CN101886137B

CN101886137B - 荧光定量pcr定性检测高危型hpv的试剂盒

Info

Publication number: CN101886137B
Application number: CN 200910051131
Authority: CN
Inventors: 张艳; 李宁丽; 顾关林; 马式薇; 陈勇; 姜惠民; 何昕; 蔡佩民; 管爱民
Original assignee: SHANGHAI DUONAMEI ENTERPRISE DEVELOPMENT Co Ltd
Current assignee: SHANGHAI DUONAMEI ENTERPRISE DEVELOPMENT Co Ltd
Priority date: 2009-05-13
Filing date: 2009-05-13
Publication date: 2013-02-13
Anticipated expiration: 2029-05-13
Also published as: CN101886137A

Abstract

本发明公开了一种荧光定量PCR定性检测高危型HPV的方法，该方法的荧光PCR反应体系中镁离子的浓度为1～10mM，Taq聚合酶0.1～5U，各种引物及探针浓度为100nM；在PCR反应前测定反应前荧光值；在PCR反应后测得反应后荧光值；计算出差值。同时用公式VL＝2^{-(CtHPV-CtHMBS)}算出相对病毒载量值，并根据相对病毒载量值判定是否HPV感染阳性。该方法可简单快速的对HPV感染进行相对定量的检测。本发明还提供了一种用于该方法的试剂盒，使用本试剂盒可以准确、快速、特异和方便地检测出临床疾病相关的特异性核酸序列。

Description

荧光定量PCR定性检测高危型HPV的试剂盒

技术领域

本发明属于病毒检测技术领域，尤指一种荧光定量PCR定性检测高危型HPV的方法。

背景技术

宫颈癌在全球妇女的癌症死因中高居第二位，世界上每年的新发病例约为45万，死亡率为50％。Drs.Rous and Beard最早在1934曾经提出HPV为致癌物质，此后自1974年Zur Hausen提出HPV是宫颈癌的最可能因素后，国内外学者就HPV感染与子宫颈癌的关系进行了大量的研究，并获取了许多实验室与临床证据。1977年Laverty在电镜中观察到子宫颈癌活检组织中存在HPV颗粒，1981年第一次在生殖道分离出了HPV，1983-1986年依次从宫颈癌样本中分离出HPV16、18、31、35等型别。1995年IARC专题讨论会确定：HPV感染是子宫颈癌的主要病因。目前研究发现99.7％的宫颈鳞状细胞癌有人乳头瘤病毒的感染，而高危型人乳头状瘤病毒的持续感染是宫颈癌发病的重要因素。

人乳头瘤病毒(Human Papillomaviruses，HPV)属乳多空病毒科A亚群内的一组DNA病毒，外形呈20多面体对称型，无包膜，直径约45nm～55nm，基因组为共价闭合环状双链DNA分子，含近8000个碱基对(bp)。HPV基因组含8个开放读码框架；可分为三个基因区，包括两个编码区和一个非编码调控区。编码区分为E区和L区，E区包括E1、E2、E4、E5、E6、E7；L区包括L1、L2，分别编码早期蛋白和晚期蛋白，六个E蛋白主要负责病毒DNA的复制、转录和细胞转化，两个L蛋白为衣壳蛋白主要负责病毒颗粒的组装和DNA包装。

当分离株病毒L1区序列与已知序列近源病毒株同源性少于90％时，就可被确定为一种新的HPV型别，按照HPV亚型与癌症相关性的高低将HPV分为高危型和低危型。高危型HPV包括HPV-16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73和82；可能的高危型包括HPV26、53和66；低危型包括HPV6、11、40、42、43、44、54、61、70、72、81 和CP6108。HPV与多种疾病密切相关，低危型HPV能引起良性生殖器疣；而高危型HPV则可引起宫颈癌、外生殖器癌及高度子宫颈上皮内瘤等恶性病变。因此，HPV感染的检测和分型对了解女性生殖道肿瘤相关病情、判断预后、指导治疗、分析HPV流行状况以及基因疫苗的研制均具有重要价值。

由于HPV具有高度种属特异性，难以在体外常规细胞培养系统中培养，也不能通过分离病毒来确定型别，目前缺少一种可行的血清学技术检验手段，因此，HPV的检测只能依赖对其DNA序列的分子水平的检查。

