CN102803512B - 检测呼吸道病原体的方法和试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种能够检测常见呼吸道病原体的方法。本发明还涉及用于检测常见呼吸道病原体的扩增引物和延伸引物，以及包含这些引物的试剂盒。

Description

检测呼吸道病原体的方法和试剂盒
技术领域
本发明涉及病原微生物分子生物学领域，具体而言涉及呼吸道病原体的检测方法。本发明还涉及用于检测呼吸道病原体的扩增引物和延伸引物，以及包含这些引物的试剂盒。
背景技术
呼吸道感染是全球范围内临床最常见的疾病之一，据全球疾病死亡率调查，急性呼吸道感染造成的死亡人数位居所有疾病造成死亡数的第3位，尤其下呼吸道感染是造成婴幼儿残疾和死亡的主要原因。可引起呼吸道感染的病原体十分复杂，其中包括细菌、病毒、支原体、衣原体等，其临床表现与治疗措施存在差异。最常见的呼吸道病原体包括甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒1、副流感病毒2、副流感病毒3、呼吸道合孢病毒、流感嗜血杆菌、肺炎军团菌、肺炎链球菌、肺炎支原体、肺炎衣原体等。近年来，新的呼吸道致病性病原体还在不断地被发现，如高致病性禽流感病毒、SARS病毒、甲型流感病毒H1N1以及人类偏肺病毒等。
呼吸道病原体的检测方法很多，为临床疾病诊断和治疗提供了一定帮助，目前常见的临床检测方法主要有：
1.病毒分离法：该法特异性较强，但耗时长，一般需1-2周，且成本较高，分离阳性率也较低。
2.酶联免疫吸附法(ELISA)：测定血清中各种病原体的IgM抗体，此方法简便、快速、设备要求不高，可用于大批量的筛查，但特异性不高，假阳性率较高。
3.聚合酶链反应(PCR)：该方法近年来广泛用于临床病原体的检测，其敏感性和特异性都能满足临床的需求，但是由于多重反应容易造成交叉污染，在面对复杂、众多的病原体种类时，PCR检测通量一直是瓶颈问题。
目前，也有一些实验室利用质谱技术进行多重病原体检测，其原理是在PCR扩增引物上加入不同质量的特异序列标签(MassTag)，经过紫外照射使质量标签从产物上释放，继而通过质量光谱法分析检测到的不同质量标签，从而对病原体进行鉴定。此方法特异性较差，操作较为复杂，难以向临床推广。
呼吸道感染的病原谱十分复杂，混合感染发病率高，病原诊断是一个世界性的难题。精确的病原检测分析不仅是确诊依据，也是合理选择治疗方案的基础。但是目前病原检测技术远远不能满足临床的需要，我们希望建立一种可以达到高通量、敏感性高、特异性强、检测速度快、价格便宜、用途广泛的呼吸道病原体检测新技术。
发明内容
本发明涉及一种能够检测常见呼吸道病原体的方法，所述病原体包括但不限于以下25种呼吸道病原体，其中包括细菌、DNA病毒、RNA病毒、衣原体、支原体，它们是：肺炎链球菌、肺炎军团菌、结核分枝杆菌、脑膜炎双球菌、流感嗜血杆菌、博卡病毒、腺病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体、Q热立克次体、副流感病毒1、副流感病毒2、副流感病毒3、冠状病毒OC43、SARS病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、腮腺炎病毒、鼻病毒、人偏肺病毒、麻疹病毒、风疹病毒、冠状病毒229E和禽流感病毒H5。
根据病原体基因组类型，以及引物设计原则的局限，25种病原体分在三个反应体系中检测：反应体系1包括10种DNA病原体：肺炎链球菌、肺炎军团菌、结核分枝杆菌、脑膜炎双球菌、流感嗜血杆菌、博卡病毒、腺病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体、Q热立克次体。
反应体系2包括9种RNA病毒：副流感病毒1、副流感病毒2、副流感病毒3、冠状病毒OC43、SARS病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、腮腺炎病毒。
反应体系3包括6种RNA病毒：鼻病毒、人偏肺病毒、麻疹病毒、风疹病毒、冠状病毒229E、禽流感病毒H5。
所述方法包括如步骤：
1)使用扩增引物对对样品cDNA或DNA(具体类型可由本领域技术人员根据所要检测病原体基因组类型进行确定)进行PCR扩增，从而获得扩增产物，所述扩增引物对针对的是每种待检测呼吸道病原体基因组序列的保守区；
2)以步骤1)中获得的扩增产物为模板，使用延伸引物通过延伸反应，例如单碱基延伸反应，获得延伸产物，优选各延伸引物之间的分子量差异不小于9道尔顿，且各延伸产物之间以及延伸产物与相应延伸引物之间的分子量差异不小于30道尔顿，所述延伸引物针对的是扩增引物所扩增序列中相对保守的区域；
3)用质谱系统对所述延伸产物进行质谱检测确定样品的谱峰，通过将所述谱峰与延伸引物分子量及对应延伸产物分子量信息比对(例如，使用由Sequenom公司提供的Typer4.0分析软件进行比对)确定待检测的呼吸道病原体的具体类型，优选用基质辅助激光解吸附/电离飞行时间质谱系统对所述延伸产物或纯化的延伸产物进行质谱检测，所述谱峰和所述扩增引物对和延伸引物信息优选被导入Typer4.0分析软件(由Sequenom公司提供)中以进行检测结果的分析。
在一个实施方案中，还优选在步骤1和步骤2)之间包括除dNTP步骤：除去所述扩增产物中的dNTP；并且/或者还优选在步骤2和步骤3)之间包括纯化步骤：纯化所述延伸反应的延伸产物以获得纯化的延伸产物。本领域技术人员可以理解，不除去扩增产物中的dNTP可以实现本发明的目的，但除去扩增产物中的dNTP优选在碱基延伸方案中可以排除未消耗dNTP对延伸反应的影响。并且纯化延伸产物也不是实现本发明所必须，但纯化延伸产物可以有利于质谱系统对延伸产物分析，从而得到更加高质量的谱峰。
在一个实施方案中，本发明的方法所使用的扩增引物对的核苷酸序列包含SEQ ID NO：1和2、SEQ ID NO：3和4、SEQ ID NO：5和6、SEQ ID NO：7和8、SEQ ID NO：9和10、SEQ ID NO：11和12、SEQ ID NO：13和14、SEQ ID NO：15和16、SEQ ID NO：17和18、SEQ ID NO：19和20、SEQ ID NO：21和22、SEQ ID NO：23和24、SEQ IDNO：25和26、SEQ ID NO：27和28、SEQ ID NO：29和30、SEQ ID NO：31和32、SEQ ID NO：33和34、SEQ ID NO：35和36、SEQ ID NO：37和38、SEQ ID NO：39和40、SEQ ID NO：41和42、SEQ ID NO：43和44、SEQ ID NO：45和46、SEQ ID NO：47和48以及SEQ ID NO：49和50中的一对或多对。在一些实施方案中，在所述扩增引物的5′端还包含标签序列，例如SEQ ID NO：76。在一些实施方案中，本发明的方法所使用的延伸引物的核苷酸序列包含SEQ ID NO：51-75中的一个或多个。在一些实施方案中，本发明的方法所使用的扩增引物对和延伸引物是针对反应体系1、2或3的病原体。
在一个优选实施方案中，样品选自来自人体的样品(例如血清、全血、粪便、咽拭子、鼻涕、唾液、汗液、毛发)、土壤、食物、水、纯病毒、细菌培养物以及携带此类病原体的媒介生物样本。在一个优选实施方案中，待检测的呼吸道病原体选自肺炎链球菌、肺炎军团菌、结核分枝杆菌、脑膜炎双球菌、流感嗜血杆菌、博卡病毒、腺病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体、Q热立克次体、副流感病毒1、副流感病毒2、副流感病毒3、冠状病毒OC43、SARS病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、腮腺炎病毒、鼻病毒、人偏肺病毒、麻疹病毒、风疹病毒、冠状病毒229E和禽流感病毒H5中的一种或多种。
