CN102033099B - 用质谱技术进行hpv定量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种分型和定量样品中的HPV的新方法，其包括以下步骤：设计HPV型别特异性突变质粒和野生质粒；构建数学模型以确定HPV型别特异性突变质粒与野生型质粒的浓度比例与质谱峰图中相应的峰面积比值的相关性；对样品中的HPV进行分型和定量。本发明还提供了用于该方法的试剂盒。
Description
发明领域
本发明涉及人类乳头瘤病毒(Human Papilloma Virus，HPV)的检测方法，特别是用质谱进行HPV分型和定量的新方法。
发明背景
人乳头瘤病毒(human papillomavirus，简称HPV)是一种小型、无包膜的DNA病毒，其具有双链闭环的DNA基因组，大小约为7.2-8kb，相对分子量约为5×106。HPV基因组可分为3个区域：非编码的上游调节区；早期开放读码区，包括E6、E7、E1、E2、E4、E5；晚期开放读码区，编码主要衣壳蛋白L1和小衣壳蛋白L2。根据编码主要衣壳蛋白L1的开放读码框(ORF)基因序列的不同，可以对HPV进行分型：将L1区ORF的相似性小于60％的HPV分为不同的属，相似性在60-70％之间的HPV分为不同的种，相似性在71-89％之间的HPV则分为不同的型别。目前已鉴定的HPV约有130多型，根据其病毒致病力大小，可分为高危型HPV，如HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68、HPV73等，以及低危型HPV，如HPV6、HPV11、HPV42、HPV43、HPV44等。高危型HPV可致宫颈上皮内瘤病变(CN)，多见于高龄妇女，不易自然缓解，与宫颈癌的发生关系密切。低危型HPV多见于年轻妇女，自然缓解率高。
目前HPV检测技术主要包括第二代杂交捕获技术(HC2)，荧光定量PCR、采用基质辅助激光解吸附/电离飞行时间质谱系统(MALDI-TOF-MS)的质谱检测。其中HC2已成为临床HPV检测领域的金标准。
第二代杂交捕获技术(HC2)是美国Digene公司发展的、唯一获得FDA批准的可在临床使用的一种检测HPV DNA的技术。该技术的原理是对抗体捕获信号进行放大和对化学发光信号进行检测。该方法使用高危型和低危型核糖核酸探针，能检测13种高危型HPV(HPV 16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59和68)，是一种易于操作的液基杂交检测方法。然而，该方法并不能对HPV进行精确分型，也不能检测多重感染，并且当任何一种型别的HPV DNA超过阈值时，其检测结果均为阳性。此外，高危型探针还可与其他型别的HPV(例如HPV 53、66、67和73)发生交叉反应，产生假阳性结果，降低实验特异性。
荧光定量PCR(FQ-PCR)在常规PCR的基础上把基因扩增、分子杂交和光化学融为一体，使PCR扩增和产物分析的全过程在单管封闭条件下进行，实现了实时动态检测和结果自动化分析，从根本上解决了扩增产物污染和不能定量的问题。该方法通过探针杂交进一步提高了HPV DNA检测的特异性，具有快速、简便、灵敏度高、特异性强等优点，适用于临床工作和大规模筛查。然而，目前该方法主要针对HPV6、11、16和18感染，易漏诊其他HPV亚型。同时，与HC2一样，荧光定量PCR也不能实现对HPV进行精确分型，即不能明确HPV感染型别。
采用基质辅助激光解吸附/电离飞行时间质谱系统(MALDI-TOF-MS)的质谱检测可以同时检测HPV型别的一种或几种，并能准确对HPV进行定量，其具有高灵敏度，高特异性和高通量的特点，且相对于其它的检测方法成本低。然而，目前利用质谱技术定量HPV的方法主要利用寡核苷酸(oligo)来对HPV DNA样品进行定量，由于oligo价格昂贵、设计复杂且为一次性使用，因此，该方法在实际生产中的应用受到了很大的限制，无法满足大规模测序和定量的生产需要。
因此，迫切需要开发成本低，且能够实现HPV分型和定量检测的新方法，以适应我国现有的大规模测序和定量的生产需要。
发明内容
