CN116121465A

CN116121465A - 引物及其和探针的组合物在制备检测hpv的试剂盒中的应用

Info

Publication number: CN116121465A
Application number: CN202310251747.3A
Authority: CN
Inventors: 王世东; 陈书容; 蒋析文; 黄志文; 覃碧依
Original assignee: Guangzhou Da'an Gene Co ltd
Current assignee: Guangzhou Da'an Gene Co ltd
Priority date: 2023-03-14
Filing date: 2023-03-14
Publication date: 2023-05-16

Abstract

本发明公开了引物及其和探针的组合物在制备检测HPV的试剂盒中的应用，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：15～42所示；所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：1～14所示。本发明克服了传统的宫颈癌筛查方法存在的检测耗时长、假阴性率高、操作技术门槛高的问题，提供了检测14种高危型HPV的引物和探针，并提供了相应的检测试剂盒，不仅简化操作过程，降低成本和技术复杂性，还大大缩短宫颈癌筛查的时间，具有高特异性，适用于临床上的大规模宫颈癌初步筛查，具有推广应用价值。

Description

引物及其和探针的组合物在制备检测HPV的试剂盒中的应用

技术领域

本发明涉及领域，具体地，涉及引物及其和探针的组合物在制备检测HPV的试剂盒中的应用。

背景技术

宫颈癌是常见的女性妇科恶性肿瘤，患病率居女性生殖道恶性肿瘤的首位。全世界范围内每年有超过50万例新发宫颈癌确诊病例，超过30万人死于这种恶性肿瘤。据估计，在中国宫颈癌每年约有13.2万新发病例，占全球宫颈癌新发病例总数的四分之一，且发病呈明显年轻化趋势。而宫颈癌也是目前仅有的一种病因明确且三级预防手段完善的恶性肿瘤。高危型人乳头状瘤病毒(human papillomavirus，HPV)持续感染是导致宫颈上皮内瘤变及宫颈癌的主要原因。全球范围的研究结果显示，在99.7％的宫颈癌患者体内检测到高危型HPV DNA的存在。目前已知有一百多种不同类型的HPV，其中大部分被视为“低风险”，与宫颈癌并无关联，但有14种HPV类型(HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68型)被列为“高风险”。国际癌症研究协会已经评价并确定，几乎所有的宫颈癌均由这14种高危型HPV感染引起。其中，两种风险最高的病毒株HPV16和HPV18可导致约70％的宫颈癌病例。

根据世界卫生组织(WHO)估计，若缺乏适当有效的筛查方法及预防措施，到2025年，亚洲宫颈癌发病率将上升40％。从最初的高危型HPV的持续感染，发展到宫颈上皮瘤样病变，最终发展为宫颈癌，大约需要5～10年。有文献报道，早期宫颈癌患者的5年治愈率可高达90％，所以早发现、早诊断、早治疗对宫颈上皮内瘤变的患者有重大意义。建立以宫颈癌筛查为目的针对高危型HPV的检测方法，对宫颈癌的预防、诊断和治疗具有重要的意义。

现有的宫颈癌筛查方法主要包括细胞学检查，阴道镜病理活检，HPV病毒检测三种。初步筛查一般选取细胞学检查和HPV病毒检测。

细胞学检查是宫颈癌筛查的“金标准”，已在全球沿用75年，典型代表技术为传统巴氏涂片(CV)和液基薄层细胞学技术(TCT)。但即便是“金标准”，细胞学检查也只能发现约50％的宫颈癌前病变。有研究表明，HPV16或18型检测为阳性，即便细胞学结果正常，每10位女性中仍会有1人存有宫颈癌前病变。所以，单一的细胞学检查还不足以评估女性罹患宫颈癌的风险，HPV检测会有助于宫颈癌筛查。

阴道镜检查可实时可视化评估宫颈，尤其是宫颈转化区，以发现宫颈上皮内瘤变或鳞状上皮内病变(SIL)和浸润癌。它是对异常宫颈癌筛查结果初始评估的重要一步，可评估宫颈癌前病变的风险。阴道镜检查需要经过充分训练和有经验医师才能胜任，结果的判定具有主观性和不精确性，假阴性率(遗漏高级别病变或浸润癌的比例)为13％～69％。因而，阴道镜病理活检不适用于临床上的大规模初步筛查。

