黏度应不超过200cP，按现行《中国兽药典》附录进行装量检查，应符合规定；按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验，应无菌生长。
⑵安全检验：取5日龄健康易感雏鸭10只，各颈部皮下注射疫苗0.5mL。观察14日，应全部健活，且不出现因注射疫苗引起的任何局部和全身不良反应。
⑶效力检验
血清学方法：用5日龄健康易感雏鸭20只，10只各颈部皮下注射疫苗0.25mL，另10只不接种作为对照，接种后14日，连同对照鸭10只，采血测定抗体凝集效价，免疫鸭血清抗体效价几何平均值均应不低于1:16，对照鸭血清抗体效价几何平均值均应不高于1:2。
免疫攻毒法：用5日龄健康易感雏鸭20只，10只各颈部皮下注射疫苗0.25mL，另10只不接种作为对照，接种后14日，每只鸭各肌肉注射鸭疫里默氏杆菌RA BYT06株菌液0.5mL（1.0×106CFU/mL）。观察10日，免疫组应至少保护9只，对照组至少9只发病且至少5只死亡。
按上述方法制备5批鸭疫里默氏杆菌灭活疫苗，每批抽取1瓶，分别用5日龄健康易感鸭20只，10只各颈部皮下注射疫苗0.25mL，另10只作对照。14日后，连同对照10只，采血分离血清，检测血清抗体效价，再连同对照鸭，每只鸭肌肉注射RA BYT06F8代菌株液0.5mL(1×106CFU/mL)，观察10日。结果显示，试验组各批疫苗血清抗体效价几何平均值达到1:18.38~1:25.99，攻毒保护均达到9/10~10/10，对照鸭均发病且其中5只死亡（详见表3）。
表3：5批鸭疫里默氏杆菌灭活疫苗效力检验结果
上述的实验结果表明，本发明筛选得到的鸭疫里默氏杆菌具有高致病性，用其制备的灭活疫苗，能够预防以神经症状、纤维素性心包炎、肝周炎和气囊炎为特征的鸭传染性浆膜炎的发生，具有良好的市场推广前景。
Claims (3)
1.一种鸭疫里默氏杆菌，其保藏编号为CGMCC No.6832。
2.权利要求1所述的鸭疫里默氏杆菌在制备疫苗中的应用。
3.一种灭活疫苗，所述的灭活疫苗是以权利要求1所述的鸭疫里默氏杆菌作为抗原制备的。
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