CN110423835B - 用于下呼吸道病原微生物检测的引物组合物 - Google Patents

用于下呼吸道病原微生物检测的引物组合物 Download PDF

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    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

本发明公开了一种用于下呼吸道病原微生物检测的引物组合物，该引物组合物包含SEQ NO:1‑SEQ NO:30的引物。本发明的引物组合物对下呼吸道病原微生物的检测具有检测通量高、特异性强、不易污染、安全性高的优点，检测结果具有较好的准确性和重复性，可以用于临床指导用药和治疗。

Description

用于下呼吸道病原微生物检测的引物组合物
技术领域
本发明涉及微生物检测领域，具体的说涉及一种用于下呼吸道病原微生物检测的引物组合物。
技术背景
呼吸道感染是当今重要的全球性公共卫生问题，也是临床上最常见的感染性疾病。感染性病原体种类多样，主要包括病毒、细菌、衣原体、支原体等。它们传播迅速，不仅有较强的传染性，而且可引起严重的并发症甚至死亡。对致病病原体的识别和分析是治疗和防控的第一步，而单从临床表现很难区分感染性病原体，易造成误诊、贻误病情和抗生素滥用。因此对致病性病原体进行快速有效的检测和监控对于指导临床规范用药以及减少疾病传播有着深远意义。
目前临床上主要使用的鉴定病原体方法一般是依靠细菌培养法，这也是临床下呼吸道感染检测的金标准。然而这种涂片镜检、分离培养的方式，临床检出率低(分离培养阳性率仅40％～60％)，周期长(2～5天)，假阳性率高，迫使临床医生在没有病原学精确结果的情况下进行抗菌药物的经验性用药，这对于下呼吸道感染的精准治疗和细菌耐药性的控制都非常不利。
除了细菌培养之外，应用最为广泛的是呼吸道病原体免疫九联检。这一检测价格低廉，能覆盖细菌培养无法覆盖或检测效果差的一些常见病原体，检测速度相对较快。但是由于免疫法检测的是样本中病原体引起机体产生的特异性抗体，因此存在一个较长的空窗期，并且灵敏度相对较低。
在基因水平对下呼吸道病原微生物的检测方法主要有核酸杂交法、基因芯片法、PCR及其衍生技术法、宏基因组法等。基于PCR法的检测灵敏度高，时间短，但要达到多目标检测，充分覆盖临床可能致病病原体，就会增加成本。宏基因组高通量测序法在过去的数年中被广大科学家用于分析环境微生物宏基因组，近两年，这一方法作为一个新的微生物检测工具，开始被一些测序服务公司用于病原体诊断。该方法具有所有检测方法中最全面的检测覆盖范围，然而只能检测微生物的有无，无法对微生物诊疗相关的基因，且检测时间相对较长，无法检测病毒等RNA，易受污染，成本高。基因芯片法使分子检测走入了高通量检测时代，检测通量高，灵敏度高，检测速度相对较快；存在的不足是成本高，对一些序列突变导致的耐药无能为力，相对于测序检测平台，其定量性能差，稳定性弱。
综上所述，下呼吸道病原的检测方法多种多样，各种方法都有其优缺点，急需为临床提供灵敏度高、特异性强、耗时短、结果明确的病原体检验方案。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于下呼吸道病原微生物检测的引物组合物，该引物组合物包含SEQ NO:1-SEQ NO:30的引物；
这些引物以混合物形式溶解于水中，根据后续检测需要配制成所需的浓度；
所述的引物组合物可以同时检测15种下呼吸道病原微生物，这15种病原微生物为：肺炎链球菌、无乳链球菌、酿脓链球菌、金黄色酿脓葡萄球菌、结核杆菌复合群、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、流感嗜血杆菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、阴沟肠杆菌属、隐球菌属、肠球菌属、肺炎支原体；
具体的说，本发明的引物组合物中包含的SEQ NO:1-SEQ NO:30的引物，具体见如下表1。其中上游引物SEQ NO:1和下游引物SEQ NO:2用于检测肺炎链球菌；上游引物SEQNO:3和下游引物SEQ NO:4用于检测无乳链球菌；上游引物SEQ NO:5和下游引物SEQ NO:6用于检测酿脓链球菌；上游引物SEQ NO:7和下游引物SEQ NO:8用于检测金黄色酿脓葡萄球菌；上游引物SEQ NO:9和下游引物SEQ NO:10用于检测结核杆菌复合群；上游引物SEQ NO:11和下游引物SEQ NO:12用于检测大肠杆菌；上游引物SEQ NO:13和下游引物SEQ NO:14用于检测肺炎克雷伯菌；上游引物SEQ NO:15和下游引物SEQ NO:16用于检测流感嗜血杆菌；上游引物SEQ NO:17和下游引物SEQ NO:18用于检测铜绿假单胞菌；上游引物SEQ NO:19和下游引物SEQ NO:20用于检测鲍曼不动杆菌；上游引物SEQ NO:21和下游引物SEQ NO:22用于检测嗜麦芽窄食单胞菌；上游引物SEQ NO:23和下游引物SEQ NO:24用于检测阴沟肠杆菌属；上游引物SEQ NO:25和下游引物SEQ NO:26用于检测隐球菌属；上游引物SEQ NO:27和下游引物SEQ NO:28用于检测肠球菌属；上游引物SEQ NO:29和下游引物SEQ NO:30用于检测肺炎支原体.
表1检测引物组合物的引物序列
Figure BDA0002193077990000031
本发明组合物中的引物是针对15种病原体的特定序列进行设计，引物经优化设计和修饰后，偏向性扩增的程度降低，各引物之间相互干扰性小，特异性强，扩增效果好。这15种病原体的引物对应特定区域如下表2：
表2病原体的引物对应特定区域
Figure BDA0002193077990000032
Figure BDA0002193077990000041
Figure BDA0002193077990000051
这些引物以混合物形式溶解于无菌、无核酸酶的双蒸水中，在检测时同时加入。
