CN113667728B - 一种基于纳米孔测序仪的分枝杆菌快速鉴定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于纳米孔测序仪的分枝杆菌快速鉴定方法，属于分子生物学领域，本发明包括如下步骤：步骤一，设计结核分枝杆菌插入序列IS6110、hsp65、rpoB、16S rRNA、gyrB基因待测区域的特异性引物；步骤二，得到含有特定碱基序列的引物并混合形成引物池；步骤三，合成Barcode引物；步骤四，提取基因组DNA；步骤五，第一轮扩增并纯化；步骤六，第二轮扩增并纯化；步骤七，构建测序文库并纯化；步骤八，使用纳米测序仪测序，对数据进行质控分析后，进行数据分析；本发明通过找到这5种靶基因组合的扩增引物，使扩增序列能对分枝杆菌不同菌种进行鉴定区分，实现快速、准确、灵敏的鉴定分歧杆菌。

Description

一种基于纳米孔测序仪的分枝杆菌快速鉴定方法
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，特别是一种基于纳米孔测序仪的分枝杆菌快速鉴定方法。
背景技术
结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）是引起人类结核病的主要病原菌。结核病是威胁人类健康的重要公共卫生问题之一，是全球各大死因中重要原因。非结核分枝杆菌（NTM）与MTB同属于分枝杆菌属，有少部分可引起人类感染（如鸟胞内分枝杆菌复合群、堪萨斯分枝杆菌、脓肿分枝杆菌等），NTM感染可以具有与结核病相似的临床表现，近年来NTM感染有逐渐增加的趋势。因此对于两者的菌种鉴定对于临床诊断与治疗具有重要意义；根据以上市场需求，本司研究了以下技术。
多重聚合酶链式反应（Multiplex PCR）技术，是在一个反应体系中加入两对以上的引物，达到同时扩增出多个核酸片段的目的。
分子诊断技术具备灵敏度高、特异性好、周期短等诸多优点。目前已广泛用于MTB病原学检测以及分枝杆菌菌种鉴定。其主要原理是以分枝杆菌相关基因作为标志物，完成对标本中是否含有分枝杆菌核酸的检测。
纳米孔测序技术，可以通过扩增子富集DNA（cDNA）目标序列、加接头、制备文库测序。利用接头上的马达蛋白解旋DNA双链，并牵引单链分子穿过固定在电阻膜上的纳米孔蛋白，不同的碱基会形成特征性离子电流变化信号。纳米孔测序仪再将这种电信号转化为化学信号，最终获得DNA序列。
市场需要找到几种靶基因组合的扩增引物，使扩增序列能对分枝杆菌不同菌种进行鉴定区分，将纳米孔测序技术与多重PCR相结合，设计建库测序方法，能够快速、准确、灵敏的检测，本发明解决这样的问题。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种基于纳米孔测序仪的分枝杆菌快速鉴定方法，本发明通过找到IS6110、hsp65、rpoB、16S rRNA、gyrB基因这5种靶基因组合的扩增引物，使扩增序列能对分枝杆菌不同菌种进行鉴定区分，再配合纳米孔测序技术与多重PCR相结合，实现快速、准确、灵敏的鉴定分歧杆菌。
为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种基于纳米孔测序仪的分枝杆菌快速鉴定方法，包括如下步骤：
步骤一，设计结核分枝杆菌插入序列IS6110、hsp65、rpoB、16S rRNA、gyrB基因待测区域的特异性引物MTB-IS6110-F、MTB-IS6110-R，MTB-hsp65-F、MTB-hsp65-R，MTB-rpoB-F、MTB-rpoB-R，MTB-16s-F、MTB-16s-R，MTB-gyrB-F、MTB-gyrB-R；扩增产物为427-533 bp；
步骤二，在正向引物的5’端加上AGGTCTTCACGATACGTCGAG碱基序列，在反向引物的5’端加上GTCCAATCAGTTGCAGCTTCAG碱基序列，得到含有特定碱基序列的引物Nano-MTB-IS6110-F、Nano-MTB-IS6110-R，Nano-MTB-hsp65-F、Nano-MTB-hsp65-R，Nano-MTB-rpoB-F、Nano-MTB-rpoB-R，Nano-MTB-16s-F、Nano-MTB-16s-R，Nano-MTB-gyrB-F、Nano-MTB-gyrB-R；合成这些含有特定碱基序列的引物，将Nano-MTB-IS6110-F、Nano-MTB-IS6110-R，Nano-MTB-hsp65-F、Nano-MTB-hsp65-R，Nano-MTB-rpoB-F、Nano-MTB-rpoB-R，Nano-MTB-16s-F、Nano-MTB-16s-R，Nano-MTB-gyrB-F、Nano-MTB-gyrB-R这五对引物混合，形成引物池；
