CN102533959A - 一种鉴别结核分枝杆菌的多重pcr试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医学检测领域，与微生物分子生物学检测技术领域有关，本发明具体涉及一种能够对结核分枝杆菌、非结核分枝杆菌、牛结核分枝杆菌以及卡介苗同时进行快速鉴别诊断的多重PCR试剂盒。公开了针对上述分枝杆菌4个差异基因16S rRNA、IS6110、Rv2652、Rv3873特异性片段设计的4个引物对序列及多重PCR的扩增条件。本发明能够从结核病人的痰液样本中快速准确地扩增出结核分支杆菌复合群序列，并能进行种类鉴定。灵敏度为50个CFU/模板，远高于抗酸染色法，并大大简化了结核分枝杆菌的查验程序，加快了检测速度，同时还可经一次PCR鉴定多种分枝杆菌菌种，为结核病的临床快速诊断和分子流行病学调查提供了技术手段。

Description

一种鉴别结核分枝杆菌的多重PCR试剂盒

技术领域

本发明属于生物医学检测技术领域，具体涉及一种微生物分子生物学检测技术领域，具体涉及一种用于快速鉴别诊断结核分枝杆菌、非结核分枝杆菌、牛分枝杆菌以及卡介苗的多重PCR检测试剂盒。

技术背景

20世纪90年代以来，以聚合链式反应(PCR)为代表的分子生物学诊断技术在医学领域得到了的飞速发展。直到1989年研究者首次将这一技术引入到结核病的诊断以来，立即成为结核病诊断领域中备受关注的焦点。经过多年的科学研究和临床检验，使这一技术日趋完善，其反应灵敏、快速、特异的特点在多数报告中得到验证。

近年来，结核病的流行出现了新情况，也对结核病的诊断工作提出了新要求。非结核分枝杆菌和牛分枝杆菌感染呈上升趋势，感染结核病的诊断和治疗，日益引起人们的关注。由于结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非结核分枝杆菌的致病性和药物敏感性不尽相同，在临床治疗前进行病原菌的鉴别诊断显得尤为重要。目前普遍采用的方法是依靠生化手段进行型别鉴定，该方法存在耗时长、操作复杂、主观性强等缺点。而以基因分型鉴定为基础的单重PCR需要多次反应才能完成分型鉴定全过程，不仅耗时耗力，同时也增加了不确定性。

结核分枝杆菌复合群多重PCR技术是在同一PCR反应体系中，设计多对特异性引物，针对不同特异性靶区域进行扩增，经凝胶电泳检测观察各特异性扩增片段，用于结核分支杆菌检测和菌种鉴定。国内外的很多学者也做了很多相关工作，并取得一定成绩。国内2000年Ikon.JA，张宏图等首先建立了一种多重PCR方法能够特异性检测出结核分枝杆菌复合群，鸟型结核复合体以及蔓生长分枝杆菌(Ikon.JA et al，2000)。随后2001年苏明权谭庆荣等建立了一种能够特异性检测结核分枝杆菌和其他微生物的多重PCR方法(苏明权等，2000)。2005年王洪生李晓杰等利用特异性引物对结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌和堪萨斯分枝杆菌菌悬液DNA进行多重PCR扩增，能特异性地区分这四种菌，但是其灵敏度不够(王洪生等，2005)。2007年孟祥红匡铁吉等利用多重PCR方法，设计三对特异性引物能检测出分枝杆菌，并能区分结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌，但是该方法不能区分结核分枝杆菌和牛分枝杆菌(孟祥红，2007)。Gopinath等扩增hsp65、Rv3875、16S rRNA三个基因，可用于鉴别结核分枝杆菌以及禽分枝杆菌(Gopinath，2008)；Eduardo Eustáquio等扩增Rv2031c和IS6110两个基因，可用于鉴别结核分枝杆菌和牛分枝杆菌(Eduardo Eustáquio et al，2009)。但目前还没有报道可同时检测结核分枝杆菌、非结核分枝杆菌、牛分枝杆菌和卡介苗4个菌种的多重PCR方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有结核病诊断技术检测速度慢、效率低、生物安全要求高等缺陷，提供一种简便、快速、灵敏度高、特异性好的病原快速诊断方法。本发明的第二个目的在于能够通过一次PCR同时完成对结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非结核分支杆菌以及卡介苗的鉴别诊断试剂盒。

