CN102181549B - 一种鸭源常见细菌多重pcr检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种鸭源常见细菌多重PCR检测试剂盒及其检测方法。本发明公开了一种鸭源常见细菌多重PCR检测试剂盒，其包含3对引物：RADnaBP1和RADnaBP2；E.coliphoAP1和E.coliphoAP2；SalminvAP1和SalminvAP2,其中所述RADnaBP1的核酸序列如SEQ ID NO.1所示,所述RADnaBP2的核酸序列如SEQ ID NO.2所示,所述E.coliphoAP1的核酸序列如SEQ ID NO.3所示,所述E.coliphoAP2的核酸序列如SEQ ID NO.4所示,所述SalminvAP1的核酸序列如SEQ ID NO.5所示,所述SalminvAP2的核酸序列如SEQ ID NO.6所示。本发明能快速、方便、特异、灵敏地检测鸭疫里默氏杆菌、大肠杆菌和沙门氏菌，易于大范围推广，可用于细菌鉴定、疾病诊断和流行病学调查，具有广阔的市场前景和较大的经济效益。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种鸭源常见细菌多重PCR检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
鸭疫里默氏杆菌病、大肠杆菌病和沙门氏菌病是当前危害养鸭业最为严重的三种细菌性传染病。
鸭疫里默氏菌(Riemerella anatipestifer, RA)病是一种主要侵害鸭、火鸡和其他鸟类的接触性传染病。迄今为止，已确认的RA血清型有21个 (l～21型)。该病主要病理变化是纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、脑膜炎、干酪样输卵管炎等，发病率高，病死率高（死亡率1%－80%，甚至高达90%以上），耐过鸭多成僵鸭，生长迟缓，造成极大的经济损失。
鸭大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌感染所引起，由于感染鸭的年龄、抵抗力以及大肠杆菌的致病力、感染途径的不同，可以产生许多症状和病变不同的病型。在雏鸭引起大肠杆菌肝炎和脑炎为特征，在产蛋鸭以发生大肠杆菌性生殖器官病变为特性。感染雏鸭的大肠杆菌主要有O78、O8、O7、O73、O19、O45等。大肠杆菌也是一种条件性致病菌，当由于各种应激刺激造成鸭体的免疫功能降低时，就会发生感染，因此，在临诊上常常成为鸭疫里默氏杆菌病的并发菌。
鸭沙门氏菌病是由鼠伤寒沙门氏菌、鸭沙门氏菌和肠炎沙门氏菌等引起的疾病的总称。各种日龄的鸭都能感染，主要发生于雏鸭，可造成大批死亡。这一类细菌常引起人的食物中毒，在公共卫生上有重要意义。
以上3种细菌性传染病都易发生于雏鸭，且其临床症状和剖检病变相似，难以区分。目前实验室的诊断方法主要靠细菌的分离鉴定与鉴定，以及针对单个病原建立的PCR检测方法等。细菌的分离与鉴定是诊断的金标准，但这种方法所需检测时间长、造作繁琐，且不能批量检测。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种快速、特异性和灵敏性高的鸭源常见细菌多重PCR检测试剂盒及其检测方法。
为此，本发明公开了一种鸭源常见细菌多重PCR检测试剂盒，其包含3对引物：RA DnaB P1和RA
DnaB P2；E.coli phoA P1和E.coli phoA P2；Salm
invA P1和Salm invA P2，其中所述RA DnaB P1的核酸序列如SEQ
ID NO.1所示, 所述RA
DnaB P2的核酸序列如SEQ ID NO.2所示, 所述E.coli phoA P1的核酸序列如SEQ ID NO.3所示, 所述E.coli phoA P2的核酸序列如SEQ
ID NO.4所示, 所述Salm
invA P1的核酸序列如SEQ ID NO.5所示, 所述Salm invA P2的核酸序列如SEQ ID NO.6所示。
所述细菌为鸭疫里默氏杆菌和/或大肠杆菌和/或沙门氏菌。
本发明利用申请人测定并提交到GenBank上鸭疫里默氏杆菌不同血清型DnaB基因的序列（GenBank accession numbers：