第二代杂交捕获法(hybrid caputure II，HC-II)是经美国FDA认证的可应用于临床的HPV DNA检测技术，HC-II采用孔平板法，可一次检测13种高危型HPV病毒(包括16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、69)型，具体操作步骤：样本DNA双链被释放并分解为核苷酸单链。DNA单链与RNA探针结合为RNA-DNA杂交体。特异性抗体将RNA-DNA杂交体固定在微孔壁上。结合有碱性磷酸酶的多个二抗与RNA-DNA杂交体结合，放大信号。碱性磷酸酶使酶底物发光，根据光的强弱确定碱性磷酸酶的含量，从而确定RNA-DNA杂交体的含量。检测结果的判断标准是RLU(相对光单位，光信号)/Cutoff(域值＝三个阳性质控指标的平均值)≥1为阳性，＜1为阴性。HC-II检测灵敏度高、重复性好且客观性强，然而缺点是无法明确宫颈病变中感染的HPV型别。

导流杂交技术是一种结合低密度基因芯片与导流杂交的新型检测技术(简称HybriMax)，可进行21种HPV型别(6、11、16、18、31、33、35、39、42、43、44、45、51、52、53、56、58、59、66、68、CP8304)的检测。导流杂交的技术原理为：将探针固定于纤维膜上，使目标分子在电流的引导下穿过固定有探针的薄膜并与互补探针相结合，形成复合物而被固定下来。而非目标分子不能被结合固定而穿过薄膜被洗去。因此，导流杂交加速了互补分子之间的相互作用，将杂交时间从几个小时降低至十几分钟，比传统杂交法省时几百倍。而21种型别探针共同固定于同一张膜条上，检测结果可以通过肉眼或专用软件获得，阳性点为清晰可见的蓝紫色圆点，根据膜条HPV型别分布图，判断阳性点为何种型别，结果直观易判。一台机器每次可检测15个标本，方便易行。因此，目前国内也有医院采用这一方法。虽然有报道表明HybriMax检测诊断与HC-II对13种高危型HPV的检测结果总符合率可达90％左右[9、10]，但是实际应用中还有较多问题，如我们发现在使用HybriMax检测临床样本时发现检测结果重复性较差：即同一标本在不同检测人员的操作下、或者不同时间再次检测时会出现不同结果。如我们曾经检测过凯普导流杂交实验检测HPV的重复率(对于49例的临床样本DNA进行重复检测)，结果发现两次结果的符合例数仅为30例，即重复试验的符合率为：30/49×100％＝61％。这样的结果将不仅会对临床诊断造成影响，而且会影响临床医生对于宫颈癌可疑患者的跟踪诊断，从而导致误诊或漏诊。我们通过大量的试验研究发现其原因可能与下列因素有关：1、杂交仪的使用与保养：如杂交仪必须严格保养、隔离条必须严格定时更换，如不及时更换可导致泄漏而造成结果的不准确；2、操作较复杂，需经PCR及杂交两个阶段，一则因需时较长易产生误差，而则因PCR较容易受到污染而产生假阳性；3、虽然能够分型，但是不能相对定量，只是定性和分型。然而HPV感染的定量非常重要(如前述)。因此，这种方法也有待改进。

用于HPV检测的主要方法所存在的缺陷，至今，尚未见对高危型HPV型别定量检测的报道。

发明内容

为了解决现有技术中上述的问题，本发明提供一种本专利报道了一种即能够简单快速的检测高危型HPV感染、又能够报告HPV感染相对定量的方法，以及用于该方法的试剂盒，该方法可以从而大大提高高危型HPV感染的检出率。

本发明的荧光定量PCR定性检测高危型HPV的方法包括如下步骤：

A)根据待检测的HPV基因的特异性核酸序列分别合成13对引物，上下游引物之间相距50～200个碱基；

B)并根据各型HPV基因的特异性核酸序列中位于两个引物之间的序列分别设计、合成Taqman荧光探针；

C)使用步骤A)中的引物和步骤B)中的荧光探针荧光反应体系，其中镁离子的浓度为1～10mM，Taq聚合酶0.1～5U，各种引物及探针浓度为10～500nM；

D)从待测临床标本中提取DNA，取适量加入步骤C)中的反应体系中，经离心混合后将反应管放入实时定量PCR反应仪，进行20～50次循环扩增反应，反应结束后测定反应管中的荧光增值；