本发明以临床常见的4种分枝杆菌菌种(结核分枝杆菌，非结核分枝杆菌，牛分枝杆菌以及卡介苗)为研究对象，筛选出4个差异性基因序列16S rRNA、IS6110、Rv2652和Rv3873，并设计特异性引物，建立了一种多重PCR方法，通过在同一PCR扩增体系中同时鉴别检测四类细菌，用于结核杆菌的快速诊断和分型。实验室和临床样本验证实验证实，该方法可快速、准确地对结核分枝杆菌群成员进行检测与分型。

实现本发明的技术方案如下所述。

一种同时鉴别结核分枝杆菌、非结核分枝杆菌、牛分枝杆菌和卡介苗的多重PCR试剂盒，它包含下列试剂组合物：

扩增16S rRNA基因片段的引物对：

引物1：5’ATCGACGAAGGTCCGGGTTCTCTC3’，

引物2：5’CCGGCTTTTAAGGATTCGCTTAAC3’；

(2)扩增IS6110基因片段的引物对：

引物3：5’CGTCTCGGCTAGTGCATTGTCATAG3’，

引物4：5’TACTACGACCACATCAACCGGGAG3’；

(3)扩增Rv2652基因片段的引物对：

引物5：5’CGAGCACCAAAACGTCCCTC3’，

引物6：5’GACCCGAAACCCGGAAAGAG3’；

(4)扩增Rv3873基因片段的引物对：

引物7：5’TCGCGTTGACCGAGATGGATTAT3’，

引物8：5’CGCTCATCTCACCCAGTTGGC3’；

(5)10×酶切缓冲液；

(6)Taq酶；

(7)d NTP；

(8)甜菜碱；和

(9)小牛血清白蛋白；

在一个反应总体积为20μL的PCR反应体系中的用量：

引物1(10μM)：            1.5μL；

引物2(10μM)：            1.5μL；

引物3(10μM)：            0.5μL；

引物4(10μM)：            0.5μL；

引物5(10μM)：            1.0μL；

引物6(10μM)：            1.0μL；

引物7(10μM)：            0.7μL；

引物8(10μM)：            0.7μL；

10×酶切缓冲液            2μL；

Taq酶(5U/μL)             0.6μL；

d NTP(10mM)               1μL；

甜菜碱(0.5M)              4.5μL；

小牛血清白蛋白(10mM)      2μL；

模板DNA                   2μL；

PCR反应扩增程序：

预变性：95℃5分钟；变性：95℃45秒；复性：56℃50秒；延伸：72℃2分钟；循环次数：30次；延伸：72℃10分钟。

本发明根据已经公布的分支杆菌属主要致病菌的基因序列信息(见实施例所述)，筛选出四个差异性基因，即，16S rRNA，IS6110，Rv2652，Rv3873，通过生物信息学分析，选定这四个基因序列的靶区段，进一步设计4对特异性寡聚核苷酸引物。然后以上述四种标准菌株为PCR反应模板，探索合适的PCR扩增体系和反应条件，建立完善的多重PCR方法；再用模拟样本和临床痰液样本来验证该方法的灵敏度、特异性和重复性等指标。

本发明的主要优点：

(1)本发明操作简便、快捷，只需要数小时就能完成对结核分枝杆菌，非结核分枝杆菌，牛分枝杆菌以及卡介苗的鉴别检测。

(2)本发明能够准确扩增到50个CFU/模板，灵敏性和特异性远高于抗酸染色和分菌培养等传统的结核分枝杆菌诊断方法。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1-4是多重PCR扩增的4个基因片段：即16S rRNA、IS6110、Rv2652和Rv3873的部分核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO：5-12是本发明设计的扩增上述四个基因片段的的四对寡聚核苷酸引物(共8条引物)。

图1：多重PCR检测牛分枝杆菌(M.bovis)的敏感性试验。图中所示牛分枝杆菌显示3条带，各泳道模板中含菌量分别为(个菌)：1：10⁴；2：5×10³；3：10³；4：500；5：200；6：100；7：50；8：25；9：13；10：6；11：3；12：2；13：1；14：1/2；…17：空白对照。

图2：多重PCR检测结核分枝杆菌(H37RV)的敏感性试验。图中所示各泳道模板中含菌量分别为(个菌)：1：10⁴；2：5×10³；3：10³；4：500；5：200；6：100；7：50；8：25；9：13；10：6；11：3；12：2；13：1；14：1/2；…17：空白对照。