待测DNA样品为痰液DNA、肺泡灌洗液DNA或胸腔积液DNA。
利用本发明的引物组合物，检测待测DNA中的病原体，包括如下步骤：
多重PCR法构建文库，上机测序，数据处理，特异性数据分析；
其中，多重PCR法构建文库具体为：
第一轮PCR扩增：以待测DNA为模板，利用引物组合物进行扩增；第二轮PCR扩增：以第一轮PCR扩增得到的纯化产物为模板，加入测序接头；得到的第二轮PCR产物处理后即为文库。
上机测序：对文库进行测序。
数据处理：包括拆分Barcode；数据质量过滤，去掉低质量reads；数据拼接，去除二聚体及非特异扩增。
特异性数据分析流程：(1)将各样品中病原体检出得到的reads按照扩增均一性系数换算成标准扩增均一性reads数，得到结果1。(2)将H20样品(H20样品即阴性对照，即将第一轮PCR体系中的待测DNA替换成水，进行同样的建库和测序，用来确定反应过程中的背景污染水平。)中检出的特定病原体按照与H20中内参的对应比例关系从其它测序样品中扣除，得到结果2。扣成负值的记为0。(3)将结果2中的total reads数归一化到10000，除两个内参外，其它小于100的reads数归零，得到结果3，即为最终结果。
本发明的原理是：
首先找出15种病原菌中每株菌的保守区域，然后和整个病原数据库进行比对，筛选出该菌与其它菌有明显差异的区域；最后利用这个种内保守、种间特异的区域设计引物。利用此引物组合物扩增痰液中DNA，结合测序结果分析，可以检测到下呼吸道感染病人痰液中的病原体种类。
本发明的创新点：
本发明具备以下优点：(1)特异性强：针对15种目标病原体设计引物，获得病原体上特定位置的碱基序列，通过测序进行鉴定，特异性可达99％以上；(2)检测全面：一次反应可以覆盖常见的15种下呼吸道感染病原体；(3)结果直观明确：根据测序结果，医生可以以定量方式观测各病原体在病人体液样品中的相对比例；(4)安全：整个体系不使用有害有毒物质，对试验人员及环境均无害。
总之，本发明的引物组合物偏向性扩增的程度低，各引物之间的干扰性小，特异性强，扩增效果好，对下呼吸道病原微生物的检测具有检测通量高、特异性强、不易污染、安全性高的优点，检测结果具有较好的准确性和重复性，可以用于临床指导用药和治疗。
具体实施方式
下列实施例中所用引物以及测序相应接头和barcode均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，所有序列均是从5’-3’。
实施例1：根据病原微生物设计合成15对引物，配合成组合物
由生工生物工程(上海)股份有限公司根据表1中SEQ NO:1-SEQ NO:30的序列，合成15对引物；
然后将15对引物溶于无菌、无核酸酶的双蒸水中，使各引物的浓度分别为10uM，4℃下保存。
实施例2：检测实施例1中引物组合物的特异性
实验材料
DNA模板为11种病原微生物的标准菌株(11种标准菌株见标3，均购自广东环凯微生物科技有限公司)提取的基因组DNA。
所有引物纯度应达到电泳级(PAGE)或HPLC级，不含杂质。
所有试剂购买自正规厂家：多重PCR酶(KAPA公司)，AMPureXP Beads(Beckman公司)，Qubit 2.0DNA定量试剂(Life Technologies公司)。
主要仪器
Figure BDA0002193077990000071
2.0荧光定量仪(Life Technologies公司)、10ul.200ul.1000ul移液器(Eppendorf公司)、常规PCR仪(BioRAD公司)、超净工作台(江苏苏净公司)、高速离心机、水浴锅、涡旋振荡仪、冰箱、烘箱。
反应体系及程序
第一轮PCR的反应体系如下：标准菌株的基因组DNA 12ul，每种菌株对应的扩增上下游引物(实施例1的)Panel Mix 8ul，PCR酶10ul。其中引物Panel Mix中各引物浓度均为10uM。PCR扩增反应程序：95℃预变性3min；聚合酶链式反应扩增阶段：95℃变性20s，60℃延伸4.5min，并进行22个循环(如DNA投入量为10ng，适当增加2个循环)；72℃延伸4min，10℃保温，完成扩增。
第一轮PCR获得目标片段后，Ampure XP磁珠纯化试剂盒进行纯化，有效的富集目标区域片段，减低非特异性扩增的浓度。
对目标区域回收产物进行第二轮PCR，引入测序相应接头(序列为：aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttcc)与Barcode，反应体系如下：第一轮PCR回收产物18ul，PCR酶10ul，测序相应接头与barcode各1ul。PCR扩增反应程序：95℃预变性3min；聚合酶链式反应扩增阶段：95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸1min，并进行6～8个循环；72℃延伸5min，10℃保温，完成扩增。
其中Barcode选择用300-314：
Barcode 300：caagcagaagacggcatacgagatcttacggggtgactggagttccttggcacc
Barcode 301：caagcagaagacggcatacgagatcttggtgtgtgactggagttccttggcacc
Barcode 302：caagcagaagacggcatacgagatggcgttaggtgactggagttccttggcacc
Barcode 303：caagcagaagacggcatacgagatgaaagaccgtgactggagttccttggcacc
Barcode 304：caagcagaagacggcatacgagattcccgtaggtgactggagttccttggcacc
Barcode 305：caagcagaagacggcatacgagattcccaatcgtgactggagttccttggcacc
Barcode 306：caagcagaagacggcatacgagatctgcgttggtgactggagttccttggcacc
