CN102808032B - 一种检测干细胞注射液中细菌的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种检测干细胞注射液中细菌的方法。该方法运用实时荧光定量PCR荧光探针技术实现了3小时内对常见的细菌进行快速检测，有效解决了以往细菌检测滞后的问题。该方法对常见细菌进行通用的检测，提高了细菌检测的通用性和快捷性，为细胞注射液早期的无菌检测提供了重要依据。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及细菌的快速检测方法。
背景技术
近年来，干细胞可塑性研究为各种免疫类型疾病的治疗提供了一个新的方向。干细胞免疫疗法是通过调控细胞因子，修复受损的组织细胞，然后通过细胞间的相互作用及产生细胞因子抑制受损细胞的增殖及其免疫反应，从而发挥免疫重建的功能。这种治疗方法在观念上完全不同于传统的药物治疗方法，其主要是通过修复人体免疫细胞来治疗疾病。
间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层。间充质干细胞是干细胞的一个研究分支，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而应用于治疗治疗临床上一些难治性疾病，如血液系统疾病、心血管疾病、肝硬化、神经系统疾病、膝关节半月板部分切除损伤修复、自身免疫性疾病等，根据初步的临床报告，间充质干细胞对这些疾病的治疗都取得明显的疗效。并且认为在应用间充质干细胞治疗疾病的同时不需要严格的配型。
人脐带间充质干细胞抗肝纤维化注射液（Umbilical Cord Derived Mesenchymal StemCells Injection Against Liver Fibrosis）做为临床治疗肝硬化起到了良好的效果。它作为药物制剂，其主要成分及含量：复方电解质注射液（每1000ml含氯化钠5.26g，葡萄糖酸钠5.02g，醋酸钠3.68g，氯化钾0.37g，氯化镁0.30g），68IU/ml低分子肝素钙，2%人血清白蛋白，脐带间充质干细胞5.0×105个/ml。人脐带间充质干细胞是一种贴壁细胞，在体外的实效性不得超过24小时，否则会严重影响干细胞的活力。但是按照2010年版《中国药典》的附录ⅪH无菌检查法中，干细胞抗肝纤维化注射液作为供试品的无菌检查，按规定的培养基和温度下培养14天，并在培养期间应逐日观察并记录是否有细菌生长。该药典方法检测时间与人脐带间充质干细胞抗肝纤维化注射液出厂前无菌检查时间发生了矛盾，所以需要一种3小时内快速有效的检测无菌检查方法。
细菌的16S rDNA中有多个保守区段，为所有细菌所共有，又有分子化石之称。根据这些保守区可以找出细菌通用引物，并且这些引物仅对细菌是特异性的，也就是说这些引物不会与非细菌的DNA互补，而细菌的16SrDNA可变区的差异可以用来区分不同的菌。因此16SrDNA基因已成为较理想的的临床细菌检测靶基因序列，成为细菌鉴别和检测的金标准。
实时荧光定量PCR荧光探针技术的特点有：1.具有高适应性和可靠性，实验结果稳定重复性好，特异性比一般的PCR技术更高。2.适用于样品中靶基因含量过低的定量PCR检测。3.存在与靶基因同源的序列时，普通PCR容易出现非特异性扩增，实时荧光定量PCR适用于对特异性要求较高的定量检测。4.广泛用于人类传染病的诊断和病原定量，并且数据的采集、分析全部由仪器自动完成，因此整个检测所需的时间比普通PCR要节省得多。
本发明采用实时荧光定量PCR荧光探针技术实现了3小时内对常见的细菌快速检测的目的，有效的解决了以往细菌检测滞后的问题。对常见的细菌进行通用的检测，提高了细菌检测的通用性和敏感性。为细胞注射液早期的检测无菌提供了重要依据。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速检测干细胞注射液中细菌的方法。
本发明的干细胞注射液细菌快速检测方法采用实时荧光定量PCR荧光探针技术检测干细胞注射液中的细菌，能够在3小时内完成对常见革兰氏阴性细菌和阳性细菌的检测。
在特定的实施方案中，所述干细胞注射液为人脐带间充质干细胞抗肝纤维化注射液。
本发明的干细胞注射液细菌快速检测方法中，上下游PCR引物及荧光探针序列是从细菌16S rDNA序列的保守区域中筛选得到的通用引物和通用探针（见图1），能够与常见革兰氏阴性细菌和阳性细菌的16S rDNA序列保守区域互补。在优选的实施方案中，上下游PCR引物及荧光探针序列如下：