本发明至少部分地基于下述原理：根据待检测的HPV型别的碱基序列设计突变质粒，该突变质粒含有HPV型别特异性DNA片段，并且该DNA片段与该HPV型别的野生型DNA片段只相异于一个碱基；将该突变质粒作为竞争子与样品混合，并进行采用基质辅助激光解吸附/电离飞行时间质谱系统(MALDI-TOF-MS)的质谱检测法；根据获得的质谱峰图确定HPV的型别，并利用质谱分析软件确定各个峰的峰面积数值，从而计算出样品中的HPV与竞争子的浓度比；根据已知的竞争子的浓度，确定样品中HPV的含量，实现对样品中的HPV进行定量的目的。
本发明还至少部分地基于下述原理：突变质粒与相应HPV型别的野生型DNA片段只有一个碱基的差异，即，突变质粒与样品之间的差异尽可能小，因此，突变质粒与样品的扩增效率基本上相同。基于此，利用质谱检测中的延伸产物峰的峰面积比值，可以根据竞争子(突变质粒)的浓度来计算出样品中HPV的含量。
因此，在一个方面，本发明提供了对样品中的HPV进行分型和定量的方法，其包括以下步骤：
(1)构建多个HPV型别的每一个型别的野生质粒和突变质粒，其中各HPV型别的野生质粒分别包含第一DNA片段，所述第一DNA片段能够用于进行针对该型别的特异性扩增；各HPV型别的突变质粒分别包含第二DNA片段，所述第二DNA片段与相同型别的野生质粒的第一DNA片段仅在延伸碱基所对应的位点上相异；
(2)将不同浓度的各HPV型别的野生质粒与突变质粒混合，并进行质谱检测法，获得质谱峰图，从而确定各个HPV型别的野生质粒和突变质粒的浓度比与质谱峰图中各自的延伸产物峰的峰面积比值的相关性；
(3)将待检测的样品与确定浓度的步骤(1)中构建的各突变质粒混合，并进行质谱检测法，获得质谱峰图；任选地，在进行步骤(3)之前，对待检测的样品进行稀释；
(4)根据步骤(3)获得的质谱峰图确定所述样品的延伸产物峰的分子量大小，从而对样品中的HPV进行分型；
(5)在确定样品中的HPV型别后，测定样品的延伸产物峰与相应HPV型别的突变质粒的延伸产物峰的峰面积比值，从而根据步骤(2)获得的相关性确定样品中的HPV的浓度，对样品中的HPV进行定量。
在一个优选实施方案中，待检测的样品优选是宫颈脱落细胞。在一个优选实施方案中，待分型和定量的HPV是HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66和HPV68中的一种或几种。
在一个实施方案中，本发明所使用的质谱检测法包括以下步骤：
1)用扩增引物PCR扩增DNA，从而获得扩增产物；
2)任选地，除去步骤1)的扩增产物中的dNTP，优选通过使用SAP酶处理所述扩增产物来除去dNTP；
3)以步骤1)或2)中获得的产物为模板，用延伸引物通过单碱基延伸反应获得延伸产物；
4)任选地，纯化所述延伸产物，优选通过树脂来进行纯化，从而获得纯化产物；和
5)用基质辅助激光解吸附/电离飞行时间质谱系统对步骤3)或4)的产物进行检测。
在一个优选实施方案中，本发明所使用的扩增引物的核苷酸序列分别如缺失5′端前10个碱基的SEQ ID NO：1-21所示，优选所述扩增引物在5′端还包含标签序列，更优选各扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1-21所示。
在一个优选实施方案中，本发明所使用的延伸引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：22-36所示。
在又一个优选实施方案中，各HPV型别的突变质粒的延伸碱基分别如表2所示。
在另一个方面，本文提供了根据本发明的突变质粒用于对样品中的HPV进行分型和定量的用途。在一个优选实施方案中，所述样品优选是宫颈脱落细胞。在一个优选实施方案中，待分型和定量的HPV是HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66和HPV68中的一种或几种。
在另一个方面，本文提供了根据本发明的突变质粒用于制备试剂盒的用途，所述试剂盒用于对样品中的HPV进行分型和定量。在一个优选实施方案中，所述样品优选是宫颈脱落细胞。在一个优选实施方案中，待分型和定量的HPV是HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66和HPV68中的一种或几种。
在另一个方面，本文还提供了一种试剂盒，其包含根据本发明的突变质粒。在一个优选实施方案中，本发明的试剂盒还包含根据本发明的野生质粒和/或根据本发明的扩增引物和/或根据本发明的延伸引物。
