CN102304573B - 一种用于细菌诊断的核苷酸序列及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种核苷酸序列及所述核苷酸序列在细菌鉴别诊断中的应用，本发明所提供的探针序列及检测方法可以快速、特异、灵敏地检测类志贺邻单胞菌，有效地避免了其它细菌，特别是肠出血性大肠杆菌的非特异性扩增。

Description

一种用于细菌诊断的核苷酸序列及应用

技术领域

本发明涉及TaqMan探针在细菌检测中的应用，特别是在类志贺邻单胞菌鉴别诊断中的应用，属于分子生物学和微生物学领域。

背景技术

类志贺邻单胞菌(Plesiomonas shigelloides)呈世界性分布。淡水水源和江河水生态环境是类志贺邻单胞菌的主要储存地，鱼类是类志贺邻单胞菌常见的宿主。过去认为该菌对人的致病性不强，是鱼类等水生动物重要的致病菌。最近几年由该菌引起的婴幼儿、老年人以及免疫功能不全病人的胃肠道感染病例逐渐增加，是人类肠炎的主要病因，世界各地屡有报道。类志贺邻单胞菌亦可引起人类菌血症、蜂窝组织炎、脑膜炎等肠外感染，该菌亦与旅行者腹泻密切相关。

类志贺邻单胞菌是一种革兰氏阴性、能运动、兼性厌氧、氧化酶阳性的非孢子繁殖的细菌，1947年首次从腹泻病人粪便中分离出来。类志贺邻单胞菌是邻单胞菌属中唯一的一个种，其分类归属地位复杂。该菌曾与对人类致病的弧菌属和气单胞菌属一起归属于弧菌科，后研究发现其在分子水平跟类志贺邻单胞菌和变形杆菌属更为接近，在2005年第二版《系统细菌学伯杰氏手册》中，类志贺邻单胞菌才被确立为肠杆菌科，邻单胞菌属。

作为肠杆菌科病原菌，国内外已有过多起关于该菌引起的感染性腹泻和食物中毒的报道，可认为是一种新的引起人类腹泻的重要肠道病原菌。来自日本的一项研究发现在1994至1996年间所有引起旅行者腹泻的肠杆菌中，类志贺邻单胞菌位居第一(66.7％)。

在日常感染性腹泻病原菌监测过程中，对类志贺邻单胞菌的检测较少，在粪便样本的常规培养中往往将其忽略，并且该菌缺少特异的筛选培养基，在一些肠道培养基上形成的菌落性状与嗜水气单胞相似，难以区别，这也影响了类志贺邻单胞菌的分离率。类志贺邻单胞菌的传统检测方法需要进行选择性增菌、多种培养基筛选鉴定，整套操作步骤繁多，耗时至少6-7天，且检测结果容易受到操作人员经验丰富与否的影响。通过序列比对我们发现类志贺邻单胞菌的23S rRNA基因的5′端区域的核酸序列变异度高，可以将类志贺邻单胞菌与其他密切相近的菌属例如变形杆菌属、弧菌属以及气单胞菌属区分开来。最近，一些学者采用聚合酶链式反应(PCR)的方法对该区域的基因组DNA进行扩增检测，虽然这种方法可以节省大量的时间并使整个操作变得简单，但是这种方法在实际应用中存在不可避免的弊端。例如灵敏度低，容易对含菌量低的标本发生漏检；还有特异性差，有学者发现含有stx2基因的大肠杆菌在用该方法进行扩增时也会产生一个大小类似的扩增条带，影响了类志贺邻单胞菌的鉴定。因此在本技术领域需要建立一种针对类志贺邻单胞菌的高特异性，特别是能够鉴别诊断肠出血性大肠杆菌的检测方法。

最近几年，实时荧光TaqMan PCR技术(real time TaqMan PCR，TaqMan是罗氏公司(Roche Molecular System，Inc.)的注册商标)广泛的应用于病原体微生物的检测，普通PCR方法只能将产物从大小上进行区分，实时荧光TaqMan PCR技术在普通PCR的基础上又加入一条特异的荧光探针，并且该技术对引物与模板的同源性要求也高于普通PCR。实时荧光TaqMan PCR中的探针序列必须与目标序列完全匹配，荧光基团连接在探针的5′末端，而淬灭剂则在3′末端。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；但在PCR扩增时，随着引物的延伸Taq酶的5′-3′外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号。即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。因此比普通PCR法具有更高的特异性。但是在荧光TaqMan PCR技术的应用中，探针的选择是一个重要因素，因为其涉及到与引物的匹配，以及最关键的检测特异性的问题。在本发明中，我们针对类志贺邻单胞菌的23S rRNA基因的5′端上下游引物之间的保守序列设计了一条TaqMan探针，旨在建立一种针对该病原菌的灵敏、特异、快速的核酸检测体系。