现有的HPV病毒检测包括免疫学检测和核酸检测。免疫学检测的方法，如免疫沉淀法、ELISA、杂交捕获法等，由于存在检测灵敏度低、假阳性率高、特异性低、操作繁琐、且不便于HPV分型等缺点，限制了其在临床上的大规模应用。2021年WHO发布的最新宫颈癌前病变筛查和治疗指南中，推荐HPV-DNA检测作为宫颈癌初筛首选方法。传统的DNA检测方法，包括测序法、原位杂交法、PCR法(电泳鉴定结果)等，结果相对准确，但检测灵敏度低、操作繁琐、耗时久、扩增后的产物暴露易造成交叉污染，不适用于临床上的大规模应用。而在传统的PCR基础上发展起来的实时荧光PCR技术不但灵敏度高、特异性强，自动化程度高，成本适中，几乎不会造成污染，还可以进行HPV分型，这些优点无疑给人乳头瘤病毒的早期诊断带来了福音。

当前，亟需建立检测灵敏度高、特异性强、假阴性率低、耗时短、操作便捷的高危型HPV-DNA快速检测方法。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了引物及其和探针的组合物在制备检测HPV的试剂盒中的应用。

本发明的第一个目的是提供引物在制备检测HPV的试剂盒中的应用。

本发明的第二个目的是提供引物和探针的组合物在制备检测HPV的试剂盒中的应用。

本发明的第三个目的是提供一种检测HPV的试剂盒。

为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

本发明针对HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66和HPV68，共14种高危型HPV的L1基因，提供特异性的检测引物和探针。国际癌症研究协会已经评价并确定，几乎所有的宫颈癌均由这14种高危型HPV感染引起，所以检测这14种HPV可以有效地进行大规模的宫颈癌初步筛查。

一种检测HPV的引物，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：15～42所示。

引物在制备检测HPV的试剂盒中的应用，所述引物的核苷酸序列如SEQ IDNO：15～42所示。

所述HPV为HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66和HPV68。

检测HPV16的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：15～16所示；

检测HPV18的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：17～18所示；

检测HPV31的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：19～20所示；

检测HPV33的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：21～22所示；

检测HPV35的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：23～24所示；

检测HPV39的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：25～26所示；

检测HPV45的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：27～28所示；

检测HPV51的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：29～30所示；

检测HPV52的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：31～32所示；

检测HPV56的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：33～34所示；

检测HPV58的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：35～36所示；

检测HPV59的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：37～38所示；

检测HPV66的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：39～40所示；

检测HPV68的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：41～42所示。

一种检测检测HPV的引物和探针的组合物，所述引物为上述引物；所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：1～14所示。

引物和探针的组合物在制备检测HPV的试剂盒中的应用，所述引物为上述引物；所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：1～14所示。

检测HPV16的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

检测HPV18的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；

检测HPV31的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；

检测HPV33的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；

检测HPV35的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；

检测HPV39的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；

检测HPV45的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示；

检测HPV51的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示；

检测HPV52的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示；

检测HPV56的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示；

检测HPV58的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示；

检测HPV59的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示；

检测HPV66的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示；

检测HPV68的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示。

优选地，所述组合物包含组A～C，所述组合物包含组A～C，各组间的探针的5’端设有不同的荧光报告基团，3’端设有荧光淬灭基团；所述荧光报告基团为Texas Red、VIC或FAM中的任意一种；所述荧光淬灭基团为BHQ1、BHQ2或DQ1中的任意一种；

所述组A包含核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的探针及核苷酸序列如SEQ ID NO：15～16所示的引物；所述组B包含核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的探针及核苷酸序列如SEQ ID NO：17～18所示的引物；所述组C包含核苷酸序列如SEQ ID NO：3～18所示的探针及核苷酸序列如SEQ ID NO：19～42所示的引物。

所述组A检测HPV16，所述组B检测HPV18，所述组C检测其余12种HPV，所述其余12种HPV为HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66和HPV68。