特别地，在本发明中，术语“延伸碱基”是指，在单碱基延伸反应中添加至延伸引物3′端的碱基。
发明的有益效果
与现有技术相比，本发明的技术方案采用基质辅助激光解吸附/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)系统，利用质粒实现对HPV的定量，其具有以下显著优点：
1)使用的试剂耗材相对简单且稳定，不需要荧光染料、特殊的酶等价格昂贵的试剂；
2)反应可以在微量体系中进行，减少了样品和各种消耗品的使用；
3)利用质谱技术，本发明的技术方案能够实现自动化和高通量检测；
4)本发明的技术方案利用质粒进行定量，与使用oligo进行定量的现有技术相比，成本大大降低，有利于大规模应用；
5)本发明的技术方案能够对样品进行准确定量，其定量结果与荧光定量PCR结果完全一致，在低成本的基础上保证了准确性。
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
附图概述
图1-4中，横坐标表示各延伸引物和产物的分子量大小，其中左边的虚线表示延伸引物分子量所在位置，右边虚线表示延伸产物分子量所在位置；纵坐标表示信号强度。
图1示意性展示了HPV 58型野生质粒样品的质谱峰图。图中检测到的HPV的型别为HPV58型，检测碱基(即延伸碱基)为T，代表的是HPV 58型野生质粒样品的峰。
图2示意性展示了HPV 58型突变质粒样品的质谱峰图。图中检测到的HPV的型别为HPV58型，检测碱基为G，代表的是HPV 58型突变质粒样品的峰。
图3示意性展示了HPV 58型突变质粒与野生质粒混合样品的质谱峰图。图中检测到的HPV的型别为HPV 58型，检测碱基为G的是HPV58型突变质粒的峰，检测碱基为T的是HPV 58型野生质粒的峰。
图4示意性展示了HPV 58型样品加入质粒竞争子(即，HPV 58型突变质粒)后的质谱峰图。图中检测到的HPV的型别为HPV 58型，检测碱基为G的是质粒竞争子(即，HPV 58型突变质粒)的峰，检测碱基为T的是HPV 58型样品的峰。
具体实施方式
在本发明的实施例中，通过使用本发明的方法，实现了对样品中的HPV进行分型和定量。特别地，样品中待分型和定量的HPV为HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66和HPV68中的一种或几种。
实施例1：设计并构建突变质粒和野生质粒
在本实施例中，设计并构建了上述各个HPV型别的突变质粒和野生质粒，以用于后续的质谱检测中。特别地，下面以HPV58为例，设计并构建了HPV58的突变质粒和野生质粒。
使用表1中的HPV 58扩增引物(不含5′端前10个碱基，这10个碱基为标签序列)，将HPV58的L1基因片段扩增出来，并将其克隆入PMD-T载体(Takara PMD-T连接试剂盒)，然后转化入大肠杆菌DH5α。转化后的大肠杆菌经蓝白斑筛选以及二次扩大培养后，用于质粒提取。使用质粒提取试剂盒(AXYGEN)提取并纯化质粒。通过DNA测序对质粒进行鉴定，从而获得HPV 58野生质粒。通过之前描述的方法(NelsonJH，Hawkins GA，Edlund K等人，A novel and rapid PCR based methodfor genotyping human papilloma viruses in clinical samples[J].Clin Microbiol，2000，38(2)：688-695)，在HPV 58野生质粒的基础上构建HPV58突变质粒。HPV58野生质粒与HPV58突变质粒仅在延伸碱基所对应的位点上相异，从而HPV 58野生质粒的延伸碱基与HPV58突变质粒的延伸碱基不同。在本实施例中，HPV58野生质粒的延伸碱基为T，而HPV58突变质粒的延伸碱基为G。
分别测定HPV58的突变质粒和野生质粒的OD值，然后根据摩尔公式：1ng质粒的拷贝数≈[1ng*10-9/2*330*(载体分子量+插入片断分子量)]*6.02*1023计算出1ng质粒的拷贝数。根据计算出的拷贝数将质粒稀释为以下10个浓度：100ng，10ng，1ng，107，106，105，104，103，102，10拷贝/ul。