采用本方法解决了目前的检测方法灵敏度低，特异性差，难以实现高通量，成本高，周期长，自动化程度低的缺陷。
与目前的检测方法相比，本发明的方法具有如下优点：
1)使用的试剂耗材相对简单，反应体系稳定，不需要使用荧光染料、特殊的酶等价格昂贵的试剂，且不易造成环境污染；
2)反应可以在微量体系中进行，减少了样品和各种消耗品的使用，降低成本；
3)由于质谱技术直接检测DNA的分子量(质荷比)且直接确定碱基的类型(即不需要经过任何形式的信号转换)，因此，理论上只要有一个拷贝的扩增DNA片段被扩增即可识别，从而具有高的灵敏度；同时，采用了特异保守的延伸引物作为最终检测识别标志物，具有高度的特异性；
4)质谱技术本身具有高度自动化的特点，与多引物延伸技术相结合，可以在一个反应体系中同时检测多种呼吸道病原体，节省时间、人力、物力，提高检测通量。
同时，本发明的技术方案采用了质谱技术，特别是基质辅助激光解吸附/电离飞行时间质谱系统(MALDI-TOF-MS)，通过设计一套全新的扩增引物对和延伸引物，实现了对上述25种呼吸道病原体的检测。其与其它现有方法相比，能够同时准确检测出25种呼吸道病原体，具有高通量、自动化、低成本的特点，有显著的优点。
本发明还涉及用于检测25种常见呼吸道病原体中一种或多种的扩增引物对和/或延伸引物。在一些实施方案中，所述扩增引物的核苷酸序列包含SEQ ID NO：1和2、SEQ ID NO：3和4、SEQ ID NO：5和6、SEQ ID NO：7和8、SEQ ID NO：9和10、SEQ ID NO：11和12、SEQ ID NO：13和14、SEQ ID NO：15和16、SEQ ID NO：17和18、SEQ ID NO：19和20、SEQ ID NO：21和22、SEQ ID NO：23和24、SEQ ID NO：25和26、SEQ IDNO：27和28、SEQ ID NO：29和30、SEQ ID NO：31和32、SEQ ID NO：33和34、SEQ ID NO：35和36、SEQ ID NO：37和38、SEQ ID NO：39和40、SEQ ID NO：41和42、SEQ ID NO：43和44、SEQ ID NO：45和46、SEQ ID NO：47和48以及SEQ IDNO：49和50中的一对或多对。
在一些实施方案中，在所述扩增引物的5′端还包含标签序列。在一些实施方案中，所述延伸引物的核苷酸序列包含SEQ ID NO：51-75中的一个或多个。
本发明还涉及包含用于检测25种常见呼吸道病原体中一种或多种的扩增引物对和/或延伸引物的试剂盒。在一些实施方案中，所述扩增引物的核苷酸序列包含SEQ ID NO：1和2、SEQ ID NO：3和4、SEQ ID NO：5和6、SEQ ID NO：7和8、SEQ ID NO：9和10、SEQ ID NO：11和12、SEQ ID NO：13和14、SEQ ID NO：15和16、SEQ ID NO：17和18、SEQ ID NO：19和20、SEQ ID NO：21和22、SEQ ID NO：23和24、SEQ ID NO：25和26、SEQ ID NO：27和28、SEQ ID NO：29和30、SEQ ID NO：31和32、SEQ IDNO：33和34、SEQ ID NO：35和36、SEQ ID NO：37和38、SEQ ID NO：39和40、SEQ ID NO：41和42、SEQ ID NO：43和44、SEQ ID NO：45和46、SEQ ID NO：47和48以及SEQ ID NO：49和50中的一对或多对。在一些实施方案中，在所述扩增引物的5′端还包含标签序列。在一些实施方案中，所述延伸引物的核苷酸序列包含SEQ IDNO：51-75中的一个或多个。在一些实施方案中，本发明的试剂盒中的扩增引物对和延伸引物是针对反应体系1、2或3的病原体。
本发明中使用标签序列的目的仅是为了增加与标签序列相连的引物序列的分子量，以排除这些引物在后续试验的影响，本领域技术人员可以根据需要以及通常的引物设计原则选择使用不同的标签序列，而实现本发明的目的。因此，在一些实施方案中可以使用任何可以达到上述目的，且不会与检测目的物相互作用的标签序列。
在一些实施方案中，上述的试剂盒中的其他试剂为用于PCR扩增反应的酶和试剂，用于延伸反应的酶和试剂，以及/或者用于纯化延伸产物的树脂。所述延伸反应可以是单碱基延伸反应、双碱基延伸反应或多碱基延伸反应。
在一些实施方案中，本发明涉及上述的扩增引物对和/或延伸引物用于对样品中的呼吸道病原体进行检测的用途；或者上述试剂盒用于对样品中的呼吸道病原体进行检测的用途。在一些实施方案中，本发明涉及上述的扩增引物对和/或延伸引物用于制备试剂盒的用途，所述试剂盒用于检测样品中的呼吸道病原体。
以下表1和表2中分别示例性显示了针对所述25种常见的呼吸道病原体的PCR扩增引物，以及针对所述25种呼吸道病原体的延伸引物。
表1：针对所述25种常见的呼吸道病原体的PCR扩增引物
SEQ ID NO.   引物名称   引物序列5′-3′   引物说明
1   Cox_burF   TTTAGTACGCCGAGCGATTC   Q热立克次体正向引物
2   Cox_burR   TGTTACCTTTATGGACGAGC   Q热立克次体反向引物
3   Myc_pneF   GACACCTATACTCAAAGGCG   肺炎支原体正向引物
4   Myc_pneR   CAAGCGCTTTTGGTGTTTGG   肺炎支原体反向引物
5   Leg_pneF   AGCGTCTTGCATGCCTTTAG   肺炎军团菌正向引物
6   Leg_pneR   TGCCGATTTGGGGAAGAATT   肺炎军团菌反向引物
7 Mvc_tubF AACAAGAAGGCGTACTCGAC   结核分枝杆菌正向引物
8   Myc_tubR   AACCGGATCGATGTGTACTG   结核分枝杆菌反向引物
9   Str_pneF   GCTGGGACATTATTGACCTG   肺炎链球菌正向引物
10   Str_pneR   CAATTCAAGTGTTCGCGGAG   肺炎链球菌反向引物
11   Ch1_pneF   TTGTGCAACTTTGGGAGCTG   肺炎衣原体正向引物
12   Chl_pneR   TGCGATACGTTACAGATCAC   肺炎衣原体反向引物
13   HAdVF   ATCCTGCATACCAACATGCC   腺病毒正向引物
14   HAdVR   ACCATCACCCGCGCCTTAAA   腺病毒反向引物
15   Nei_menF   TTTTGTCGCGGATTTGCAAC   脑膜炎双球菌正向引物
16   Nei_menR   GATACGAATGTGCAGCTGAC   脑膜炎双球菌反向引物
17   HBCVF   GTACCATCTCTAGCAATGCG   博卡病毒正向引物
18   HBCVR   CAACACAGAGCTTCCAATCC   博卡病毒反向引物
19   Hae_infF   CCAGCATCAACACCTTTACC   流感嗜血杆菌正向引物
20   Hae_infR   TGATGAACGTGGTACACCAG   流感嗜血杆菌反向引物
