CN101942440A

CN101942440A - 检测和定型食管hpv病毒的引物和方法

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Publication number: CN101942440A
Application number: CN201010298199.2A
Authority: CN
Inventors: 倪培相; 瞿宁; 李晓艳
Original assignee: BGI Shenzhen Co Ltd
Current assignee: Bgi Diagnosis Co ltd; BGI Shenzhen Co Ltd
Priority date: 2010-09-28
Filing date: 2010-09-28
Publication date: 2011-01-12
Anticipated expiration: 2030-09-28
Also published as: CN101942440B; WO2012040996A1; HK1149293A1

Abstract

本发明涉及用于检测和定型感染食管细胞(例如食管粘膜细胞)的人乳头瘤病毒的引物和方法。特别地，本发明基于采用基质辅助激光解吸附/电离飞行时间质谱系统(MALDI-TOF-MS)的质谱检测技术，设计了一套全新的引物(包括扩增引物和延伸引物)，从而实现对感染食管细胞的15种型别进行检测和定型。

Description

检测和定型食管HPV病毒的引物和方法

发明领域

本发明涉及用于检测和定型感染食管细胞(例如食管粘膜细胞)的人乳头瘤病毒的引物和方法。

发明背景

人乳头瘤病毒(human papilloma virus，简称HPV)是一种小型、无包膜的DNA病毒，其具有双链闭环的DNA基因组，大小约为7.2-8kb，相对分子量约为5×10⁶。HPV基因组可分为3个区域：非编码的上游调节区；早期开放读码区，包括E6、E7、E1、E2、E4、E5；晚期开放读码区，编码主要衣壳蛋白L1和小衣壳蛋白L2。根据编码主要衣壳蛋白L1的开放读码框(ORF)基因序列的不同，可以对HPV进行分型：将L1区ORF的相似性小于60％的HPV分为不同的属，相似性在60-70％之间的HPV分为不同的种，相似性在71-89％之间的HPV则分为不同的型别。目前已鉴定的HPV约有130多型，根据其病毒致病力大小，可分为高危型HPV，如HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68、HPV73等，以及低危型HPV，如HPV6、HPV11、HPV42、HPV43、HPV44等。

HPV病毒是与多种肿瘤发生相关的感染因素。据报道，全世界约有15％的人类肿瘤与HPV病毒相关。1982年，Syrjanen等首先发现高危型HPV感染可能和食管癌有关。

目前HPV检测技术主要包括第二代杂交捕获技术(HC2)，荧光定量PCR、采用基质辅助激光解吸附/电离飞行时间质谱系统(MALDI-TOF-MS)的质谱检测。其中HC2已成为临床HPV检测领域的金标准。

第二代杂交捕获技术(HC2)是美国Digene公司发展的、唯一获得FDA批准的可在临床使用的一种检测HPV DNA的技术。该技术的原理是对抗体捕获信号进行放大和对化学发光信号进行检测。该方法使用高危型和低危型核糖核酸探针，能检测13种高危型HPV(HPV 16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59和68)，是一种易于操作的液基杂交检测方法。然而，该方法并不能对HPV进行精确分型，也不能检测多重感染，并且当任何一种型别的HPV DNA超过阈值时，其检测结果均为阳性。此外，高危型探针还可与其他型别的HPV(例如HPV 53、66、67和73)发生交叉反应，产生假阳性结果，降低实验特异性。

荧光定量PCR(FQ-PCR)在常规PCR的基础上把基因扩增、分子杂交和光化学融为一体，使PCR扩增和产物分析的全过程在单管封闭条件下进行，实现了实时动态检测和结果自动化分析，从根本上解决了扩增产物污染和不能定量的问题。该方法通过探针杂交进一步提高了HPV DNA检测的特异性，具有快速、简便、灵敏度高、特异性强等优点，适用于临床工作和大规模筛查。然而，目前该方法主要针对HPV6、11、16和18感染，易漏诊其他HPV亚型。同时，与HC2一样，荧光定量PCR也不能实现对HPV进行精确分型，即不能明确HPV感染型别。

采用基质辅助激光解吸附/电离飞行时间质谱系统(MALDI-TOF-MS)的质谱检测可以同时检测HPV型别的一种或几种，具有高灵敏度，高特异性和高适量的特点，且相对于其它的检测方法成本低。然而，该方法目前主要用于检测和定型感染宫颈上皮细胞的HPV，应用受到了限制。

发明内容

本发明基于采用基质辅助激光解吸附/电离飞行时间质谱系统(MALDI-TOF-MS)的质谱检测技术，开发了新的用于检测和/或分型样品中的HPV病毒，特别地感染食管细胞的HPV病毒的引物和方法。