将浓度为105，104，103，102，10拷贝/ul的HPV58突变质粒和野生质粒进行质谱检测实验，以确定HPV检测的灵敏度。质谱检测实验的结果显示，HPV58突变质粒和野生质粒的检测灵敏度均为100拷贝/ul(参见图1和2)。图1和2分别显示了HPV58野生质粒和突变质粒在质谱峰图中的延伸产物峰(对应的分子量分别为7226.730和7242.73)。
通过类似的方法，使用表1中的扩增引物和表2中的延伸引物，设计并构建各个HPV型别的突变质粒和野生质粒。
表1：针对各个HPV型别的L1区PCR扩增引物。
| SEQ ID NO： | 引物序列 | HPV型别 |
| 1 | acgttggatgTTTGTTACTGTGGTGGAATCTAC | HPV18/66正向引物 |
| 2 | acgttggatgTTTGTTACCGTTGTTGATGCTAC | HPV16正向引物 |
| 3 | acgttggatgTTTGTTACTGTGGTGCATACCTC | HPV31/33/52正向引物 |
| 4 | acgttggatgTTTGTTACTGTTGTGGATAGATTCC | HPV68正向引物 |
| 5 | acgttggatgTTTGTTACTGTTGTGGACACTAC | HPV39/45正向引物 |
| 6 | acgttggatgTTTGTTACTGAGGTAGAATAGGAC | HPV11/6正向引物 |
| 7 | acgttggatgTTTGTTACTGTTCTAGATACTTC | HPV59正向引物 |
| 8 | acgttggatgTTTATTACCTGTGTAGATACTAC | HPV51正向引物 |
| 9 | acgttggatgTTTGTTACCGTGGTTGATTCCAC | HPV58正向引物 |
| 10 | acgttggatgTTTGTTACAATAGTAGATACATC | HPV56正向引物 |
| 11 | acgttggatgGAAAAATAAACTGTAAATGATAGTCCT | HPV16/18/45/68反向引物 |
| 12 | acgttggatgGAAAAATAAATTGTAAATCATAGTC | HPV39/6反向引物 |
| 13 | acgttggatgGAAATATAAATTGTAAATCATATAC | HPV52反向引物 |
| 14 | acgttggatgGAAATATAAATTGTAAATCGTATTC | HPV31反向引物 |
| 15 | acgttggatgGAAAAATAAACTGTAAATCATACTC | HPV11反向引物 |
| 16 | acgttggatgGAAAAACAGACTGTAGATGTTATTC | HPV33反向引物 |
| 17 | acgttggatgGAAAAATAACATGCAATTCTTACTC | HPV51反向引物 |
| 18 | acgttggatgGAAATATAATCTGCAAATCTATTTC | HPV59反向引物 |
| 19 | acgttggatgGAAACACAAAGTGTAACGCATCTTC | HPV58反向引物 |
| 20 | acgttggatgGAAACACAAACTGTGGTGCAAATTC | HPV66反向引物 |
| 21 | acgttggatgGAAAAACAATATGTAATGCATCTTC | HPV56反向引物 |
表2：针对各个HPV型别的质谱延伸引物。
实施例2：构建数学模型。
在本实施例中，构建了数学模型，以展示上述各个HPV型别的突变质粒与野生质粒的浓度比例与质谱峰图中相应延伸产物峰的峰面积比值的相关性。特别地，下面以HPV58为例，将HPV58的突变质粒与野生质粒按比例梯度混合并进行质谱实验，从而统计出HPV58型突变质粒与野生型质粒的浓度比例与质谱峰图中相应的峰面积比值的相关性。
(1)将一定浓度的HPV58型突变质粒(HPV突变质粒浓度均为1000拷贝/ul)与一定浓度的HPV58型野生质粒等体积混合(1ul+1ul)，混合后两者的拷贝数比例见表3。
表3：混合后HPV突变质粒与野生质粒的拷贝数比例
| 模板 | 初始浓度比(突变/野生) |
| HPV突变质粒+HPV野生质粒 | 1∶1 |
| HPV突变质粒+HPV野生质粒 | 1∶2 |
| HPV突变质粒+HPV野生质粒 | 1∶5 |