更优选地，所述组A的5’端设有荧光报告基团Texas Red；所述组B的5’端设有荧光报告基团VIC；所述组C的5’端设有荧光报告基团FAM。

更优选地，所述组A的3’端设有荧光淬灭基团BHQ2；所述组B的3’端设有荧光淬灭基团BHQ1；所述组C的3’端均设有荧光淬灭基团BHQ1。

一种检测HPV的试剂盒，包含上述核苷酸序列如SEQ ID NO：15～42所示的引物。

优选地，包含任一上述引物和探针的组合物，所述引物的核苷酸序列如SEQ IDNO：15～42所示；所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：1～14所示。

更优选地，所述组合物包含组A～C，各组间的探针的5’端设有不同的荧光报告基团，3’端设有荧光淬灭基团；所述荧光报告基团为Texas Red、VIC或FAM中的任意一种；所述荧光淬灭基团为BHQ1、BHQ2或DQ1中的任意一种；

进一步优选地，所述组A的5’端设有荧光报告基团Texas Red；所述组B的5’端设有荧光报告基团VIC；所述组C的5’端设有荧光报告基团FAM。

进一步优选地，所述组A的3’端设有荧光淬灭基团BHQ2；所述组B的3’端设有荧光淬灭基团BHQ1；所述组C的3’端均设有荧光淬灭基团BHQ1。

更进一步优选地，所述组A～C的探针终浓度为0.10μM～0.42μM；所述组A～C的引物终浓度为0.08μM～0.62μM。

最优选地，组A中，核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的探针终浓度为0.10μM，核苷酸序列如SEQ ID NO：15～16所示的引物终浓度为0.20μM；

组B中，核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的探针终浓度为0.20μM，述核苷酸序列如SEQ ID NO：17～18所示的引物终浓度为0.40μM；

组C中，核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的探针终浓度为0.14μM，核苷酸序列如SEQID NO：19～20所示的引物终浓度为0.26μM；

核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的探针终浓度为0.20μM，核苷酸序列如SEQ IDNO：21～22所示的引物终浓度为0.40μM；

核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示的探针终浓度为0.12μM，核苷酸序列如SEQ IDNO：23～24所示的引物终浓度为0.26μM；

核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示的探针终浓度为0.20μM，核苷酸序列如SEQ IDNO：25～26所示的引物终浓度为0.40μM；

核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示的探针终浓度为0.20μM，核苷酸序列如SEQ IDNO：27～28所示的引物终浓度为0.40μM；

核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示的探针终浓度为0.20μM，核苷酸序列如SEQ IDNO：29～30所示的引物终浓度为0.30μM；

核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示的探针终浓度为0.40μM，核苷酸序列如SEQ IDNO：31～32所示的引物终浓度为0.60μM；

核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示的探针终浓度为0.20μM，核苷酸序列如SEQ IDNO：33～34所示的引物终浓度为0.30μM；

核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示的探针终浓度为0.12μM，核苷酸序列如SEQ IDNO：35～36所示的引物终浓度为0.30μM；

核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示的探针终浓度为0.20μM，核苷酸序列如SEQ IDNO：37～38所示的引物终浓度为0.30μM；

核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示的探针终浓度为0.22μM，核苷酸序列如SEQ IDNO：39～40所示的引物终浓度为0.24μM；

核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示的探针终浓度为0.20μM，核苷酸序列如SEQ IDNO：41～42所示的引物终浓度为0.10μM。

优选地，所述组合物还包含组D，所述组D包含检测内参基因的引物和探针。本发明对检测上述14种HPV所用的内参基因不做特殊限定，如GAPDH、β-actin、18s RNA等常规的内参基因，均可作为检所用的内参基因。

更优选地，所述内参基因为GAPDH基因。

进一步优选地，组D包含检测GAPDH基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：43所示的探针和核苷酸序列如SEQ ID NO：44～45所示的引物。