21   HPIV3F   GTCTGAGAGTGGATAGAGTC   副流感病毒3正向引物
22   HPIV3R   CAGGTCTCGCTTCATTCTTC   副流感病毒3反向引物
23   HPIV2F   ACTACCATTGACTTGCGGAT   副流感病毒2正向引物
24   HPIV2R   CAACAAGGGAGAATCAATGC   副流感病毒2反向引物
25   OC43-covF   ATAGGCACACCTTGTCCTTC   冠状病毒OC43正向引物
26   OC43-covR   GAGGGAATGTTGTACCCTAC   冠状病毒OC43反向引物
27   FLUAVF   AAAGCGTCTACGCTGCAGTC   甲型流感病毒正向引物
28   FLUAVR   GACAAGACCAATCCTGTCAC   甲型流感病毒反向引物
29   MMSVF   TATTTATGGTTGGAGGGAGG   腮腺炎病毒正向引物
30   MMSVR   ATGCACGCGCCAATCTTAC   腮腺炎病毒反向引物
31   RSVF   GGAGAAGTGGCTCCAGAATA   呼吸道合胞病毒正向引物
32   RSVR   GTCTCCTGCTGCTAATTTGG   呼吸道合胞病毒反向引物
33   FLUBVF   GGGCTGAAGTAGATGGTTTT   乙型流感病毒正向引物
34   FLUBVR   CCAGAGATGTCAAAGAAGGG   乙型流感病毒反向引物
35   HPIV1F   TAGGGATACTTGTCTTGAAC   副流感病毒1正向引物
36   HPIV1R   CTACTGCTTCCACATTGTTG   副流感病毒1反向引物
37   SARS-covF   GCAATTTGCGGCCAATGTTTG   SARS病毒正向引物
38   SARS-covR   AAGCATTTGGGAGACGTGGT   SARS病毒反向引物
39   RVF   GAACACCCGTTCTGCAACA   风疹病毒正向引物
40   RVR   ATGTACTCAACCAGGTCCCC   风疹病毒反向引物
41   HMPVF   TACCTGATGATTCCTTAAGC   人偏肺病毒正向引物
42   HMPVR   TAGACATACACGGAGTAGAG   人偏肺病毒反向引物
43   MVF   GGTATGATCCTGCACTGAAC   麻疹病毒正向引物
44   MVR   CTGCACCCTACATGGTAATC   麻疹病毒反向引物
45   AVH5F   AGTGTTGATGTCCCAACGGA   禽流感病毒H5正向引物
46   AVH5R   TTTGGTACTGTGGGGGATTCAC   禽流感病毒H5反向引物
47   229E-covF   TCCTGAGGCTTGTCAAAACC   冠状病毒229E正向引物
48   229E-covR   CTCGGAATCCTTCAAGTGACA   冠状病毒229E反向引物
49   HRVF   CCGTCCCGGAATTGCTCATTA   鼻病毒正向引物
50   HRVR   TTGTGAGTCCTCCGGCCC   鼻病毒反向引物
表2：针对所述25种呼吸道病原体的延伸引物
SEQ ID NO.   引物名称   引物序列5′-3′   引物说明
  51   UEPCox_bur   CCATTGATAATGACCGC   Q热立克次体
  52   UEPMyc_pne   TGGGCCGACTTGGTAAC   肺炎支原体
  53   UEPLeg_pne   TGCCTTTAGCCATTGCTTC   肺炎军团菌
  54   UEPMyc_tub   AGGCGTACTCGACCTGAAAG   结核分枝杆菌
  55   UEPStr_pne   CATAATCTTGATGCCACTTAG   肺炎链球菌
  56   UEPChl_pne   GGAGCTGAATTCCAATATGCAC   肺炎衣原体
  57   UEPHAdV   AAATGTGAACGAGTTCATGTTTA   腺病毒
  58   UEPNei_men   CGGATTTGCAACTAAATCTTCCA   脑膜炎双球菌
  59   UEPHBCV   GCGAGTAGAGTGCCAGTA   博卡病毒
  60   UEPHae_inf   TCAACACCTTTACCAGCTAA   流感嗜血杆菌
  61   UEPHPIV3   TCAAAGCTGCCATTCTAGT   副流感病毒3
  62   UEPHPIV2   TTGACTTGCGGATGGCATT   副流感病毒2
  63   UEPOC43-cov   CTCCTTTCCCTTTTGAAACT   冠状病毒OC43
  64   UEPFLUAV   ACAAATCCCAAAATCCCCTTA   甲型流感病毒
  65   UEPMMSV   CAAAGCATAGGCAGCAATTTC   腮腺炎病毒
  66   UEPRSV   AGTGGCTCCAGAATATAGGCAT   呼吸道合胞病毒
  67   UEPFLUBV   TTTATCATCTCTTACCATCTTGT   乙型流感病毒
  68   UEPHPIV1   GGGATACTTGTCTTGAACAACATA   副流感病毒1
  69   UEPSARS-cov   GGGACCAAGACCTAATCAGA   SARS病毒
  70   UEPRV   CACGGACAACTCGAGGT   风疹病毒
  71   UEPHMPV   GCTTCTTTGTCTATCTCTTCTAC   人偏肺病毒
  72   UEPMV   GCACTGAACTTGTTCTGAAT   麻疹病毒
  73   UEPAVH5   GCTCTATCAAAACCCAACCA   禽流感病毒H5
  74   UEP229E-cov   GATGACATCATGAAGGCAGT   冠状病毒229E
  75   UEPHRV   CTGAATGCGGCTAACCTTAA   鼻病毒
本发明涉及的方法和引物可以实现对25种常见呼吸道感染病原体中的一种或多种的同时检测，可应用于检测及鉴别临床采集的样本，如咽拭子、血清和全血，纯病毒和细菌培养物，以及携带此类病原体的媒介生物样本等。本发明在呼吸道流行病原大规模筛查和流行病学特征研究等方面具有重要价值。
附图说明
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员应理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围进行限定。本领域技术人员参考如下对附图和优选实施方案的详细描述，显然可以明了本发明的各种目的和各个有利方面。
峰图中引物峰谱高度和产物峰谱高度与实验中加入的引物浓度、检测样品呼吸道病原体载量等有关，具体实验需要具体分析，以下峰图仅作为参考并且是为了更好地描述优选实施方案。
图1是对肺炎链球菌(Str_pne)质粒样品的检测结果峰图，其中显示在质量6627.4处有明显的峰谱，而在质量6380.2处的峰(对应于延伸引物峰)明显消失，这表明样品中含有肺炎链球菌(Str_pne)质粒。