| HPV突变质粒+HPV野生质粒 | 1∶10 |
| HPV突变质粒+HPV野生质粒 | 1∶20 |
| HPV突变质粒+HPV野生质粒 | 1∶50 |
| HPV突变质粒+HPV野生质粒 | 1∶100 |
(2)通过PCR扩增，获得靶序列扩增产物。PCR扩增反应体系参见表4。其中，所有试剂购买自sequenom公司。
表4
PCR反应条件为94℃，15分钟；94℃变性20秒，56℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共扩增45循环；最终72℃延伸3分钟。
(3)通过SAP酶(虾碱性磷酸酶)处理，除去步骤(2)获得的扩增产物中含有的dNTP。SAP酶反应体系见表5。所有试剂购买自sequenom公司。
表5
| 试剂 | 体积/反应 |
| 水(HPLE级) | 1.53ul |
| SAP酶缓冲液 | 0.17ul |
| SAP酶 | 0.30ul |
| PCR扩增产物 | 5.0ul |
| 总体积 | 7.0ul |
SAP酶反应条件为37℃温育40分钟，以去除PCR扩增反应中剩余的dNTP；85℃温育5分钟，以使SAP酶失活。
(4)以(3)中获得的产物为模板，通过延伸反应，在延伸引物的3’端连接一个碱基，从而得到延伸产物。延伸反应体系见表6。所有试剂购买自sequenom公司。
表6
*其中延伸引物混合物按照各引物的分子量大小进行线性关系调整(即，根据每种延伸引物的分子量计算每种引物的使用量)。
延伸反应条件为94℃，30秒；94℃变性5秒，52℃退火5秒，80℃延伸5秒，共扩增40个循环，且在每个循环中退火和延伸进行5个小循环；最终72℃延伸3分钟。
(5)采用树脂(购买自sequenom公司)纯化步骤(4)中获得的延伸产物。在延伸产物中加入6mg树脂，18.00ul水，垂直摇匀一小时。经过本步反应后，树脂将与反应体系中的阳离子充分结合，从而使反应体系脱盐。反应完成后的纯化产物可在4℃保存数天，也可在-20℃保存数周。所得的纯化产物在4000rpm离心5分钟后，取上清直接用于质谱检测。
(6)根据厂商的说明书，将纯化后的产物在Sequenom MALDI-TOF质谱仪上进行质谱检测。
(7)通过质谱分析软件(由sequenom公司提供)导出所得到的质谱峰图中各延伸产物峰的峰面积并进行统计分析。结果参见表7。
表7
| 模板 | 初始浓度比 | 峰面积比值(野生/突变) |
| HPV突变质粒+HPV野生质粒 | 1000拷贝∶1000拷贝 | ≈1 |
| HPV突变质粒+HPV野生质粒 | 1000拷贝∶2000拷贝 | ≈2 |
| HPV突变质粒+HPV野生质粒 | 1000拷贝∶5000拷贝 | ≈5 |
| HPV突变质粒+HPV野生质粒 | 1000拷贝∶10000拷贝 | ≈10 |
| HPV突变质粒+HPV野生质粒 | 1000拷贝∶20000拷贝 | ≈20 |
| HPV突变质粒+HPV野生质粒 | 1000拷贝∶50000拷贝 | ≈50 |
| HPV突变质粒+HPV野生质粒 | 1000拷贝∶100000拷贝 | ≈100 |
从以上结果可知，样品中HPV 58型突变质粒与野生质粒的浓度比例与质谱峰图中相应的峰面积比值相当(还参见图3)。特别地，图3显示，当HPV58野生质粒与突变质粒的初始浓度比为2000拷贝∶1000拷贝时，二者在质谱峰图中对应的延伸产物峰的峰面积比值大约为2∶1。类似地，可针对各个HPV型别构建数学模型，从而确定各个HPV型别的突变质粒与野生质粒的浓度比例与质谱峰图中相应的峰面积比值是相当的。
实施例3：对样品中的HPV进行分型和定量
在本实施例中，将经10倍稀释的待检测的样品(来自宫颈脱落细胞的DNA样品)与实施例1中构建的突变质粒混合并进行质谱检测实验，从而通过质谱峰图对样品中的HPV进行分型，并通过相应峰的峰面积比值对样品中的HPV进行定量。具体步骤如下：
(1)将待检测的样品与实施例1中构建的突变质粒(各1000拷贝/ul)等体积混合(1ul+1ul)；
(2)如实施例2(2)中所述，以步骤(1)中的混合物为模板，通过PCR扩增，获得靶序列扩增产物；
(3)如实施例2(3)中所述，通过SAP酶处理，除去步骤(2)的扩增产物中含有的dNTP；