更进一步优选地，组D中，所述核苷酸序列如SEQ ID NO：44～45所示的引物终浓度为0.18μM～0.22μM。

最优选地，组D中，所述核苷酸序列如SEQ ID NO：44～45所示的引物终浓度为0.20μM。

更进一步优选地，组D中，所述核苷酸序列如SEQ ID NO：43所示的探针的5’端设有荧光报告基团CY5，3’端设有荧光淬灭基团Eclipse和4*Zip。

再进一步优选地，组D中，所述核苷酸序列如SEQ ID NO：43所示的探针的终浓度为0.28μM～0.32μM。

最优选地，组D中，所述核苷酸序列如SEQ ID NO：43所示的探针的终浓度为0.30μM。

优选地，所述试剂盒还包含阳性质控品，所述阳性质控品为假病毒，所述假病毒的基因组包含核苷酸序列如SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47和SEQ ID NO：54所示的序列。

优选地，所述试剂盒还包含阴性质控品，所述阴性质控品为纯化水。

优选地，所述试剂盒还包含荧光定量PCR反应试剂。

更优选地，所述荧光定量PCR反应试剂包含PCR buffer和PCR酶。

进一步优选地，所述试剂盒的使用方法包括如下步骤：

S1.获得检测样本的基因组DNA；

S2.以检测样本的DNA作为模板，使用上述引物和探针的组合物、阴性质控品、阳性质控品和荧光定量PCR试剂制备反应体系，进行荧光定量PCR扩增，获得Texas Red通道、VIC通道、FAM通道和CY5通道的Ct值，判定检测样本中是否含有高危型人乳头瘤病毒；

所述判定的方法如下：

Texas Red通道、VIC通道和FAM通道中至少一个通道的Ct值≤38，CY5通道有或无Ct值均不影响结果判断；

阳性质控品的Texas Red通道、VIC通道和FAM通道均为Ct值≤38，阴性质控品的CY5通道Ct值≤38且Texas Red通道、VIC通道和FAM通道均为Ct值＞38或无Ct值，检测样本的Texas Red通道、VIC通道、FAM通道和CY5通道至少一个通道有明显扩增曲线，表明检测结果有效，进行下一步感染情况的判定；否则检测结果无效，需要重新检测。

感染情况的判定：

检测样本的CY5通道Ct值≤38且Texas Red通道、VIC通道和FAM通道均为Ct值＞38或无Ct值，表明检测样本未感染HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66和HPV68；

检测样本的Texas Red通道Ct值≤38，VIC通道和FAM通道Ct值＞38或无Ct值，表明检测样本感染HPV16，未感染HPV18、HPV26、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV53、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68、HPV73和HPV82；

检测样本的VIC通道Ct值≤38，Texas Red通道和FAM通道Ct值＞38或无Ct值，表明检测样本感染HPV18，未感染HPV16、HPV26、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV53、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68、HPV73和HPV82；

检测样本的FAM通道Ct值≤38，Texas Red通道和VIC通道Ct值＞38或无Ct值，表明检测样本感染HPV26、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV53、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68、HPV73和HPV82中的至少一种，未感染HPV16和HPV18；

检测样本的Texas Red通道和VIC通道Ct值≤38，FAM通道Ct值＞38或无Ct值，表明检测样本感染HPV16和HPV18，未感染其余12种HPV(HPV26、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV53、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68、HPV73和HPV82)；

检测样本的Texas Red通道和FAM通道Ct值≤38，VIC通道Ct值＞38或无Ct值，表明检测样本感染HPV16，感染HPV26、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV53、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68、HPV73和HPV82中的至少一种，未感染HPV18；

检测样本的Texas Red通道Ct值＞38或无Ct值，VIC通道和FAM通道Ct值≤38，表明检测样本感染HPV18，感染HPV26、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV53、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68、HPV73和HPV82中的至少一种，未感染HPV16；

检测样本的Texas Red通道、VIC通道和FAM通道均为Ct值≤38，表明检测样本感染HPV16，感染HPV18，感染HPV26、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV53、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68、HPV73和HPV82中的至少一种。

本发明对检测样本基因组DNA的提取方法没有特殊限定，一般可用常规方法，或用核酸提取试剂盒提取检测样本的基因组DNA。

更优选地，步骤S1中，提取所得到的检测样本的基因组DNA，并使用相同的提取方法处理阳性质控品。

更优选地，步骤S2中，所述引物和探针的组合物存在于三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(pH8.3)中，即为引物探针混合液。