步骤三，合成Barcode 引物，每个Barcode引物对应一个样本，使每个样本带有不同的Barcode标签；
步骤四，提取基因组DNA；
步骤五，用引物池进行第一轮扩增并纯化；
步骤六，用Barcode引物进行第二轮扩增并纯化；
步骤七，构建测序文库并纯化；
步骤八，使用纳米测序仪测序，对数据进行质控分析后，进行数据分析。
前述的一种基于纳米孔测序仪的分枝杆菌快速鉴定方法，步骤二中的引物MTB-IS6110-F、MTB-IS6110-R、MTB-hsp65-F、MTB-hsp65-R、MTB-rpoB-F、MTB-rpoB-R、MTB-16s-F、MTB-16s-R、MTB-gyrB-F、MTB-gyrB-R的序列分别是：SEQ01、SEQ02、SEQ03、SEQ04、SEQ05、SEQ06、SEQ07、SEQ08、SEQ09、SEQ10。
前述的一种基于纳米孔测序仪的分枝杆菌快速鉴定方法，步骤一中的引物Nano-MTB-IS6110-F、Nano-MTB-IS6110-R、Nano-MTB-hsp65-F、Nano-MTB-hsp65-R、Nano-MTB-rpoB-F、Nano-MTB-rpoB-R、Nano-MTB-16s-F、Nano-MTB-16s-R、Nano-MTB-gyrB-F、Nano-MTB-gyrB-R的序列分别是：SEQ11、SEQ12、SEQ13、SEQ14、SEQ15、SEQ16、SEQ17、SEQ18、SEQ19、SEQ20。
前述的一种基于纳米孔测序仪的分枝杆菌快速鉴定方法，
步骤二中，Nano-MTB-IS6110-F、Nano-MTB-IS6110-R，Nano-MTB-hsp65-F、Nano-MTB-hsp65-R，Nano-MTB-rpoB-F、Nano-MTB-rpoB-R，Nano-MTB-16s-F、Nano-MTB-16s-R，Nano-MTB-gyrB-F、Nano-MTB-gyrB-R引物的浓度分别为15 µM、15 µM、40 µM、40 µM、50 µM、50 µM、60 µM、60 µM、40 µM、40 µM，将引物等体积比例混合，形成引物池。
前述的一种基于纳米孔测序仪的分枝杆菌快速鉴定方法，
步骤五中用引物池扩增富集基因组DNA的反应总体系包括：2×PCR mix（Vazyme）25μl，引物池5μl，基因组DNA 100 ng，ddH2O补足至50μl；
反应程序为：95 ℃ 预变性5min；95 ℃变性15s ，58 ℃退火60s，72 ℃延伸15s，20个循环；95 ℃变性15s ，62 ℃退火60s，72 ℃延伸15s，20个循环；循环结束后72 ℃延伸5min，4 ℃保存；
纯化采用磁珠纯化。
前述的一种基于纳米孔测序仪的分枝杆菌快速鉴定方法，步骤六中第二轮扩增反应包括：2×PCR mix 25μl，Barcode引物 2μl，第一轮扩增纯化后产物23μl；
反应程序为：95 ℃ 预变性5min；95 ℃变性15s ，62 ℃退火15s，72 ℃延伸30s，12个循环；循环结束后72 ℃延伸5min，4 ℃保存；
纯化采用磁珠纯化。
前述的一种基于纳米孔测序仪的分枝杆菌快速鉴定方法，步骤七中构建测序文库并纯化的具体方法包括：
（1）pooling：将第二次扩增后的纯化产物进行pooling；
（2）末端修复、加A尾：总体系为：pooling完的DNA溶液50μl，末端修复mix 15μl；反应程序为：20 ℃ 反应15min，65 ℃终止反应 15min，4 ℃保存；
（3）末端修复进行磁珠纯化；
（4）接头连接的总体系为：末端修复纯化后产物25μl，5×连接缓冲液 10μl，DNA连接酶 5μl，Adapter Mix 1μl，ddH2O 9μl；反应程序为，20 ℃ 反应15min，4 ℃保存；
（5）将接头连接产物进行磁珠纯化后得到终文库；
（6）测定终文库qubit浓度。
前述的一种基于纳米孔测序仪的分枝杆菌快速鉴定方法，步骤八中使用Nanopore公司的MinION测序仪，测序试剂盒：SQK-LSK109，测序芯片：R9进行纳米测序仪测序。
前述的一种基于纳米孔测序仪的分枝杆菌快速鉴定方法，步骤八中使用纳米测序仪测序，对数据进行质控分析后，进行数据分析的具体步骤包括：