(4)如实施例2(4)中所述，以步骤(3)中的产物为模板，通过延伸反应，获得延伸产物；
(5)如实施例2(5)中所述，用树脂纯化步骤(4)中的延伸产物；
(6)如实施例2(6)中所述，采用基质辅助激光解吸附/电离飞行时间质谱系统，对纯化后的产物进行质谱检测；
(7)根据质谱检测所获得的质谱峰图确定各延伸产物的分子量，从而确定待检测的样品中的HPV的型别，同时用质谱分析软件(由sequenom公司提供)导出已确定了型别的样品的延伸产物峰和相应突变质粒的延伸产物峰的峰面积，根据峰面积比值对样品中的HPV进行定量。定量结果示于表8中。
| 模板 | 峰面积(样品/相应突变质粒) | 样品的初始浓度(拷贝数) |
| 突变质粒各1000拷贝+待检测样品 | ＜1 | ＜1000 |
| 突变质粒各1000拷贝+待检测样品 | [1-1.4] | ≈1000 |
| 突变质粒各1000拷贝+待检测样品 | (1.4-2.1) | ＞1000且＜2000 |
| 突变质粒各1000拷贝+待检测样品 | [2.1-2.8] | ≈2000 |
| 突变质粒各1000拷贝+待检测样品 | (2.8-4.9) | ＞2000且＜5000 |
| 突变质粒各1000拷贝+待检测样品 | [4.9-6.6) | ≈5000 |
| 突变质粒各1000拷贝+待检测样品 | [6.6-7.1) | ＞5000且＜10000 |
| 突变质粒各1000拷贝+待检测样品 | [7.1-15.2) | ≈10000 |
| 突变质粒各1000拷贝+待检测样品 | [15.2-26.3] | ＞10000且＜20000 |
| 突变质粒各1000拷贝+待检测样品 | (26.3-32.5] | ≈20000 |
| 突变质粒各1000拷贝+待检测样品 | (32.5-45.3) | ＞20000且＜50000 |
| 突变质粒各1000拷贝+待检测样品 | [45.3-64.6) | ≈50000 |
| 突变质粒各1000拷贝+待检测样品 | [64.6-80.1) | ＞50000且＜100000 |
| 突变质粒各1000拷贝+待检测样品 | [80.1-94.7) | ≈100000 |
图4显示，待检测的样品的延伸产物的分子量约为7226.730，从而确定样品中的HPV为HPV58。进一步，通过质谱分析软件，确定该样品的延伸产物峰与HPV58突变质粒的延伸产物峰(分子量约为7242.73)的峰面积比值为2.3，从而确定样品中的HPV58的初始浓度为约2000拷贝×稀释度10，即，约20000拷贝。
特别地，当质谱峰图中只存在样品的延伸产物峰，而不存在突变质粒的延伸产物峰时，对样品进行稀释，直至可以同时检测到样品和突变质粒的延伸产物峰，从而根据峰面积比值对样品中的HPV进行定量。
实施例4：利用荧光定量PCR对质谱检测结果进行验证
在本实施例中，利用荧光定量PCR对实施例3中的质谱检测结果进行验证。
(1)核酸提取
用带滤芯吸嘴吸取100ul样品处理液A(购自凯普公司，HPV(PCR)荧光检测试剂盒)于0.5ul离心管中。加入100ul的待检测样品，振荡混匀，然后以13000rpm离心10分钟。弃去上清，并加入25ul样品处理液B(购自凯普公司，HPV(PCR)荧光检测试剂盒)。振荡混匀，低速(2000rpm)离心数秒后，沸水浴10分钟。以13000rpm离心10分钟，取上清作为PCR反应模板。
(2)PCR试剂准备
将凯普公司，HPV(PCR)荧光检测试剂盒中的PCR反应液A、PCR反应液B、PCR反应液C室温融化，混匀并低速(2000rpm)离心数秒，之后按照13.5∶13.5∶1的比例配置PCR反应液，并分装至PCR反应管中，每管28ul。
(3)PCR扩增
向装有PCR反应液的反应管中分别加入2ul步骤(1)中制备的样品DNA。将反应管放入荧光PCR扩增仪(ABI PRISM 7300)进行扩增检测。循环参数设定见表9。每个样品进行一式两份的实验。
(4)结果分析
利用仪器自带的软件进行分析，从而得到各样品中的HPV DNA的检测结果。利用Ct值计算出HPV DNA的初始拷贝数。定量PCR的结果显示，待检测的样品中含有的HPV的浓度为20520拷贝，与使用突变质粒进行定量的质谱结果完全一致。
Claims (15)
1.用于对样品中的HPV进行分型和定量的方法，所述方法用于非诊断目的，其包括以下步骤：