上游引物序列：5'-TCCTACGGGAGGCAGCAGT-3'（SEQ ID NO：1）；
下游引物序列：5'-GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT-3'（SEQ ID NO：2）；
荧光探针序列：（FAM）-5'-CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3'-（TAMRA）（SEQ ID NO：3）。
上述引物和探针序列能够检测的常见细菌种类如表1所示，总计能够检测98种革兰氏阴性细菌和112种革兰氏阳性细菌。
表1 引物（SEQ ID NO：1和2）和探针（SEQ ID NO：3）可检测到常见细菌的种类
供试品：人脐带间充质干细胞抗肝纤维化注射液（Umbilical Cord DerivedMesenchymal Stem Cells Injection Against Liver Fibrosis）。脐带间充质干细胞浓度：5.0×105/ml。主要成分及含量：本品系体外培养的人脐带来源的间充质干细胞，内含复方电解质注射液（每1000ml含氯化钠5.26g，葡萄糖酸钠5.02g，醋酸钠68g，氯化钾0.37g，氯化镁0.30g），68IU/ml低分子肝素钙，2%人血清白蛋白。性状：无色或几乎无色混悬液。保存条件：2－8℃避光保存，使用时常温保存。有效期：24h。稳定性及均一性：使用时将供试品摇匀成混悬液。
阳性质控品：浓度为2cfu/μl大肠杆菌取5μl，总数量为10cfu。
阴性质控品：无菌的去离子水。
阳性干扰品：取人脐带间充质干细胞抗肝纤维化注射液，加入5μl浓度为2cfu/μl大肠杆菌。
在一个特定的实施方案中，本发明的检测方法的具体步骤如下：
(1)供试品处理：干细胞注射液混匀取1ml转移到1.5ml离心管中，4000-6000r/m离心8-12min，取上清到新的离心管中，12000-14800r/m离心5-10min，弃上清，加100-1000μl无菌的去离子水重悬，再12000-14800r/m离心5-10min，再次弃上清，各加100-1000μl无菌的去离子水重悬，再12000-14800r/m离心5-10min，弃上清加10μl无菌的去离子水重悬，取其中5μl做供试品模板。
(2)阳性对照的处理：大肠杆菌经过发酵过夜，用无菌的去离子水稀释大肠杆菌菌液浓度为2cfu/μl，取其中5μl做阳性对照模板。
(3)阴性对照的处理：取5μl无菌的去离子水做阴性对照模板。
(4)阳性干扰品的处理：干细胞注射液混匀取1ml上清到1.5ml离心管中，同时加入10μl浓度为2cfu/μl大肠杆菌菌液，4000-6000r/m离心8-12min，取上清到新的离心管中，12000-14800r/m离心5-10min，弃上清，加100-1000μl无菌的去离子水重悬，再12000-14800r/m离心5-10min，再次弃上清，加100-1000μl无菌的去离子水重悬，再12000-14800r/m离心5-10min，弃上清加10μl无菌的去离子水重悬，取其中5μl做阳性干扰品模板。
(5)扩增检测：在荧光定量PCR仪上进行，总反应体积为20μl，其中模板5μl，10μM的上下游引物各1μl，2μM的探针1μl，PCR预混液4μl，剩下的用无菌的去离子水补齐；反应条件为：①50℃2min；②95℃10min预变性；③95℃15sec，60℃1min为一个循环，共40次循环；④40℃1sec。
(6)结果判断：通过比较供试品、阳性对照、阴性对照以及阳性干扰品的Ct值确定供试品中是否含有细菌；如果阳性干扰品的Ct值和阳性对照的Ct值接近，则说明供试品的处理过程不会导致假阴性的产生；结果判断的标准为：①Ct值≥40.0的标本为阴性；②Ct值≤35.0的标本，检测结果为阳性；③Ct值在35.0-40.0之间为灰色区域，供试品的Ct值≤阳性对照的Ct值，检测结果为阳性；供试品的Ct值≥阴性对照的Ct值，检测结果为阴性。
每次检测均设立阳性对照、阴性对照、阳性干扰品和供试品各2个平行样。
本发明还提供了用于所述干细胞注射液细菌快速检测方法的试剂盒，其包括定量PCR反应液、阴性对照和阳性对照，其中PCR反应液由PCR预混液、细菌检测上游PCR引物、下游PCR引物及荧光探针组成。在优选的的实施方案中，上下游PCR引物及荧光探针序列如下：