（a） 芯片诱发：配置诱发剂后诱发；
诱发剂为：15μl FLT，500μl FB， 200μl 去酶水；
（b）上机文库点样：配置上机文库后加样，加样完毕后，盖上加样孔的盖子，关闭诱发试剂孔，插上数据线，与上机电脑相连接，设置上机程序后开始测序；
上机文库为：18.8μlsQB，12.8μl LB，100 ng 终文库，然后加入ddH2O补充至47μl；
（c）数据下机后，通过对下机数据进行质控分析：将序列长度小于400bp或者大于600bp的序列进行过滤，得到400-600bp的目标序列；再将目标序列与数据库中的分枝杆菌基因组序列进行比对，完成质控；
（d）将质控后的序列与分枝杆菌基因组靶序列比对后一致，即可判定是否存在相应的分枝杆菌。
采用上述技术方案后，本发明的有益之处在于：
本发明通过找到5种靶基因组合的扩增引物，这5种的扩增序列组合能够对分枝杆菌不同菌种进行鉴定区分，具有协同作用；将纳米孔测序技术与多重PCR相结合，设计建库测序方法，使多重PCR得到的扩增子序列能有效地连接上接头，并高效地通过纳米孔，最终得到预期目标序列；采用本发明的检测方法准确度可达99%以上；
本发明使用分子测序的手段进行检测，可将分枝杆菌鉴定到“种”水平；
本发明与常规的结核分枝杆菌分子检测手段相比的优势在于可以同时进行多样本的检测、可以对临床样本分枝杆菌多重感染进行鉴定，降低假阳性样本的检出率；
本发明选取的菌种鉴定位点全面地涵盖了临床上常见的MTB与NTM菌种，可以为临床诊断与治疗提供依据；
本发明流程简单，操作简便，不需要依赖特别大型与昂贵的设备；
本发明配合纳米孔测序仪MinION，即可完成测序，此款测序仪仅有手掌大小，可以实现实时测序，具备非常高的可移动性与灵活性；样本从标本处理直到完成数据分析可短至8小时，相比其它分子测序平台耗时最短。
附图说明
图1为本发明文库构建的流程示意图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
根据如下的基于纳米孔测序仪的分枝杆菌快速鉴定方法验证本发明的技术效果，包括如下步骤：
步骤一，设计结核分枝杆菌插入序列IS6110、hsp65、rpoB、16S rRNA、gyrB这五个基因组合待测区域的特异性引物，扩增产物为427-533 bp。引物序列信息见表1。
本发明中选择同时检测IS6110、hsp65、rpoB、16S rRNA、gyrB这5个靶标，既弥补了单一序列鉴别能力的不足（如16S rRNA基因无法区分堪萨斯分枝杆菌与胃分枝杆菌，而rpoB基因能将两者鉴别出来），也可减少少单一序列公用数据库不完整或数据错误引起的错误鉴定。
表1 结核分枝杆菌插入序列IS6110特异性引物
步骤二，在上述正向引物的5’端加上AGGTCTTCACGATACGTCGAG碱基序列，反向引物的5’端加上GTCCAATCAGTTGCAGCTTCAG碱基序列，具体见表2：
表2含特定碱基序列的引物
合成含有特定碱基序列的引物，Nano-MTB-IS6110-F、Nano-MTB-IS6110-R，Nano-MTB-hsp65-F、Nano-MTB-hsp65-R，Nano-MTB-rpoB-F、Nano-MTB-rpoB-R，Nano-MTB-16s-F、Nano-MTB-16s-R，Nano-MTB-gyrB-F、Nano-MTB-gyrB-R的浓度分别为15 µM、15 µM、40 µM、40 µM、50 µM、50 µM、60 µM、60 µM、40 µM、40 µM，将引物等体积比例混合，形成引物池；需要说明的是：这是一种优选，其他比例也能实现本发明。
步骤三，合成Nanopore公司的二轮扩增barcode 引物，共96种（这里只合成了前12种）。具体见表3：
表3 Barcode引物
步骤四，4例样本肺泡灌洗液中基因组DNA的提取
4例样本（编号1、2、3、4）各取1.8 ml肺泡灌洗液样本于装有约200mg的0.5mm研 磨珠的2 ml离心管中，12000rpm，室温离心10min。
弃上清，加入500 µl裂解液，20μl的蛋白酶K，10μl的溶菌酶。置于研磨机中研 磨，60Hz，研磨 5min。
75 ℃金属浴10min。
12000rpm，室温离心3min，然后取400µl上清于另一1.5 ml离心管。加入400μl 无水乙醇，20μl羟基磁珠（磁珠提前30min室温平衡）。充分涡旋混匀后室温静置5min。
瞬离，将离心管置于磁力架上吸附、静置后弃上清。