E)同时用系列阳性和阴性模板也进行D)的核酸提取反应，测得各自相应的代表荧光增值的循环数(Ct值)，根据Ct值算出目的基因相对含量(算法详见后述)，并将其相对于阳性模板的初始核酸量做图，制作标准曲线；

F)用上述步骤中获得的各样品Ct值计算得出的目的基因的相对含量即可在标准曲线上查出相应的样品中的核酸起始拷贝数。

其中步骤A)中所述的两个引物之前相距73～104个碱基。

其中步骤D)中所述的PCR反应优选进行30～50个循环。

其中步骤D)中所述的PCR反应更优选进行35～45个循环。

此种用于荧光定量PCR定性检测高危型HPV方法的试剂盒，它包括：荧光PCR反应液，阳性摸板，阴性摸板以及根据待测核酸的特异性核酸序列设计的PCR引物和荧光探针，该荧光PCR反应液中镁离子的浓度为1～10mM，Taq聚合酶0.1～5U，各种引物及探针浓度为10～500nM。

所述的待测核酸分别为HPV16，HPV18，HPV31，HPV33，HPV35，HPV39，HPV45，HPV51，HPV52，HPV56，HPV58，HPV59，HPV67，及内参照基因HMBS。

所述的待测核酸为HPV16；

所述的特异性核酸序列为：

AGCTCAGAGGAGGAGGATGAAATAGATGGTCCAGCTGGACAAGCAGAACC

GGACAGAGCCCATTACAATATTGTAACC：

上游引物：AGCTCAGAGGAGGAGGATGAA

下游引物：GGTTACAATATTGTAATGGGCTC

所述的荧光探针的序列为：CCAGCTGGACAAGCAGAACCGG

所述的待测核酸为HPV18；

所述的特异性核酸序列为：

CATTTTGTGAACAGGCAGAGCTAGAGACAGCACAGGCATTGTTCCATGCGC

AGGAGGTCCACAATGATGCACAAGT

上游引物：CATTTTGTGAACAGGCAGAGC

下游引物：ACTTGTGCATCATTGTGGAC C

所述的荧光探针的序列为：AGAGACAGCACAGGCATTGTTCCATG

所述的待测核酸为HPV31；

所述的特异性核酸序列为：

ACGATTCCACAACATAGGAGGAAGGTGGACAGGACGTTGCATAGCATGTTG

GAGAAGACCTCGTACTGAAACCCAAGTGTA

上游引物：ACGATTCCACAACATAGGAGGA

下游引物：TACACTTGGGTTTCAGTACGAGGT

所述的荧光探针的序列为：CTCCAACATGCTATGCAACGTCC

所述的待测核酸为HPV33；

所述的特异性核酸序列为：

CGTCGCAGGCGTAAACGTTTTCCATATTTTTTTACAGATGTCCGTGTGGCGG

CCTAGTGAGGCCACAGTGTACCTGCCTCCTGT

上游引物：CGTCGCAGGCGTAAACG

下游引物：ACAGGAGGCAGGTACAC

所述的荧光探针的序列为：AGATGTCCGTGTGGCGGCCTAG

所述的待测核酸为HPV35；

所述的特异性核酸序列为：

GCCTGCTCCGTGGGCACCACAGAAACCCAGAAGACAAATCACAAACGACTT

CGAGGGGGTACCGAGCTCCCCTACAACCCCACCAAGCGAGTGCGACTCAGT

GC

上游引物：GCCTGCTCCGTGGGC

下游引物：GCACTGAGTCGCACTCGC

所述的荧光探针的序列为：AGAAGACAAATCACAAACGACTTCGAGGG

所述的待测核酸为HPV39；

所述的特异性核酸序列为：

CGAGCAATTAGGAGAGTCAGAGGATGAAATAGATGAACCCGACCATGCAGT

TAATCACCAACATCAACTACTAGCCAGACGGGATGAACCACAGCGTCACAC

A

上游引物：CGAGCAATTAGGAGAGTCAGAGG

下游引物：TGTGTGACGCTGTGGTTCAT

所述的荧光探针的序列为：AACCCGACCATGCAGTTAATCACCAAC

所述的待测核酸为HPV45；

所述的特异性核酸序列为：

CCATTTGTGAACAGGCAGAGCAAGAGACAGCACAGGCATTGTTCCATGCGC