图2是对甲型流感病毒(FLUAV)质粒样品的检测结果峰图，其中显示在质量6574.3处有明显的峰谱，而在质量6287.1处的峰(对应于延伸引物峰)明显消失，这表明样品中含有甲型流感病毒(FLUAV)质粒。
图3是对冠状病毒229E(229E-cov)质粒样品的检测结果峰图，其中显示在质量6579.1处有明显的峰谱，而在质量6252.0处的峰(对应于延伸引物峰)明显消失，这表明样品中含有冠状病毒229E(229E-cov)质粒。
图4是对临床混合感染病原体样本的检测结果峰图，其中显示了检测到的各个峰。从图中可以看出，FLUAV和FLUBV两个位置有明显的峰存在，因此表明样本中存在甲型流感病毒和乙型流感病毒。
具体实施方式
本发明提供了一种对样品中的呼吸道病原体进行检测的方法，其包括以下步骤：
1)使用扩增引物对对样品cDNA或DNA进行PCR扩增，从而获得扩增产物，所述扩增引物对针对的是每种待检测病原体基因组序列的保守区；
2)以步骤1)中获得的扩增产物为模板，使用延伸引物通过延伸反应，例如单碱基延伸反应，获得延伸产物，优选各延伸引物之间的分子量差异不小于9道尔顿，且各延伸产物之间及延伸产物与相应延伸引物之间的分子量差异不小于30道尔顿，所述延伸引物针对的是扩增引物所扩增序列中相对保守的区域；
3)用质谱系统对所述延伸产物进行质谱检测确定样品的谱峰，并通过将所述谱峰与延伸引物分子量及对应延伸产物分子量信息比对(例如，使用由Sequenom公司提供的Typer4.0分析软件进行比对)确定待检测的呼吸道病原体的具体类型，优选用基质辅助激光解吸附/电离飞行时间质谱系统对所述延伸产物或纯化的延伸产物进行质谱检测，所述谱峰和所述扩增引物对和延伸引物信息优选被导入Typer4.0分析软件(由Sequenom公司提供)中以进行检测结果分析。
在上述方法的步骤1)中，本领域技术人员可以按照常规的PCR扩增方法进行PCP扩增。对于具体的PCR扩增，本领域技术人员可以根据扩增目的核酸、引物以及其他条件选择PCR扩增条件。如果要检测病原体基因组类型为RNA，将所述样品中的RNA并反转录成cDNA的方法是本领域技术人员可以用常规方法实现的，步骤1)中的样品可以是任何可检测的样品，例如来自人体或动物体的样品(例如血清、全血、粪便、咽拭子、鼻涕、咽拭子、鼻涕、唾液、汗液、毛发)、土壤、食物、水、纯病毒、细菌培养物以及携带此类病原体的媒介生物样本。
在上述方法的步骤2)中，本领域技术人员可以按照常规的碱基延伸方法进行延伸反应。对于具体的碱基延伸反应，本领域技术人员可以根据延伸目的核酸、延伸引物以及其他条件选择延伸反应条件。
在上述方法的步骤3)中，可以通过质谱系统完成对所述延伸产物或纯化的延伸产物的质谱检测和分析。例如本领域中常用的质谱系统有Sequenom MALDI-TOF质谱仪和Typer4.0分析软件、布鲁克·道尔顿的基质辅助激光解吸附电离(MALDI)飞行时间质谱仪(MALDI-TOF)，岛津公司的基质辅助激光解离离子源-线性飞行时间质谱等。
在一个实施方案中，还优选在步骤1和步骤2)之间包括除dNTP步骤：除去所述扩增产物中的dNTP，可以通过本领域已知的任何方法除去所述dNTP，但优选通过使用SAP酶处理所述扩增产物来除去dNTP。在一个实施方案中，还优选在步骤2和步骤3)之间包括纯化步骤：纯化所述延伸反应的延伸产物以获得纯化的延伸产物，可以通过本领域已知的任何方法纯化延伸产物，但优选使用离子交换树脂进行纯化。
扩增引物和延伸引物可以如下方式进行设计、制备：根据所选择的25种待检测呼吸道病原体的基因序列，设计出针对每种呼吸道病原体的特异性扩增引物，设计的扩增引物区域在每种病原体的种内相对保守，但在种间具有特异性。在所述扩增引物的3′端具有与其所针对的病原体类型的基因序列完全匹配的至少15个碱基，在所述扩增引物的5′端可以具有标签序列(Tag)，例如实施例中使用的SEQ ID NO：76(acgttggatg)。加标签序列的目的为增加引物序列的分子量，以排除其在后续步骤中的影响。设计延伸引物，所述延伸引物的长度为17-28个碱基，并且在其3′端包括延伸碥基在内的5个碱基具有病原体类型特异的高度保守性位点标记。同时，各延伸引物之间的分子量差异不小于9道尔顿，且各病原体类型的延伸产物之间及延伸产物与相应延伸引物之间的分子量差异不小于30道尔顿；按照引物间、引物与扩增产物/延伸产物之间不形成二聚体，引物自身不形成发夹结构，以及引物与模板间不发生错配的原则设计引物。特别地，用于质谱检测的延伸引物满足如下条件：各延伸产物之间以及延伸产物与相应延伸引物之间的分子量相互间的差别不小于30道尔顿，各延伸引物之间的分子量差异不小于9道尔顿，延伸引物与延伸产物的分子量在4500-8500道尔顿之间。按照引物间、引物与产物间不形成二聚体，引物自身不形成发卡结构，以及引物与模板间不发生错配的原则设计上述引物。本发明中针对所述25种常见呼吸道病原体的扩增引物对参见表1，延伸引物参见表2。
实施例1：
在本实施例中，提供了对3种病原体质粒(肺炎链球菌、甲型流感病毒、冠状病毒229E)进行检测的方法，包括如下步骤：
(1)通过PCR扩增获得待测病原体质粒目的序列的扩增产物。使用的扩增引物组(待检测病原体所在反应体系1、2或3中的对应的病原体引物组合)参见表1，其中每条引物在制备时需在其5′端加上10个碱基的标签序列(acgttggatg)，目的为增加引物序列的分子量，以排除其在后续步骤中的影响。
PCR扩增所使用的后应体系如下，其中所有试剂均购买自Sequenom公司：
PCR反应条件为：94℃，15分钟；94℃变性20秒，56℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共扩增45循环；最终72℃延伸3分钟。其中使用的模板DNA是人工构建的病原体质粒。
本实施例中使用的病原体质粒按照如下方法进行制备：
使用特异性引物扩增每种病原体的包含扩增引物扩增基因片段在内的保守基因区，将扩增产物分别克隆入PMD-T载体(Takara PMD-T连接试剂盒)，然后转化入大肠杆菌DH5α。转化后的大肠杆菌经蓝白斑筛选以及二次扩大培养后，用于质粒提取。使用质粒提取试剂盒(购自AXYGEN公司)提取并纯化质粒。通过DNA测序对质粒进行鉴定。分别测定制备好的各型质粒的OD值。根据OD值将各型质粒稀释为500pg/μl、5pg/μl和0.5pg/μl三种浓度的存储液。然后根据摩尔公式：1ng质粒的拷贝数≈[1×10-9/12×330×(载体分子量+插入片断分子量)]×6.02×1023计算出1ng质粒的拷贝数。再根据这个值将各型质粒稀释为1000拷贝/μl，供本实施例中使用。
本实施例中，将无菌双蒸水作为阴性对照，将对照样本与待测质粒样本按照相同的反应过程进行反应和测试，以验证检测的有效性。
(2)通过虾碱性磷酸酶(SAP酶)处理，除去步骤(1)获得的扩增产物中含有的dNTP。SAP酶反应体系如下，所有试剂购买自Sequenom公司：
试剂 体积/反应
水(HPLE级) 1.53μl
SAP酶缓冲液 0.17μl
SAP酶 0.30μl
PCR扩增产物 5.0μl
总体积 7.0μl
SAP酶反应条件为37℃温百40分钟，以去除PCR扩增反应中剩余的dNTP；85℃温育5分钟，以使SAP酶失活。
(3)以步骤(2)中获得的产物为模板，通过延伸反应，在延伸引物的3’端连接一个碱基，从而得到延伸产物。使用的延伸引物参见表2中的相应反应体系1、2或3的延伸引物。延伸反应体系如下，所有试剂购买自Sequenom公司：
*其中延伸引物混合物按照各引物的分子量大小进行线性关系调整(即，根据每种延伸引物的分子量计算每种引物的使用量)。