JF723296 to JF723300），与在GenBank上发表的其他细菌如大肠杆菌、沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌等的DnaB基因进行比对，选择序列差异大的区域设计引物。
本发明将选择大肠杆菌的持家基因phoA基因作为靶基因，用于鸭大肠杆菌的检测。对已发表的不同细菌的DnaB基因序列作序列比对，设计引物。选择phoA作为靶基因主要基于如下两点考虑：肝、脑组织中的大肠杆菌是直接感染或继发感染后才进入这些组织的，并与疾病相关，即使检测时有少量污染进来的大肠杆菌，也是低于多重PCR的检测线；另外，大肠杆菌携带的毒力因子可因不同的菌株有所变化，且有报道表明，致病性大肠杆菌中检测到的那些毒力因子，在非致病性的大肠杆菌中也可检测到。
本发明将选择目前科研人员公认可行的沙门氏菌侵袭蛋白基因invA作为检测的靶基因，并根据已发表的沙门氏菌invA基因序列重新设计引物。
在一些实施例中，所述检测试剂盒还含有甘油、10×反应缓冲液、DNA聚合酶、dNTP（2.5mM each）。
另一方面，本发明还公开了一种鸭疫里默氏杆菌和/或大肠杆菌和/或沙门氏菌的检测方法，包括下列步骤：
取禽类（如：鸭）组织样本或分离细菌的DNA并以此为模板；
利用3对引物： RA
DnaB P1和RA DnaB P2；
E.coli phoA P1和E.coli phoA P2；Salm invA P1和Salm
invA P2，进行多重PCR,其中所述RA
DnaB P1的核酸序列如SEQ ID NO.1所示, 所述RA DnaB P2的核酸序列如SEQ ID NO.2所示, 所述E.coli phoA P1的核酸序列如SEQ
ID NO.3所示, 所述E.coli
phoA P2的核酸序列如SEQ ID NO.4所示, 所述Salm invA P1的核酸序列如SEQ ID NO.5所示, 所述Salm invA P2的核酸序列如SEQ
ID NO.6所示；进行多重PCR反应；
琼脂糖凝胶电泳，在紫外成像仪下观察，若出现459bp， 720bp和 256bp条带，则表明鸭组织样本中含鸭疫里默氏杆菌和大肠杆菌和沙门氏菌；若出现459bp和 720bp条带，则表明鸭组织样本中含鸭疫里默氏杆菌和大肠杆菌；若459bp和 256bp条带，则表明鸭组织样本中含鸭疫里默氏杆菌和沙门氏菌；若出现720bp和256bp条带，则表明鸭组织样本中含大肠杆菌和沙门氏菌；若只出现459bp条带，则表明鸭组织样本中含或分离的细菌是鸭疫里默氏杆菌；若只出现720bp条带，则表明鸭组织样本中含或分离的细菌是大肠杆菌； 若只出现256bp条带，则表明鸭组织样本中含或分离的细菌是沙门氏菌。
在一些实施例中，所述禽类为鸭、鹅、火鸡、鸡或鸟类中任何之一。
在一些实施例中， 所述琼脂糖凝胶电泳法具体可为1-2%（质量百分含量）琼脂糖凝胶电泳。
所述多重 PCR 的反应条件具体可为：94℃预变性5分钟，再94℃45秒，57－60℃40秒，72℃60秒共运行30个循环，最后72℃延伸10分钟。
所述多重 PCR 的反应体系中，反应初始时，每个所述引物对的上游引物和下游引物的终浓度可为5-40
pmol;,其中最优化RA DnaB P1和RA
DnaB P2的终浓度为5 pmol；
E.coli phoA P1和E.coli phoA P2的终浓度为20 pmol；Salm invA P1和Salm invA P2的终浓度为5
pmol。
与现有技术相比，本发明具有如下的优点：
1）在一个反应体系中可同时检测鸭疫里默氏杆菌、大肠杆菌和沙门氏菌这3种病原菌。
2）在普通的生物学实验室有PCR仪就可完成检测工作，检测时间可以缩短到3～5个小时，大大缩短了检测时间。
3）能批量对样品进行检测，可用于实验室细菌的鉴定和临床样品的检测与诊断。
本发明的建立的多重PCR检测方法具有可同时检测鸭最常见的3种传染病的病原，且快速、特异和操作简单的特点，填补了目前缺少快速鉴别这3种病原方法的空白，易于大范围推广应用，可检测这3种鸭病的流行，具有广阔的市场前景和较大的经济效益。
附图说明
图1. 本发明一鸭源常见细菌多重PCR检测试剂盒引物浓度范围实验结果；