AGGAAGTTCAGAATGATGCACAGGTGTTG

上游引物：CATTTTGTGAACAGGCAGAGC

下游引物：CAACACCTGTGCATCATTCTGA

所述的荧光探针的序列为：AGAGACAGCACAGGCATTGTTCCATG

所述的待测核酸为HPV51；

所述的特异性核酸序列为：

AAAGCAAAAATTGGTGGACGAAAAAAAAAGGTTCCATGAAATAGCGGGAC

GTTGGACGGGGCAATGCGCTAATTGCTGGCA

上游引物：AAAGCAAAAATTGGTGGACGA

下游引物：TGCCAGCAATTAGCGCATT

所述的荧光探针的序列为：CATGAAATAGCGGGACGTTGGACG

所述的待测核酸为HPV52；

所述的特异性核酸序列为：

CGTCGCAGGCGTAAACGTTTTCCATATTTTTTTACAGATGTCCGTGTGGCGG

CCTAGTGAGGCCACTGTGTACCTGCCTCCTGT

上游引物：CGTCGCAGGCGTAAACG

下游引物：ACAGGAGGCAGGTACAC

所述的荧光探针的序列为：AGATGTCCGTGTGGCGGCCTAG

所述的待测核酸为HPV56；

所述的特异性核酸序列为：

TGCATTGTGACAGAAAAAGACGATTTCATCTAATAGCACATGGTTGGACCG

GGTCATGTTTGGGGTGCTGGAG

上游引物：TGCATTGTGACAGAAAAAGACGAT

下游引物：CTCCAGCACCCCAAACATG

所述的荧光探针的序列为：TCATCTAATAGCACATGGTTGGACCGGG

所述的待测核酸为HPV58；

所述的特异性核酸序列为：

GCGTCGCAGACGTAAACGTTTTCCATATTTTTTTGCAGATGTCCGTGTGGCG

GCCTAGTGAGGCCACTGTGTACCTGCCTCCTGT

上游引物：GCGTCGCAGACGTAAACG

下游引物：ACAGGAGGCAGGTACAC

所述的荧光探针的序列为：AGATGTCCGTGTGGCGGCCTAG

所述的待测核酸为HPV59；

所述的特异性核酸序列为：

TGTATGGAGAAACATTAGAGGCTGAAACCAAGACACCGTTACATGAGCTGC

TGATACGCTGTTATAGATGCCTAAAACCTCTATGTCCA

上游引物：TGTATGGAGAAACATTAGAGGCTGAA

下游引物：TGGACATAGAGGTTTTAGGCATCTATAA

所述的荧光探针的序列为：AGACACCGTTACATGAGCTGCTGATACGC

所述的待测核酸为HPV67；

所述的特异性核酸序列为：

CGTCGCAGGCGTAAACGGTTTCCATATTTTTTTGCAGATGTCCGTGTGGCGG

CCTAGTGAGGCCACTGTGTACCTGCCTCCTGT

上游引物：CGTCGCAGGCGTAAACG

下游引物：ACAGGAGGCAGGTACAC

所述的荧光探针的序列为：AGATGTCCGTGTGGCGGCCTAG

所述的待测核酸为HMBS；

所述的特异性核酸序列为：

GCCTGCAGTTTGAAATCAGTGAGTTTTCTGGAAAGGAGTGGAAGCTAATGG

GAAGCCCAGTACCCCGAGAGGAGAGAACACAACATTTCTGGCTTTGCCTAT

AGCTAAAGCCCGTCCCG

上游引物：GCCTGCAGTTTGAAATCAGTG

下游引物：CGGGACGGGCTTTAGCTA

所述的荧光探针的序列为：TGGAAGCTAATGGGAAGCCCAGTACC

该方法和试剂盒的有益效果如下

1.该方法可简单快速的对HPV感染进行相对定量的检测，与DIG-II检测法检测结果的符合率达到94.32％(κ＝0.87)；

2.该方法测定时由实时定量PCR仪自动检测，并且反应中引入内参照基因及阴性对照的平行检测用于检测结果的校正，减少了由于操作人员的手法不同而引起的操作误差；

3.样本检测时核酸的扩增反应发生在同一密闭管中，减少了会产生交叉污染的操作过程。