加入600μl Wash Buffer 1，涡旋混匀，瞬离后置于磁力架上吸附、静置后弃上 清。
加入800μl 80%乙醇，涡旋混匀，瞬离后置于磁力架上吸附、静置后弃上清。
重复步骤一次，并弃净残留的乙醇，开盖室温晾干至磁珠干燥。
加入120μl无核酸水，吹打混匀磁珠，室温静置5min。然后置于磁力架上2min后 吸取上清即得到基因组DNA。
测定qubit浓度为1：8.33 ng/µl，2：23.5 ng/µl，3：4.27 ng/µl，4：7.5 ng/µl。
步骤五，4例样本目标序列扩增子富集与产物纯化：
PCR富集扩增子与文库构建流程见图1。
用混合好的引物池对4例样本DNA进行PCR扩增（加上1个PCR阴性对照）：反应总 体系50μl，其中2×PCR mix（Vazyme）25μl，引物池5μl，基因组DNA 100 ng，ddH2O补足至50μ l。反应程序为：95 ℃ 预变性5min；95 ℃变性15s ，58 ℃退火60s，72 ℃延伸15s，20个循 环；95 ℃变性15s ，62 ℃退火60s，72 ℃延伸15s，20个循环；循环结束后72 ℃延伸5min，4 ℃保存。
在50μl PCR产物加入35μl AMpure XP Beads，吹打混匀后室温静置5min；置于 磁力架上，待2-5min液体澄清后弃上清；加入200μl 新配的80%乙醇，磁力架上静置30s后弃 上清，重复一次；吸干净残留的乙醇，开盖室温晾干约5min，待磁珠干燥即加入25μl ddH2O 洗脱DNA；吹打混匀后室温静置3min，吸取23μl 用于第二次扩增。
步骤六，二轮扩增：
用Barcode引物（BC01-BC05）进行PCR扩增：反应总体系50μl，其中2×PCR mix （Vazyme）25μl，Barcode引物 2μl，第一轮扩增纯化后产物23μl。反应程序为：95 ℃ 预变性 5min；95 ℃变性15s ，62 ℃退火15s，72 ℃延伸30s，12个循环；循环结束后72 ℃延伸 5min，4 ℃保存。
磁珠纯化方法与实施例3中的方法完全相同。
测定纯化产物qubit浓度为1：28.6 ng/µl，2：10.5 ng/µl，3：10.8 ng/µl，4： 2.53 ng/µl，NC（PCR阴性对照）：0.386 ng/µl。
步骤七，测序文库的构建、纯化：
pooling：将第二次扩增后的5份纯化产物按照每个样本100 ng进行pooling （不足100ng的加10μl），然后用ddH2O补充总体积至50μl。
末端修复、加A尾：总体系为65μl，pooling完的DNA溶液50μl，末端修复mix （Vazyme）15μl。反应程序为，20 ℃ 反应15min，65 ℃终止反应 15min，4 ℃保存。
末端修复纯化，在65μl PCR产物加入52μl AMpure XP Beads，之后纯化方式与 实施例3 中的纯化方法相同，最后洗脱DNA时用27μl ddH2O洗脱，取25μl用于接头连接。
接头连接：总体系为50μl，末端修复纯化后产物25μl，5×Ligation Buffer （NEB）10μl，T4 Rapid DNA Ligase（NEB）5μl，Adapter Mix（Nanopore）1μl，ddH2O 9μl。反应 程序为，20 ℃ 反应15min，4 ℃保存。
接头连接产物纯化：在50μl 接头连接产物中加入35μl AMpure XP Beads，吹 打混匀后室温静置5min；置于磁力架上，待2-5min液体澄清后弃上清；加入200μlsFB （Nanopore），磁力架上静置30s后弃上清，重复一次；吸干净残留的乙醇，开盖室温晾干约 5min，待磁珠干燥即加入15μl ddH2O洗脱DNA；吹打混匀后室温静置3min，吸取13μl 即得到 终文库。
测定终文库qubit浓度为：21.1 ng/µl。
步骤八，
使用Nanopore公司的MinION测序仪（测序试剂盒：SQK-LSK109，测序芯片：R9）
芯片诱发：
诱发剂的配制：取一个1.5 ml EP管，加入15μl FLT，500μl FB，然后加入200μl 的去酶水，吹打混匀。
诱发：将已质检完毕的芯片插入到上机机器中，打开加诱发试剂的孔，用1000μl的移液枪，吸取450μl的诱发剂，加入诱发剂前先调小一点量程，使枪尖带有小液珠，插入孔中，调小量程使液体缓缓进入芯片。诱发剂加入完毕后，关闭孔洞静置5min。接着打开孔洞，按照上一步方法继续加入200μl的诱发剂。
上机文库点样：