上游引物序列：5'-TCCTACGGGAGGCAGCAGT-3'（SEQ ID NO：1）；
下游引物序列：5'-GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT-3'（SEQ ID NO：2）；
荧光探针序列：（FAM）-5'-CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3'-（TAMRA）（SEQ ID NO：3）。
本发明还提供了所述干细胞注射液细菌快速检测方法在干细胞注射液早期无菌检测中的应用。
本发明的优点与效果是：
1、本发明的方法不需要从样品中提取DNA，样品处理方法简便快速。
2、本发明的方法实现了3小时内对干细胞注射液中常见的革兰氏阴性和阳性细菌快速检测的目的，有效解决了以往细菌检测滞后的问题，为细胞注射液早期的无菌检测提供了重要依据。
附图说明
图1为本发明的上下游引物序列和探针序列在16SrDNA序列中的位置图例。
图2为本发明的大肠杆菌的实时荧光定量PCR扩增曲线。
图3为本发明的大肠杆菌的实时荧光定量PCR标准曲线。
图4为本发明的金黄色葡萄球菌的实时荧光定量PCR扩增曲线。
图5为本发明的金黄色葡萄球菌的实时荧光定量PCR标准曲线。
具体实施方式
本发明结合附图和具体实施例作进一步说明。应该理解，这些实施例仅用于说明目的，不用于限制发明范围。
以下是实施例中使用到的材料：
1、大肠杆菌（ATCC 25922）和金黄色葡萄球菌（ATCC 29213）购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。
2、人脐带间充质干细胞抗肝纤维化注射液（Umbilical Cord Derived Mesenchymal StemCells Injection Against Liver Fibrosis）由天津和泽干细胞科技有限公司提供。其中，人脐带间充质干细胞浓度：5.0×105细胞/ml，其它主要成分及含量：复方电解质注射液（每1000ml含氯化钠5.26g，葡萄糖酸钠5.02g，醋酸钠68g，氯化钾0.37g，氯化镁0.30g），68IU/ml低分子肝素钙，2%(w/v)人血清白蛋白。性状：无色或几乎无色混悬液。保存条件：2～8℃避光保存，使用时常温保存。有效期：24h。稳定性及均一性：使用时将供试品摇匀成混悬液。
3、PCR预混液购自Roche公司。
4、细菌检测上游引物、下游引物及荧光探针由invitrogen公司合成。其中：
上游引物序列为：5'-TCCTACGGGAGGCAGCAGT-3'（SEQ ID NO：1）
下游引物序列为：5'-GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT-3'（SEQ ID NO：2）
荧光探针序列为：（FAM）-5'-CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3'-（TAMRA）（SEQ ID NO：3）
5、LightCycler 2.0型荧光定量PCR仪为Roche公司产品。
实施例1实时荧光定量PCR荧光探针技术检测大肠杆菌
一、检测标准品的制备
用发酵过夜的大肠杆菌，浓度为2×109cfu/ml。取100μl大肠杆菌的菌液，用无菌的去离子水10倍稀释大肠杆菌液至108倍，编号为10的倍数EC-1至EC-8（共8管）。各取5μl做标准品的模板。同时从EC-1至EC-8各取5μl划平板，做三个平行样，细菌37℃培养14天，每天计数观察培养皿的菌落数。
取无菌的去离子5μl做空白对照的模板，编号为EC-空白。
二、扩增检测
在荧光定量PCR仪（Roche LightCycler 2.0）上进行，总反应体积20μl，其中模板5μl，10μM的上下游引物各1μl，2μM的探针1μl，PCR预混液4μl，剩下的用无菌的去离子水补齐。反应条件：①50℃2min；②95℃10min预变性；③95℃15sec，60℃1min为一个循环，共40次循环；④40℃1sec。
三、检测结果
实验与预期相符，标准品检测见图2。其中表2的Ct值结果来自图2。
表2大肠杆菌做标准品的平板菌落数和荧光定量PCR检测结果对照
大肠杆菌检测的标准曲线见图3。其中：
y=-3.3501x+40.289 R2=0.990
实施例2 实时荧光定量PCR荧光探针技术检测金黄色葡萄球菌