延伸反应条件：94℃，30秒；94℃变性5秒，52℃退火5秒，80℃延伸5秒，共扩增40个循环，且在每个循环中退火和延伸进行5个小循环；最终72℃延伸3分钟。
(4)采用离子交换树脂(购买自Sequenom公司)纯化步骤(3)中获得的延伸产物。在延伸产物中加入6mg树脂，18.00μl水，垂直摇匀一小时。经过本步反应后，树脂将与反应体系中的阳离子充分结合，从而使反应体系脱盐。反应完成后的纯化的延伸产物可在4℃下保存数天，也可在-20℃下保存数周。所得的纯化的延伸产物在4000rpm离心5分钟后，取上清直接用于质谱检测。
(5)依照制造商建议的步骤，将纯化的延伸产物在MALDI-TOF质谱仪(购自Sequenom公司)上进行质谱检测。根据提供商的说明书，所得到的质谱峰图通过Typer4.0分析软件(由Sequenom公司提供)进行分析，得到分型结果。峰图报告一般分为四种：A：结果可靠；B：结果中度可靠；C：结果一般可靠；D：结果低度可靠。前三种表示结果可靠，有相应病原体感染；后一种表示峰图基线不稳，视为结果无效。但是在具体的实验中要根据具体样本信息和峰图信息具体分析。
以下结合图1-3，对上述病原体质粒检测结果进行分析说明。
从图1可知，当使用肺炎链球菌(Str_pne)质粒作为模板DNA时，质谱检测在质量6627.4处检测到峰，所述峰经软件分析后，被确认为是肺炎链球菌(Str_pne)延伸产物的峰，而在质量6380.2处的峰(对应于延伸引物峰)不存在，说明延伸引物已经被反应消耗，从而确定样品中含有肺炎链球菌(Str_pne)质粒。
与此类似，如图2和图3中分别显示了甲型流感病毒(FLUAV)质粒和冠状病毒229E(229E-cov)质粒的检测结果。图2中，当使用甲型流感病毒(FLUAV)质粒作为模板DNA时，质谱检测在质量6574.3处检测到峰，从而确定样品中含有甲型流感病毒(FLUAV)质粒。图3中，当使用冠状病毒229E(229E-cov)质粒作为模板DNA时，质谱检测在质量6579.1处检测到峰，从而确定样品中含有冠状病毒229E(229E-cov)质粒。
上述这些结果均与已知质粒型别完全一致。
从本实施例可知，本发明所开发的引物和方法可以实现对25种常见呼吸道感染病原体(包括肺炎链球菌、肺炎军团菌、结核分枝杆菌、脑膜炎双球菌、流感嗜血杆菌、博卡病毒、腺病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体、Q热立克次体、副流感病毒1、副流感病毒2、副流感病毒3、冠状病毒OC43、SARS病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、腮腺炎病毒、鼻病毒、人偏肺病毒、麻疹病毒、风疹病毒、冠状病毒229E和禽流感病毒H5)的检测和鉴别。
实施例2：
在本实施例中，提供了对临床采集的病原体混合感染样本的检测方法，包括如下步骤：
(1)对临床采集的样本进行前期处理，使用试剂盒(QIAGEN公司)提取病原体DNA和RNA，利用购自Takara公司的RT reagent Kit将提取的RNA样本反转录为cDNA。
步骤(2)-(6)同实施例1中步骤(1)-(5)，不同之处仅在于PCR扩增反应体系中使用的模板为以上步骤(1)中制备的临床样本DNA和cDNA，并且使用的扩增引物和延伸引物是反应体系2所对应的扩增引物和延伸引物。
以下结合图4，对上述病原体混合感染样本检测结果进行分析说明。
图4为使用临床混合感染病原体cDNA作为模板时质谱检测峰图，其中显示了检测到的各个峰。峰谱位置有UEP字样的代表该处是相应的延伸引物峰位置，仅有病原体简称的峰谱位置代表延伸产物峰位置，如UEP.FLUAV表示甲型流感病毒的延伸引物位置，FLUAV表示甲型流感病毒的延伸产物位置。从图中可以看出，FLUAV和FLUBV两个位置有明显的峰存在，因此表明样本中存在甲型流感病毒和乙型流感病毒。
从本实施例可知，本发明所开发的引物和方法可以在三个反应体系中实现对临床样本中25种常见呼吸道混合感染病原体的多重检测。

Claims (19)

1.对样品中的呼吸道病原体进行检测的方法，其包括以下步骤：
1)使用扩增引物对PCR扩增样品的cDNA或DNA，从而获得扩增产物，所述扩增引物对针对的是每种待检测呼吸道病原体基因组序列的保守区；
2)以步骤1)中获得的扩增产物为模板，使用延伸引物通过延伸反应获得延伸产物，所述延伸引物针对的是扩增引物所扩增序列中相对保守的区域；
3)对所述延伸产物进行质谱检测确定样品的谱峰，通过将所述谱峰与延伸引物分子量及对应延伸产物分子量信息比对确定待检测的呼吸道病原体的具体类型，
其中所述扩增引物对和所述延伸引物的组合如下：
扩增引物对SEQ ID NO:1和2或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:1和2，延伸引物SEQ ID NO:51；
扩增引物对SEQ ID NO:3和4或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:3和4，延伸引物SEQ ID NO:52；
扩增引物对SEQ ID NO:5和6或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:5和6，延伸引物SEQ ID NO:53；
扩增引物对SEQ ID NO:7和8或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:7和8，延伸引物SEQ ID NO:54；
扩增引物对SEQ ID NO:9和10或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:9和10，延伸引物SEQ ID NO:55；
扩增引物对SEQ ID NO:11和12或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:11和12，延伸引物SEQ ID NO:56；
扩增引物对SEQ ID NO:13和14或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:13和14，延伸引物SEQ ID NO:57；
扩增引物对SEQ ID NO:15和16或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:15和16，延伸引物SEQ ID NO:58；
扩增引物对SEQ ID NO:17和18或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:17和18，延伸引物SEQ ID NO:59；
扩增引物对SEQ ID NO:19和20或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:19和20，延伸引物SEQ ID NO:60；
扩增引物对SEQ ID NO:21和22或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:21和22，延伸引物SEQ ID NO:61；
扩增引物对SEQ ID NO:23和24或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:23和24，延伸引物SEQ ID NO:62；
扩增引物对SEQ ID NO:25和26或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:25和26，延伸引物SEQ ID NO:63；