上机文库的配置：取一个EP管，加入18.8μlsQB，12.8μl LB，100 ng 终文库，然后加入ddH2O补充至47μl，吹打混匀。
加样：打开加样孔，用100μl的移液枪，吸取47μl的上机文库，加样时，枪尖悬空在加样孔上方，确保上机文库一滴一滴地加入。加样完毕后，盖上加样孔的盖子，关闭诱发试剂孔，插上数据线，与上机电脑相连接，设置上机程序后开始测序。
数据下机后，通过对下机数据进行质控分析：将序列长度小于400bp或者大于 600bp的序列进行过滤，得到400-600bp的目标序列。再将序列与数据库中的分枝杆菌基因 组序列进行比对。
数据分析结果见表4，当质控后的序列与某种分枝杆菌基因组靶序列比对后一 致，即可判定本次实验检测到了相应的分枝杆菌。因此可得出结论：样本1中检测到结核分 枝杆菌，样本2中检测到胞内分枝杆菌、样本3中检测到脓肿分枝杆菌，样本4中未检测到分 枝杆菌，阴性对照无分枝杆菌污染。
表4 4例样本使用本发明检测分析结果
（注：Barcode列即不同样本使用的Barcode标签）
实验一：本发明方法特异性验证实验
为了验证本发明对于分枝杆菌阳性样本检出的准确性，以及对于不含分枝杆菌阴性样本检测的特异性，本实施例对20例不同样本使用本发明进行了检测。这些样本均已通过一代测序验证所含有的病原菌。具体见表5：
表5 20例样本使用本发明的验证结果
表5的实验结果说明，对于已知的10例不同的分枝杆菌阳性样本（结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、副胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、龟分枝杆菌、偶发分枝杆菌、海分枝杆菌、耻垢分枝杆菌），本发明均能准确地检测出。对于不含分枝杆菌的10种样本（大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎链球菌、诺卡氏菌、白色念珠菌、隐球菌、铜绿假单胞菌、流感嗜血杆菌、人类副流感病毒），本发明均未检测到分枝杆菌，说明特异性高。另外需要说明的是，由于样本的限制，本发明只对部分分枝杆菌进行了验证，理论上使用本发明所述的方法对于其它易造成临床感染的非结核分枝杆菌也能进行鉴定（包括但不限于胃分枝杆菌、日内瓦分枝杆菌、猿分枝杆菌、戈登分枝杆菌、玛尔摩分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、蟾分枝杆菌、马萨分枝杆菌）。
本发明通过找到5种靶基因组合的扩增引物，这5种的扩增序列组合能够对分枝杆菌不同菌种进行鉴定区分，具有协同作用；将纳米孔测序技术与多重PCR相结合，设计建库测序方法，使多重PCR得到的扩增子序列能有效地连接上接头，并高效地通过纳米孔，最终得到预期目标序列；采用本发明的检测方法准确度可达99%以上。
除上述优选实施例外，本发明还有其他的实施方式，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变和变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明权利要求书中所定义的范围。
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<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
tgatgtggtc gtagtaggt 19
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
ggtcatgtca ggtggttc 18
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
gacgacagca tggagcagat 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
gcatggccaa gtcgtgcagc 20
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
tgtcctagtc gtactctg 18
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
cttgcgctag atgtccaa 18
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