一、检测标准品的制备
用发酵过夜的金黄色葡萄球菌，浓度为2×108cfu/ml。取100μl金黄色葡萄球菌的菌液，用无菌的去离子水10倍稀释金黄色葡萄球菌液至107倍，编号为10的倍数SA-1至SA-7（共7管）。各取5μl做标准品的模板。同时从SA-1至SA-7各取5μl划平板，做三个平行样，细菌37℃培养14天，每天计数观察培养皿的菌落数。
取无菌的去离子5μl做空白对照的模板，编号为SA-空白。
二、扩增检测
在荧光定量PCR仪（Roche LightCycler 2.0）上进行，总反应体积20μl，其中模板5μl，10μM的上下游引物各1μl，2μM的探针1μl，PCR预混液4μl，剩下的用无菌的去离子水补齐。反应条件：①50℃2min；②95℃10min预变性；③95℃15sec，60℃1min为一个循环，共40次循环；④40℃1sec。
三、检测结果
实验与预期相符，标准品检测见图4。其中表3的Ct值结果来自图4。
表3金黄色葡萄球菌做标准品的平板菌落数和荧光定量PCR检测结果对照
金黄色葡萄球菌检测的标准曲线见图5。其中：
y=-3.2518x+38.693 R2=0.9971
实施例3通过实时荧光定量PCR荧光探针技术对人脐带间充质干细胞抗肝纤维化注射液的无菌检测
一、检测品的制备
每次检测均设立阳性对照、阴性对照、阳性干扰品和供试品各2个平行样。
供试品处理：人脐带间充质干细胞抗肝纤维化注射液混匀取出1ml转移到1.5ml离心管中，6000r/m离心12min，取上清到新的离心管中，14800r/m离心10min，弃上清，加1000μl无菌的去离子水重悬，再14800r/m离心10min，再次弃上清，加1000μl无菌的去离子水重悬，再14800r/m离心10min，弃上清加10μl无菌的去离子水重悬，取其中5μl做供试品模板。
阳性对照的处理：大肠杆菌经过发酵过夜，用无菌的去离子水10倍稀释大肠杆菌液浓度为2cfu/μl。取大肠杆菌液的5μl（大肠杆菌数量为10cfu）做阳性对照模板。
阴性对照的处理：取5μl无菌的去离子水做阴性对照模板。
阳性干扰品的处理：人脐带间充质干细胞抗肝纤维化注射液取1ml上清到1.5ml离心管中，同时加入10μl浓度为2cfu/μl大肠杆菌液，6000r/m离心12min，取上清到新的离心管中，14800r/m离心10min，弃上清，加1000μl无菌的去离子水重悬，再14800r/m离心10min，再次弃上清，加1000μl无菌的去离子水重悬，再14800r/m离心10min，弃上清加10μl无菌的去离子水重悬，取其中5μl做阳性干扰品模板。
二、扩增检测
在荧光定量PCR仪（Roche LightCycler 2.0）上进行，总反应体积20μl，其中模板5μl，10μM的上下游引物各1μl，2μM的探针1μl，PCR预混液4μl，剩下的用无菌的去离子水补齐。反应条件：①50℃2min；②95℃10min预变性；③95℃15sec，60℃1min为一个循环，共40次循环；④40℃1sec。
三、检测结果
由表4可知，阳性干扰品的Ct值和阳性对照的Ct值相近，说明供试品处理后排除了假阴性结果的可能；选取的供试品的Ct值≥阴性对照的Ct值，检测结果为阴性。
表4 检测品的平板菌落数和荧光定量PCR检测结果对照
实施例4 通过实时荧光定量PCR荧光探针技术对人脐带间充质干细胞抗肝纤维化注射液的无菌检测
一、检测品的制备
每次检测均设立阳性对照、阴性对照、阳性干扰品和供试品各2个平行样。
供试品处理：人脐带间充质干细胞抗肝纤维化注射液混匀取出1ml转移到1.5ml离心管中，4000r/m离心8min，取上清到新的离心管中，12000r/m离心5min，弃上清，加100μl无菌的去离子水重悬，再12000r/m离心5min，再次弃上清，加100μl无菌的去离子水重悬，再12000r/m离心5min，弃上清加10μl无菌的去离子水重悬，取其中5μl做供试品模板。
阳性对照的处理：同实施例3。
阴性对照的处理：同实施例3。
阳性干扰品的处理：人脐带间充质干细胞抗肝纤维化注射液取1ml上清到1.5ml离心管中，同时加入10μl浓度为2cfu/μl大肠杆菌液，4000r/m离心8min，取上清到新的离心管中，12000r/m离心5min，弃上清，加100μl无菌的去离子水重悬，再12000r/m离心5min，再次弃上清，加100μl无菌的去离子水重悬，再12000r/m离心5min，弃上清加10μl无菌的去离子水重悬，取其中5μl做阳性干扰品模板。
