CN111197095B - 一种疫苗菌株的筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种筛选方法，具体涉及一种疫苗菌株的筛选方法。本发明疫苗菌株的筛选方法包括以下步骤：待筛选菌株分离培养；鉴定待筛选菌株是否为所需种类的疫苗菌株，如果是，则进行后续操作；鉴定待筛选菌株的血清型；获取待筛选菌株的基因指纹；建立混合菌株感染模型，以获得最佳攻毒剂量以及攻毒后最佳分离待筛选菌株的时间；筛选优胜者菌株及最佳优胜者；将最佳优胜者中的各菌株按照相同的剂量制备灭活苗，进行免疫，保护效果最佳的菌株即为所需的疫苗菌株。本发明提供了一种高效的疫苗菌株筛选方法，该方法筛选时间短，易于操作，方便快捷，同时大幅度降低了成本，能达到快速筛选的目的。

Description

一种疫苗菌株的筛选方法

技术领域

本发明涉及一种筛选方法，具体涉及一种疫苗菌株的筛选方法。

背景技术

疫苗菌株通常选用保护效率高，免疫剂量小，容易培养且生产成本低的菌株。在某种细菌研究背景知识模糊，毒力因子尚不明确时，疫苗菌株的筛选方法通常的是，依次对各个分离株进行毒力的测定，常用不同剂量的细菌感染易感动物，通过测定最小致死量(MLD)和/或半数致死量(LD50)还可以用最小感染量(MID)和/或半数感染量(ID50)来评价。这些方法都需要将临床分离的细菌一一测定，工作量较大，比较费时费力，限制了能够参与筛选的菌株的数量。

RA感染是发生在鸭、鹅、火鸡等禽类的一种接触传染性疾病，通常称该病为鸭传染性浆膜炎，该病呈急性或慢性经过，其特征是纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、干酪性输卵管炎和脑膜炎。该菌主要侵害1～8周龄鸭，是长期以来是危害国内外养鸭业的一种主要疫病。由于RA血清型众多(目前已鉴定出25种血清型)且交叉保护效果几乎没有，只有同血清型的RA才能有效保护同血清型的RA感染，而且，即使是同一种血清型的RA，对同血清型RA的感染能够提供的保护力也是不同的，如何从同血清型的RA中来筛选到最好的菌株，用常用的筛选疫苗菌株方法有诸多局限。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种疫苗菌株的筛选方法，该方法筛选效率高。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种疫苗菌株的筛选方法，其包括以下步骤：

(1)待筛选菌株分离培养：从疑似病理组织中获取含菌病料，进行分离培养，得到待筛选菌株；

(2)鉴定待筛选菌株是否为所需种类的疫苗菌株，如果是，则进行后续操作；

(3)鉴定待筛选菌株的血清型；

(4)获取待筛选菌株的基因指纹；

(5)混合菌株感染模型的建立:从步骤(1)所得待筛选菌株中挑取单菌落，进行培养后调整菌株浓度，选取相同血清型的不同待筛选菌株进行多个菌株同样的浓度混合，每个组内多个菌株的浓度一样，按照不同细菌浓度得到多个混合组；且同混合组内待筛选菌株的基因指纹不同；然后进行攻毒，在攻毒后不同时间梯度分离菌株，以获得最佳攻毒剂量以及攻毒后最佳分离待筛选菌株的时间；

(6)从步骤(1)所得待筛选菌株中重新挑取单菌落，按照步骤(5)建立多个混合组，并筛选出每个混合组中的1～3个优胜者；

(7)重复步骤(6)从而获得多个优胜者，测序各个优胜者的基因指纹，然后再将多个优胜者组成新的小组，按照步骤(6)的方式继续筛选，得到多个最佳优胜者；

(8)将最佳优胜者中的各菌株按照相同的剂量制备灭活苗，进行免疫和交叉保护试验，保护效果最佳的菌株即为所需的疫苗菌株。

本发明提供了一种简捷的筛选疫苗菌株的新方法，该方法通过混合菌株感染试验动物，确定了最佳混合感染剂量及优势菌种进入动物脑部的最佳时间(步骤(5)分离菌株时可从脑部分离)，然后将从试验动物中分离出的优势菌株进行验证，筛选出优势菌种。

需说明的是，上述步骤(5)是根据分离到的结果确定最佳攻毒剂量以及攻毒后最佳分离待筛选菌株的时间。其中，分离到的结果包括：1)能否分离到病原菌；2)分到的菌是否单一)。步骤(6)和步骤(7)确定优胜者是以步骤(5)获得的最佳攻毒剂量以及攻毒后最佳分离待筛选菌株的时间为标准，考察菌株是否分离到。