tactcgagtg gcgaacgg 18
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
gctgctggca cgtagttggc 20
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
tatgcgatac ctggtcgtct g 21
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
tccaggatgc tgctatgtat c 21
<210> 11
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
aggtcttcac gatacgtcga gtgatgtggt cgtagtaggt 40
<210> 12
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
gtccaatcag ttgcagcttc agggtcatgt caggtggttc 40
<210> 13
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
aggtcttcac gatacgtcga ggacgacagc atggagcaga t 41
<210> 14
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 14
gtccaatcag ttgcagcttc aggcatggcc aagtcgtgca gc 42
<210> 15
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 15
aggtcttcac gatacgtcga gtgtcctagt cgtactctg 39
<210> 16
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 16
gtccaatcag ttgcagcttc agcttgcgct agatgtccaa 40
<210> 17
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 17
aggtcttcac gatacgtcga gtactcgagt ggcgaacgg 39
<210> 18
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 18
gtccaatcag ttgcagcttc aggctgctgg cacgtagttg gc 42
<210> 19
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 19
aggtcttcac gatacgtcga gtatgcgata cctggtcgtc tg 42
<210> 20
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 20
gtccaatcag ttgcagcttc agtccaggat gctgctatgt atc 43
<210> 21
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 21
aagaaagttg tcggtgtctt tgtg 24
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 22
tcgattccgt ttgtagtcgt ctgt 24
<210> 23
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 23
gagtcttgtg tcccagttac cagg 24
<210> 24
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 24
ttcggattct atcgtgtttc ccta 24
<210> 25
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 25
cttgtccagg gtttgtgtaa cctt 24
<210> 26
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 26