二、扩增检测
同实施例3。
三、检测结果
由表5可知，阳性干扰品的Ct值和阳性对照的Ct值相近，说明供试品处理后排除了假阴性结果的可能；选取的供试品的Ct值≥阴性对照的Ct值，检测结果为阴性。
表5检测品的平板菌落数和荧光定量PCR检测结果对照
本发明是结合最佳实施例进行描述，然而在阅读了本发明的上述内容后，本领域的技术人员可以对本发明做补充和修改，这些等价形式的改动同样属于本发明专利要求所限定的范围。
<110> 天津和泽干细胞科技有限公司
<120> 一种检测干细胞注射液中细菌的方法
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tcctacggga ggcagcagt 19
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggactaccag ggtatctaat cctgtt 26
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cgtattaccg cggctgctgg cac 23
Claims (6)
1.一种检测干细胞注射液中细菌的方法，其特征是采用实时荧光定量PCR荧光探针技术检测干细胞注射液中的细菌，上下游PCR引物及荧光探针序列与细菌16S rDNA序列的保守区域互补；该方法包括以下步骤：
(1)供试品处理：干细胞注射液混匀取1ml转移到1.5ml离心管中，4000-6000r/m离心8-12min，取上清到新的离心管中，12000-14800r/m离心5-10min，弃上清，加100-1000μl无菌的去离子水重悬，再12000-14800r/m离心5-10min，再次弃上清，各加100-1000μl无菌的去离子水重悬，再12000-14800r/m离心5-10min，弃上清加10μl无菌的去离子水重悬，取其中5μl做供试品模板；
(2)阳性对照的处理：大肠杆菌经过发酵过夜，用无菌的去离子水稀释大肠杆菌菌液浓度为2 cfu /μl，取其中5μl做阳性对照模板；
(3)阴性对照的处理：取5μl无菌的去离子水做阴性对照模板；
(4)阳性干扰品的处理：干细胞注射液混匀取1ml上清到1.5ml离心管中，同时加入10μl浓度为2 cfu/μl大肠杆菌菌液，4000-6000r/m离心8-12min，取上清到新的离心管中，12000-14800r/m离心5-10min，弃上清，加100-1000μl无菌的去离子水重悬，再12000-14800r/m离心5-10min，再次弃上清，加100-1000μl无菌的去离子水重悬，再12000-14800r/m离心5-10min，弃上清加10μl无菌的去离子水重悬，取其中5μl做阳性干扰品模板；
(5)扩增检测：在荧光定量PCR仪上进行，总反应体积为20μl，其中模板5μl，10μM的上下游引物各1μl，2μM的探针1μl，PCR预混液4μl，剩下的用无菌的去离子水补齐；反应条件为：①50℃ 2min；②95℃ 10min预变性；③95℃ 15 sec ，60℃ 1min为一个循环，共40次循环；④40℃ 1 sec；
(6)结果判断：通过比较供试品、阳性对照、阴性对照以及阳性干扰品的Ct值确定供试品中是否含有细菌。
2.根据权利要求1的方法，其能够在3小时内完成对常见的革兰氏阴性细菌和阳性细菌的检测。
3.根据权利要求1的方法，所述干细胞注射液为人脐带间充质干细胞抗肝纤维化注射液。
4.根据权利要求1的方法，其中上下游PCR引物及荧光探针序列分别为SEQ ID NO：1、2和3。
5.根据权利要求1的方法，其中结果判断的标准为：①Ct值≥40.0的标本为阴性；②Ct值≤35.0的标本，检测结果为阳性；③Ct值在35.0-40.0之间为灰色区域，供试品的Ct值≤阳性对照的Ct值，检测结果为阳性；供试品的Ct值≥阴性对照的Ct值，检测结果为阴性。
6.权利要求1-5任一项的方法在干细胞注射液早期无菌检测中的应用。
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2012
- 2012-08-27 CN CN 201210306849 patent/CN102808032B/zh active Active
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