目前已知的感染食管细胞的HPV病毒主要有以下15种型别：HPV3、HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV26、HPV31、HPV33、HPV45、HPV52、HPV56、HPV57、HPV58、HPV59和HPV94。

因此，在一个方面，本发明提供了对样品中的HPV病毒进行检测和/或分型的方法，其包括以下步骤：

(1)根据所选择的待检测的HPV型别(即，上述15种HPV型别)的基因序列，在GP5+/GP6+通用引物的基础上，设计出特异于各个型别的扩增引物，优选所述扩增引物在5′端具有10个碱基acgttggatg的标签序列；设计延伸引物，所述延伸引物的长度为17-28个碱基，并且在其3′端包含一个型别特异性多态性位点标记，延伸引物选择的位置是GP5+/GP6+序列中相对保守的区域，并且延伸产物和延伸引物之间分子量差异不小于9D，且各个型别的延伸产物间的分子量差异不小于30D；

(2)通过用扩增引物进行PCR扩增，获得靶序列扩增产物；

(3)除去所述扩增产物中的dNTP，优选通过使用SAP酶处理所述扩增产物来除去dNTP；

(4)使用延伸引物进行单碱基延伸反应，以获得延伸产物；

(5)纯化延伸产物，优选通过树脂来进行纯化；

(6)采用基质辅助激光解吸附/电离飞行时间质谱系统对纯化后的产物进行质谱检测，从而检测和/或分型HPV型别。

在一个优选实施方案中，本发明的方法所使用的扩增引物包含23种引物，各引物的核苷酸序列分别如缺失5′端前10个碱基的SEQ ID NO：1-23所示，优选所述引物在5′端还包含标签序列，更优选各引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1-23所示。在一个优选实施方案中，本发明的方法所使用的延伸引物包含15种引物，各引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：26-40所示。

在一个优选实施方案中，样品优选是食管细胞，例如食管粘膜细胞。在一个优选实施方案中，待检测和/或分型的HPV病毒选自HPV 3、6、11、16、18、26、31、33、45、52、56、57、58、59和94中的一种或多种。

因此，在另一个方面，本发明提供了扩增引物组，其包含23种引物，各引物的核苷酸序列分别如缺失5′端前10个碱基的SEQ ID NO：1-23所示，优选所述引物在5′端还包含标签序列，更优选各引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1-23所示。特别地，本发明的扩增引物组可用于本发明的方法中和/或用于扩增感染食管细胞的HPV病毒，例如HPV3、HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV26、HPV31、HPV33、HPV45、HPV52、HPV56、HPV57、HPV58、HPV59和HPV94。

在另一个方面，本发明提供了延伸引物组，其包含15种引物，各引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：26-40所示。特别地，本发明的延伸引物组可用于本发明的方法中，以检测和/或分型样品中的HPV病毒，例如感染食管细胞的HPV病毒，例如HPV3、HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV26、HPV31、HPV33、HPV45、HPV52、HPV56、HPV57、HPV58、HPV59和HPV94。

在另一个方面，本发明提供了一种试剂盒，其包含本发明的扩增引物组和延伸引物组。在一个实施方案中，本发明的试剂盒还可以包含其他试剂，例如用于PCR扩增反应的酶和试剂，用于单碱基延伸反应的酶和试剂，用于纯化延伸产物的树脂等。

特别地，本发明的试剂盒可用于检测和/或分型样品中的HPV病毒，例如感染食管细胞的HPV病毒，例如HPV3、HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV26、HPV31、HPV33、HPV45、HPV52、HPV56、HPV57、HPV58、HPV59和HPV94。

在另一个方面，还提供了本发明的扩增引物组和/或延伸引物组用于制备试剂盒的用途，所述试剂盒用于检测和/或分型样品中的HPV病毒，例如感染食管细胞的HPV病毒。

在另一个方面，还提供了本发明的试剂盒的用途，其用于对样品中的HPV病毒进行检测和/或分型，其中待检测和/或分型的HPV病毒优选选自HPV 3、6、11、16、18、26、31、33、45、52、56、57、58、59和94中的一种或多种，所述样品优选是食管细胞，例如食管粘膜细胞。