图2.本发明一鸭源常见细菌多重PCR检测试剂盒的特异性试验结果；
图3.本发明一鸭源常见细菌多重PCR检测试剂盒的灵敏性试验结果；
图4.本发明一鸭源常见细菌多重PCR检测试剂盒检测实验室感染鸭临床样品的结果。
具体实施方式
以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。
实施例
1
：
1
、鸭源常见细菌多重
PCR
检测试剂盒的建立
按下列组成配制鸭疫细菌多重PCR检测试剂盒：
含有10×反应缓冲液、DNA聚合酶、dNTP（2.5mM each）、50%Glycerol、3对引物其序列为：
RA DnaB P1：
AAACTCAGGCAAAGGTGGCAC (SEQ ID NO.1)
RA DnaB P2：TGTATGGTAGTTTTGATGCTTTCAA
(SEQ ID NO.2)
E.coli phoA P1：CGATTCTGGAAATGGCAAAAG
(SEQ ID NO.3)
E.coli phoA P2：CGTGATCAGCGGTGACTATGAC
(SEQ ID NO.4)
Salm invA P1：AACCAGCAAAGGCGAGCAG
(SEQ ID NO.5)
Salm invA P2：CAATACGATGCTGTTATCGTCCAG
(SEQ ID NO.6)
多重PCR反应体系及反应条件的确立
本发明对各引物的配比浓度、甘油的浓度、Taq DNA聚合酶的用量等条件进行了优化，最终确定的反应体系如下：
| 反 应 组 分 | 体 积 (µL) |
| 10×Taq酶反应缓冲液 (TaKaRa，含2.5mM MgCl2) | 5 |
| dNTP（2.5mM each, TaKaRa） | 4 |
| 50%Glycerol | 5 |
| RA DnaB P1 (20µM) | 0.3－1 |
| RA DnaB P2 (20µM) | 0.3－1 |
| E.coli phoA P1 (20µM) | 0.5－1.5 |
| E.coli phoA P2 (20µM) | 0.5－1.5 |
| Salm invA P1 (20µM) | 0.3－1 |
| Salm invA P2 (20µM) | 0.3－1 |
| DNA模板 | 1 |
| Taq DNA聚合酶(TaKaRa, 5U/µL) | 1 |
| 加去离子水至总体积 | 50 |
本发明中引物浓度范围的确定实验中，三对引物的浓度相同时，不能扩增出E. coli phoA基因对应的片段；而当引物RA DnaB P1、RA
DnaB P2、 Salm invA P1和Salm invA P2的终浓度为引物E.coli
phoA P1和E.coli phoA P2终浓度的2～5倍时，均能扩增出各基因相应的片段。结果见图1，泳道M:
Takara DL2000 marker；泳道1: RA DnaB P1和RA DnaB P2的终浓度为5
pmol； E.coli phoA P1和E.coli phoA P2的终浓度为10
pmol；Salm invA P1和Salm invA P2的终浓度为5
pmol。泳道2: RA DnaB P1和RA DnaB P2的终浓度为5
pmol； E.coli phoA P1和E.coli phoA P2的终浓度为15
pmol；Salm invA P1和Salm invA P2的终浓度为5
pmol。泳道3: RA DnaB P1和RA DnaB P2的终浓度为5
pmol； E.coli phoA P1和E.coli phoA P2的终浓度为20
pmol；Salm invA P1和Salm invA P2的终浓度为5
pmol。泳道4: RA DnaB P1和RA DnaB P2的终浓度为5
pmol； E.coli phoA P1和E.coli phoA P2的终浓度为30pmol；Salm invA P1和Salm
invA P2的终浓度为5 pmol。
多重PCR反应条件：先94 ℃预变性5分钟，再94 ℃45秒，57－60℃40秒，72℃60秒共运行30个循环，最后72℃延伸10分钟。琼脂糖凝胶电泳后观察检测结果。