发明内容

本发明的目的在于提供一种应用能够应用于细菌检测，特别是荧光TaqMan PCR技术的检测探针序列，更进一步提供荧光TaqMan PCR技术检测类志贺邻单胞菌方法，以及用于该方法的试剂盒。

基于以上目的，发明人对NCBI上所有的类志贺邻单胞菌核酸序列进行比对，发现该致病菌23S rRNA基因(X65487.1，Plesiomonasshigelloides)的5′端区域核酸序列特异性好，可以将类志贺邻单胞菌与其他密切相近的菌属例如变形杆菌属、弧菌属以及气单胞菌属区分开来。发明人在该区域使用引物探针设计软件Primer Express3.0(ABI)设计引物探针，并将获得的特异性引物和探针在NCBI数据库中进行比对分析，以排除引物-探针与其他物种序列可能存在的非特异性匹配，最终获得优化后的引物-探针序列。

本发明首先提供了一种用于细菌检测的探针序列，所述序列含有如SEQ ID NO：3所示的序列。序列选自于X65487.1中的第1111到1132位核苷酸.

优选地，所述序列为SEQ ID NO：3所示。

其次，本发明提供了一种荧光TaqMan PCR检测方法，所述方法包括：

(1)被检测物种的基因组DNA的抽提；

(2)以步骤(1)获得的DNA为模板进行TaqMan PCR扩增，其中上游引物为SEQ ID NO：1所示的序列，下游引物为SEQ ID NO：2所示的序列，探针序列为SEQ ID NO：3；

(3)对扩增结果进行检测分析。

上述SEQ ID NO：1选自于X65487.1中的第1165到1189位核苷酸，SEQ ID NO：2选自于X65487.1中的第906到930位核苷酸。

优选地，步骤(2)的PCR反应条件为：

优选地，所述步骤(2)和(3)在ABI 7500Fast实时荧光定量PCR仪中进行。

在上述方法中，所述物种优选为细菌。

更为优选地，所述细菌选自下述细菌：肠致病性大肠杆菌(EPEC)、肠产毒性大肠杆菌(ETEC)、肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)、肠出血性大肠杆菌(EHEC)、肠聚集性大肠杆菌(EaggEC)、尿路致病性大肠杆菌(UPEC)、福氏志贺菌、宋内志贺菌、甲型副伤寒沙门氏菌、肺炎克雷伯菌、普通变形杆菌、奇异变形杆菌、弗劳地枸橼酸杆菌、阴沟肠杆菌、粘质沙雷菌、副溶血弧菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、酿脓链球菌、血链球菌、唾液链球菌、牛链球菌、粪肠球菌、小肠结肠炎耶尔森菌、铜绿假单胞菌、嗜水气单胞菌、单增李斯特菌、空肠弯曲菌。

更为优选地，所述细菌为类志贺邻单胞菌。

更为优选地，所述细菌为肠出血性大肠杆菌。

最后，本发明还提供了一种用于细菌检测的TaqMan PCR试剂盒，所述试剂盒包括：

(1)热启动Taq DNA聚合酶；

(2)实时荧光定量PCR缓冲液；

(3)序列为SEQ ID NO：1的上游引物为和序列为SEQ ID NO：2的下游引物；

(4)序列为SEQ ID NO：3的探针。

本发明建立的实时荧光TaqMan PCR方法是首次将荧光探针运用到了类志贺邻单胞菌的检测，与普通PCR相比，实时荧光TaqMan PCR方法主要有三个优点：1、实时荧光TaqMan PCR检测方法比普通PCR方法的灵敏度高，能检测出10拷贝/μl的质粒标准品和含菌量为1.2×10³CFU/ml的粪便模拟标本，灵敏度提高了100倍。2、实时荧光TaqMan PCR方法对样本检测所需时间短，整个反应在2h内完成。3、实时荧光TaqManPCR方法的特异性更好，TaqMan探针的使用避免了非特异性扩增，在对肠出血性大肠杆菌进行检测时未产生特异性扩增曲线。

附图说明

图1为普通PCR检测灵敏度的琼脂糖凝胶电泳图；

图2为实时荧光TaqMan PCR对质粒标准品的扩增曲线图；

图3为普通PCR对类志贺邻单胞菌基因组DNA检测灵敏度的电泳图；

图4为实时荧光TaqMan PCR对类志贺邻单胞菌基因组的扩增图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改和替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例：