4.该检测方法成本相对较低，可适用于临床普查。

5.使用本试剂盒可以准确、快速、特异和方便地检测出临床疾病相关的特异性核酸序列。

附图说明

图1是在HPV的病毒拷贝数在50-0.005ng的范围内，本法的循环数与模板量呈线性的反相关关系；

图2是Realtime检测法与DIG-II检测法的拟合曲线图；

图3是Realtime检测法与DIG-II检测法所检出的阳性例数及阴性例数的比较；

图4是Realtime检测法与凯普检测法检测HPV的阳性例数(positive)与阴性例数(Negative)比较；

图5是Realtime检测法与DIG-II及凯普检测法检测HPV的阳性符合率(Positive coincidence rate)、阴性符合率(Negative coincidence rate)及总符合率(Totle coincidence rate)比较；

图6是定量加入Siha细胞数后内参循环数及HPV循环数。

具体实施方式

实施例1

材料与方法

(一)、实验条件：

1、高危型HPV引物与探针序列：13型HPV高危型的引物与探针序列见表1。所合成的Taqman探针已可以同时检测13型HPV型别，包括：16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、67等。所扩增的区域主要集中在E区和L1区、扩增的片断长度在73-104bp(表1)。

2、引物合成与探针标记：所有引物与探针均在英俊公司合成。HPV探针的5’端标记荧光为FAM，3’端标记荧光为TAMRA。内参(HMBS)探针的5’端标记为HEX，3’端标记的荧光为TAMRA。

3、扩增仪器：ABI-7500。

4、试剂：所用Premix Ex Taq购自Takara公司(见下)。

5、反应体系：20ul。

样本DNA：6.8ul

Probe mixture：10ul/reaction

Primers(mixed)：HPV：0.08ul/primers or pb

内参：0.096ul/reaction

H2O：0.512ul(无菌标准去离子水，电阻≤18.2Ω)

PCR mixture：10ul(buffer，enzyme，Mg++，dNTP)(Real time PCRMix，Takara公司)。

6、反应条件：95度10秒，95度5秒，57度45秒，40个循环。

(二)、检测灵敏度：以HPV16和18型为代表测定了本方法的检测灵敏度为0.005ng(5pg)/样本。也即在HPV的病毒拷贝数在50-0.005ng的范围内，本法的循环数与模板量呈线性的反相关关系(图1)。

(三)、样本中高危型HPV的相对定量：由于HPV感染的量与临床上是否发展为宫颈癌有着极为密切的关系。关于定量方法建立中内参基因的引入：本实验中，引入的内参基因为HMBS(羟甲基胆素合成酶)。HMBS为一低丰度表达的内参照，当和HPV的各型引物探针混至一管时有可能出现竞争性结合，因此，内参与目的基因引物探针的混合比例至关重要。本实验中经过大量混合比例的实验，发现20ul体系中，当HPV的引物探针为0.08ul，HMBS的引物探针为0.096ul时，对于各型HPV及HMBS的扩增相对平衡。

1.感染高危型HPV相对含量的计算：相对感染量，用循环数的2ΔCt次幂表示当样本中细胞数相同时所含HPV的相对量。其计算公式为：

VL＝2^ΔCt＝2^{-(CtHPV-CtHMBS)}

注：CtHPV为Realtime实验中HPV的循环数，CtHMBS为HMBS的循环数。

2.拟合曲线及临界值的确定：为了确定阴性标本与阳性标本的临界值，将所有样本(134例)分别用DigII检测法所得比值及Realtime检测法所得2ΔCt次幂做拟合曲线图(图2)。于拟合曲线可得公式1：y＝0.4514e^0.0509x(R²＝0.9937)，公式2：y＝0.5738e^0.0597x(R2＝0.9142)。由于在HC-II检测法中，当样品所测结果大于等于1时，被认为HPV感染阳性，而结果小于1时，被认为HPV感染阴性，结合上述拟合曲线公式1、2，可以得出，在Realtime-PCR检测法中，当样本值大于等于1.46时，可被认为HPV感染阳性，而小于1.46时，认为HPV感染阴性。