本发明中检测鸭疫里默氏杆菌DnaB、大肠杆菌phoA和沙门氏菌invA 3种靶基因的长度分别为459bp， 720bp和 256bp。
、多重
PCR
反应的特异性检测
为验证本发明的检测特异性，运用本发明对1、2、6、8、10、12、15等不同血清型的鸭疫里默氏杆菌（包括5株参考菌株和130株野生株）、不同血清型的大肠杆菌（包括68株鸭源大肠杆菌野生株和1株禽致病性大肠杆菌参考株）、沙门氏菌（包括28株鸭源沙门氏菌野生株和鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、鸭沙门氏菌共3株参考株）、多杀性巴氏杆菌、约氏黄杆菌(Flavobacterium johnsoniae)、禽结核分枝杆菌、金黄色葡萄球菌、禽败血支原体、禽波氏杆菌等病原微生物进行检测。对PCR反应产物进行电泳后观察。结果表明本发明可以分别特异性地检测出鸭疫里默氏杆菌、大肠杆菌和沙门氏菌，而其他细菌均未检出条带，结果见图2，泳道M: Takara DL2000 marker；泳道1：鸭疫里默氏杆菌+大肠杆菌+ 沙门氏菌（阳性对照）；泳道2：鸭疫里默氏杆菌CH3株（1型）；泳道3：鸭疫里默氏杆菌Th4株（2型）；泳道4：鸭疫里默氏杆菌P2123株（6型）；泳道5：鸭疫里默氏杆菌D26220株（8型）；泳道6：鸭疫里默氏杆菌HXb2株（10型）；泳道7：鸭疫里默氏杆菌8785株（12型）；泳道8：鸭疫里默氏杆菌D743株（15型）；泳道9：鸭疫里默氏杆菌698/95株（20型）；泳道10：Flavobacterium
johnsoniae (ATCC17061) ；泳道11：大肠杆菌DE47株（O1）；泳道12：大肠杆菌DE14株（O2）；泳道13：大肠杆菌DE48株（O78）；泳道14：大肠杆菌CVCC1547株；泳道15：鸭源沙门氏菌JXb1株；泳道16：肠炎沙门氏菌CVCC 1805株；泳道17：鼠伤寒沙门氏菌14028株；泳道18：鸭沙门氏菌CAU0118；泳道19：多杀性巴氏杆菌CVCC 274株；泳道20：鸡败血支原体CVCC 1651株；泳道21：禽分支杆菌CVCC 274；泳道22：金黄色葡萄球菌CVCC 543株；泳道23：禽波氏杆菌IPDH 591-77；泳道24：阴性对照（去离子水）。
对PCR产物测序的结果进一步验证了此多重PCR反应体系的特异性。以上结果表明本发明建立的方法对以上3种细菌均可进行特异性检测。
、多重
PCR
反应的灵敏性检测
为验证本发明的灵敏性，分别运用多重PCR对不同稀释度（102～105）的鸭疫里默氏杆菌、大肠杆菌和沙门氏菌分别进行检测，结果表明本发明建立的多重PCR方法对这3种细菌的检测灵敏度均为1000个CFU(菌落形成单位) ，见图3，泳道M: Takara DL2000
marker；泳道1：鸭疫里默氏杆菌+大肠杆菌+ 沙门氏菌（阳性对照）；泳道2：鸭疫里默氏杆菌CH3株105；泳道3：鸭疫里默氏杆菌CH3株104；泳道4：鸭疫里默氏杆菌CH3株103；泳道5：鸭疫里默氏杆菌CH3株102；泳道6：大肠杆菌DE47株105；泳道7：大肠杆菌DE47株104；泳道8：大肠杆菌DE47株103；泳道9：大肠杆菌DE47株102；泳道10：沙门氏菌JXb1株105；泳道11：沙门氏菌JXb1株104；泳道12：沙门氏菌JXb1株103；泳道13：沙门氏菌JXb1株102；泳道14：阴性对照（去离子水）。。
实施例
2
：多重
PCR
方法对实验室中鸭疫里默氏杆菌、大肠杆菌和沙门氏菌野生株的检测
(
可在
3
小时内完成
)
运用建立的多重PCR方法对实验室保存的130株鸭疫里默氏杆菌、68株大肠杆菌和28株沙门氏菌野生株进行了检测。
（1）细菌DNA模板制备
将TSA / LB上的鸭疫里默氏杆菌、大肠杆菌和沙门氏菌单菌落分别接种至TSB 或LB液体培养基，37 ℃摇菌。然后再1：100转接一次，摇菌至OD600=0.6－0.8左右，各取0.5mL菌液至1.5ml Eppondorf管中，100℃煮沸5分钟后室温冷却，－20℃备用。并设已知的鸭疫里默氏杆菌、大肠杆菌和沙门氏菌3种细菌混合菌液煮沸后，作为阳性对照；另外以去离子水替代DNA模板作为阴性对照。
（2）按下列组成配制多重PCR检测反应体系：
| 反 应 组 分 | 体 积 (µL) |