进一步优选地，步骤S2中，所述反应体系中，引物探针混合液、PCR Buffer、PCR酶和模板的体积比为(9～11)：(6.5～8.5)：(2～4)：(28～32)，所述模板为检测样本的基因组DNA、阴性质控品或使用相同的提取方法处理后的阳性质控品。

步骤S2中，所述反应体系中，引物探针混合液、PCR Buffer、PCR酶和模板的体积比为10：7：3：30。

更优选地，步骤S2中，所述荧光定量PCR扩增的程序为：48～52℃，2分钟；93～97℃，15分钟；92～96℃，15秒，48～52℃，45秒，43～47个循环。

进一步优选地，步骤S2中，所述荧光定量PCR扩增的程序为：50℃，2分钟；95℃，15分钟；94℃，15秒，50℃，45秒，45个循环，收集荧光。

更优选地，步骤S2中，所述荧光定量PCR扩增的荧光通道选择Texas Red通道、VIC通道、FAM通道和CY5通道收集荧光。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明克服了传统的宫颈癌筛查方法存在的检测耗时长、假阴性率高、操作技术门槛高的问题，提供了检测14种引发宫颈癌的HPV的引物和探针，并提供了相应的检测试剂盒，不仅简化操作过程，降低成本和技术复杂性，还大大缩短宫颈癌的筛查时间，具有高特异性，适用于临床上的大规模宫颈癌初步筛查，具有推广应用价值。

附图说明

图1为本发明检测阴性质控品的PCR结果。

图2为本发明检测阳性质控品的PCR结果。

具体实施方式

下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1HPV核酸检测探针及引物

一、序列

根据HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66和HPV68的L1基因序列(NCBI号依次为：KM058666.1、MH057749.1、KU163584.1、GQ479019.1、GQ479039.1、MK344673.1、MW052843.1、MW888944.1、KY077863.1、LR862083.1、ON355256.1、MT934364.1、MK648148.1、LR861959.1)，设计得到14种型别人乳头瘤病毒的核酸检测引物及探针，具体序列如表1和表2所示。

表1 14种型别人乳头瘤病毒的核酸检测探针的序列

上述核苷酸序列如SEQ ID NO：1～14所示的探针均为荧光探针，标记有不同的荧光报告基团和荧光淬灭基团。其中，HPV16型的探针(SEQ ID NO：1)的5’端标记有荧光报告基团Texas Red，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ2；所述HPV18型的探针(SEQ ID NO：2)的5’端标记有荧光报告基团VIC，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1；所述HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66和HPV68的探针(SEQ ID NO：3～SEQ IDNO：14)的5’端标记有荧光报告基团FAM，3’端均设有荧光淬灭基团BHQ1。

表2 14种型别人乳头瘤病毒的核酸检测引物的序列

以上的探针和引物可用于检测14种HPV，根据PCR反应管呈现的荧光信号结果，可以判断检测样本中HPV的型别数以及HPV16和HPV18的感染情况。

本发明对检测HPV所用的内参基因不做特殊限定，如GAPDH、β-actin、18sRNA等常规的内参基因，均可作为检测HPV的内参基因。

本实施例以GAPDH为例，提供检测内参基因的探针及引物，具体序列如下：

检测GAPDH的探针(5’～3’)：TGACCTCAACTACATGGTGAGT(SEQ IDNO：43)，5’端标记有荧光报告基团CY5，3’端标记有荧光淬灭基团Eclipse和4*Zip；

检测GAPDH的引物(5’～3’)：上游：GTGAGTGCTACATGGTGA(SEQ ID NO：44)；下游：CCATGGGTGGAATCATATT(SEQ ID NO：45)。

二、引物及探针的工作浓度

分别以含HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66和HPV68 DNA片段的14种质粒(SEQ ID NO：46～59)为模板，质粒的浓度各为50000copies/mL、5000copies/mL或500copies/mL，使用上述引物及探针进行实时荧光定量PCR扩增。实时荧光定量PCR反应程序设置为：50℃，2分钟；95℃，15分钟；94℃，15秒，50℃，45秒，45个循环。