图3：是16S rRNA、IS6110、Rv2652和Rv3873四个基因片段的核苷酸序列，下划线部分为引物序列。

具体实施方式

以下结合说明书附图对本发明的具体实施方式作进一步说明。

实施例1

1、引物设计

根据GenBank已经公布的分支杆菌属主要致病菌的基因序列信息，筛选出四个差异性基因16S rRNA(登录号HM803175)，IS61109(登录号DQ217928)，Rv2652(登录号AD000019.1)，Rv3873(登录号DQ229941)，并根据这四个基因片段序列设计4对特异性的寡聚核苷酸引物。所述的引物对的核苷酸序列分别如下所述：

扩增16S rRNA基因片段：

引物1：5’ATCGACGAAGGTCCGGGTTCTCTC3’(对应SEQ ID NO：5所示的序列)

引物2：5’CCGGCTTTTAAGGATTCGCTTAAC3’(对应SEQID NO：6所示的序列)

扩增IS6110基因片段：

引物3：5’CGTCTCGGCTAGTGCATTGTCATAG3’(对应SEQ ID NO：7所示的序列)

引物4：5’TACTACGACCACATCAACCGGGAG3’(对应SEQ ID NO：8所示的序列)

扩增Rv2652基因片段：

引物5：5’CGAGCACCAAAACGTCCCTC3’(对应SEQ ID NO：9所示的序列)

引物6：5’GACCCGAAACCCGGAAAGAG3’(对应SEQ ID NO：10所示的序列)

扩增Rv3873基因片段：

引物7：5’TCGCGTTGACCGAGATGGATTAT3’(对应SEQ ID NO：11所示的序列)

引物8：5’CGCTCATCTCACCCAGTTGGC3’(对应SEQ ID NO：12所示的序列)

2、多重PCR反应

(1)多重PCR反应体系

PCR反应是在PE-9600扩增仪中进行的。体系中的试剂组合物如下：模板DNA、寡聚核苷酸引物对、Taq酶、dNTP、小牛血清白蛋白(BSA)、甜菜碱和10×Buffer(缓冲液)。其中，Taq酶、10×Buffer购自Fermentas公司。本实施例的PCR反应体系中各成分的浓度如表1

表1  PCR反应试剂组合物

(2)PCR扩增条件

经过对多种温度和时间的检测，最终确定多重PCR扩增的程序如下：

预变性：95℃5分钟；

变性：95℃45秒；

复性：56℃50秒；

延伸：72℃2分钟

循环次数：30次；

延伸：72℃10分钟。

(3)结果检测

基于扩增产物片段长度的梯度性差异，用琼脂糖凝胶电泳对其进行分离，溴化乙淀(EB)染色后判断结果。

所选用的电泳检测原料，仪器和试剂如下：

琼脂糖凝胶成分：0.5g琼脂糖粉，1×TAE 50mL

电泳槽、电泳仪：DYY-2C(北京六一仪器厂产品)

电泳条件：上样量：5μL；采用恒压方式电泳：120V，35分钟

显色成像过程：2％EB溶液浸泡10分钟后，经凝胶成像系统观察结果(见图1-2)。

(4)结果判定

由图1-2，当只出现16s rRNA(824bp)的目的条带，则判定样品中含有非结核分枝杆菌复合群细菌存在。

当出现两条带，即出现16s rRNA(824bp)条带以及IS6110(621bp)条带，则判定样品中含有结核分枝杆菌复合群细菌存在。

当出现3条带，即出现16s rRNA(824bp)条带，IS6110(621bp)条带和RV3877(418bp)条带，则判定样品中含有结核分枝杆菌或者牛分枝杆菌存在。

当出现4条带，即出现16s rRNA(824bp)条带，IS6110(621bp)条带，RV3877(418bp)条带，以及RV2652(254bp)条带，则判定样品中含有结核分枝杆菌存在。

2、多重PCR灵敏度检测

首先进行牛分枝杆菌东京株和结核分支杆菌北京株(两菌株购自中国兽医药品监察所)的细菌计数，具体方法如下：取牛分枝杆菌和结核分支杆菌的菌液，倍比稀释后，均匀涂布在Middle Brook 7H10固体培养基(购自青岛海博生物有限公司)上，放入37℃温箱中培养4周，通过观察菌落数来确定结核菌数。用双蒸水进行倍比稀释后，于100℃煮沸15min，作为多重PCR的模板，进行多重PCR的敏感性检测，结果表明本发明的多重PCR的敏感性能够达到50个菌/模板，即灵敏度为50个菌(见图1、图2)。