| 10×Taq酶反应缓冲液 (TaKaRa，含2.5mM MgCl2) | 5 |
| dNTP（2.5mM each, TaKaRa） | 4 |
| 50%Glycerol | 5 |
| RA DnaB P1 (20µM) | 0.5 |
| RA DnaB P2 (20µM) | 0.5 |
| E.coli phoA P1 (20µM) | 1.5 |
| E.coli phoA P2 (20µM) | 1.5 |
| Salm invA P1 (20µM) | 0.5 |
| Salm invA P2 (20µM) | 0.5 |
| DNA模板 | 1 |
| Taq DNA聚合酶(TaKaRa, 5U/µL) | 1 |
| 去离子水 | 29 |
| 总体积 | 50 |
RA DnaB P1：
AAACTCAGGCAAAGGTGGCAC (SEQ ID NO.1)
RA DnaB P2：TGTATGGTAGTTTTGATGCTTTCAA
(SEQ ID NO.2)
E.coli phoA P1：CGATTCTGGAAATGGCAAAAG
(SEQ ID NO.3)
E.coli phoA P2：CGTGATCAGCGGTGACTATGAC
(SEQ ID NO.4)
Salm invA P1：AACCAGCAAAGGCGAGCAG
(SEQ ID NO.5)
Salm invA P2：CAATACGATGCTGTTATCGTCCAG
(SEQ ID NO.6)
（3）多重PCR反应条件
在反应液A中，加入制备的1μL细菌模板，先94 ℃预变性5分钟，再94 ℃45秒，59℃40秒，72℃60秒共运行30个循环，最后72℃延伸10分钟。琼脂糖凝胶电泳后观察检测结果。
（4）多重PCR检测结果
结果显示鸭疫里默氏杆菌、大肠杆菌和沙门氏菌3种细菌均分别在阳性对照位置出现了对应的条带，即呈现特异性的反应。结果表明本发明对上述3种细菌的野生分离株都可进行特异性检测。
实施例
3
：多重
PCR
对临床样品的检测
(
可在
5
小时内完成
)
6份样品来自实验室分别感染了鸭疫里默氏杆菌、大肠杆菌或沙门氏菌鸭的脑和肝脏组织。18份病死鸭的肝脏、脑组织均来自发病鸭场收集到的、且怀疑是细菌感染的病死鸭（共9只鸭）。
（1）DNA模板的制备
无菌操作取少量病死鸭的肝脏、脑组织，用QiAamp® DNA mini
kit提取基因组DNA作为模板。－20℃备用。并设已知的鸭疫里默氏杆菌、大肠杆菌和沙门氏菌3种细菌混合菌液煮沸后，作为阳性对照；另外以去离子水替代DNA模板作为阴性对照。
（2）按下列组成配制多重PCR检测反应体系：
| 反 应 组 分 | 体 积 (µL) |
| 10×Taq酶反应缓冲液 (TaKaRa，含2.5mM MgCl2) | 5 |
| dNTP（2.5mM each, TaKaRa） | 4 |
| 50%Glycerol | 5 |
| RA DnaB P1 (20µM) | 0.5 |
| RA DnaB P2 (20µM) | 0.5 |
| E.coli phoA P1 (20µM) | 1.5 |
| E.coli phoA P2 (20µM) | 1.5 |
| Salm invA P1 (20µM) | 0.5 |
| Salm invA P2 (20µM) | 0.5 |
| DNA模板 | 1 |
| Taq DNA聚合酶(TaKaRa, 5U/µL) | 1 |
| 去离子水 | 29 |
| 总体积 | 50 |
3对引物其序列为：
RA DnaB P1：
AAACTCAGGCAAAGGTGGCAC (SEQ ID NO.1)
RA DnaB P2：TGTATGGTAGTTTTGATGCTTTCAA
(SEQ ID NO.2)
E.coli phoA P1：CGATTCTGGAAATGGCAAAAG
(SEQ ID NO.3)
E.coli phoA P2：CGTGATCAGCGGTGACTATGAC
(SEQ ID NO.4)
Salm invA P1：AACCAGCAAAGGCGAGCAG
(SEQ ID NO.5)
Salm invA P2：CAATACGATGCTGTTATCGTCCAG
(SEQ ID NO.6)
（3）多重PCR反应条件