扩增引物对SEQ ID NO:27和28或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:27和28，延伸引物SEQ ID NO:64；
扩增引物对SEQ ID NO:29和30或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:29和30，延伸引物SEQ ID NO:65；
扩增引物对SEQ ID NO:31和32或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:31和32，延伸引物SEQ ID NO:66；
扩增引物对SEQ ID NO:33和34或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:33和34，延伸引物SEQ ID NO:67；
扩增引物对SEQ ID NO:35和36或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:35和36，延伸引物SEQ ID NO:68；
扩增引物对SEQ ID NO:37和38或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:37和38，延伸引物SEQ ID NO:69；
扩增引物对SEQ ID NO:39和40或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:39和40，延伸引物SEQ ID NO:70；
扩增引物对SEQ ID NO:41和42或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:41和42，延伸引物SEQ ID NO:71；
扩增引物对SEQ ID NO:43和44或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:43和44，延伸引物SEQ ID NO:72；
扩增引物对SEQ ID NO:45和46或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:45和46，延伸引物SEQ ID NO:73；
扩增引物对SEQ ID NO:47和48或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:47和48，延伸引物SEQ ID NO:74；以及
扩增引物对SEQ ID NO:49和50或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:49和50，延伸引物SEQ ID NO:75，
所述方法用于非诊断目的。
2.权利要求1的方法，其中所述步骤2)中的延伸反应是单碱基延伸反应、双碱基延伸反应或多碱基延伸反应。
3.权利要求1的方法，其中在所述步骤1)之后和步骤2)之前还包括除去所述扩增产物中的dNTP的步骤。
4.权利要求3的方法，其中通过使用虾碱性磷酸酶(SAP酶)处理所述扩增产物来除去dNTP。
5.权利要求1-4任一项的方法，其中在所述步骤2)之后和步骤3)之前还包括纯化步骤：纯化所述延伸反应的延伸产物以获得纯化的延伸产物。
6.权利要求5的方法，其中使用离子交换树脂纯化所述延伸反应的延伸产物。
7.权利要求1-4任一项的方法，其中在所述步骤3)中用基质辅助激光解吸附/电离飞行时间质谱系统对所述延伸产物进行质谱检测。
8.权利要求5的方法，其中在所述步骤3)中用基质辅助激光解吸附/电离飞行时间质谱系统对所述纯化的延伸产物进行质谱检测。
9.权利要求1-4任一项的方法，其中所述呼吸道病原体为如下的25种呼吸道病原体：肺炎链球菌、肺炎军团菌、结核分枝杆菌、脑膜炎双球菌、流感嗜血杆菌、博卡病毒、腺病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体、Q热立克次体、副流感病毒1、副流感病毒2、副流感病毒3、冠状病毒OC43、SARS病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、腮腺炎病毒、鼻病毒、人偏肺病毒、麻疹病毒、风疹病毒、冠状病毒229E和禽流感病毒H5。
10.权利要求1-4任一项的方法，其中所述标签序列是SEQ ID NO:76。
11.权利要求1-4任一项的方法，其中所述样品选自纯病毒、细菌培养物以及携带此类病原体的媒介生物样本。
12.权利要求11的方法，其中所述媒介生物样本选自土壤、食物和水。
13.一种用于检测样品中的呼吸道病原体的试剂盒，其包含如下扩增引物对和延伸引物的组合：
扩增引物对SEQ ID NO:1和2或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:1和2，延伸引物SEQ ID NO:51；
扩增引物对SEQ ID NO:3和4或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:3和4，延伸引物SEQ ID NO:52；
扩增引物对SEQ ID NO:5和6或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:5和6，延伸引物SEQ ID NO:53；
扩增引物对SEQ ID NO:7和8或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:7和8，延伸引物SEQ ID NO:54；
扩增引物对SEQ ID NO:9和10或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:9和10，延伸引物SEQ ID NO:55；
扩增引物对SEQ ID NO:11和12或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:11和12，延伸引物SEQ ID NO:56；
扩增引物对SEQ ID NO:13和14或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:13和14，延伸引物SEQ ID NO:57；
扩增引物对SEQ ID NO:15和16或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:15和16，延伸引物SEQ ID NO:58；
扩增引物对SEQ ID NO:17和18或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:17和18，延伸引物SEQ ID NO:59；
扩增引物对SEQ ID NO:19和20或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:19和20，延伸引物SEQ ID NO:60；
扩增引物对SEQ ID NO:21和22或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:21和22，延伸引物SEQ ID NO:61；
扩增引物对SEQ ID NO:23和24或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:23和24，延伸引物SEQ ID NO:62；
扩增引物对SEQ ID NO:25和26或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:25和26，延伸引物SEQ ID NO:63；