ttctcgcaaa ggcagaaagt agtc 24
<210> 27
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 27
gtgttaccgt gggaatgaat cctt 24
<210> 28
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 28
ttcagggaac aaaccaagtt acgt 24
<210> 29
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 29
aactaggcac agcgagtctt ggtt 24
<210> 30
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 30
aagcgttgaa acctttgtcc tctc 24
<210> 31
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 31
gtttcatcta tcggagggaa tgga 24
<210> 32
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 32
caggtagaaa gaagcagaat cgga 24

Claims (7)

1.一种基于纳米孔测序仪的分枝杆菌快速鉴定引物在制备分枝杆菌鉴定产品中应用，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，设计结核分枝杆菌插入序列IS6110、hsp65、rpoB、16S rRNA、gyrB基因待测区域的特异性引物MTB-IS6110-F、MTB-IS6110-R，MTB-hsp65-F、MTB-hsp65-R，MTB-rpoB-F、MTB-rpoB-R，MTB-16s-F、MTB-16s-R，MTB-gyrB-F、MTB-gyrB-R；扩增产物为427-533bp；
步骤二，在正向引物的5’端加上AGGTCTTCACGATACGTCGAG碱基序列，在反向引物的5’端加上GTCCAATCAGTTGCAGCTTCAG碱基序列，得到含有特定碱基序列的引物Nano-MTB-IS6110-F、Nano-MTB-IS6110-R，Nano-MTB-hsp65-F、Nano-MTB-hsp65-R，Nano-MTB-rpoB-F、Nano-MTB-rpoB-R，Nano-MTB-16s-F、Nano-MTB-16s-R，Nano-MTB-gyrB-F、Nano-MTB-gyrB-R；合成这些含有特定碱基序列的引物，将Nano-MTB-IS6110-F、Nano-MTB-IS6110-R，Nano-MTB-hsp65-F、Nano-MTB-hsp65-R，Nano-MTB-rpoB-F、Nano-MTB-rpoB-R，Nano-MTB-16s-F、Nano-MTB-16s-R，Nano-MTB-gyrB-F、Nano-MTB-gyrB-R这五对引物混合，形成引物池；
步骤三，合成Barcode引物，每个Barcode引物对应一个样本，使每个样本带有不同的Barcode标签；
步骤四，提取基因组DNA；
步骤五，用引物池进行第一轮扩增并纯化；
步骤六，用Barcode引物进行第二轮扩增并纯化；
步骤七，构建测序文库并纯化；
步骤八，使用纳米测序仪测序，对数据进行质控分析后，进行数据分析；所述步骤二中的引物MTB-IS6110-F、MTB-IS6110-R、MTB-hsp65-F、MTB-hsp65-R、MTB-rpoB-F、MTB-rpoB-R、MTB-16s-F、MTB-16s-R、MTB-gyrB-F、MTB-gyrB-R的序列分别是：SEQ01、SEQ02、SEQ03、SEQ04、SEQ05、SEQ06、SEQ07、SEQ08、SEQ09、SEQ10；所述步骤一中的引物Nano-MTB-IS6110-F、Nano-MTB-IS6110-R、Nano-MTB-hsp65-F、Nano-MTB-hsp65-R、Nano-MTB-rpoB-F、Nano-MTB-rpoB-R、Nano-MTB-16s-F、Nano-MTB-16s-R、Nano-MTB-gyrB-F、Nano-MTB-gyrB-R的序列分别是：SEQ11、SEQ12、SEQ13、SEQ14、SEQ15、SEQ16、SEQ17、SEQ18、SEQ19、SEQ20。