调整各型别引物及探针的用量，以获得最佳的引物和探针工作浓度。具体调整用量的分组信息如下表3所示。

表3各型别引物探针工作浓度调整情况

检测结果表明，工作浓度组1测得HPV18的荧光强度过高，而HPV35和HPV51的荧光强度过低，HPV33曲线未呈S型，HPV45和HPV56漏检，剩余8个型别扩增良好；工作浓度组2测得的HPV33、HPV39、HPV45和HPV66的荧光强度过低，HPV52和HPV68的曲线未呈S型，HPV56漏检，剩余7个型别扩增良好；工作浓度组3检测14个HPV型别均显示扩增曲线形态良好，Ct值与模板的浓度梯度呈良好的线性关系，检测灵敏度均达标。所以，确定最优的实时荧光定量PCR反应体系如表4所示。

表4 实时荧光定量PCR反应体系

实施例2一种快速筛查人乳头瘤病毒的试剂盒

一、组成

试剂盒(48反应/盒)包括HPV(12+2)PCR反应液A(810μL/管)、HPV(12+2)PCR反应液B(312μL/管)、阳性质控品(900μL/管)和阴性质控品(900μL/管)。

HPV(12+2)PCR反应液A包含实施例1的HPV核酸检测探针及引物，其主要成分如表5所示。

表5HPV(12+2)PCR反应液A的主要成分

上述核苷酸序列如SEQ ID NO：1～14和SEQ ID NO：43所示的探针均为荧光探针，标记有不同的荧光报告基团和荧光淬灭基团。其中，HPV16型的探针(SEQ ID NO：1)的5’端标记有荧光报告基团Texas Red，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ2；所述HPV18型的探针(SEQID NO：2)的5’端标记有荧光报告基团VIC，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1；HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66和HPV68的探针(SEQ ID NO：3～SEQ ID NO：14)的5’端标记有荧光报告基团FAM，3’端均设有荧光淬灭基团BHQ1；GAPDH的探针(SEQ ID NO：43)的5’端标记有荧光报告基团CY5，3’端标记有荧光淬灭基团Eclipse和4*Zip。

在进行实时荧光定量PCR反应时，根据各探针的荧光报告基团设置收集荧光的检测通道：检测HPV16设置Texas Red通道，检测HPV18设置VIC通道；检测HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66和HPV68设置FAM通道；检测GAPDH基因设置CY5通道。

HPV(12+2)PCR反应液B的主要成分如表6所示。

表6HPV(12+2)PCR反应液B的主要成分

二、使用方法

1、检测样本基因组DNA的提取

本试剂盒以宫颈脱落细胞样本作为检测样本。

检测样本基因组DNA的提取方法没有指定要求，一般可用实验室常规方法(酚-氯仿抽提法)，或用合格的核酸提取试剂盒提取检测样本基因组DNA。

采用相同的方法对本试剂盒的阳性质控品进行相同的提取处理。

提取所得到的检测样本基因组DNA、阴性质控品和提取处理后的阳性质控品，可立即用于本试剂盒检测，或可置于-20℃保存备用。

2、实时荧光定量PCR反应体系的制备

按照如表8所示的信息中配制实时荧光定量PCR反应体系(总体积为50μL)。

表8实时荧光定量PCR反应体系

3、实时荧光定量PCR扩增

(1)上机

将PCR反应管放入实时荧光定量PCR仪的样品槽内，并记录放置顺序。

(2)荧光通道选择

选择Texas Red通道检测HPV16；选择VIC通道检测HPV18；选择FAM通道检测另外12种型别，分别为HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66和HPV68；选择CY5通道检测内参基因GAPDH基因。

(3)反应程序

同实施例1中的实时荧光定量PCR反应程序。

4、结果读取及分析

反应结束后，获得检测样本各荧光通道的Ct值，分析判断检测样本的感染情况，具体判断方法如下：

(1)检测结果是否有效的判断

阳性质控品的Texas Red通道、VIC通道和FAM通道均为Ct值≤38，阴性质控品的CY5通道Ct值≤38且Texas Red通道、VIC通道和FAM通道均为Ct值＞38或无Ct值，检测样本的Texas Red通道、VIC通道、FAM通道和CY5通道至少一个通道有明显扩增曲线，表明检测结果有效，进行下一步感染情况的判定；否则检测结果无效，需要重新检测；