扩增引物对SEQ ID NO:27和28或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:27和28，延伸引物SEQ ID NO:64；
扩增引物对SEQ ID NO:29和30或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:29和30，延伸引物SEQ ID NO:65；
扩增引物对SEQ ID NO:31和32或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:31和32，延伸引物SEQ ID NO:66；
扩增引物对SEQ ID NO:33和34或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:33和34，延伸引物SEQ ID NO:67；
扩增引物对SEQ ID NO:35和36或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:35和36，延伸引物SEQ ID NO:68；
扩增引物对SEQ ID NO:37和38或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:37和38，延伸引物SEQ ID NO:69；
扩增引物对SEQ ID NO:39和40或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:39和40，延伸引物SEQ ID NO:70；
扩增引物对SEQ ID NO:41和42或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:41和42，延伸引物SEQ ID NO:71；
扩增引物对SEQ ID NO:43和44或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:43和44，延伸引物SEQ ID NO:72；
扩增引物对SEQ ID NO:45和46或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:45和46，延伸引物SEQ ID NO:73；
扩增引物对SEQ ID NO:47和48或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:47和48，延伸引物SEQ ID NO:74；以及
扩增引物对SEQ ID NO:49和50或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:49和50，延伸引物SEQ ID NO:75，
或者还包含其他试剂。
14.权利要求13的试剂盒，其中所述其他试剂是用于PCR扩增反应的酶和试剂，用于延伸反应的酶和试剂，以及/或者用于纯化延伸产物的树脂。
15.权利要求13的试剂盒，其中所述标签序列是SEQ ID NO:76。
16.如下的扩增引物对和延伸引物的组合用于对样品中的呼吸道病原体进行检测的用途，所述用途为非诊断目的；或者用于制备试剂盒的用途，所述试剂盒用于检测样品中的呼吸道病原体：
扩增引物对SEQ ID NO:1和2或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:1和2，延伸引物SEQ ID NO:51；
扩增引物对SEQ ID NO:3和4或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:3和4，延伸引物SEQ ID NO:52；
扩增引物对SEQ ID NO:5和6或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:5和6，延伸引物SEQ ID NO:53；
扩增引物对SEQ ID NO:7和8或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:7和8，延伸引物SEQ ID NO:54；
扩增引物对SEQ ID NO:9和10或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:9和10，延伸引物SEQ ID NO:55；
扩增引物对SEQ ID NO:11和12或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:11和12，延伸引物SEQ ID NO:56；
扩增引物对SEQ ID NO:13和14或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:13和14，延伸引物SEQ ID NO:57；
扩增引物对SEQ ID NO:15和16或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:15和16，延伸引物SEQ ID NO:58；
扩增引物对SEQ ID NO:17和18或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:17和18，延伸引物SEQ ID NO:59；
扩增引物对SEQ ID NO:19和20或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:19和20，延伸引物SEQ ID NO:60；
扩增引物对SEQ ID NO:21和22或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:21和22，延伸引物SEQ ID NO:61；
扩增引物对SEQ ID NO:23和24或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:23和24，延伸引物SEQ ID NO:62；
扩增引物对SEQ ID NO:25和26或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:25和26，延伸引物SEQ ID NO:63；
扩增引物对SEQ ID NO:27和28或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:27和28，延伸引物SEQ ID NO:64；
扩增引物对SEQ ID NO:29和30或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:29和30，延伸引物SEQ ID NO:65；
扩增引物对SEQ ID NO:31和32或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:31和32，延伸引物SEQ ID NO:66；
扩增引物对SEQ ID NO:33和34或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:33和34，延伸引物SEQ ID NO:67；
扩增引物对SEQ ID NO:35和36或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:35和36，延伸引物SEQ ID NO:68；
扩增引物对SEQ ID NO:37和38或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:37和38，延伸引物SEQ ID NO:69；