在又一个方面，本发明提供了对样品中的HPV病毒进行检测和/或分型的方法，其包括以下步骤：

1)用本发明的扩增引物组或本发明的试剂盒中的扩增引物组PCR扩增样品中的DNA，从而获得扩增产物；

2)除去所述扩增产物中的dNTP，优选通过使用SAP酶处理所述扩增产物来除去dNTP；

3)以步骤2)中获得的产物为模板，使用本发明的延伸引物组或本发明的试剂盒中的延伸引物组，通过单碱基延伸反应获得延伸产物；

4)纯化所述延伸产物，优选通过树脂来进行纯化，从而获得纯化产物；和

5)用基质辅助激光解吸附/电离飞行时间质谱系统对所述纯化产物进行质谱检测，从而对样品中的HPV病毒进行检测和/或分型；

在一个优选实施方案中，待检测和/或分型的HPV病毒选自HPV 3、6、11、16、18、26、31、33、45、52、56、57、58、59和94中的一种或多种。在一个优选实施方案中，所述样品是食管细胞，例如食管粘膜细胞。

发明的有益效果

与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下显著优点：

1)使用的试剂耗材相对简单且稳定，不需要荧光染料、特殊的酶等价格昂贵的试剂；

2)反应可以在微量体系中进行，减少了样品和各种消耗品的使用；

3)由于质谱技术直接检测DNA的分子量(质荷比)且直接确定碱基的类型(即，不需要经过任何形式的信号转换)，因此，理论上只要有一个拷贝的SNP片段被扩增即可识别，从而杜绝了假阳性发生的可能；

4)质谱技术还有自动化、高通量检测等特点，因此，质谱技术与多引物延伸技术相结合，可以在一个反应体系中同时检测多种HPV型别，从而大大减少了工作量，提高了检测通量。

另外，质谱分型系统从引物设计的角度而言，特别适合于进行HPV检测。一方面，质谱分型系统要求前PCR产物在100-180bp的范围内为最佳，而HPV的L1区通用引物GP5+/GP6+扩增大约140bp的片段，且扩增的有效性已经得到证实。即，在本发明的方法中，修改后的引物GP5+/GP6+扩增的产物长度满足质谱分型系统对前PCR产物片段的长度的要求。另一方面，质谱分型系统要求延伸产物和延伸引物之间的分子量差异不小于9D，且各个型别的延伸产物间的分子量差异不小于30D，而本发明的方法中设计的特异于上述15型HPV的延伸引物在质谱系统中能彼此区分，满足了质谱分型系统的要求。因此，本发明的引物和方法可以同时检测和分型上述15种HPV型别。

特别地，本发明的技术方案采用基质辅助激光解吸附/电离飞行时间质谱系统(MALDI-TOF-MS)，通过设计一套全新的质谱延伸引物，实现了对上述15种HPV型别的检测和分型。其与第二代杂交捕获技术和荧光定量PCR方法相比，能够准确检测出15种HPV型别(HPV3、HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV26、HPV31、HPV33、HPV45、HPV52、HPV56、HPV57、HPV58、HPV59和HPV94)并对其进行精确分型，与现有的飞行时间质谱技术相比，能够另外准确检测出HPV3、HPV26、HPV57和HPV94这四种HPV型别，具有显著的优点。

本发明的引物和方法实现了对感染食管细胞的15种HPV型别的检测和分型，有利于研究HPV感染型别与食管癌之间的关系，对于研究食管癌的发病机制有重要意义。

下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。

附图概述

图1和2为HPV3质粒样品的检测结果。具体而言，图1为质谱检测峰图，其显示，在质量5407.58处的峰(对应于产物峰)很高，而在质量5120.39处的峰(对应于引物峰)不存在。这表明样品中含有病毒HPV 3。图2显示质谱峰图分析软件的分析结果，其表明样品中含有HPV 3型病毒，而不含其他14种型别的HPV病毒。

图3和4为HPV 33质粒样品的检测结果。具体而言，图3为质谱检测峰图，其显示，在质量5446.6处的峰(对应于产物峰)很高，而在质量5175.37处的峰(对应于引物峰)不存在。这表明样品中含有病毒HPV 33。图4显示质谱峰图分析软件的分析结果，其表明样品中含有HPV 3型病毒，而不含其他14种型别的HPV病毒。

具体实施方式

本发明的实施例提供了对感染食管细胞的上述15种HPV型别进行检测和分型的方法，其包括如下的步骤。

(1)根据所选择的待检测的HPV型别(即，上述15种HPV型别)的基因序列，在GP5+/GP6+通用引物的基础上，设计出特异于各个型别的扩增引物，所述扩增引物在3′端具有与其所针对的型别的基因序列完全匹配的12个碱基，在5′端具有10个碱基(acgttggatg)的标签序列；设计延伸引物，所述延伸引物的长度为17-28个碱基，并且在其3′端的包括延伸碱基在内的4个碱基中，包含一个型别特异性多态性位点标记，延伸引物选择的位置是GP5+/GP6+序列中相对保守的区域；其中，延伸产物和延伸引物之间的分子量差异不小于9D，且各个型别的延伸产物间的分子量差异不小于30D；按照引物间，引物与扩增产物/延伸产物间不形成二聚体，引物自身不形成发夹结构，以及引物与模板间不发生错配的原则设计引物。