(2)感染情况的判定

检测样本的CY5通道Ct值≤38且Texas Red通道、VIC通道和FAM通道均为Ct值＞38或无Ct值，表明检测样本未感染14种HPV(HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66和HPV68)；

检测样本的Texas Red通道Ct值≤38，VIC通道和FAM通道Ct值＞38或无Ct值，表明检测样本感染HPV16，未感染其余13种HPV(HPV18、HPV26、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV53、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68、HPV73和HPV82)；

检测样本的VIC通道Ct值≤38，Texas Red通道和FAM通道Ct值＞38或无Ct值，表明检测样本感染HPV18，未感染其余13种HPV(HPV16、HPV26、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV53、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68、HPV73和HPV82)；

检测样本的FAM通道Ct值≤38，Texas Red通道和VIC通道Ct值＞38或无Ct值，表明检测样本感染其余12种HPV(HPV26、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV53、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68、HPV73和HPV82)中的至少一种，未感染HPV16和HPV18；

检测样本的Texas Red通道和FAM通道Ct值≤38，VIC通道Ct值＞38或无Ct值，表明检测样本感染HPV16和其余12种HPV(HPV26、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV53、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68、HPV73和HPV82)中的至少一种，未感染HPV18；

检测样本的Texas Red通道Ct值＞38或无Ct值，VIC通道和FAM通道Ct值≤38，表明检测样本感染HPV18和其余12种HPV(HPV26、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV53、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68、HPV73和HPV82)中的至少一种，未感染HPV16；

检测样本的Texas Red通道、VIC通道和FAM通道均为Ct值≤38，表明检测样本感染HPV16、HPV18和其余12种HPV(HPV26、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV53、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68、HPV73和HPV82)中的至少一种。

实施例3试剂盒灵敏度的情况

1、实验方法

(1)按照实施例2中所述的方法，配制实时荧光定量PCR反应体系，其中模板为含HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66和HPV68的DNA片段的质粒(核苷酸序列如SEQ ID NO：46～59所示，浓度为500copies/mL)30μL或经提取处理的试剂盒的阳性质控品30μL或试剂盒的阴性质控品30μL，每管PCR反应液总体积为50μL。

(2)按照实施例2中所述的方法，进行实时荧光定量PCR扩增和结果读取及分析。

2、实验结果

如图1所示，本发明实施例2的试剂盒检测阴性质控品，CY5通道、Texas Red通道、VIC通道和FAM通道都没有明显的荧光扩增曲线；如图2所示，CY5通道、Texas Red通道、VIC通道和FAM通道都有明显的荧光扩增曲线。

表9试剂盒的灵敏度检测结果

如表9所示，本发明实施例2的试剂盒可以检测出浓度约为500copies/mL的14种HPV的DNA(HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66和HPV68)，具有高灵敏度，可以满足临床的检测需求。

实施例4试剂盒准确性的情况

1、实验方法

(1)使用本发明实施例2的试剂盒检测实施例3中含HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66和HPV68的DNA片段的质粒(核苷酸序列如SEQ ID NO：46～59所示，浓度各为50000copies/mL)，记为阳性参考品P1～P14；检测临床样本(临床阴性样本、HPV6阳性临床样本、HPV11阳性临床样本、HPV42阳性临床样本、HPV43阳性临床样本、HPV81阳性临床样本和HPV83阳性临床样本)、灭活培养物(单纯疱疹病毒Ⅱ型、解脲支原体、人型支原体、淋病奈瑟菌、白色念珠菌、沙眼衣原体和巨细胞病毒)，记为阴性参考品N1～N14。

按照实施例2中所述的方法，配制实时荧光定量PCR反应体系，其中模板为上述阳性参考品P1～P14和阴性参考品N1～N14各30μL，每管PCR反应液总体积为50μL。

2、实验结果

本发明实施例2的试剂盒的准确性检测结果如表10所示。

表10试剂盒的准确性检测结果

如表10所示，本发明试剂盒的检测结果准确率为100％，表明本发明实施例2的试剂盒具有高度的准确性，符合检测要求，可用于HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66和HPV68的鉴定，以及HPV16型和HPV18型确定分型。