2.根据权利要求1所述的一种基于纳米孔测序仪的分枝杆菌快速鉴定引物在制备分枝杆菌鉴定产品中应用，其特征在于，
步骤二中，所述Nano-MTB-IS6110-F、Nano-MTB-IS6110-R，Nano-MTB-hsp65-F、Nano-MTB-hsp65-R，Nano-MTB-rpoB-F、Nano-MTB-rpoB-R，Nano-MTB-16s-F、Nano-MTB-16s-R，Nano-MTB-gyrB-F、Nano-MTB-gyrB-R引物的浓度分别为15μM、15μM、40μM、40μM、50μM、50μM、60μM、60μM、40μM、40μM，将所述引物等体积比例混合，形成引物池。
3.根据权利要求1所述的一种基于纳米孔测序仪的分枝杆菌快速鉴定引物在制备分枝杆菌鉴定产品中应用，其特征在于，
步骤五中用引物池扩增富集基因组DNA的反应总体系包括：2×PCR mix(Vazyme)25μl，引物池5μl，基因组DNA 100ng，ddH2O补足至50μl；
反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性15s，58℃退火60s，72℃延伸15s，20个循环；95℃变性15s，62℃退火60s，72℃延伸15s，20个循环；循环结束后72℃延伸5min，4℃保存；
纯化采用磁珠纯化。
4.根据权利要求1所述的一种基于纳米孔测序仪的分枝杆菌快速鉴定引物在制备分枝杆菌鉴定产品中应用，其特征在于，步骤六中第二轮扩增反应包括：2×PCR mix 25μl，Barcode引物2μl，第一轮扩增纯化后产物23μl；
反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性15s，62℃退火15s，72℃延伸30s，12个循环；循环结束后72℃延伸5min，4℃保存；
纯化采用磁珠纯化。
5.根据权利要求1所述的一种基于纳米孔测序仪的分枝杆菌快速鉴定引物在制备分枝杆菌鉴定产品中应用，其特征在于，步骤七中构建测序文库并纯化的具体方法包括：
(1)pooling：将第二次扩增后的纯化产物进行pooling；
(2)末端修复、加A尾：总体系为：pooling完的DNA溶液50μl，末端修复mix 15μl；反应程序为：20℃反应15min，65℃终止反应15min，4℃保存；
(3)末端修复进行磁珠纯化；
(4)接头连接的总体系为：末端修复纯化后产物25μl，5×连接缓冲液10μl，DNA连接酶5μl，Adapter Mix 1μl，ddH2O 9μl；反应程序为，20℃反应15min，4℃保存；
(5)将接头连接产物进行磁珠纯化后得到终文库；
测定终文库qubit浓度。
6.根据权利要求1所述的一种基于纳米孔测序仪的分枝杆菌快速鉴定引物在制备分枝杆菌鉴定产品中应用，其特征在于，步骤八中使用Nanopore公司的MinION测序仪，测序试剂盒：SQK-LSK109，测序芯片：R9进行纳米测序仪测序。
7.根据权利要求1所述的一种基于纳米孔测序仪的分枝杆菌快速鉴定引物在制备分枝杆菌鉴定产品中应用，其特征在于，步骤八中使用纳米测序仪测序，对数据进行质控分析后，进行数据分析的具体步骤包括：
(a)芯片诱发：配置诱发剂后诱发；
所述诱发剂为：15μl FLT，500μl FB，200μl去酶水；
(b)上机文库点样：配置上机文库后加样，加样完毕后，盖上加样孔的盖子，关闭诱发试剂孔，插上数据线，与上机电脑相连接，设置上机程序后开始测序；
所述上机文库为：18.8μlsQB，12.8μl LB，100ng终文库，然后加入ddH2O补充至47μl；
(c)数据下机后，通过对下机数据进行质控分析：将序列长度小于400bp或者大于600bp的序列进行过滤，得到400-600bp的目标序列；再将目标序列与数据库中的分枝杆菌基因组序列进行比对，完成质控；
(d)将质控后的序列与分枝杆菌基因组靶序列比对后一致，即可判定是否存在相应的分枝杆菌。
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Title
"聚合酶链反应鉴定结核分枝杆菌常用靶基因序列的研究进展";严慧等;《中华临床实验室管理电子杂志》;第4卷(第3期);摘要、第160页第3段、第161页右侧第4段 *

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