3、临床痰液样本检测

(1)临床痰液样本处理

采集不同结核病疑似病人的新鲜痰液，在收集痰液样品中加入2倍体积4％氢氧化钠溶液，振荡混匀，使其充分液化；12000rpm/min离心15min；弃上清，加1mL PBS(pH7.6)，重悬均匀后，12000rpm/min离心10min，弃上清，重复本步骤1次；取沉淀加入50μL DNA快速提取液，80℃水浴15min，-20℃备用。

利用上述的多重PCR诊断方法，对115份疑似结核病人的临床痰液样本进行了检测，并同时做了抗酸染色涂片和分枝杆菌培养对照，结果如表2所示。

结果显示证实本发明能很好地完成结核病疑似病人对临床痰液样本的鉴别诊断，其灵敏性、特异性或检测效率高于常规抗酸染色和分菌培养的结核分枝杆菌诊断方法。

表2  本发明的方法与常规抗酸染色涂片法对结核分枝杆菌的诊断

注：表2所述的试验参考《全国结核病防治工作手册》；

参考文献

1.张宏图.多重聚合酶链反应检测结核病及结节病中结核杆菌.世界医学杂志，2000：136-142；

2.苏明权，谭庆荣.多重聚合酶链反应快速检测脑膜炎中的病原体.第四军医大学学报，2000，4：24-29；

王洪生，李晓杰.四种分枝杆菌快速检测方法的研究.中华皮肤科杂志，2005，5：26-40.

3.孟祥红.匡铁吉应用多重PCR方法快速鉴定结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌.解放军医学杂志，2007：11-17；

4.K.Gopinath and S.Singh；Multiplex PCR assay for simultaneous detectionanddifferentiation of Mycobacterium tuberculosis，Mycobacterium avium complexes andother Mycobacterial species directly from clinical specimens[J]Journal of AppliedMicrobiology，2008，425-435；

5.Eduardo Eustáquio de Souza Figueiredol；Ricardo Cezar Tavares Carvalho2；FláviaGalindo Silvestre.Detection of mycobacterium bovis dna in nasal swabs fromtuberculous cattle by a multiplex pcr[J]Brazilian Journal of Microbiology，2010，41：386-390。

Claims (1)

1.一种同时鉴别结核分枝杆菌、非结核分枝杆菌、牛分枝杆菌和卡介苗的多重PCR试剂盒，其特征在于，它包含下列试剂组合物：

(1)扩增16S rRNA基因片段的引物对：

引物1：5’ATCGACGAAGGTCCGGGTTCTCTC3’，

引物2：5’CCGGCTTTTAAGGATTCGCTTAAC3’；

(2)扩增IS6110基因片段的引物对：

引物3：5’CGTCTCGGCTAGTGCATTGTCATAG3’，

引物4：5’TACTACGACCACATCAACCGGGAG3’；

(3)扩增Rv2652基因片段的引物对：

引物5：5’CGAGCACCAAAACGTCCCTC3’，

引物6：5’GACCCGAAACCCGGAAAGAG3’；

(4)扩增Rv3873基因片段的引物对：

引物7：5’TCGCGTTGACCGAGATGGATTAT3’，

引物8：5’CGCTCATCTCACCCAGTTGGC3’；

(5)10×酶切缓冲液；

(6)Taq酶；

(7)d NTP；

(8)甜菜碱；和

(9)小牛血清白蛋白；

在一个反应总体积为20μL的PCR反应体系中的用量：

引物1(10μM)：            1.5μL；

引物2(10μM)：            1.5μL；

引物3(10μM)：            0.5μL；

引物4(10μM)：            0.5μL；

引物5(10μM)：            1.0μL；

引物6(10μM)：            1.0μL；

引物7(10μM)：            0.7μL；

引物8(10μM)：            0.7μL；

10×酶切缓冲液            2μL；

Taq酶(5U/μL)             0.6μL；

d NTP(10mM)               1μL；

甜菜碱(0.5M)                4.5μL；

小牛血清白蛋白(10mM)        2μL；

模板DNA                     2μL；

PCR反应扩增程序：

预变性：℃95℃5分钟；变性：95℃45秒；复性：56℃50秒；延伸：72℃2分钟；循环次数：30次；延伸：72℃10分钟。

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