扩增引物对SEQ ID NO:39和40或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:39和40，延伸引物SEQ ID NO:70；
扩增引物对SEQ ID NO:41和42或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:41和42，延伸引物SEQ ID NO:71；
扩增引物对SEQ ID NO:43和44或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:43和44，延伸引物SEQ ID NO:72；
扩增引物对SEQ ID NO:45和46或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:45和46，延伸引物SEQ ID NO:73；
扩增引物对SEQ ID NO:47和48或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:47和48，延伸引物SEQ ID NO:74；以及
扩增引物对SEQ ID NO:49和50或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:49和50，延伸引物SEQ ID NO:75；
或者权利要求13的试剂盒用于对样品中的呼吸道病原体进行检测的用途，所述用途为非诊断目的。
17.权利要求16的用途，其中所述标签序列是SEQ ID NO:76。
18.一组用于检测样品中的呼吸道病原体的引物：
扩增引物对SEQ ID NO:1和2或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:1和2，延伸引物SEQ ID NO:51；
扩增引物对SEQ ID NO:3和4或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:3和4，延伸引物SEQ ID NO:52；
扩增引物对SEQ ID NO:5和6或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:5和6，延伸引物SEQ ID NO:53；
扩增引物对SEQ ID NO:7和8或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:7和8，延伸引物SEQ ID NO:54；
扩增引物对SEQ ID NO:9和10或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:9和10，延伸引物SEQ ID NO:55；
扩增引物对SEQ ID NO:11和12或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:11和12，延伸引物SEQ ID NO:56；
扩增引物对SEQ ID NO:13和14或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:13和14，延伸引物SEQ ID NO:57；
扩增引物对SEQ ID NO:15和16或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:15和16，延伸引物SEQ ID NO:58；
扩增引物对SEQ ID NO:17和18或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:17和18，延伸引物SEQ ID NO:59；
扩增引物对SEQ ID NO:19和20或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:19和20，延伸引物SEQ ID NO:60；
扩增引物对SEQ ID NO:21和22或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:21和22，延伸引物SEQ ID NO:61；
扩增引物对SEQ ID NO:23和24或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:23和24，延伸引物SEQ ID NO:62；
扩增引物对SEQ ID NO:25和26或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:25和26，延伸引物SEQ ID NO:63；
扩增引物对SEQ ID NO:27和28或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:27和28，延伸引物SEQ ID NO:64；
扩增引物对SEQ ID NO:29和30或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:29和30，延伸引物SEQ ID NO:65；
扩增引物对SEQ ID NO:31和32或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:31和32，延伸引物SEQ ID NO:66；
扩增引物对SEQ ID NO:33和34或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:33和34，延伸引物SEQ ID NO:67；
扩增引物对SEQ ID NO:35和36或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:35和36，延伸引物SEQ ID NO:68；
扩增引物对SEQ ID NO:37和38或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:37和38，延伸引物SEQ ID NO:69；
扩增引物对SEQ ID NO:39和40或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:39和40，延伸引物SEQ ID NO:70；
扩增引物对SEQ ID NO:41和42或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:41和42，延伸引物SEQ ID NO:71；
扩增引物对SEQ ID NO:43和44或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:43和44，延伸引物SEQ ID NO:72；
扩增引物对SEQ ID NO:45和46或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:45和46，延伸引物SEQ ID NO:73；
扩增引物对SEQ ID NO:47和48或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:47和48，延伸引物SEQ ID NO:74；以及
扩增引物对SEQ ID NO:49和50或者5’端包含标签序列的SEQ ID NO:49和50，延伸引物SEQ ID NO:75。
19.权利要求18的引物，其中所述标签序列是SEQ ID NO:76。
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