与传统疫苗菌株筛选方法相比，本发明的筛选方法易于操作、方便快捷、能大幅缩短筛选时间和降低筛选成本，为高效筛选疫苗菌株提供有力的技术手段。

本发明的筛选方法可适用于各种疫苗筛选，尤其适用于细菌背景知识模糊的疫苗筛选。例如，本发明的筛选方法可用来筛选用于鸭的疫苗，具体地，用于鸭的疫苗可选择为针对鸭疫里默氏杆菌的疫苗。本发明方法可应用在鸭疫里默氏杆菌的多价灭活苗研发中，但不局限于鸭疫里默氏杆菌，还可以用于其他的病原菌及病毒。

作为本发明所述疫苗菌株的筛选方法的优选实施方式，所述步骤(4)中，获取待筛选菌株的基因指纹的方法包括以下步骤：

(4a)基因组提取：从步骤(1)所得待筛选菌株中挑取单菌落，培养后提取基因组；

(4b)采用PCR扩增步骤(4a)所得基因组的高变异片段，通过电泳检测PCR扩增产物，并进行胶回收；

(4c)进行测序分析，然后对比测序结果，得到待筛选菌株的基因指纹。

需说明的是，上述步骤(4b)中，PCR扩增的高变异片段的序列需作为待筛选菌株的识别标签，是用以识别待筛选菌株的基因指纹。(本方法以鸭疫里默氏杆菌的CRISPR的Spacer序列为识别标签，但不应局限于CRISPR的Spacer序列)

作为本发明所述疫苗菌株的筛选方法的优选实施方式，所述步骤(7)中，最佳优胜者为5株以下待筛选菌株；优选地，所述步骤(7)中，最佳优胜者为3-5株待筛选菌株。

作为本发明所述疫苗菌株的筛选方法的优选实施方式，所述疫苗菌株用于鸭。

作为本发明所述疫苗菌株的筛选方法的优选实施方式，所述疫苗菌株为鸭疫里默氏杆菌。

作为本发明所述疫苗菌株的筛选方法的优选实施方式，所述步骤(1)中，疑似病理组织为肝脏或鸭脑。

作为本发明所述疫苗菌株的筛选方法的优选实施方式，所述疫苗菌株为鸭疫里默氏杆菌，所述步骤(4b)中的高变异片段为CRISPR spacer序列。鸭疫里默氏杆菌的CRISPRspacer序列可作为RA的特殊标识(识别标签)。

作为本发明所述疫苗菌株的筛选方法的优选实施方式，所述步骤(4b)中，PCR扩增的试剂包括如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物。采用SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的引物扩增RA的CRISPR序列，可使得扩增效率高达85％，扩增条带大小为1500bp左右。

作为本发明所述疫苗菌株的筛选方法的优选实施方式，所述步骤(4b)中，PCR扩增的试剂还包括2×Taq PCR Mix、双蒸水、阴性对照品和阳性对照品。

作为本发明所述疫苗菌株的筛选方法的优选实施方式，所述阴性对照品为双蒸水，所述阳性对照品为鸭疫里默氏杆菌基因组。

到目前为止，还未有高效筛选疫苗菌株的相关文献，与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明提供了一种高效的疫苗菌株筛选方法，该方法筛选时间短，易于操作，方便快捷，同时大幅度降低了成本，能达到快速筛选的目的。本发明筛选方法为疫苗研制工作提供了有力的技术手段。

本发明首次指出RA的CRISPR spacer序列可作为RA的特殊标识，并提供了针对RACRISPR spacer序列的特异性引物组，扩增效率高达85％，扩增条带大小为1500bp左右。同时建立了混合菌株攻毒感染模型，筛选可优先突破血脑屏障到达鸭子脑部的菌株。

附图说明

图1为本发明实施例所述疫苗菌株的筛选方法的流程图；

图2为本发明实施例平板划线分离培养的照片图；

图3为本发明实施例所述RA的血清鉴定图；

图4为本发明实施例所述电泳检测结果图；

图5为本发明实施例所述测序结果图。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例

本实施例以鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer，RA)为例，对本发明疫苗菌株的筛选方法进行说明。本实施例所述疫苗菌株的筛选流程如图1所示。本实施例以RA的血清I型的97株分离菌株为材料，来完成优异的疫苗菌株的筛选，具体筛选方法如下：