3.验证临界值：另收集60例病人样本，同时使用HC-II法及Realtime-PCR法进行检测，比较其检测结果。

4.与国内现在普遍使用的检测HPV方法比较：

a)与DIG-II检测方法对比：已做平行标本194例，其中DIG-II阳性例数150例，而本法检出为157例阳性；阴性样本44例，本法检测判断为阴性样本35例(图3)(另外有2例样本由于检测HMBS循环数大于40，被认为样本细胞数不够，建议重新采集样本。)

b)与导流杂交法(凯普检测)法相比：已做的平行标本81例，其中凯普阳性为60例，而本法检出为48例阳性；阴性样本21例，本法检测判断为阴性样本21例(图4)。

c)检出率比较：根据上述结果，分别计算出本法与国内现在普遍使用的检测HPV方法平行比较检出率：与DIG-II方法：阳性符合率为：98.67％(148/150)，阴性符合率为：79.54％(35/44)，总符合率为：94.32％(183/194)。与导流杂交法：阳性符合率为80％，阴性符合率为100％(图5)。

5.Realtime-PCR扩增效率检测及相对感染病毒拷贝数的估算：为了进一步研究能够相对检测感染样本中HPV拷贝数的方法，我们采用Siha细胞(HPV16型的宿主细胞)进行了探索。本法中，取不同量Siha细胞(每细胞含有1到2个HPV16型病毒基因拷贝)用同前所述的方法作Realtime-PCR检测，如图6所示，随着细胞数的增加，样本内参及HPV的循环数逐渐减少，因此根据循环数及其2ΔCt次幂即可估算出样本被感染细胞数。

荧光PCR检测试剂盒临床应用总结：

本试剂盒临床检测194例，检出阳性样本157例，阴性样本35例，2例细胞数过少建议重新采集标本，与DIG-II检出符合率94.32％，(κ＝0.87)；并且该方法操作简便易行，具有较为准确的检出率，且成本较低，适于临床普查。

表1是高危型HPV引物与探针序列

编号

Type

Sequence

扩增区域

扩增片断 (bp)

Primer

Probe

F

R

1

F16

AGCTCAGAGGAGGA GGATGAA

1

R16

GGTTACAATATTGTA ATGGGCTC

1

Pb.16

CCAGCTGGACAAGC AGAACCGG

E7

78

2/3

F18

CATTTTGTGAACAGG CAGAGC

2

R18

ACTTGTGCATCATTG TGGACC

3

R45

CAACACCTGTGCATC ATTCTGA

2/3

Pb.18/ 45F

AGAGACAGCACAGG CATTGTTCCATG

E1/E 1

76/80

4

F31

ACGATTCCACAACAT AGGAGGA

[0166]

4

R31

TACACTTGGGTTTCA GTACGAGGT

4

Pb31

CTCCAACATGCTATG CAACGTCC

E6

81

5/6/7

F33，52 ，67

CGTCGCAGGCGTAAA CG

8

F58

GCGTCGCAGACGTAA ACG

5/6/ 7/8

R33/ 52/58/67

ACAGGAGGCAGGTA CAC

5/6/7 /8

Pb33/5 2/58/67

AGATGTCCGTGTGGC GGCCTAG

L1/L 1/L1/L1

84/84/ 85/84

9

F35

GCCTGCTCCGTGGGC

9

R35

GCACTGAGTCGCACT CGC

9

Pb35

CAGAAGACAAATCA CAAACGACTTCGAGGG

E4

104

10

F39

CGAGCAATTAGGAG AGTCAGAGG

10

R39

TGTGTGACGCTGTGG TTCAT

10

Pb39

AACCCGACCATGCAG TTAATCACCAAC

E7

103

11

F51

AAAGCAAAAATTGGT GGACGA

11

R51

TGCCAGCAATTAGCG CATT

11

Pb1.51

CATGAAATAGCGGG ACGTTGGACG

E6

81

12

F56

TGCATTGTGACAGAA AAAGACGAT

12

R56

CTCCAGCACCCCAAA CATG

12

Pb1.56

TCATCTAATAGCACA TGGTTGGACCGGG

E6

73

[0167]