实施例5试剂盒的应用

1、实验方法

(1)对200份经测序确认的临床样本(人宫颈脱落细胞样本)使用本发明实施例2的试剂盒进行检测，其中171例含高危型人乳头瘤病毒DNA，17例临床样本含低危型人乳头瘤病毒DNA(HPV6、HPV11、HPV26、HPV53、HPV73、HPV81和HPV 82)，12例临床样本不含人乳头瘤病毒DNA。

按照实施例2中所述的方法，提取200份临床样本的基因组DNA，配制实时荧光定量PCR反应体系，其中模板为200份临床样本的基因组DNA 30μL或经提取处理的试剂盒的阴性质控品30μL或经提取处理的试剂盒的阳性质控品30μL，每管PCR反应液总体积为50μL。

2、实验结果

本发明实施例2的试剂盒检测200份经测序确认的临床样本，检测的结果如表11所示。

表11试剂盒检测200份经测序确认的临床样本的结果

如表11所示，测序诊断为感染HPV16的样本共46例，其余154例样本为未感染HPV16；使用本发明实施例2的试剂盒检测，结果显示有46例样本感染HPV16，154例未感染HPV16，且所属样本与测序诊断结果相同的样本一一对应。所以本发明实施例2的试剂盒检测HPV16的结果与测序诊断结果的符合率为100％。

测序诊断为感染HPV18的样本共11例，其余189例样本未感染HPV18；使用本发明实施例2的试剂盒检测，结果显示有11例样本感染HPV18，189例样本未感染HPV18。所以本发明实施例2的试剂盒检测HPV18的结果与测序诊断结果的符合率为100％。

测序诊断为感染其余12种HPV中至少一种的样本共133例，其余67例样本未感染其余12种HPV；使用本发明实施例2的试剂盒检测，有133例样本为感染其余12种HPV中至少一种，67例呈未感染其余12种HPV，且所属样本与测序诊断结果相同的样本一一对应。所以本发明实施例2的试剂盒检测其余12型HPV的结果与测序诊断结果的符合率为100％。

使用本发明实施例2的试剂盒检测17例低危型人乳头瘤病毒DNA阳性临床样本和12例不含人乳头瘤病毒DNA的临床样本，检测结果均未无Ct值，且所属样本与测序诊断结果相同的样本一一对应，与测序诊断结果的符合率为100％，表明本发明实施例2的试剂盒的特异性高，不产生假阳性结果。

以上结果表明，本发明实施例2的试剂盒具有高特异性，能够特异性检测出HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66和HPV68共14种高危型HPV，可以满足临床检测的需要。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims

1.引物在制备检测HPV的试剂盒中的应用，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如SEQID NO：15～42所示。

2.引物和探针的组合物在制备检测HPV的试剂盒中的应用，其特征在于，所述引物为权利要求1中的引物；所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：1～14所示。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述组合物包含组A～C，各组间的探针的5’端设有不同的荧光报告基团，3’端设有荧光淬灭基团；

所述荧光报告基团为Texas Red、VIC或FAM中的任意一种；所述荧光淬灭基团为BHQ1、BHQ2或DQ1中的任意一种；

所述组A包含核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的探针及核苷酸序列如SEQ ID NO：15～16所示的引物；

所述组B包含核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的探针及核苷酸序列如SEQ ID NO：17～18所示的引物；

所述组C包含核苷酸序列如SEQ ID NO：3～18所示的探针及核苷酸序列如SEQ ID NO：19～42所示的引物。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述组A的5’端设有荧光报告基团TexasRed；所述组B的5’端设有荧光报告基团VIC；所述组C的5’端设有荧光报告基团FAM。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述组A的3’端设有荧光淬灭基团BHQ2；所述组B的3’端设有荧光淬灭基团BHQ1；所述组C的3’端均设有荧光淬灭基团BHQ1。

6.一种检测HPV的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1中所述的引物。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，包含权利要求2～5中任一所述的组合物。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述组合物为权利要求3中所述组合物。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述组合物中，组A～C的探针终浓度为0.10μM～0.42μM，组A～C的引物终浓度为0.08μM～0.62μM。

10.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含阳性质控品，所述阳性质控品为假病毒，所述假病毒的基因组包含核苷酸序列如SEQ IDNO：46、SEQ ID NO：47和SEQ ID NO：54所示的序列。