类志贺邻单胞菌实时荧光TaqMan PCR检测体系

(一)本发明中涉及的实时荧光TaqMan PCR引物及探针序列

上游引物为SEQ ID NO：1所示，下游引物为SEQ ID NO：2所示，探针序列为SEQ ID NO：3所示。

(二)本发明中实时荧光TaqMan PCR检测使用和涉及的主要试剂

1、热启动DNA聚合酶TaKaRa Ex Taq HS及Buffer(Premix Ex Taq^TMKit)购自宝生物工程(大连)有限公司。

2、无DNA酶和RNA酶超纯水(UltraPure^TMDnase/RNase-Free DistilledWater)，购自美国Invitrogen公司。

3、细菌基因组DNA抽提试剂盒(

Genomic DNA Purification Kit)购自Promega公司。

4、PCR产物胶回收试剂盒(QIAquick Gel Extraction Kit)，购自德国Qiagen公司。

5、PCR产物克隆试剂盒(

20-T Vector)，购自宝生物工程(大连)有限公司。

6、DL2000DNA Marker和EasyDilution均购自宝生物工程(大连)有限公司。

其余试剂均为市售分析纯产品

(三)本发明实验中使用和涉及的主要仪器。

PCR仪为Sensoquest Labcycler，德国Sensoquest产品；

离心机为Eppendorf5415D，德国Eppendorf产品；

电泳设备为北京君意东方电泳设备有限公司产品；

凝胶成像系统为Bio-Rad Gel Doc XR，美国Bio-Rad产品；

ABI 7500Fsat实时荧光定量PCR仪为美国应用生物系统公司产品。

(四)本发明中的主要实验步骤

1、引物和探针的合成

利用GenBank的Blast工具对类志贺邻单胞菌的基因序列进行分析，选择23S rRNA基因上的一段特定区域作为检测靶标，针对这段序列设计引物和探针。引物和探针均由上海基康生物公司合成。

2、细菌基因组DNA的抽提

细菌基因组DNA的抽提使用TaKaRa公司的

Genomic DNAPurification试剂盒，按照说明书进行操作。利用紫外分光光度计测定细菌基因组DNA的纯度和浓度，类志贺邻单胞菌基因组DNA用EasyDilution缓冲液稀释至3×10⁵～3×10^-3pg/μL的浓度梯度，阴性对照用EasyDilution缓冲液稀释至3×10⁴pg/μL，各种基因组DNA均少量分装，-20℃保存备用。

3、质粒标准品的构建与制备

①以SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2为引物，扩增目的基因284bp；②切胶回收，纯化PCR产物；③连接到T载体；④转化JM109感受态细胞；⑤筛选阳性克隆子，用PCR进行验证，最终测序确认；⑥提取质粒，根据质粒的分子量将质粒样品浓度换算为拷贝数浓度：每μL样品中检测基因的拷贝数＝浓度(ng/μL)×阿佛加德罗常数×10^-9/(660×重组质粒碱基数)；⑦用EasyDilution将上述质粒依次稀释成1.0×10⁰拷贝/μL～1.0×10⁹拷贝/μL，共10个浓度梯度。

4、普通PCR反应体系的建立

普通PCR反应体系如下：

PCR反应条件：

反应结束后，取5μL PCR产物在1.5％的琼脂糖凝胶上进行电泳，并在凝胶成像系统上观察分析结果。

5、实时荧光TaqMan PCR反应体系的建立

实时荧光TaqMan PCR法反应体系如下：

在ABI 7500Fast实时荧光定量PCR仪上扩增并测定结果

PCR反应条件：

扩增结束后，扣除本底荧光信号后取同一阈值分析数据，确定各样本的Ct(cycle threshold)值。

6、普通PCR与实时荧光TaqMan PCR检测体系灵敏度的评价

取质粒标准品每反应体系10⁰拷贝至10⁹拷贝，或者以3×10^-3pg/μL至3×10⁵pg/μL浓度梯度的类志贺邻单胞菌基因组DNA为模板，评价普通PCR与实时荧光TaqMan PCR检测体系的检测灵敏度。

7、检测特异性评价

以常见致病菌及条件致病菌DNA(肠致病性大肠杆菌(EPEC)、肠产毒性大肠杆菌(ETEC)、肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)、肠出血性大肠杆菌(EHEC)、肠聚集性大肠杆菌(EaggEC)、尿路致病性大肠杆菌(UPEC)、福氏志贺菌、宋内志贺菌、甲型副伤寒沙门氏菌、肺炎克雷伯菌、普通变形杆菌、奇异变形杆菌、弗劳地枸橼酸杆菌、阴沟肠杆菌、粘质沙雷菌、副溶血弧菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、酿脓链球菌、血链球菌、唾液链球菌、牛链球菌、粪肠球菌、小肠结肠炎耶尔森菌、铜绿假单胞菌、嗜水气单胞菌、单增李斯特菌、空肠弯曲菌)为模板评价实时荧光TaqMan PCR体系的特异性。