特别地，用于质谱检测的延伸引物按照下列原则设计：各延伸产物的分子量相互间的差别不小于30Da，各延伸引物与各延伸产物之间的分子量差异不小于9Da，延伸引物与延伸产物的分子量在4500-8500Da之间。本发明设计的针对所述15种HPV型别的扩增引物参见表1，延伸引物参见表2。

表1：针对所述15种HPV型别的L1区PCR扩增引物。

表2：针对所述15种HPV型别的质谱延伸引物。

SEQ ID NO：	延伸引物名称	引物序列5′→3′	HPV型别	延伸碱基
					26	HPV16	TTAAAGTTAGTATTTTTATATGTAGT	HPV16	T
27	HPV18A4	TACACAGTCTCCTGTACCTGGGC	HPV18	A
					28	HPV33A2	ATGTACTGTCACTAGTT	HPV33	A
29	HPV45	CTACTATACTGCTTAAACTTAGTAG	HPV45	G
					30	HPV52	TGTGCTTTCCTTTTTAACCTCAG	HPV52	C
31	HPV58	TGTACCTTCCTTAGTTACTTCAG	HPV58	T
					32	HPV6A	TCCACATGACGCATGTACTC	HPV6	T
33	HPV11A3	CATCTGTGTCTAAATCTGCT	HPV11	A
					34	HPV26A	CACTCCATTTAAACCATCT	HPV26	G
35	HPV31A4	CTGCAATTGCAAACAGTGAT	HPV31	A
					36	HPV56A	TCGTGCATCATATTTACTTAACTGTTC	HPV56	T
37	HPV59A2	CGCAGCACCAATCTTT	HPV59	C
					38	HPV94A	GTGGAGGCATCAGAAGGGACG	HPV94	C
39	HPV57A2	GGACACCACGCGCAGCACAAATGTCTC	HPV57	T
					40	HPV3	GTTTCTACTGAAACCTC	HPV3	G
41	HBB	GGAGAAGTCTGCCGTT	内参	T

(2)通过PCR扩增，获得靶序列扩增产物。PCR扩增反应体系参见表3。其中，所有试剂购买自sequenom公司。

表3

PCR反应条件为94℃，15分钟；94℃变性20秒，56℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共扩增45循环；最终72℃延伸3分钟。在本实施例中，使用的模板DNA是HPV 3质粒和HPV 33质粒。同时，将无菌双蒸水作为阴性对照。阳性对照为HPV18重组质粒(250拷贝/ul)，其中掺有10ng/ul的经检测无HPV感染的人基因组DNA。将对照样本与待测样本按照相同的反应过程进行反应和测试，以验证检测的有效性。

本实施例中所使用的HPV质粒如下进行制备：

使用L1区特异引物扩增HPV3、HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV26、HPV31、HPV33、HPV45、HPV52、HPV56、HPV57、HPV58、HPV59和HPV94型的L1区基因片段，将扩增产物分别克隆入PMD-T载体(Takara PMD-T连接试剂盒)，然后转化入大肠杆菌DH5α。转化后的大肠杆菌经蓝白斑筛选以及二次扩大培养后，用于质粒提取。使用质粒提取试剂盒(AXYGEN)提取并纯化质粒。通过DNA测序对质粒进行鉴定。

分别测定制备好的HPV3、6、11、16、18、26、31、33、45、52、56、57、58、59、94型质粒的OD值。根据OD值将各质粒稀释为500pg/μl，5pg/μl，0.5pg/μl三种浓度的存储液。然后根据摩尔公式：1ng质粒的拷贝数≈[1*10^-9/12*330*(载体分子量+插入片断分子量)]*6.02*10²³计算出1ng质粒的拷贝数。根据这个值将各质粒稀释为10⁵，10⁴，5000，10³，10²，10¹拷贝/ul 6个浓度梯度以进行灵敏度验证。