Barcode 307：caagcagaagacggcatacgagattattgcctgtgactggagttccttggcacc
Barcode 308：caagcagaagacggcatacgagattccttattgtgactggagttccttggcacc
Barcode 309：caagcagaagacggcatacgagatgagaattggtgactggagttccttggcacc
Barcode 310：caagcagaagacggcatacgagattggcctgtgtgactggagttccttggcacc
Barcode 311：caagcagaagacggcatacgagattcggttcggtgactggagttccttggcacc
Barcode 312：caagcagaagacggcatacgagatttcggcctgtgactggagttccttggcacc
Barcode 313：caagcagaagacggcatacgagatccagtgaagtgactggagttccttggcacc
Barcode 314：caagcagaagacggcatacgagattgctatttgtgactggagttccttggcacC
获得的产物用Ampure XP磁珠纯化试剂盒进行纯化。纯化后产物为构建好的文库，定量检测文库浓度，符合要求后上机，送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。
测序结果分析
测序数据先通过常规处理：拆分Barcode；数据质量过滤，去掉低质量reads；数据拼接，去除二聚体及非特异扩增，再进行序列比对，验证引物扩增出的片段为目标区域。实验结果见如下表3：
表3特异性检测结果
Figure BDA0002193077990000081
实验结论：以标准菌株的核酸为模板，使用本方案进行检测，测序数据经分析后，能比对上相应菌种的序列(特异性reads)几乎均可达到每一个样本测序总reads的99％以上，并无非特异性扩增，因此得以验证本方法的高特异性。
实施例3：采用实施例1的引物组合物检测下呼吸道感染病人痰液中病原微生物实验材料
本实施例中涉及的95例临床痰液样本来自中山医院呼吸科微生物实验室。样本采集后2h内进行检验，未能及时检验的样本存储在4℃冰箱内，但放置时间不可超过24h。
所有引物纯度应达到电泳级(PAGE)或HPLC级，不含杂质。
所有试剂购买自正规厂家：多重PCR酶(KAPA公司)，AMPureXP Beads(Beckman公司)，Qubit 2.0DNA定量试剂(Life Technologies公司)。
主要仪器
Figure BDA0002193077990000091
2.0荧光定量仪(Life Technologies公司)、10ul.200ul.1000ul移液器(Eppendorf公司)、常规PCR仪(BioRAD公司)、超净工作台(江苏苏净公司)、高速离心机、水浴锅、涡旋振荡仪、冰箱、烘箱。
实验设计
利用实施例1的引物组合物分别扩增样本痰液中的DNA，结合测序结果分析，可以检测到下呼吸道感染病人痰液中的病原体种类。
反应体系及程序
第一轮PCR的反应体系如下：包含实施例1的SEQ NO:1-SEQ NO:30引物的引物Panel Mix 8ul，待测DNA 12ul，PCR酶10ul。其中引物Panel Mix中各引物浓度均为10uM。PCR扩增反应程序：95℃预变性3min；聚合酶链式反应扩增阶段：95℃变性20s，60℃延伸4.5min，并进行22个循环(如DNA投入量为10ng，适当增加2个循环)；72℃延伸4min，10℃保温，完成扩增。
第一轮PCR获得目标片段后，用Ampure XP磁珠纯化试剂盒或者其他等效功能的试剂盒进行纯化，有效的富集目标区域片段，减低非特异性扩增的浓度。
对目标区域回收产物进行第二轮PCR，引入测序相应接头与barcode，反应体系如下：第一轮PCR回收产物18ul，PCR酶10ul，测序相应接头与barcode各1ul。PCR扩增反应程序：95℃预变性3min；聚合酶链式反应扩增阶段：95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸1min，并进行6～8个循环；72℃延伸5min，10℃保温，完成扩增。
获得的产物用Ampure XP磁珠纯化试剂盒或者其他等效功能的试剂盒进行纯化。纯化后产物为构建好的文库，定量检测文库浓度(大于等于1ng/ul)，符合要求后上机测序。
测序结果分析
测序数据先通过常规处理：拆分Barcode；数据质量过滤，去掉低质量reads；数据拼接，去除二聚体及非特异扩增，再进行序列比对，验证引物扩增出的片段为目标区域。再进行特异性数据分析：(1)将各样品中病原体检出得到的reads按照扩增均一性系数换算成标准扩增均一性reads数，得到结果1。(2)将H20样品中检出的特定病原体按照与H20中内参的对应比例关系从其它测序样品中扣除，得到结果2。扣成负值的记为0。(3)将结果2中的total reads数归一化到10000，除两个内参外，其它小于100的reads数归零，得到结果3，即为最终结果。
与临床试验室检测结果相比较，两种方法的实验结果实现了完全覆盖，灵敏度相对于细菌培养而言为100％，具体结果见表4
表4检测结果
Figure BDA0002193077990000101
序列表
<120> 用于下呼吸道病原微生物检测的引物组合物
<160> 30
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgcaaaaggt tagaatgatt g 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aagtcagagt agggaggaaa g 21
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctgtaagtct ttatctttct cg 22