在反应液A中，加入制备的1μL细菌模板，先94 ℃预变性5分钟，再94 ℃45秒，59℃40秒，72℃60秒共运行30个循环，最后72℃延伸10分钟。琼脂糖凝胶电泳后观察检测结果。
（4）多重PCR检测结果
结果见图4，泳道M: Takara DL2000 marker；泳道1：鸭疫里默氏杆菌+大肠杆菌+沙门氏菌（阳性对照）；泳道2：鸭疫里默氏杆菌CH3株感染鸭的脑组织；泳道3：鸭疫里默氏杆菌CH3株感染鸭的肝脏组织；泳道4：鸭源大肠杆菌DE47株感染鸭的脑组织；泳道5：鸭源大肠杆菌DE47株感染鸭的肝脏组织；泳道6：鸭源沙门氏菌JXb1株感染鸭的脑组织；泳道7：鸭源沙门氏菌JXb1株感染鸭的肝脏组织；泳道8：阴性对照（去离子水）。6份来自实验室分别感染鸭疫里默氏杆菌、大肠杆菌或沙门氏菌鸭的脑和肝脏组织样品，用多重PCR检测全部为阳性。在18份临床样品中，有10份样品（来自5只鸭）检出鸭疫里默氏杆菌、有4份样品（来自2只鸭）检出大肠杆菌，有2份样品（来自1只鸭）检出沙门氏菌，另外有2份样品（来自1只鸭）未出现特异性条带。细菌分离和鉴定的结果也证实的多重PCR结果的正确性。
本发明的范围不受所述具体实施方案的限制，所述实施方案只作为阐明本发明各个方面的单个例子，本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。实际上，除了本文所述的内容外，本领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易地掌握对本发明的多种改进。所述改进也落入所附权利要求书的范围之内。上文提及的每篇参考文献皆全文列入本文作为参考。
序列表
<110>
中国农业科学院上海兽医研究所
<120> 一种鸭源常见细菌多重PCR检测试剂盒及其检测方法
<130> 说明书序列表
<160>
6
<170>
PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 1
aaactcaggc aaaggtggca c 21
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 2
tgtatggtag ttttgatgct ttcaa 25
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 3
cgattctgga aatggcaaaa g 21
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 4
cgtgatcagc ggtgactatg ac
22
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 5
aaccagcaaa ggcgagcag
19
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 6
caatacgatg ctgttatcgt ccag 24
Claims (2)
1.一种鸭源常见细菌多重PCR检测试剂盒，其特征在于其包含3对引物：RA DnaB P1和RA DnaB P2；E.coli phoA P1和E.coli phoA P2；Salm invA P1和Salm invA P2，其中所述RA DnaB P1的核酸序列如SEQ ID NO.1所示, 所述RA DnaB P2的核酸序列如SEQ
ID NO.2所示, 所述E.coli phoA P1的核酸序列如SEQ ID NO.3所示, 所述E.coli
phoA P2的核酸序列如SEQ ID NO.4所示, 所述Salm invA P1的核酸序列如SEQ ID NO.5所示, 所述Salm invA P2的核酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述细菌为鸭疫里默氏杆菌和/或大肠杆菌和/或沙门氏菌。
2.根据权利要求1所述的鸭源常见细菌多重PCR检测试剂盒，其特征在于，其还含有10×反应缓冲液、DNA聚合酶、dNTP和甘油。
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