(3)通过SAP酶(虾碱性磷酸酶)处理，除去步骤(2)获得的扩增产物中含有的dNTP。SAP酶反应体系见表4。所有试剂购买自sequenom公司。

表4

试剂	体积/反应
		水(HPLE级)	1.53ul
SAP酶缓冲液	0.17ul
		SAP	0.30ul

PCR扩增产物	5.0ul
		总体积	7.0ul

SAP酶反应条件为37℃温育40分钟，以去除PCR扩增反应中剩余的dNTP；85℃温育5分钟，以使SAP酶失活。

(4)以(3)中获得的产物为模板，通过延伸反应，在延伸引物的3’端连接一个碱基，从而得到延伸产物。延伸反应体系见表5。所有试剂购买自sequenom公司。

表5

*其中延伸引物混合物按照各引物的分子量大小进行线性关系调整(即，根据每种延伸引物的分子量计算每种引物的使用量)。

延伸反应条件为94℃，30秒；94℃变性5秒，52℃退火5秒，80℃延伸5秒，共扩增40个循环，且在每个循环中退火和延伸进行5个小循环；最终72℃延伸3分钟。

(5)采用树脂(购买自sequenom公司)纯化步骤(4)中获得的延伸产物。在延伸产物中加入6mg树脂，18.00ul水，垂直摇匀一小时。经过本步反应后，树脂将与反应体系中的阳离子充分结合，从而使反应体系脱盐。反应完成后的纯化产物可在4℃保存数天，也可在-20℃保存数周。所得的纯化产物在4000rpm离心5分钟后，取上清直接用于质谱检测。

(6)将纯化后的产物在Sequenom MALDI-TOF质谱仪上进行质谱检测。所得到的质谱峰图通过HPV分析软件(由sequenom公司提供)进行分析，得到分型结果。

从图1可知，当使用HPV 3质粒作为模板DNA时，MALDI-TOF质谱检测在质量5407.58处检测到峰，所述峰经软件分析后，被确认为特异于HPV 3的延伸产物的峰(如图2所示)，从而确认样品中含有HPV 3。类似地，当使用HPV 33质粒作为模板DNA时，MALDI-TOF质谱检测在质量5446.6处检测到峰，所述峰经软件分析后，被确认为特异于HPV 33的延伸产物的峰(参见图3和4)，从而确认样品中含有HPV 33。这些检测结果与已知的质粒型别完全一致。

从以上实施例可知，本发明所开发的引物和方法可以实现对感染食管细胞的HPV病毒(例如HPV 3、6、11、16、18、26、31、33、45、52、56、57、58、59和94)的检测和精确分型。

Claims

1.扩增引物组，其包含23种引物，各引物的核苷酸序列分别如缺失5′端前10个碱基的SEQ ID NO：1-23所示，优选所述引物在5′端还包含标签序列，更优选各引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1-23所示。

2.延伸引物组，其包含15种引物，各引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：26-40所示。

3.一种试剂盒，其包含权利要求1的扩增引物组和权利要求2的延伸引物组，优选其还包含其他试剂，例如用于PCR扩增反应的酶和试剂，用于单碱基延伸反应的酶和试剂，或用于纯化延伸产物的树脂。

4.权利要求1的扩增引物组和/或权利要求2的延伸引物组用于制备试剂盒的用途，所述试剂盒用于对样品中的HPV病毒，例如感染食管细胞的HPV病毒，进行检测和/或分型。

5.权利要求1的扩增引物组和/或权利要求2的延伸引物组的用途，其用于对样品中的HPV病毒进行检测和/或分型，其中待检测和/或分型的HPV病毒优选选自HPV 3、6、11、16、18、26、31、33、45、52、56、57、58、59和94中的一种或多种，所述样品优选是食管细胞，例如食管粘膜细胞。

6.权利要求3的试剂盒的用途，其用于对样品中的HPV病毒进行检测和/或分型，其中待检测和/或分型的HPV病毒优选选自HPV 3、6、11、16、18、26、31、33、45、52、56、57、58、59和94中的一种或多种，所述样品优选是食管细胞，例如食管粘膜细胞。

7.对样品中的HPV病毒进行检测和/或分型的方法，其包括以下步骤：

1)用权利要求1的扩增引物组或权利要求3的试剂盒中的扩增引物组PCR扩增样品中的DNA，从而获得扩增产物；

3)以步骤2)中获得的产物为模板，使用权利要求2的延伸引物组或权利要求3的试剂盒中的延伸引物组，通过单碱基延伸反应获得延伸产物；

其中，待检测和/或分型的HPV病毒优选选自HPV 3、6、11、16、18、26、31、33、45、52、56、57、58、59和94中的一种或多种，所述样品优选是食管细胞，例如食管粘膜细胞。