步骤一：待检菌株分离培养及鉴定

取疑似病料组织如肝脏、脑部，将病料组织在无菌操作台中剖开，用接种环粘取含菌病料，在含有5％胎牛血清的TSA固体培养基表面进行划线。将平板放入37℃、5％二氧化碳恒温培养箱中培养24h。

步骤二：血清型鉴定

从步骤一的平板中挑取单菌落重新接种于TSA固体培养基纯化扩大，置于37℃、5％二氧化碳恒温培养箱中培养12-16h后再于TSA固体培养基上均匀划线进行大量繁殖，37℃、5％二氧化碳恒温培养箱培养24h，之后用PCR鉴定是否为鸭疫里默氏杆菌。

然后再用pH 7.4的PBS洗下菌苔，7000r/min 2min进行离心后弃上清，估测细菌沉淀的体积，加入菌体体积9倍的pH 7.4的PBS，涡旋混合均匀后室温过夜，7000r/min 10min离心后取上清即为用于间接血凝试验的分型抗原，又称温水抗原，然后121℃高压蒸汽制备热稳定性抗原。

在琼脂板上打孔，中间为待检菌的热稳定抗原，周围六孔分别放入RA的高免血清，每孔分别放20ul，取湿润棉球，与琼脂板一起放入一次性手套中，置于37℃温培养箱中培养24h。若待检菌热抗原与其中一类高免血清间出现一条白色沉淀线，待检菌则与这类高免血清的血清型一致(如果没有特别声明，以下所描述的RA菌株均是温氏集团研究院自己分离的血清1型的RA)。

本发明RA的血清鉴定图如图3所示。

步骤三：基因组提取

在无菌环境中从步骤一培养好的平板上挑取单菌落置于10ml含有5％胎牛血清的TSB液体培养基中，设定恒温摇床37℃、220r/min，将离心管置于其中8-10h进行振摇。从离心管中取样进行镜检，观察是否有杂菌污染。然后按天根生化科技(北京)有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取RA的基因组。

步骤四：待检样品CRISPR Spacer序列的PCR扩增反应

引物扩增RA的CRISPR Spacer序列，其试剂组成包括2×Taq PCR Mix、灭菌双蒸水、RAC-2上下游引物、阴性对照、阳性对照，所述阴性对照为灭菌双蒸水，阳性对照为RA基因组。引物如下表1所示。

表1

扩增反应体系为：2×Taq PCR Mix 25μL，RAC-2上下游引物各2μL，DNA模板1μL，灭菌双蒸水20μL。配制扩增反应体系，加入上述待检样品DNA，进行PCR扩增反应。

所述PCR扩增反应的条件依次为：95℃预变性反应3min，95℃变性反应30s，55℃退火反应30s，72℃延伸反应2min，34个循环，72℃终延伸反应10min，扩增时设置阴性对照和阳性对照。

步骤五：电泳检测

通过琼脂糖凝胶电泳分别对所述待检样品PCR扩增产物，阴性、阳性扩增产物以及样品扩增产物进行电泳检测，并进行判断。电泳检测结果如图4所示。

所述判断的标准为：阴性对照无扩增条带，阳性对照扩增条带大小为约1500bp，说明对照成立；其他待检样品在1500bp附近出现明亮条带。

步骤六：胶回收

采用TAKARA公司的胶回收试剂盒进行胶回收。

步骤七：测序分析

测序由英潍捷基(上海)贸易有限公司完成，测序结果如图5所示。将不同RA菌株测序后序列通过MEGA软件比对分析序列一致性达到83.3％(20/24)并与攻毒菌株的FJ-HJH完全吻合；有16.7％(4/24)的序列与菌株XT5一致。步骤八：混合菌株感染模型的建立

同步骤三，取RA分离株依次进行TSA平板培养、挑取单菌落TSB液体培养，活菌计数计算细菌浓度，选取不同RA菌株进行多个菌株同样的浓度混合，每个组内多个菌株的浓度一样，将每株菌的剂量调至10⁶、10⁷、10⁸cfu/ml后混得到多个混合组。例如，以RA1型菌株为例进行6株菌混合，混合组结果如表2所示。对1-2周雏鸭进行攻毒，找寻优势菌种进入脑部的最佳时间，暂设定时间梯度为攻毒后3h、6h、9h、12h、24h、48h处死试验动物，通过细菌分离试验探索最佳攻毒剂量、攻毒后最佳时间来进行RA菌株分离时间。