(五)结果

1.普通PCR检测体系的灵敏度

将质粒梯度稀释进行普通PCR扩增后显示：当每反应体系中23S rRNA特定序列重组质粒的模板数降低至10⁴拷贝以下时，普通PCR扩增后电泳图上未出现目的条带，阴性对照也未见扩增条带(图1)。图中泳道M为DNA分子量Marker DL2000；泳道11为阴性对照；泳道1至泳道10分别是模板量为1.0×10⁹～1.0×10⁰拷贝/反应体系的质粒标本。

2.实时荧光TaqMan PCR检测体系的灵敏度

用与普通PCR检测体系相同的质粒稀释梯度作为模板进行实时荧光PCR检测的结果显示：当23S rRNA特定序列重组质粒浓度为1.0×10²～1.0×10⁹拷贝/μL时，其荧光信号强度高于检测阈值，故其检测范围是1.0×10²～1.0×10⁹拷贝每反应体系(图2)。图中1～8是模板量依次为1.0×10⁹～1.0×10²拷贝/反应体系的质粒标本；NTC是阴性对照。在该PCR检测体系中，靶基因扩增反应的Ct值与模板浓度之间均存在良好的线性关系，相关系数为0.993。提示实时荧光PCR检测体系对类志贺邻单胞菌质粒标准品的检测灵敏度比普通PCR高100倍。

3.普通PCR与实时荧光TaqMan PCR体系对类志贺邻单胞菌基因组的检测灵敏度

将类志贺邻单胞菌基因组DNA稀释到3×10^-3～3×10⁵pgμL进行普通PCR扩增后结果显示：当基因组DNA稀释至每反应体系3×10⁰pg以下时普通PCR扩增后电泳图上未出现特异性扩增条带(图3)；图中泳道M为DNA分子量Marker DL2000；泳道N为阴性对照；泳道1至泳道9分别是模板量为3×10⁵～3×10^-3pg/反应体系的基因组DNA。用相同稀释梯度的基因组DNA进行实时荧光PCR扩增显示：当基因组DNA浓度为3×10^-2～3×10⁵pg/μL时，其荧光信号强度高于检测阈值，提示实时荧光PCR检测体系对类志贺邻单胞菌基因组DNA的检测灵敏度比普通PCR高100倍(图4)。图中1～8是模板量依次为3×10⁵～3×10^-2pg/反应体系的基因组DNA；NTC是阴性对照。

4.实时荧光TaqMan PCR体系的检测特异性

该检测体系在检测30种其他肠道致病菌及院内感染中常见的致病菌时未出现特异性扩增，说明该检测体系的特异性良好。

Claims (9)

1.一种用于细菌检测的探针序列，所述序列为SEQ ID NO：3所示。 

2.一种用于非诊断目的的荧光TaqMan PCR检测方法，所述方法包括： 

(1)被检测物种的基因组DNA的抽提； 

(2)以步骤(1)获得的DNA为模板进行TaqMan PCR扩增，其中上游引物为SEQ ID NO：1所示的序列，下游引物为SEQ ID NO：2所示的序列，探针序列为SEQ ID NO：3所示的序列； 

(3)对扩增结果进行检测分析。 

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)的PCR反应条件为： 

95℃    30s 

。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)和(3)在ABI7500Fast实时荧光定量PCR仪中进行。 

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述物种为细菌。 

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述细菌选自下述细菌：肠致病性大肠杆菌(EPEC)、肠产毒性大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌、肠聚集性大肠杆菌、尿路致病性大肠杆菌、福氏志贺菌、宋内志贺菌、甲型副伤寒沙门氏菌、肺炎克雷伯菌、普通变形杆菌、奇异变形杆菌、弗劳地枸橼酸杆菌、阴沟肠杆菌、粘质沙雷菌、副溶血弧菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、酿脓链球菌、血链球菌、唾液链球菌、牛链球菌、粪肠球菌、小肠结肠炎耶尔森菌、铜绿假单胞菌、嗜水气单胞菌、单增李斯特菌、空肠弯曲菌。 

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述细菌为类志贺邻单胞菌。 

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述细菌为肠出血性大肠杆菌。 

9.一种用于细菌检测的TaqMan PCR试剂盒，所述试剂盒包括： 

(1)热启动Taq DNA聚合酶； 

(2)实时荧光定量PCR缓冲液； 

(3)序列为SEQ ID NO：1的上游引物为和序列为SEQ ID NO：2的下游引物； 

(4)序列为SEQ ID NO：3的探针。 

Images