(1)构建多个HPV型别的每一个型别的野生质粒和突变质粒，其中各HPV型别的野生质粒分别包含第一DNA片段，所述第一DNA片段能够用于进行针对该型别的特异性扩增；各HPV型别的突变质粒分别包含第二DNA片段，所述第二DNA片段与相同型别的野生质粒的第一DNA片段仅在延伸碱基所对应的位点上相异；
(2)将不同浓度的各HPV型别的野生质粒与突变质粒混合，并进行质谱检测法，获得质谱峰图，从而确定各个HPV型别的野生质粒和突变质粒的浓度比与质谱峰图中各自的延伸产物峰的峰面积比值的相关性；
(3)将待检测的样品与确定浓度的步骤(1)中构建的各突变质粒混合，并进行质谱检测法，获得质谱峰图；任选地，在进行步骤(3)之前，对待检测的样品进行稀释；
(4)根据步骤(3)获得的质谱峰图确定所述样品的延伸产物峰的分子量大小，从而对样品中的HPV进行分型；
(5)在确定样品中的HPV型别后，测定样品的延伸产物峰与相应HPV型别的突变质粒的延伸产物峰的峰面积比值，从而根据步骤(2)获得的相关性确定样品中的HPV的浓度，对样品中的HPV进行定量；
其中，所述延伸碱基是指，在单碱基延伸反应中添加至延伸引物3′端的碱基，
其中，待分型和定量的HPV是HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66和HPV68中的一种或几种，
其中所述质谱检测法包括以下步骤：
1)用扩增引物PCR扩增DNA，从而获得扩增产物；
2)任选地，除去步骤1)的扩增产物中的dNTP；
3)以步骤1)或2)中获得的产物为模板，用延伸引物通过单碱基延伸反应获得延伸产物；
4)任选地，纯化所述延伸产物，从而获得纯化产物；和
5)用基质辅助激光解吸附/电离飞行时间质谱系统对步骤3)或4)的产物进行检测，
其中所述扩增引物的核苷酸序列分别如缺失5′端前10个碱基的SEQ ID NO：1-21所示，
其中所述延伸引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：22-36所示。
2.权利要求1的方法，其中所述样品是宫颈脱落细胞。
3.权利要求1的方法，其中在步骤2)中，通过使用SAP酶处理所述扩增产物来除去dNTP。
4.权利要求1的方法，其中在步骤4)中，通过树脂来纯化所述延伸产物。
5.权利要求1的方法，其中所述扩增引物在5′端还包含标签序列。
6.权利要求5的方法，其中所述扩增引物的核苷酸序列分别如SEQID NO：1-21所示。
7.权利要求1的方法，其中HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66和HPV68的突变质粒的所述延伸碱基分别为G、T、G、A、C、T、T、T、T、A、C、G、T、G和T。
8.权利要求1中定义的突变质粒，扩增引物和延伸引物用于制备试剂盒的用途，所述试剂盒用于对样品中的HPV进行分型和定量，其中待分型和定量的HPV是HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66和HPV68中的一种或几种。
9.权利要求8的用途，其中所述样品是宫颈脱落细胞。
10.权利要求8的用途，其中HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66和HPV68的突变质粒的延伸碱基分别为G、T、G、A、C、T、T、T、T、A、C、G、T、G和T。
11.一种试剂盒，其包含权利要求1中定义的突变质粒，扩增引物和延伸引物。
12.权利要求11的试剂盒，其还包含权利要求1中定义的野生质粒。
13.权利要求11的试剂盒，其中所述扩增引物在5′端还包含标签序列。
14.权利要求13的试剂盒，其中所述扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1-21所示。
15.权利要求11的试剂盒，其中HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66和HPV68的突变质粒的所述延伸碱基分别为G、T、G、A、C、T、T、T、T、A、C、G、T、G和T。
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