13

59F

TGTATGGAGAAACAT TAGAGGCTGAA

13

59R

TGGACATAGAGGTTT TAGGCATCTATAA

13

Pb1.59

AGACACCGTTACATG AGCTGCTGATACGC

E6

89

内参

HMBS -F

GCCTGCAGTTTGAAA TCAGTG

HMBS -R

CGGGACGGGCTTTAG CTA

PbHM BS^*

TGGAAGCTAATGGGA AGCCCAGTACC

^*：5’端：HEX，3’TAMRA

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种用于荧光定量PCR定性检测高危型HPV方法的试剂盒，它包括：荧光PCR反应液，阳性模板，阴性模板以及根据待测核酸的特异性核酸序列设计的PCR引物和荧光探针，该荧光PCR反应液中镁离子的浓度为1～10mM，Taq聚合酶0.1～5U；其特征在于，所述的待测核酸分别为HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV67及内参照基因HMBS，所述的引物序列分别为：

HPV16：

上游引物：AGCTCAGAGGAGGAGGATGAA

下游引物：GGTTACAATATTGTAATGGGCTC

HPV18：

上游引物：CATTTTGTGAACAGGCAGAGC

下游引物：ACTTGTGCATCATTGTGGACC

HPV31：

上游引物：ACGATTCCACAACATAGGAGGA

下游引物：TACACTTGGGTTTCAGTACGAGGT

HPV33：

上游引物：CGTCGCAGGCGTAAACG

下游引物：ACAGGAGGCAGGTACAC

HPV35：

上游引物：GCCTGCTCCGTGGGC

下游引物：GCACTGAGTCGCACTCGC

HPV39：

上游引物：CGAGCAATTAGGAGAGTCAGAGG

下游引物：TGTGTGACGCTGTGGTTCAT

HPV45：

上游引物：CATTTTGTGAACAGGCAGAGC

下游引物：CAACACCTGTGCATCATTCTGA

HPV51：

上游引物：AAAGCAAAAATTGGTGGACGA

下游引物：TGCCAGCAATTAGCGCATT

HPV52：

上游引物：CGTCGCAGGCGTAAACG

下游引物：ACAGGAGGCAGGTACAC

HPV56：

上游引物：TGCATTGTGACAGAAAAAGACGAT

下游引物：CTCCAGCACCCCAAACATG

HPV58：

上游引物：GCGTCGCAGACGTAAACG

下游引物：ACAGGAGGCAGGTACAC

HPV59：

上游引物：TGTATGGAGAAACATTAGAGGCTGAA

下游引物：TGGACATAGAGGTTTTAGGCATCTATAA

HPV67：

上游引物：CGTCGCAGGCGTAAACG

下游引物：ACAGGAGGCAGGTACAC

HMBS：

上游引物：GCCTGCAGTTTGAAATCAGTG

下游引物：CGGGACGGGCTTTAGCTA

所述的荧光探针的序列分别为：

HPV16探针：CCAGCTGGACAAGCAGAACCGG

HPV18探针：AGAGACAGCACAGGCATTGTTCCATG

HPV31探针：CTCCAACATGCTATGCAACGTCC

HPV33/52/58/67探针：AGATGTCCGTGTGGCGGCCTAG

HPV35探针：AGAAGACAAATCACAAACGACTTCGAGGG

HPV45探针：AGAGACAGCACAGGCATTGTTCCATG

HPV39探针：AACCCGACCATGCAGTTAATCACCAAC

HPV51探针：CATGAAATAGCGGGACGTTGGACG

HPV56探针：TCATCTAATAGCACATGGTTGGACCGGG

HPV59探针：AGACACCGTTACATGAGCTGCTGATACGC

HMBS探针：TGGAAGCTAATGGGAAGCCCAGTACC。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的特异性核酸序列在NCBI中的序列编号分别为：HPV16 NC001526，HPV18 NC001357，HPV31 J04353，HPV33 M12732，HPV35 M74117，HPV39 M62849，HPV45 X74479，HPV51 M62877，HPV52 X74481，HPV56 X74483，HPV58 D90400，HPV59 X77858，HPV67 D21208，HMBS M95623.1。

3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述的Taq聚合酶为0.625U。