通过已有LD50的数据，在不清楚各株菌毒力的情况下，统一各株菌的浓度达到1*10⁸cfu/ml每株每只作为鸭疫里默氏杆菌最佳攻毒剂量(具体攻毒条件如表3所示)。一般从鸭体内分离RA，采取肝脏和脑部取样平板划线分离培养，但由于脑部存在血脑屏障的作用，结合试验目的，采取从脑部分离RA，平板划线分离培养的照片如图2所示，分离结果如表4所示。

表2

表3

表4

根据上表4可得，3h处死时结果不稳定，6h分离RA效率高，9h及12h能达到完全分离到RA的效果，再结合试验目的，找到优势菌种进入鸭脑部的最快速时间，确定混合菌株攻毒感染后分离细菌的最佳时间为6h。

步骤九：优胜菌株的筛选

无菌环境下从鸭的脑和肝脏中分离出RA，对分离株进行培养，挑取若干单菌落、并进行血清型鉴定、CRISPR spacer序列的PCR扩增反应、进行测序并与测序前菌株序列比对，通过对比选到这一组的优胜者。然后再将多组的优胜者组成新的小组，按照上述方法进一步优化筛选，并在每组选出新的优胜者，最终只有3-5株优胜者被选出。再将每一株菌按照相同的剂量制备灭活苗，免疫10日龄番鸭，2周后进行交叉保护试验，以保护效果最好的菌株作为最终的优胜者，从而完成鸭疫里默氏杆菌同种血清型疫苗菌株的筛选。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 温氏食品集团股份有限公司

<120> 一种疫苗菌株的筛选方法

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gtgtcggttt acataattgg 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

accaacctat cagcaattag 20

Claims (6)

1.一种疫苗菌株的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）待筛选菌株分离培养：从疑似病理组织中获取含菌病料，进行分离培养，得到待筛选菌株；

（2）鉴定待筛选菌株是否为所需种类的疫苗菌株，如果是，则进行后续操作；

（3）鉴定待筛选菌株的血清型；

（4）获取待筛选菌株的基因指纹；

（5）混合菌株感染模型的建立: 从步骤（1）所得待筛选菌株中挑取单菌落，进行培养后调整菌株浓度，选取相同血清型的不同待筛选菌株进行多个菌株同样的浓度混合，每个组内多个菌株的浓度一样，按照不同细菌浓度得到多个混合组；且同混合组内待筛选菌株的基因指纹不同；然后进行攻毒，在攻毒后不同时间梯度分离菌株，以获得最佳攻毒剂量以及攻毒后最佳分离待筛选菌株的时间；

（6）从步骤（1）所得待筛选菌株中重新挑取单菌落，按照步骤（5）建立多个混合组，并筛选出每个混合组中的1~3个优胜者；

（7）重复步骤（6）从而获得多个优胜者，测序各个优胜者的基因指纹，然后再将多个优胜者组成新的小组，按照步骤（6)的方式继续筛选，得到多个最佳优胜者；

(8) 将最佳优胜者中的各菌株按照相同的剂量制备灭活苗，进行免疫和交叉保护试验，保护效果最佳的菌株即为所需的疫苗菌株；

所述步骤（4）中，获取待筛选菌株的基因指纹的方法包括以下步骤：

（4a）基因组提取：从步骤（1）所得待筛选菌株中挑取单菌落，培养后提取基因组；

（4b）采用PCR扩增步骤（4a）所得基因组的高变异片段，通过电泳检测PCR扩增产物，并进行胶回收；

（4c）进行测序分析，然后对比测序结果，得到待筛选菌株的基因指纹；

所述疫苗菌株为鸭疫里默氏杆菌，所述步骤（4b）中的高变异片段为CRISPR spacer序列；

所述步骤（4b）中，PCR扩增的试剂包括如SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2所示的引物。

2.如权利要求1所述的疫苗菌株的筛选方法，其特征在于，所述步骤（7）中，最佳优胜者为3-5株待筛选菌株。

3.如权利要求1~2任一项所述的疫苗菌株的筛选方法，其特征在于，所述疫苗菌株用于鸭。

4.如权利要求1所述的疫苗菌株的筛选方法，其特征在于，所述步骤（1）中，疑似病理组织为肝脏或鸭脑。

5.如权利要求1所述的疫苗菌株的筛选方法，其特征在于，所述步骤（4b）中，PCR扩增的试剂还包括2×Taq PCR Mix、双蒸水、阴性对照品和阳性对照品。

6.如权利要求5所述的疫苗菌株的筛选方法，其特征在于，所述阴性对照品为双蒸水，所述阳性对照品为鸭疫里默氏杆菌基因组。

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