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tccattcgct tagtctcc 18
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ttatctgatt taggacattt atc 23
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atatcagtta atggacaagc ag 22
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gcaatggcta aagggttacc acc 23
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gtggcggctt ataccctgta tct 23
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gaacggctga tgaccaaact 20
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ggatcagcga tcgtggtcc 19
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ataatcctcg tcatttgcag 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gacttcgggt gattgataag 20
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ccgatcgagt ccattacc 18
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gcgtacggcg aatttact 18
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
acttttggcg gttactctg 19
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tgtgcctaat ttaccagcat 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gcgagtacaa catggctctg 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
accggacgct ctttaccata 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
cattatcacg gtaattagtg 20
<210> 20
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
agagcactgt gcacttaag 19
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
acgccgaaga acaccatgac 20
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
cttcttcgcc agtgcctaca tc 22
<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
agagagtaag gtccgattga ac 22
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
ggttgtttcc cgtattatgc 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
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ctgcgtcaga tcgtttccaa 20
<210> 26
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
cgttgtaacc gtagttacct tcgcc 25
<210> 27
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
catgcctgtt tgagagtcat gaa 23
<210> 28
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
atcaccttcc cactaacaca tt 22
<210> 29
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
tgccatcaac ccgcgctta 19
<210> 30
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
ggtgatctgc ccggtttg 18

Claims (2)

1.一种用于下呼吸道病原微生物检测的引物组合物，其特征在于该引物组合物包含SEQ NO:1-SEQ NO:30的引物。
2.根据权利要求1所述的引物组合物，其特征在于所述的下呼吸道病原微生物为：肺炎链球菌、无乳链球菌、酿脓链球菌、金黄色酿脓葡萄球菌、结核杆菌复合群、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、流感嗜血杆菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、阴沟肠杆菌属、隐球菌属、肠球菌属、肺炎支原体。
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